（果树学专业论文）柑橘nac转录因子的克隆与表达分析.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授夜书譬9 7 9 3 学位论文 不 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 白 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材科，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：营银1 1 7时间：加p 年月岁日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 一、 学位敝储始曹州 导师始斯劣欤 签名日期：劲j o 年月3 日 签名日期：孓。( 。年6 月g 日 注：请将本袭直接装订红学能论文的廊页和目录之间 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 目录 摘要兽i a b s t r a c t i i 缩略词表i i i 1 一前言1f j u 看1 1 1 课题的提出l 1 2 转录因子研究1 1 3n a c 转录因子的研究概况3 1 3 1n a c 转录因子的结构特点及其分类3 1 3 2n a c 转录因子的生物功能5 1 3 2 1 营养器官和生殖器官的发育5 1 3 2 2 侧根形成和激素传导5 1 3 2 3 植物细胞次生壁的合成6 1 3 2 4 调控植物组织衰老6 1 3 2 5 防御和非生物胁迫6 1 3 3n a c 表达水平和活性的调控7 1 3 3 1n a c 基因的转录调控7 1 3 3 2 转录后调控7 1 3 3 3 翻译后调控。8 1 3 4 未来研究前景8 1 4n a c 转录因子在果树中的研究9 1 5 本研究的目的及内容9 2 材料与方法1 0 2 1 实验材料10 2 2 实验方法10 2 2 1n a c 基因全长的克隆10 2 2 1 1r n a 提取10 2 2 1 2 单链c d n a 合成12 2 2 1 3 同源克隆法设计p c r 引物1 2 2 2 1 4p c r 反应13 2 2 1 5 产物回收，连接1 4 2 2 1 6 转化，测序1 4 2 2 1 7 序列拼接1 4 2 2 2 基因表达检测1 4 柑橘n a c 转录因子的克隆与表达分析 2 2 2 1 实时荧光定量p c r 引物的获得1 4 2 2 2 2 实时荧光定量p c r 引物检测1 5 2 2 2 3c d n a 模板的制备15 2 2 2 4 实时荧光定量p c r 检测基因表达1 5 2 2 3n a c 序列的生物信息学分析1 6 2 2 3 1 序列的基本特征分析16 2 2 3 2 同源性分析和功能预测16 3 结果与分析一1 7 3 1c i t n a c l 的基因克隆和表达检测1 7 3 1 1c i t n a c l 的基因克隆1 7 3 1 2c i t n a c l 的序列分析1 7 3 1 3c i t n a c l 在不同组织中的表达模式1 8 3 2c i t n a c 2 的基因克隆和序列分析2 0 3 2 1c i t n a c 2 的基因克隆2 0 3 2 2c i t n a c 2 的序列分析2 0 3 3c i t n a c 基因的克隆和序列分析2 1 3 3 1c i t n a c 基因在暗柳和红暗柳中的克隆2 l 3 3 2c i t n a c 基因在不同品种间的差异2 2 3 3 3c i t n a c 在暗柳和红暗柳不同组织中的表达模式2 2 3 4 柑橘中n a c 基因的生物信息学分析2 5 3 4 1 对柑橘n a c 基因保守结构域的分析2 5 3 4 2 对柑橘n a c 基因的聚类分析2 7 4 讨论：1 8 4 1c i t n a c 基因可能在柑橘组织器官衰老过程中发挥作用2 8 4 2c i t n a c l 基因在柑橘生长发育中的作用2 9 4 3c i t n a c 2 可能是一个抗病相关基因2 9 4 4 未来研究设想3 0 参考文献31 附录在柑橘中克隆到的n a c 基因序列3 7 致谢4 0 柑橘n a c 转录因子的克隆与表达分析 摘要 n a c 是一类植物特有的转录因子，参与植物生长发育过程中的多种生物学过 程，包括生殖器官和营养器官的发育、侧根形成、激素传导、组织衰老、以及生物 和非生物胁迫应答等。本研究以暗柳甜橙( c i t r u ss i n e n s i s l 】o s b e c k ) 的红肉突变体 红暗柳为研究材料，以野生型为对照，克隆n a c 转录因子家族的几个成员，分析 n a c 基因在这两份材料中的序列特征以及表达图谱差异，从而探究n a c 转录因子 与红暗柳芽变性状形成之间的关系，以及n a c 基因在柑橘果实发育成熟过程中可 能发挥的作用。获得的主要结果如下： 1 、利用同源克隆法从暗柳和红暗柳中克隆到c i t n a c l 。序列分析显示 c i t n a c l 包含一个7 5 0 b p 的开放阅读框，编码2 4 9 个氨基酸，属于n a c 转录因子家 族的s e n u 5 亚类；c i t n a c l 在暗柳和红暗柳中没有碱基序列差异。 2 、利用同源克隆法从红暗柳中克隆到c i t n a c 2 。序列分析显示c i t n a c 2 包 含一个9 1 8 b p 的开放阅读框，编码3 0 5 个氨基酸。序列比对发现它与奉节脐橙果皮 褐变相关基因c s n a c 高度同源，可能是其等位基因，同属于n a c 转录因子家族的 a t a f 亚类。 3 、利用在奉节脐橙中已获得的的c i t n a c 序列( e f l 8 5 4 1 9 ) 设计引物，在暗 柳和红暗柳中克隆到c i t n a c 的部分序列，长度为8 4 2 b p ，c i t n a c 属于n a c 转录因子家族中的n a p 亚类。同奉节脐橙相比，暗柳与红暗柳的c i t n a c l 基因在靠近3 端插入一个碱基g 造成移码突变，从而导致多编码了2 2 个氨基酸。 4 、c i t n a c 和c i t n a c l 都是衰老上调基因，c i t n a c 可能调控果实成熟和组织衰 老进程。这两个基因都在柑橘果皮中大量表达，并且随着果实的成熟表达量提升， 但是在红暗柳中的表达比暗柳先到达高峰。这预示红暗柳比暗柳 提前进入成熟过程，从而影响类胡萝卜素的积累。 5 、c i t n a c 2 与c s n a c 高度同源，通过生物信息学分析认为c i t n a c 2 是一个抗病 相关基因，它的表达能够阻止发病相关基因的表达。 关键词：柑橘；n a c 转录因子；基因克隆；表达模式；暗柳橙 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t n a ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，o n l ye x i s ti np l a n tt op l a ya ni m p o r t a n tr o l ei ng r o w t ha n d d e v e l o p m e n t , i n c l u d i n gr e p r o d u c t i v ea n dv e g e t a t i v eo r g a nd e v e l o p m e n t ，f o r m a t i o no f l a t e r a lr o o t ，t r a n s m i t i o no fa u x i n ，t i s s u e ss e n e s c e n c e ，p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，b i o t i ca n d a b i o t i cs t r e s sr e s p o n s e s h o n ga n l i u ，ar e d - f l e s hb u ds p o r t ，a n di t sw i l d t y p e a n l i u ( c i t r u ss i n e n s i s l 。】o s b e c k ) s w e e to r a n g ew e r es e l e c t e df o rn a cg e n ec l o n i n ga n d t r a n s c r i p tp r o f i l e s w ea i m e dt oe x p l o i tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nn a ct r a n s c r i p t i o n f a c t o r sa n dm u t a n ta p p e a r a n c ea n dt od i s c o v e rt h e i r p o t e n t i a l f u n c t i o ni nf r u i t s d e v e l o p m e n ta n dr i p e n i n g t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w ： 1 t h eh o m o l o g yc l o n i n gm e t h o dw a su s e dt oc l o n et h ec i t n ac 1g e n ei n a n l i u a n d h o n ga n l i u s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e d ：c i t n a c lh a da n7 5 0 b po p e nr e a d i n gf l a m e ， e n c o d i n g2 4 9a m i n oa c i d s ，a n d i tw a sam e m b e ro fs e n u 5s u b g r o u pi nn a c t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sf a m i l y ；t h e r ew a sn ob a s ep a i rd i f f e r e n c eb e t w e e n h o n ga n l i u a n d a n l i u 2 t h eh o m o l o g yc l o n i n gm e t h o dw a su s e dt oc l o n et h ec i t n ac 2g e n ei n h o n g a n l i u t h ec i t n a c 2s e q u e n c eh a da n9 1 8 b po p e nr e a d i n gf l a m e ，e n c o d i n g3 0 5a m i n o a c i d s s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tc i t n ac 2w a sap r e s u m e da l l e l eo fc s n acw h i c h p l a y e dar o l ei np e e lp i t t i n go f c i t r u sf r u i t s t h e yb e l o n g e dt ot h ea t a fs u b g r o u po fn a c f a m i l y 3 t h ec i t n a cs e q u e n c ei n f e n g j i e 7 2 1 n a v e lo r a n g e ( e f l 8 5 4 1 9 ) w a su s e dt o d e s i g np r i m e r s ，a n dt h e nc l o n e dt h ec i t n a cg e n ei n a n l i u a n d h o n ga n l i u w eg o tt h e p a r ts e q u e n c eo fc i t n a cg e n e ，w h i c hc o n t a i n e d8 4 2 b pa n dw a si n v o l v e di nt h en a p s u b g r o u po fn a cf a m i l y c o m p a r e dw i t hf e n g j i e 7 2 - 1 n a v e lo r a n g e ，t h ec i t n a cg e n e s o f a n l i u a n d h o n ga n l i u b o t hh a da ni n s e r t i o no fgi nt h e3 e n da n dl e a dt oe n c o d i n g m o r e2 2a m i n oa c i d s 4 c i t n a ca n dc i t n a c lw e r eb o ms e n e s c e n c eu p - r e g u l a t e dg e n e s ，c i t n a cm i g h t r e g u l a t et h ep r o c e s s e so f m a t u r ea n ds e n e s c e n c e b o t ho f t h e m h a da s t r o n ge x p r e s s i o ni nc i m a s p e e l , t h ee x p r e s s i o nw a si n c r e a s i n g 鲫l 枷l yw i t ht h ep r o c e s so ff r u i tr i p 吨, t h ep e a ko f e x p r e s s i o no f h o n ga n l i u w a sp r i o rt o a n l i u i ts u g g e s t e dt h a t h o n ga n l i u w a sm a t u r e e a r l i e rt h a n a n l i u ，t oi n f l u e n c et h ea c c u m u l a t i o no f t h ec a r o t e n o i d s 5 c i t n a c 2w a sh i g h l yh o m o l o g o u sw i t hc s n ac ，b o t ho ft h e mb e l o n g e dt oa t a f s u b g r o u pi nn a ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r sf a m i l y t h e yw e r ed i s e a s e r e s i s t a n c eg e n e s ，w h i c h e x p r e s s i o nc o u l dk e e pp l a n ta w a yf r o md i s e a s e k e yw o r d s ：c i t r u s ；n a ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ；g e n ec l o n i n g ；g e n ee x p r e s s i o n a n a l y s i s ；c i t r u ss i n e n s i s 【l 】o s b e c k 柑橘n a c 转录因子的克隆与表达分析 缩略词表 i l l 柑橘n a c 转录l 夭i 予的克隆与表达分析 - j o - 一 l 刖吾 1 1 课题的提出 柑橘是世界第一大水果，年产量达1 亿吨左右，为仅次于小麦和玉米的世界第 三大国际贸易农产品。我国是柑橘的原产地和生产大国，栽培面积和产量均排名世 界第一( 邓秀新，2 0 0 5 ) 。柑橘不仅是一种可口的水果，而且具有丰富的营养价值， 对于改善人民群众的身体素质具有很大的作用。随着人民生活水平的提高，市场对 柑橘品质的要求也越来越高。因此，通过遗传改良培育新的柑橘品种来提高我国柑 橘的在国际市场上的竞争力是柑橘育种工作者的使命。 通过体细胞变异选育品种( 芽变选种) 是柑橘等多年生果树品种改良的一种重 要方式，对于果树育种具有非常重要的意义。但是，目前人们对于果树体细胞变异 产生的机理认识还不够深入，芽变选种一直处于盲目和被动状态。一般来说芽变是 在原有性状的基础上个别或少数性状发生突变，通过研究突变体与野生型的差异， 我们可以了解柑橘的某些性状形成和变异的规律，为改良品种提供理论支撑。 色泽品质是柑橘果实品质的重要组成部分，它对果实的感官品质和营养品质都 有不可替代的贡献。除了少数品种( 血橙) 的色素以花青素为主外，大部分柑橘品 种的色素都是类胡萝卜素。医学研究表明，类胡萝卜素中的番茄红素和p 胡萝卜素 在帮助人体清除有害自由基，增强人体免疫力，预防心血管疾病，防癌抗癌和预防 维生素a 缺乏症等方面作用明显( f r a s e ra n db r a m l e y , 2 0 0 4 ；t a n ge ta 1 ，2 0 0 8 ) 。因此， 通过能够提高果实中类胡萝卜素的含量，改变果实中类胡萝卜素的组分，培育对人 体有益的柑橘新品种将是改善人类健康状况的一条有效途径。了解柑橘色素品质的 形成和调控机理对于改善果实色泽品质具有重大作用。 红暗柳是暗柳甜橙( c i t r u ss i n e n s i s 【l o s b e e k ) 的红肉突变体，本实验室 刘庆博士在研究其突变的分子机理时发现n a c 转录因子在暗柳和红暗柳中 存在转录水平的差异。n a c 转录因子在植物抗逆和衰老等方面发挥作用，而类胡萝 卜素在果实成熟时大量积累，具有抗氧化，清除自由基等作用。因此，作为后续研 究，本课题重在阐述n a c 转录因子的功能及其与色素品质形成的关系。 1 2 转录因子研究 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区 域中的顺式作用元件( c i s a c t i n ge l e m e n t ) 发生特异性结合，从而保证目的基因以特定 的强度，在特定的时间与空间表达的d n a 结合蛋白( 刘强等，2 0 0 0 ) 。它们与d n a 元件的结合常常需要蛋白间同源或异源互作，高等植物自身生长发育和对环境变化 响应等许多生理现象都是通过其转录因子调控目的基因表达的结果( s i n g he ta 1 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 0 0 2 ) 。典型的植物转录因子具有d n a 结合域( d n a b i n d i n gd o m a i n ，b d ) 、转录调 控域( t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o nd o m a i n ) ( 包括激活区或抑制区) 、寡聚化位点 ( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 和核定位信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ，n l s ) 等4 个功能区域。 转录因子通过这些功能区域在特定的时间进入细胞核内，与特定基因启动子区域中 的顺式作用元件相互作用或与其它转录因子的功能区域相互作用来调控基因的表达 ( l i ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 核定位信号是转录因子一段富含精氨酸和赖氨酸的碱性氨基酸区域，该区域的 功能受到两侧氨基酸残基的影响。虽然转录因子必须进入细胞核内才能发挥作用， 但是并不是所有的转录因子都具有核定位信号。有的转录因子含有多拷贝的核定位 信号，或是簇集在一起，或是分散在蛋白的各个部位，它们可发挥各自不同的功能； 有的可能只有一个核定位信号，有的则没有核定位信号。没有核定位信号的转录因 子需要与有核定位信号的蛋白结合后才能进入细胞核内。 d n a 结合域是转录因子识别d n a 上的顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸 序列，同一个转录因子家族具有保守的d n a 结合域，转录因子d n a 结合域的特定 氨基酸序列决定它们与顺式作用元件识别及结合的特异性，因此转录因子的分类通 常是根据保守的d n a 结合域进行的( l u s c o m b ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。拟南芥已鉴定的18 0 0 个转录因子可分成4 5 个以上的基因家族( r i e c h m a n n ，2 0 0 2 ) 。 转录调控区是转录因子上的一段氨基酸序列，它们形成的结构域可以促进或抑 制r n a 转录的起始。同一转录因子家族的不同成员间的差别主要在转录调控区。根 据所起作用的不同，转录调控区可以分为转录激活区( t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n ) 和转录抑制区( t r a n s c r i p t i o nr e p r e s s i o nd o m a i n ) 两种。转录调控区一般为d n a 结合 域以外的3 0 1 0 0 个氨基酸残基，而且有时一个转录因子可能含有几个转录激活区。 典型的植物转录激活区一般具有相似的特征，如富含酸性氨基酸，富含脯氨酸或谷 氨酰胺等，虽然这些氨基酸残基对他的功能来说并不是必需的( s a i n ze ta 1 ，1 9 9 7 ； s c h w e c h h e i m e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。很多的研究证实转录抑制区确实存在，但是目前对其结 构与作用机理的认识还不深。一般认为它可能存在的作用方式有三种：与启动子的 调控位点结合，阻止其它转录因子的结合；作用于其它转录因子，抑制其它因子的 作用；通过改变d n a 的高级结构来使转录不能进行。 寡聚化区域是不同转录因子借以发挥作用的功能域，寡聚化区域的氨基酸序列 一般高度保守，大多数与d n a 结合域相连形成一定的三维空间结构。绝大多数转 录因子结合d n a 前需通过蛋白质蛋白质相互作用形成二聚体或多聚体。所谓二聚 体化就是指两分子单体通过一定的结构域结合成二聚体，它是转录因子结合d n a 时最常见的形式。这种多聚体的形成是转录因子上的寡聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 相互作用的结果，寡聚体的形成或是通过q 一螺旋和b 一折叠之间的氢键作用力，或是 2 柑橘n a c 转录因子的克隆与表达分析 通过改变内部离子环境，提高亲水基团的相互作用力。除二聚化或多聚化反应，还 有一些调节蛋白不能直接结合d n a ，而是通过蛋白质一蛋白质相互作用间接结合 d n a ，调节基因转录，这样就形成了一个表达调控的复合物。 编码转录因子的基因又称调节基因，与结构基因不同，它的产物不是一种结构 蛋白或是一种酶，而是一种调节其他基因表达的d n a 结合蛋白。形象的说，转录 因子相当于控制阀，它先接受外界信号的刺激，然后改变目的基因的转录水平。转 录因子处于信号途径的中游，起承上启下的作用，上可接受被感知、加工放大的信 号，下则通过与其它转录因子或辅助蛋白的相互作用结合特定基因的启动子元件， 调控基因的表达；同时，可作为共同的信号转导组分位于几条信号的交汇点，参与 信号途径的整合与对话。转录因子不仅在植物的生长发育和对外界环境的适应上有 很大作用，而且对物种的进化意义重大。人类与黑猩猩至少分享9 7 的基因，但是 人类和黑猩猩在基因活性上有将近1 0 0 0 种基因存在很大的不同，这些差异可能与大 约9 0 种转录因子有关( n o w i c ke ta 1 ，2 0 0 9 ) 。最近，研究人员已经调查了人类约2 0 0 0 种转录因子中的1 2 2 2 种，并把这些转录因子之间的相互作用关系绘成草i 蛩( t i m o t h y e ta 1 ，2 0 1 0 ) 。目前，在植物分子生物学领域，对转录因子的克隆和功能研究已经成 为了一个热点。随着越来越多植物全基因组测序的完成，从基因组序列中找出这些 转录因子并且对它们的功能进行注释，并且用遗传学和分子生物学方法对这些转录 因子的功能进行研究就显得越来越重要。 1 3n a c 转录因子的研究概况 n a c 是植物特有的一类转录因子，首次是由s o u e r 等人1 9 9 6 年在矮牵牛中发 现，突变体缺乏茎尖分生组织s a m ( s h o o ta p i c a lm e r i s t e m ) 而在实生苗阶段死亡，所 以被称为n a m ( n oa p i c a lm e r i s t e m ) ，连同后来发现的a t a f l ，2 和c u c l ，2 ( c u p - s h a p e dc o t y l e d o n ) 合称为n a c 。在随后的十几年时间里，对n a c 转录 因子的研究成为植物分子生物学的一个热点。随着基因组测序的完成，人们发现 n a c 家族有着众多的成员，拟南芥中就有1 0 0 多个该家族基因( r i e c h r n a n nc ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。o o k a 等( 2 0 0 3 ) 在水稻全长c d n a 文库中也找到了7 5 个n a c 蛋白。研究表 明n a c 转录因子在植物的生长发育、器官建成、激素调节、生物和非生物胁迫应答 等方面发挥重要作用。 1 3 1n a c 转录因子的结构特点及其分类 n a c 转录因子最主要的结构特点是各成员的n 端含有高度保守的n a c 结构域。 n a c 结构域由高度保守的大约1 5 0 个氨基酸残基组成，该区域可以结合d n a 和其 他蛋白( e m s te ta 1 ，2 0 0 4 ) 。两个n a c 蛋白能激活酵母中的c a m v 3 5 s 启动子重组体， 首先表明了n a c 蛋白的分子功能( s o u e re t a l ，1 9 9 6 ) 。此后的研究发现，三个拟南芥 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 n a c 蛋白( n a c l 、a t n a m 和a n a c 0 1 9 ) 和几个油菜n a c 蛋白也能结合c a m v3 5 s 启动子( x i ee ta 1 ，2 0 0 0 ；h e g e d u se ta 1 ，2 0 0 3 ；e r n s te ta 1 ，2 0 0 4 ) 。替代实验证明序列 c a c g 是启动子片段中被a n a c 蛋白识别的核心d n a 基序( t r a n e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。a d d i e 等( 2 0 0 5 ) 的研究表明，c g t g a 是n a c 蛋白保守结合位点的核心序列，c 口3 5 s 启动子中因有与保守序列同源的片段而与n a c 结构域结合。 e r n s t 等( 2 0 0 4 ) 禾t j 用x 射线结晶技术分析a n a c 0 1 9 的结构，第一次获得了n a c 蛋白的结构，发现n a c 结构域不含有经典的螺旋转角螺旋的结构，而是一种新的 转录因子折叠结构，即由几个螺旋环绕一个反向平行的p 折叠，n a c 结构域不含有 任何已知的结合d n a 的基序，但可通过一些作用如盐桥等形成有功能的n a c 蛋白 二聚体，该二聚体表面的一侧富含正电荷，可能与d n a 的结合有关( o l s e ne ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。 o o k a 等( 2 0 0 3 ) 在水稻全长c d n a 文库中找到7 5 个n a c 蛋白，而在拟南芥物种 预测基因中找到1 0 5 个，根据n a c 结合域的结构同源性比较，将这些预测的n a c 蛋白分成两大类( g r o u pi 和g r o u pi i ) ，1 8 个亚类。其中i 组分为1 4 个亚组，包 括t e r n 、o n a c 0 2 2 、s e n u 5 、n a p 、a t n a c 3 、a t a f 2 、o s n a c 3 、n a c 2 、a n a c 0 1 l 、 t i p 、o s n a c 8 、o s n a c 7 、n a c l 和n a m ，i i 组分为4 个亚组，分别是a n a c 0 0 l 、 o n a c 0 0 3 、o n a c 0 0l 和a n a c 0 6 3 。a n a c o1 l 、a tn a c 3 、a n a c 0 6 3 和a n a c 0 01 这4 个亚组完全由拟南芥n a c 转录因子构成，而o s n a c 3 和o n a c 0 0 1 亚组由单子 叶植物水稻和小麦的n a c 转录因子组成。 根据序列的同源性，n a c 结构域又可分为a 、b 、c 、d 和e 五个子域，其中e 子域约5 0 个氨基酸。子域a 、c 和d 序列高度保守，而b 和e 的氨基酸差异较大。 b 和e 子结构域在i i 组中不保守，而在i 组的n a p 、a t n a c 3 、a t a f 和o s n a c 3 亚组中保守。我们认为高度保守的a 子域，c 子域和d 子域主要参与d n a 的结合 作用。而含有相同子域c 或d 的n a c 亚类蛋白可能识别相同的顺式作用因子；另 一方面，b 和e 的序列差异可能导致n a c 在不同的发育阶段或不同组织发挥不同的 作用( 胡红红，2 0 0 6 ) 。 酵母及植物细胞实验都表明，n a c 蛋白的c 末端区为转录激活域( t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o nr e g i o n ) ( x i ee ta 1 ，2 0 0 0 ；h e g e d u se ta 1 ，2 0 0 3 ；t r a ne ta 1 ，2 0 0 4 ；f u j i t ae ta 1 ， 2 0 0 4 ；r o b e r t s o n ，2 0 0 4 ) 。n a c 蛋白c 末端区的一个共同特征就是频繁出现简单氨基 酸重复和富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸或酸性残基的区域( s o u e re ta 1 ，1 9 9 6 ； a i d ae ta 1 ，1 9 9 7 ；x i ee ta 1 ，1 9 9 9 ；h e g e d u se ta 1 ，2 0 0 3 ) ，该特征与序列的不保守性都是 植物激活结构域所具有的共同特征( l i ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 4 柑橘n a c 转录因子的克隆与表达分析 1 3 2n a c 转录因子的生物功能 1 3 2 1 营养器官和生殖器官的发育 n a c 基因家族最重要的生物学功能首先是由突变体的极端表型显现出来的。 s o u e r 等( 1 9 9 6 ) 在矮牵牛p e m n m x h y b r i d a ) 中发现一种h a m ( n oa p i c a lm e r i s t e m ) 突变 体，它不能正常形成茎尖分生组织s a m ( s h o o ta p i c a lm e r i s t e m ) ，而在实生苗阶段 死亡。在矮牵牛l l a m 突变体中，由于d t p h l 转座子插入6 个碱基，致使a 子结构域 中增加了2 个氨基酸，影响n 端洳螺旋的结构，从而造成n a m 蛋白功能丧失。这 些突变体实生苗的子叶发生融合，即使侥幸存活下来的植株，其花器发育也是异常 的。n a m 是最先被鉴定的n a c 基因，接着是拟南芥的c u c 2 ( c u p - s h a p e d c o t y l e d o n2 ) 基因( a i d ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。当c u c l 和c u c 2 同时突变时，子叶，萼 片和雄蕊融合，顶端分生组织难以形成，由突变愈伤再生而成的茎尖植物其花器也 是异常的。2 c a m , c u c l 和c u c 2 的突变表现型和表达方式表明，它们的产物在边 缘界定和s a m 形成过程中起作用( s o u c re ta 1 ，1 9 9 6 ；a i d ae ta 1 。1 9 9 7 ) 。拟南芥c u c 基因的全面研究进一步证明了n a c 蛋白在生长发育中起着重要作用( v r o e m e ne ta 1 ， 2 0 0 3 ；a i d ae ta 1 ，1 9 9 9 ；h i b a r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。c u c l 编码一个n a c 结构域蛋白，与 c u c 2 序列同源性较高。v r o e m e n 等( 2 0 0 3 ) 发现拟南芥的第三个n a c 基因c u c 3 与 子叶边缘和茎尖分生组织的形成有关。 人们在研究中发现，c u c l 和c u c 2 对s t m 在胚s a m 形成过程中的表达是必 须的( a i d ae ta 1 ，1 9 9 9 ；h i b a r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ，而且，c u c l 的过量表达能通过诱导s t m 大量表达而导致子叶的茎尖异位( h i b a r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。h i b a r a 等( 2 0 0 3 ) 研究了c u c l 与彳肼( a s y m m e t r i c l ) 、a s 2 间的遗传互作，后两者在s a m 形成中十分重要，结 果表明c u c l 可通过不依赖s t m 而被彳肼和a s 2 负控制的途径促进s a m 的形成。 w e i r 等( 2 0 0 4 ) 对金鱼草c u p ( c u p u l i f o r m i s ) 突变体的研究表明，c u p 蛋白参与了活体 器官边缘的建成，并与t c p ( t b l 、c y c 、p c f ) 结构域转录因子相互作用。 1 3 2 2 侧根形成和激素传导 拟南芥n a c l 基因在根尖和侧根萌发处大量表达，n a c l 位于t i r l ( t r a n s p o r t i n h i b i t o rr e s p o n s e l ) 下游，起到在促进侧根发生过程中转运生长素信号的作用， 过量表达n a c i 促进侧根发育，而反义表达n a c l 则抑制侧根发育。n a c l 基因的 表达水平和侧根数量上存在正相关( x i e e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。进一步的研究表明，n a c l 能特 定激活a i r 3 启动子( x i ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。v r o e m e n 等( 2 0 0 3 ) 认为c u c 3 也可能与侧根形 成有关。此外，h e 等( 2 0 0 5 ) 发现拟南芥a t n a c 2 基因受盐胁迫诱导，但它对盐胁 迫的响应需要乙烯和生长素信号，a t n a c 2 在根和花中能高度表达，超量表达a t n a c 2 的转基因植株表现为侧根增多。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 3 2 3 植物细胞次生壁的合成 z h o n g 等( 2 0 0 6 ) 和n o b u t a k a 等( 2 0 0 7 ) 的研究证实n a c 与植物的次生壁合成有关。 鼢国j 基因控制拟南芥中茎的次生壁合成，是其转录调控关键因子。超表达融旧j 能使纤维细胞中次生壁物质累积，敲除s n d l 基因不能明显抑制次级纤维壁的加厚， 可能存在其他因子补偿了s n d l 的作用；在对s n d l 的同源基因n s t l 的研究中发现， n s t l 、s n d l 和n s t l s n d l 的t - d n a 敲除与r n a 干扰突变体能抑制次生壁的生长，使 细胞中纤维素、木聚糖、木质素等成分含量降低，n s t l s n d l 双突变体受到的抑制效 应最明显，说明s n d l 和胚丌同时调控次生壁成分合成和次生壁的生长：研究证实 n s t 3 是次级细胞壁合成调控的关键基因，它在茎器官中维管束间纤维和木质部维管 束细胞中特异表达。 1 3 2 4 调控植物组织衰老 g u o 和g a n ( 2 0 0 6 ) 发现拟南芥n a c 转录因子a t n a p 与叶片的衰老有关，t - d n a 插入失活a t n a p 的2 个突变体叶片衰老延迟，野生型a t n a p 基因和水稻、豌豆的同 源基因能够恢复a t n a pn u l l 突变体的延迟表型，超量表达a t n a p 基因则造成早熟性 衰老。g u i l h e r m e 等( 2 0 0 9 ) 将大豆的基因g m n a c l 在烟草中做瞬时表达，发现烟草叶 片枯萎，g m n a c l 的转录受到一种细胞凋零诱导剂放线菌酮( c y c l o h e x i m i d e ) i 拘诱导， 说明g m n a c l 可能在细胞凋亡和组织衰老过程中发挥作用。u a u y 等( 2 0 0 6 ) 在研究小 麦时发现，n a m - b 1 加速植株衰老，促进叶片中的营养物质向发育中的籽粒流动，而 突变植株的成熟推迟了3 周，并且籽粒蛋白含量下降3 0 左右。 1 3 2 5 防御和非生物胁迫 n a c 蛋白在生物防御中的功能最初在马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m ) 中发现的， s t n a c 基因可以感应马铃薯晚疫病的侵染，油菜( b r a s s i c an a p u s ) 的一些n a c 基因可 以感应昆虫和真菌的侵染( h e g e d u se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。w a n g 等( 2 0 0 9 ) 发现受