（海洋生物学专业论文）对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果.pdf

对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 ff|!例irll圳l i，删wihmiihf|iirft l i y 18 2 8 5 8 9 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 学位论文完成日期： 2 q ! q ：主：2 鱼 指导教师签字：二凇 答辩委员会成员签字：一 i i 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 逵；垫遗直基丝盖墓挂剔虚盟的：奎拦豆窒2 或其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：敏防签字日期沙阳年占彤) 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期勘fo 年 毒0 晃 5 月g1 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： u l 导师签字： 签字日期：2 q 。年厅月拿6 日 电话： 邮编 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 对虾抗白斑综合征病毒益生茵的筛选及其作用效果 摘要 从上世纪六十年代以来，对虾养殖业在世界范围内得到了快速的发展，中 国的对虾养殖业在经历了1 9 9 3 年的锐减之后，经过政府、研究人员和养殖者等 多方的努力，又重新登上世界对虾养殖第一大国的位置。但是在这个辉煌业绩 的背后，也出现了诸多问题，如对虾质量严重退化、免疫力低、抗病力差、虾 病频发。虽然可以通过诸如改良种质、优化养殖技术等方式提高对虾的成活率， 但是增强对虾的免疫机能是最为有效的解决途径之一。益生菌能提高动物的免 疫机能，促进动物的健康，增强动物的抗病力。本实验分以下四个部分进行： 美人鱼发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u m 踱) 和坚强芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 对凡纳 滨对虾免疫活性和抗病力的影响的比较研究：在基础饲料中分别添加分离自健 康对虾肠道的美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌( 菌含量不少于1 0 nc f u g ) 的 活菌和破碎菌各l g k g ，制备成菌含量不少于1 0 8c f w g 的四组免疫饲料，做为 免疫实验组。 在本实验中，饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组凡纳滨对虾酸性磷酸 酶( a c p ) 、碱性磷酸酶( a k p ) 活性显著高于其他实验组和对照组( p 0 0 5 ) ； 5 d 、l o d 时饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组凡纳滨对虾血清中过氧化氢酶 ( c a t ) 的活性显著高于对照组( p 0 0 5 ) ，其他组差异不显著；饲料中添加益生菌 活菌和破碎菌的所有免疫组其究凡纳滨对虾超氧化物歧化酶( s o d ) 活性显著高 于对照组( p 0 0 5 ) ；饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组凡纳滨对虾溶菌酶显 著高于对照组( p o 0 5 ) ；饲 料中添加粘着剑菌免疫3 5 d 后，其感染w s s v 的免疫保护率最高为4 l 士2 5 ， 显著高于对照组( p o 0 5 ) 。实验结果表明饲料中添加粘着剑菌持续3 5 d 后，能在 一定程度上提高对虾的抗病力。 利用t a q m a nm g b 探针分别检测了免疫1 0 d 和2 5 d ，感染w s s v 的对虾体 内w s s v 变化情况，对照组在感染w s s v 后，其体内w s s v 的拷贝数变化呈 递增趋势，由1 0 3 递增到1 0 1 1 。其余免疫实验组w s s v 拷贝数均在1 0 2 1 0 7 范围 内波动。 美人鱼发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u ms p ) 和坚强芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 的培养 条件优化：本实验从不同碳源、碳源氮源的不同配比、无机盐成分的不同配比 及培养基初始p h 等方面进行了培养条件优化的研究，为美人鱼发光杆菌和坚强 芽胞杆菌的大规模工业化生产提供基础理论依据。 本实验的研究结果表明：美人鱼发光杆菌的最佳生长条件是：培养基初始p h 值为7 6 ；最佳碳源为葡萄糖；不同碳源氮源的优化：通过正交试验，初步确定 美人鱼发光杆菌的最优化碳源氮源成分为：葡萄糖o 5 ( w ) ，蛋白胨1 o ( w ) ，牛肉膏0 2 ( w ) ，酵母膏o 5 ( w ) ；不同无机盐的优化：通过 正交试验，初步确定坚强芽孢杆菌的最优无机盐成分为：柠檬酸三钠1 0 o ( w v ) ，k 2 h p 0 40 6 o ( w v ) ，k h 2 p 0 40 1 o ( w v ) ，m g s 0 4o 8 o ( w v ) 。 坚强芽孢杆菌的最佳生长条件是：培养基初始p h 值为6 0 ；最佳碳源为蔗 糖；不同碳源氮源的优化：通过正交试验，初步确定坚强芽孢杆菌的最优化碳 源氮源培养基为：蔗糖0 5 ( 哪，蛋白胨1 0 ( w ) ，牛肉膏0 5 m w ) ， 酵母膏0 1 ( w ) ；不同无机盐的优化：通过正交试验，初步确定坚强芽孢杆 菌的最优化无机盐培养基为：柠檬酸三钠o 7 o ( w v ) ，k 2 h p 0 41 0 o ( w v ) ， k h 2 p 0 40 4 o ( w v ) ，m g s 0 40 2 o ( w v ) 。 v 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 美人鱼发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u m 删和坚强芽孢杆菌( b a c i l l u s 训在中国对 虾肠道中定植效果的比较：在基础饲料中分别添加分离自健康对虾肠道的美人 鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌( 菌含量不少于1 0 1 1c f u g ) 的活菌和破碎菌各 l g k g ，制备成菌含量不少于1 0 8c f u g 的四组免疫饲料，做为免疫实验组。免疫 实验l o d 后，对其肠道细菌进行分离培养，并进行1 6 sr r n a 测序、鉴定，研究 不同时间内这株益生菌对虾肠道内定植的情况。 在本实验中，饲料中添加美人鱼发光杆菌的免疫组，通过对凡纳滨对虾免 疫l o d 后肠道优势菌进行分离培养，并进行1 6 sr i a 测序、鉴定，结果为假单 胞菌属( 1 5x 1 0 8c f u g ) ，与假单胞菌属比对( g e n b a n k a c c e s s i o n n o g u 3 9 6 2 8 7 ) ， 相似度为1 0 0 ，占肠道细菌总数的8 0 ；饲料中添加坚强芽孢杆菌的免疫组， 鉴定结果为坚强芽孢杆菌( 2 6 7x 1 0 8c f u g ) ，与坚强芽孢杆菌比对( g e n b a n k a c c e s s i o nn o g u 8 2 6 1 6 5 ) ，相似度为1 0 0 ，占肠道细菌总数的7 6 2 ；c 组对照 组，鉴定结果为弧菌属( 4x 1 0 8c f u g ) ，与弧菌属比对( g e n b a n k a c c e s s i o nn o g q 4 0 6 7 5 9 ) ，相似度为9 9 ，占肠道细菌总数的7 0 6 。 关键词：益生菌；凡纳滨对虾；非特异。l 生免疫；w s s v v l 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 v i i 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 t h es c r e e na n de v a l u a t i o no ft h ep r o b i o t i c so fr e s i s t a n c et o s h r i m pw h i t es p o ts y n d r o m ev i r u s a b s t r a c t s i n c e19 6 0 s ，s h r i m pc u l t u r eh a ss h o w nt ob et h ef a s t e s tg r o w i n gs e c t i o ni n a q u a c u l t u r ei n d u s t r y w h i l es h r i m pc u l t u r ee x p e r i e n c e das h a r pd r o pi n19 9 3 ，w i t h t h eg o v e r n m e n t ，r e s e a r c h e r sa n df a r m e r s sh e l p ，t h es h r i m pc u l t u r eo fc h i n ao n c e a g a i no nt h ew o r l ds h r i m pf a r m i n gs u p e r p o w e rp o s i t i o n h o w e v e r ，i nt h eb r i l l i a n t a c h i e v e m e n t sb e h i n d ，t h e r eh a v eb e e nm a n yp r o b l e m s ：s e r i o u sd e g r a d a t i o no fq u a l i t y s u c ha ss h r i m p ，l o wi m m u n i t y ，p o o rd i s e a s er e s i s t a n c e ，f r e q u e n c yo fs h r i m pd i s e a s e a l t h o u g h ，s u c ha si m p r o v e dg e r m p l a s mc a no p t i m i z et h ew a y o f f a r m i n gt e c h n o l o g y t oi m p r o v et h es u r v i v a lr a t eo fs h r i m p ，b u ts h r i m pe n h a n c e dt h ei m m u n ef u n c t i o ni s o n eo ft h em o s te f f e c t i v es o l u t i o n p r o b i o t i c sc a l le n h a n c ei m m u n ef u n c t i o no f a n i m a l s ，p r o m o t ea n i m a lh e a l t h ，e n h a n c ed i s e a s er e s i s t a n c eo f a n i m a l s t h e e x p e r i m e n tw a sd i v i d e di n t of o u rp a r t s ： t h e s t u d y o f s h r i m p i m m u n e a c t i v i t y a n dd i s e a s er e s i s t a n c eo f p h o t o b a c t e r i u ms p a n db a c i l l u sm ：t h ep h o t o b a c t e r i u ms p a n db a c i l l u ss p ：i nt h e b a s i cd i e t sw e r ei s o l a t e df r o mt h ei n t e s t i n eo fh e a l t h ys h r i m p ( b a c t e r i ac o n t e n to fn o t l e s st h a n10 c f u g ) o fv i a b l eb a c t e r i aa n du l t r a s o n i c a t i o nt h exg k g b a c t e r i a c o n t e n tw a sp r e p a r e dn o tl e s st h a n10 5c f u go ff o u ri m m u n ef e e da st h ei m m u n e e x p e r i m e n t a lg r o u p i nt h i se x p e r i m e n t ，d i e t a r yb a c i l l u ss p o fs h r i m pa c i dp h o s p h a t a s e ( a c p ) ， a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a k p ) a c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h eo t h e r e x p e r i m e n t a lg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) ；5 d ，lo dt h ed i e t a r yb a c i l l u ss p o f s h r i m pi m m u n es e r u l t lc a t a l a s e ( c a t ) a c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( p 0 0 5 ) ， o t h e rg r o u p sw a sn o ts i g n i f i c a n t ；a l lt h ei m m u n eg r o u pv a n n a m e i ss u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) a c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( p o 0 5 ) ；b a c i l l u ss p i m m u n e g r o u ps h r i m pl y s o z y m ew a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( p o 0 5 ) i n t h i se x p e r i m e n t ， 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 p h o t o b a c t e r i u ms p u l t r a s o n i c a t i o ng r o u po fa n t i w s s vi m m u n es u r v i v a l ( o 4 94 - o 15 ) w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( p 0 0 5 ) ；t h ei m m u n ep r o t e c t i o no fw s s v i n f e c t i o nr a t eo f e n s i f e ，| 印u pt o4 1 4 - 2 5 i ni m m u n e3 5 d a y s ，w h i c hi s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i e t c o n t a i n i n ge n s f e 厂s p f o r3 5 di m m u n ec a nr a i s es h r i m pi nac e r t a i nd e g r e eo f r e s i s t a n c et od i s e a s e a f t e r10 da n d2 5 di m m u n ee x p e r i m e n t ，w s s vw e r ed e t e c t e du s i n gt a q m a nm g bp r o b e w s s vc o p yn u m b e rc h a n g e ss h o w e da ni n c r e a s i n gt r e n di nt h ec o n t r o lg r o u p ，i n c r e a s e df r o m10 t o10 1 1 i no t h e ri m m u n eg r o u p s ，w s s vc o p yn u m b e ro ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw e r ei nt h e 1 0 2 1 0 7r a n g e t h eo p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n so fp h o t o b a c t e r i u ms p a n db a c i l l u s 跟：i nt h i ss t u d y , t h eo p t i m i z a t i o no f c u l t u r ec o n d i t i o n sf r o md i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e s ， n i t r o g e ns o u r c e so fd i f f e r e n tr a t i oo fc a r b o n ，i n o r g a n i cs a l tc o m p o n e n ta n dt h ei n i t i a l m e d i u mp h ，p r o v i d et h eb a s i sf o rt h e o r yo fp h o t o b a c t e r i u ms p a n db a c i l l u ss p 1 a r g e s c a l ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n r x t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wp h o t o b a c t e r i u ms p b e s tg r o w t hc o n d i t i o n s ： i n i t i a lm e d i u mp hv a l u eo f7 6 ；t h eb e s tc a r b o ns o u r c ei sg l u c o s e ；b yo r t h o g o n a l t e s t ，t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n so fp h o t o b a c t e r i u ms p w a si n i t i a l l yi d e n t i f i e da s ： g l u c o s eo 5 ( w v ) ，p e p t o n e1 0 ( w v ) ，b e e fe x t r a c t0 2 ( w v ) ，y e a s t e x t r a c t0 5 ( w v ) ；s o d i u mc i t r a t e1 0 o ( w v ) ，k 2 h p 0 40 6 o ( w v ) ， k h 2 p 0 4o 1 o ( w v ) ，m g s 0 40 8 o ( w v ) b a c i l l u ss p b e s tg r o w t h c o n d i t i o n s ： i n i t i a lm e d i u mp hv a l u eo f6 0 ；t h eb e s tc a r b o ns o l l r c ei ss u c r o s e ；b yo r t h o g o n a l t e s t ，t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n so fb a c i l l u ss p w a si n i t i a l l yi d e n t i f i e da s ：s u c r o s e 0 5 ( w v ) ，p e p t o n e1 o ( w v ) ，b e e fe x t r a c t0 5 ( w v ) ，y e a s te x t r a c t0 1 ( w v ) s o d i u mc i t r a t e0 7 o ( w v ) ，k 2 h p 0 41 0 o ( w v ) ，k h 2 p 0 40 4 o ( w v ) ，m g s 0 40 2 o ( w v ) t h ee f f e c to fp h o t o b a c t e r i u ms p a n db a c i l l u ss p c o l o n i z a t i o no ft h eg u ti n f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ：t h ep h o t o b a c t e r i u ms p a n db a c i l l u ss p ：i nt h e b a s i c d i e t sw e r ei s o l a t e df r o mt h ei n t e s t i n eo fh e a l t h ys h r i m p ( b a c t e r i ac o n t e n to fn o tl e s s t h a n10 1 1 c f u g 、o flg k g b a c t e r i ac o n t e n tw a sp r e p a r e d n o tl e s st h a n1 0 9c f u g o ff o u ri m m u n ef e e da s t h ei m m u n ee x p e r i m e n t a lg r o u p a f t e r 10 di m m u n e e x p e r i m e n t ，i s o l a t ea n dc u l t u r e dt h ei n t e s t i n a lb a c t e r i a ，a n df o r 16 sr r n as e q u e n c i n g ， i d e n t i f i c a t i o nt h ed i f f e r e n ts t r a i n so fp r o b i o t i c sw i t h i nt h ei n t e s t i n a lc o l o n i z a t i o no f s h r i m pc a s e i nt h i se x p e r i m e n t ，a f t e r10 d ，t h ei n t e s t i n a lb a c t e r i u mo fp h o t o b a c t e r i u ms p i m m u n eg r o u pi d e n t i f i c a t i o nw e r ep s e u d o m o n a ss p ( 1 5x l0 8c f u g ) ，c o m p a r e dw i t h p s e u d o m o n a ss p ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o g u 3 9 6 2 8 7 ) ，i d e n t i t yo f 10 0 ， a c c o u n t i n g f o r8 0 o ft h et o t a ln u m b e ro fi n t e s t i n a lb a c t e r i a t h e i n t e s t i n a l b a c t e r i u mo fb a c i l l u ss p i m m u n eg r o u pi d e n t i f i c a t i o nw e r eb a c i l l u ss p ( 2 6 7x 10 8 c f u g ) ，c o m p a r e dw i t hb a c i l l u ss p ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o g u 8 2 6 16 5 ) ，i d e n t i t yo f 10 0 a c c o u n t i n gf o r 也et o t a ln u m b e ro fi n t e s t i n a lb a c t e r i a7 6 2 t h ei n t e s t i n a l b a c t e r i u mo fc o n t r o lg r o u pi d e n t i f i c a t i o nw e r ev i b r i os p ( 4x l0 8c f u g ) ，c o m p a r e d w i t hv i b r i os p ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o g q 4 0 6 7 5 9 ) ，a c c o u n t i n gf o r7 0 6 o ft h e x 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 t o t a ln u m b e ro fi n t e s t i n a lb a c t e r i a k e yw o r d s ：p r o b i o t i c s ；v a n n a m e i ；n o n - s p e c i f i ci m m u n i t y ；w s s v x i 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 目录 o 前言3 1对虾的免疫机能的研究概况3 1 1 对虾的细胞免疫3 1 2 对虾的体液免疫6 1 3 小结8 参考文献8 2 益生菌对水产动物的作用研究进展1 l 2 1益生菌作用机理1 2 2 2 益生菌在宿主肠道中的定植1 4 2 3检测益生菌定植常用的方法：1 4 2 4 展望17 参考文献1 7 第一章美人鱼发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u ms p ) 和坚强芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 对 凡纳滨对虾免疫活性和抗病力的影响的比较研究2 1 1 1 材料与方法2 2 1 1 1实验对虾2 2 1 1 2 实验饲料2 2 1 1 3 实验分组2 4 1 1 4 对虾非特异性免疫指标的测定2 4 1 1 5 w s s v 感染实验2 6 1 1 6 统计分析。2 6 1 2结果2 6 1 2 1 对虾血清免疫酶活性2 6 1 2 2w s s v 感染后凡纳滨对虾存活率3 2 1 3 讨论3 4 1 3 1 美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌对凡纳滨对虾非特异性免疫 活性影响的比较3 4 1 3 2 美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌对凡纳滨对虾抗w s s v 病 毒影响的比较3 5 1 4 结论3 6 参考文献3 6 第二章2 株消化道共生菌对凡纳滨对虾抗w s s v 感染能力的影响及最佳作 用时间的研究4 0 2 1 材料与方法4 l 2 1 1实验对虾4 l 2 1 2 实验饲料4 1 2 1 3 实验分组。4 l 2 1 4 病毒感染实验4 2 2 1 5 病毒定量检测4 2 2 2 结果4 2 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 2 2 1 对虾感染w s s v 免疫保护率4 2 2 2 2 对虾感染w s s v 累计死亡率4 3 2 2 3w s s vt a q m a nr e a l t i m ep c r 4 4 2 3讨论4 6 2 4 小结4 8 参考文献4 8 第三章美人鱼发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u m 踞) 和坚强芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 培 养条件的优化5 0 3 1 材料与方法5 1 3 1 1 种子液的制备51 3 1 2 种子培养基5 1 3 1 3 菌体产量的测定5 1 3 1 4 培养条件优化5 】 3 2结果5 2 3 2 1不同的碳源对细菌生长的影响5 2 3 2 2 碳源氮源的不同配比对细菌生长的影响5 4 3 2 3 无机盐成分的不同配比对细菌生长的影响5 7 3 2 4 培养基初始p h 对细菌生长的影响6 0 3 3小结6 l 3 3 1美人鱼发光杆菌的最优生长条件6 1 3 3 2 坚强芽孢杆菌的最优生长条件6 2 参考文献6 2 第四章美人鱼发光杆菌和坚强芽孢杆菌在中国对虾肠道中定植效果的比较 6 ：； 4 1 材料与方法6 4 4 1 1实验对虾。6 4 4 1 2 实验饲料，6 4 4 1 3 实验分组6 4 4 1 4 样品采集6 4 4 1 5 样品处理6 4 4 2 结果6 7 4 2 1 细菌计数及优势菌的分离6 7 4 2 2 菌落p c r 电泳结果6 8 4 2 3 肠道优势菌鉴定结果6 9 4 3 讨论7 7 4 4小结7 8 参考文献7 8 使用试剂的配制8 1 硕士研究生期间已发表的文章8 3 致谢一8 4 2 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 【) 日i j 舌 1对虾的免疫机能的研究概况 对虾等甲壳类动物，在长期生命进化过程中形成了独有的免疫系统，主要 以非特异性免疫( n o n - s p e c i f i ci m m u n i t v ) 为主。非特异性免疫是指生物在长期进 化过程中形成的、属于先天所有、相对稳定、无特殊的抵抗病原体的天然抵抗 能力。不具有b 细胞、t 细胞、免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) 、主要组织相 容性复合物( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 等，缺乏抗体介导的免 疫反应，其免疫反应不同于脊椎动物，主要依靠包括血细胞的吞噬作用、结节 形成和包囊作用的细胞免疫和血淋巴中的一些酶或因子杀菌、抗菌的体液免疫 来实现免疫防御，对外来刺激能够迅速反应，快速控制病原体的增殖。实际上， 在甲壳动物中两者密切相关，如体液因子可在血细胞中合成并释放出来，细胞 免疫又受体液因子的介导和影响等。 细胞免疫指由血细胞直接参与的免疫反应，血细胞会通过吞噬作用清除进 入血淋巴中小的病原；当入侵的病原体或寄生虫的个体较大或者较多时，则主 要进行多个血细胞的包囊或结节作用。体液免疫主要指血淋巴中的一些酶和调 节因子，如酚氧化酶原激活系统、溶血素、凝集素、溶菌酶、蛋白酶抑制剂等。 1 1 对虾的细胞免疫 虾类具有开放式血液循环，在防止外来病原微生物入侵时能够建立正确快 速的诱导防卫机制。血细胞在此诱导机制中起重要作用。 1 1 1 血细胞分类 按形态学分类，血细胞分为透明细胞( h y a l i n ec e l l ) 、半颗粒细胞 ( s e m i g r a n u l a rc e l l ) 和颗粒细胞( g r a n u l a rc e l l ) 。根据血细胞颗粒的有无及其大小、 染色、核质比等将其分为3 类，即大颗粒细胞( 1 a r g eg r a n u l a rh a e m o c y t e ，l g h ) 、 小颗粒细胞( s m a l lg r a n u l a rh a e m o c y t e ，s g h ) 和透明细胞( h y a l i n ec e l l ，h c ) 。但 由于不同的学者选用不同的材料，采用不同的方法，又根据不同的特点进行分 类和描述，因此目前对甲壳动物血细胞的分类众说纷纭，尚无定论【6 j 。 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 s a w y e r 等将蓝蟹( c a l l i n e c t e ss a p i d u s ) g 细胞分为4 类：无颗粒透明细胞 ( h y a l i n ec e l l s 埘ml a c k i n gg r a n u l e s ) 、细颗粒透明细胞( h y a l i n ec e llsw i t hf i n e g r a n u l e s ) 、细颗粒颗粒细胞( f i n e l yg r a n u l a rg r a n u l o c y t e s ) 和粗颗粒颗粒细胞 ( c o a r s e l yg r a n u l a rg r a n u l o e y t e s ) t 7 1 。b o d a m m e r 将蓝蟹( c a l l i n e c t e ss 印砌牺) 的血细 胞分为3 类：透明细胞( h y a l i n ec e l l ) 、半颗粒细胞( s e m i g r a n u l a rc e l l ) 和颗粒细 胞( g r a n u l a rc e l l ) 。透明细胞不含或仅含少量的小颗粒；半颗粒细胞含有数量适 中的小颗粒；颗粒细胞含有大量的大颗粒【8 1 。m a r t i n e 9 1 、李光友【l o 】等在研究了 两种单肢虾( s i c y o n i ai n g e n t i s 、p e n a e u sc a l i f o r n i e n s i s ) 和中国对虾( p e n a e u s c h i n e n s i s ) 的血细胞后将其分为无颗粒细胞( a g r a n u l a r ) 、小颗粒细胞 ( s m a l l - g r a n u l eh o m o c y t e s ) 和大颗粒细胞( 1a r g e - g r a n u l eh o m o e y t e s ) 。 1 1 2 血细胞功能 血细胞具有炎症性细胞的作用，如吞噬、凝集、产生活性氧和释放杀菌蛋 白，在免疫防御中起着十分重要的作用。然而，不同种类以及同种甲壳类的不 同类型血细胞免疫防御作用有较大的差异。血细胞会通过吞噬作用清除进入血 淋巴中小的病原；当入侵的病原体或寄生虫的个体较大或者较多时，则主要进 行多个血细胞的包囊或结节作用。 1 1 2 1 吞噬作用( p h a g o c y t o s i s ) 吞噬作用在动物界中普遍存在，是血淋巴细胞清除较小致病微生物的最主 要的方法。血细胞通过吞噬作用吞入病原体形成吞噬泡，释放降解酶到吞噬泡 中后产生活性氧，在细胞内部杀灭病原体。整个吞噬过程包括：异物的识别、 粘连、聚集、摄入、清除等。对异物的识别可能是由该物质的表面性质和血细 胞膜上的受体共同决定的；粘连则可能是由血细胞分泌的一种血细胞附着因子 介导的；血细胞与异物粘连后相互聚集而形成细胞团，随即对异物进行摄入和 清除。刘晓云利用透射电子显微镜观察中国对虾类淋巴其结构发现，小颗粒细 胞具有吞噬功能：无颗粒细胞又可分为巨噬细胞样无颗粒细胞和淋巴细胞样无 颗粒细胞，前者具有很强的吞噬能力，而后者在受到抗原刺激时，可表现出类 似浆细胞样分化的细胞特征【1 1 1 。 吞噬作用的杀菌机制可分为氧化性杀菌和非氧化性杀菌机制。氧化性杀菌 4 对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果 机制是指吞噬过程中伴有呼吸爆发现象出现，产生具有强大的杀灭微生物活性 的活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ；r e a c t i v eo x y g e ni n t e r m e d i a t e s ，r o i s ) 。 非氧化性杀菌机制主要以溶菌酶等为主，溶酶体酶的水解作用是动物免疫系统 攻击异物的一种重要机制。溶菌酶具有明显的杀菌作用并且在甲壳动物体内广 泛存在，由于其在非特异性免疫中具有重要作用而日渐受到研究者的重视。 1 1 2 2 包囊作用( e n c a p s u l a t i o n ) 甲壳动物机体首先将外来物质隔离，若异物颗粒直径超过1 0 1 x m 时( 如某些 真菌、寄生虫等) ，则不能通过单个细胞的吞噬作用摄入，而是在其周围包被 数层成纤维细胞而形成包囊，构成包囊的细胞之间形成致密的纤维状连接，可 以起到防止被包围的入侵物逃逸的作用。随之发生黑化作用，并最终杀死或修复 很大的伤口。邓欢等研究表明：包囊产生于多种器官和组织，形成包囊的血细 胞失去游离状态并相互连接，细胞器趋于退化，r n