（预防兽医学专业论文）基于特异性重组受体的牛IFNγ检测的研究.pdf

摘要 干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 是在特定诱生剂的作用下，由细胞产生的一种具有高度生物活性 的糖蛋白，在同种动物细胞上具有免疫调控和抗病毒活性。内源性i f n 吖水平的高低在很大程度 上可以反映机体的细胞免疫状态。i f n y 定量分析技术，对免疫学基础研究，以及结核杆菌和 布氏杆菌等多种胞内病原感染的诊断，具有高度特异、敏感的突出优势，应用前景广阔。 本实验中首先构建了牛l f n 吖受体含信号肽胞外区片段的真核表达质粒，瞬时转染哺乳动物 细胞2 9 3 t 细胞，以重组杆状病毒表达牛的i f n - t 为配体，包被e l i s a 板进行亲和能力检测，结 果证明，哺乳动物细胞重组表达牛i f n - y 受体片段表达产物能够分泌到细胞上清中，并与牛的 1 f n 一丫具有良好的亲和反应能力。进一步构建了分别表达牛i f n y 受体胞外区片段和跨膜一胞内 区片段的原核表达质粒，转化宿主菌b l 2 1 ，经i p t g 诱导，s d s p a g e 和w e s t e m b l o t t i n g 证实 目的蛋白分别获得成功表达。表达的受体蚩白经过g l u t a t h i o n es e p h a r o s e4 b 亲和层析获得纯化。 在此基础上，利用纯化的重组表达牛i f n - y 受体胞外区片段和跨膜一胞内区片段替代传统的双夹 心e l i s a 技术中的包被抗体( 单抗) ，建立了牛l f n 吖干扰素的双夹心e l i s a 定量检测方法， 并对有关反应条件进行了系统优化。重组受体与其他多种细胞因子反应均为阴性，显示出良好的 特异性。使用方法检测人肠杆菌原核表达系统表达的牛i f n 吖，受体胞外区重组蛋白和跨膜一胞 内区重组蛋白定量标准曲线的线性回归系数分别为0 9 6 8 3 和0 9 7 2 2 ，敏感性可以达到 4 0 6 5 n g m l ；用丁检测重组杆状病毒表达牛i f n 吖，受体胞外区重组蛋白和1 跨膜一胞内区重组蛋 白定量标准曲线的线性同归系数分别为0 9 6 5 6 和0 9 8 2 0 ，检测的敏感性可达1 0 抗病毒活性单位 ( i u ) 0 1 m l 。作为对照，美国a d l 公司生产的商品化的牛i f n 7 e l i s a 检测试剂盒检测重组杆 状病毒表达牛i f n - t ，敏感性为8 0i u 0 1 m l 。 本研究结果表明，重组表达牛i f n 吖的受体具有良好的特异亲和性，用于替代传统双夹心 e l i s a 技术中的包被抗体( 单抗) ，建立的牛i f n - 7 的双夹心e l i s a 定量检测方法，具有良好的 敏感性和特异性方法，与传统抗体( 单抗) 包被双夹心e l l s a 相比，具有制备简便、成本低廉的 优势。以受体亲和力原理建立的i f n y 干扰素检测方法，也为其它细胞因子的检测技术开辟了新 思路。 关键词：牛i f n 一1 ，受体，重组，双夹心e l i s a ab s t r a c t i n t e r f e r o n ( i f n ) ，g e n e r a t e db ys p e c i f i cc e l l si n d u c e db yi n d u c e r , i sak i n do fg l y c o p r o t e i nt h a t p o s s e s s e sh i g hb i o a c t i v i t ya n db r o a d s p e c t r u ma n t i v i r a la c t i v i t yo nt h eh o m o g e n e i t ya n i m a lc e l l s t h e q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fe n d o g e n o u si f n 吖c o n c e n t r a t i o n sh a s v e r ys i g n i f i c a n tv a l u ei n i m m u n o l o g i c a lb a s i s ；h a sh i g hs p e c i f i c 、s e n c e i t i v ea d v a n t a g ea n dw i d ep r o s p e c t so ni n t r a c e l l u l a r p a t h o g e nd i a g l o s i ss u c ha sm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sa n db r u c e l l a w ec o n s t r u c t e de u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i di n c l u d e st h ee x t r a c e l l u l e rr e g i o na n ds i g n a lp e p t i d e i tw a st r a n s f e c t e di n t o2 9 3 tc e l l st oc a r r yo u tt r a n s i e n te x p r e s s i o n t h ec e l ls u p e m a t a n tw a sc o a t e dt o t h ee l i s ap l a t ea n dt e s t e dt h ea f f i n i t yt ob o i f n 一丫b ye l i s a t h er e s u l t sw e r ec o n f i r m e dt h a tt h e i n t e r e s t i n gp r o t e i nw a se x p r e s s e di n2 9 3 tc e l l sa n dt h em a t u r ep r o t e i nw a ss e c r e t e do u to fc e l l sb ys i g n a l p e p t i d e sa n dt h ea f f i n i t yt ob o l f n 吖i sv e r yg o o d w ec o n s t r u c t e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d sw e r e c o n s t r u c t e d ，r e s p e c t i v e l y , t h ep l a s m i d si n c l u d et h ee x t r a c e l l u l e rr e g i o nw i t h o u ts i g n a lp e p t i d ea n dt h e t r a n s m e m b r a n ed o m a i na n di n t r a c e l l u l a rr e g i o n ，t h e nt r a n s f o r m e di n t oh o s tb a c t e r i ab l 2l t h a tw e r et h e n i n d u c e db yi p t g s d s - p a g ea n dw e s t e r n b l o a i n gw e r ec a r r i e dt oa s s u r et h a tt h ei n t e r e s t i n gp r o t e i n s w e r ee x p r e s s e d t h ep r o t e i n sw e r ep u r i f i e db yg l u t a t h i o n es e p h a r o s e4 b a n do nt h eb a s i s ，w eu s et h e a f f i n i t yb e t w e e ni f na n dr e c e p t o r si n s t e a do ft h es p e c i f i c i t yb i n d i n go fa n t i g e na n da n t i b o d y a n d e s t a b l i s hac a p t u r ee n z y m e l i n k e di m m u n os o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) f o rd e t e c t i o no fb o v i n ei f n ya n d o p t i m i z e dt h ec o n d i t i o n s t h er e c o m b i n a t ep r o t e i nd i d n tr e a c t i o nw i t ho t h e rc y t o k i n e s 。t h a ti s 。t h e y h a v eh i g hs p e c i f i ca d v a n t a g e w eu s e dt h eq u a n t i t a t e db o v i n ei f n 丫w h i c hw a s e x p r e s s e df r o mb a c t e r i a b l 21a st h es t a n d a r dp r e p a r a t i o n ，a n dd r a wt h es t a n d a r dc u r v eo fq u a n t i t y t h el i n e a r r e g r e s s i o n c o e f f i c i e n to ft h er e c o m b i n a t ep r o t e i no fe x t r a c ，1 l u a rr e g i o na n dt h et r a n s m e m b r a n c ed o m a i na n d i n t r a n c e l l u a rr e g i o nw e r eo 9 6 8 3a n d0 9 7 2 2 t h es e n s i t i v i t yv a l u eo fb o v i n ei f n - yw a s4 0 6 5 n j m l t h ea n t i v i r a la c t i v i t i e so fb o v i n ei f n 吖w h i c hw a se x p r e s s e df r o mr e c o m b i n a n tb a c u l o v i r u si ns f 9c e l l s w a sm e a s u r e d ，a n dt h eb o v i n ei f n 吖w a su s e da st h es t a n d a r dp r e p a r a t i o n ，a n dd r a wt h es t a n d a r dc u r v e o fa n t i v i r a la c t i v i t i e s t h el i n e a rr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n to ft h er e c o m b i n a t ep r o t e i no fe x t r a c e l l u a rr e g i o n a n dt h et r a n s m e m b r a n c ed o m a i na n di n t r a n c e l l u a rr e g i o nw e r e0 9 6 5 6a n d0 9 8 2 0 t h es e n s i t i v i t yv a l u e o f b o v i n ei f n - 7w a s1o i u o 1ml a sc o n t r o l ，w ed e t e c t e dt h eb o v i n ei f n 丫w h i c hw a se x p r e s s e df r o m r e c o m b i n a n tb a c u l o v i r u si ns f 9c e l l sw i t ht h ec o m m e r c i a le l i s ak i to f b o v i n ei f n - 7o f a m e r c i a na d l ， t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es e n s i t i v i t yv a l u eo f b o v i n ei f n 一丫w a s8 0 i u 0 1m l o u rs t u d ys h o w st h a tt h er e c o m b i n a t ep r o t e i nh a ss p e c i f i c 、h i g ha f f i n i t ya d v a n t a g e w ee s t a b li s h e d t h eq u a n t i t a t i v ec a p t u r ee l i s aw h i c hu s e st h er e c o m b i n a t ep r o t e i na sc a p t u r ea n t i b o d yi n s t e a do ft h e c o n v e n t i o n a lc a p t u r ea n t i b o d y c o m p a r ew i t ht h ec o n v e n t i o n a lc a p t u r ee l l s a ，o u rd e t e c t i o nh a st h e a s c e n d a n c yo fc o n v e n i e n ta n dl o wp r i c e m o r e o v e r ，t h ed e t e c t i o nw h i c hb a s e do nt h ea f f i n i t yo ft h er e c e p t o r g i v e san e ww a yt od e t e c to t h e rc y t o k i n e s k e yw o o d s ：b o l f n 一 r r e c e p t o r r e c o m b i n a t e c a p t u r ee l l s a l i i f n b o l f n - , i f n - r p c r i p r g s d s p a g e k d a e l i s a v s v g f p m d b k i u a p c m h c n k d n a r n a j a t s t a t a t p i l m c a b a m p l b e d t a d t t s k l p b s p e g d m e m h r p d m s o b s a 英文缩略表 i n t e r f e r o n 干扰素 b o v i n ei n t e r f e r o n g a m m a 牛y 干扰素 i n t e r f e r o n g a m m ar e c e p t o r y 干扰素受体 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 i s o p r o p y p d - t h i o g a l a c t o s i d e异丙基1 3d 硫代半乳糖苷 s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h e r e s i s 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 k i l o d a l t o n 千道尔顿 e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附测定 v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s 水泡性口炎病毒 g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n绿色荧光蛋白 m a d i n d a r b yb o v i n ek i d n e y ( c e l l s ) 马一达氏牛肾( 细胞) i n t e r n a t i o n a lu n i t国际单位 a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l 抗原递呈细胞 m a j o rh i s t o c o m p a b i l i t yc o m p l e x 主要组织相容性( 抗原) 复合物 n a t u r a lk i l l e rc e l l自然杀伤细胞 d e o x v r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 r i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 j a n u sk i n a s e门神激酶 s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n 信号传导和转录激活冈子 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e三磷酸腺苷 i n t e r l e u k i n白细胞介素 m o n o c l o n a la n t i b o d y单克隆抗体 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 l u r i a b e r t a n il b 液体培养基 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 d l d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 s o d i u ml a u r o y l s a r c o s i n e十二烷基肌胺酸钠 p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n 磷酸盐缓冲溶液 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m达尔伯克改良伊格尔培养液 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e辣根过氧化酶 d i m e t h y ls u l p h o x i d e 二甲基亚砜 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋 v d a b 3 , 3 - d i a m i n o b e n z i d i n e n cn i t r o c e l l u l o s e p f u p l a q u ef o r m i n gu n i t r n a s e a o p d 二氨基联苯胺 硝酸纤维素 蚀斑形成单位 r n a 酶a 联苯二胺 独创性：声明 本入声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 荡荡 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农 业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用 不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容- 0 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：b , - j i 自j ；m ：年rf6b 导师签名： 寺形乏可哼萨：名 年月日 中罔农业科学院顺f 学位论迂 第一幸绪论 第一章绪论 1 1 干扰素- 丫的研究进展 干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 是在特定的诱生剂刺激f ，由细胞产生的一类具有高度生物活性的 糖蚩白，在同种动物细胞上具有广谱抗病毒活性，除此之外还有免疫调节、抑制细胞分裂和抗肿 瘤等生物学活性。1 9 5 7 年，l s a a c s 和l i n d e n m a n n 利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时，发 现病毒感染细胞时细胞产生一种能干扰其它病毒复制的细胞因子，命名为干扰素。目前所知， 所有哺乳动物和大多数禽类均能产生干扰素。i f n 基因序列的研究结果表明，该序列早在5 1 0 亿 年前就存在于生命细胞的基因序列中( r o b e r t sr m ，1 9 9 8 ) 。根据i f n 蛋白的氨基酸序列、细胞来 源以及它们所结合受体的不同，将其分为i 型和j i 型i f n 。i 型i f n 常分为q 、1 3 两个亚型，分 别由白细胞和成纤维细胞产生，它们作用于同一受体，可抑制病毒d n a 复制和蛋白质合成，活 化n k 细胞，促进m h ci 类分子提呈抗原；i i 型i f n ，即i f n y ，又称为免疫i f n ，主要由c d 4 一、 c d 8 + t 细胞以及n k 细胞产生，它除了具有抗病毒，抗肿瘤活性外，更重要的是它还具有促进 m h c i i 类抗原的表达，增强抗原提呈细胞( a p c ) 与t 细胞的相互作用，增强辅助t 细胞和细 胞毒性t 细胞产生的能力等诸多免疫调节活性。 下文就i f n 吖的分子结构，合成及其调控，主要生物活性及其作用机制，在临床和研究中的 应用作以综述。 1 1 1i f n - - v 理化特性及分子结构 i f n 是一类糖蛋白，分子量约为2 0 1 0 0 k d a ，沉降系数低，1 l o5 9 不能使其沉淀，不能通 过普通透析膜，可通过滤菌器。一般由1 5 0 - 一1 7 0 个氨基酸组成，含有1 7 种以上氨基酸，其中天 冬氨酸，谷氨酸和亮氨酸含量较高，不含有核酸，所以不能被d n a 酶和r n a 酶破坏，但易被胰 蛋白酶、木瓜酶、乙醚、氯仿等破坏。 i f n 一丫由宿主细胞基因组编码，人i f n 吖基冈定位于第1 2 号染色体k 臂上，基冈均含有3 个 内含子和4 个外显子，不同动物的外显子和内含子核苷酸数量不同。i f n 吖都属于分泌性蛋白， 其基因结构与其它分泌性蛋白的基因结构有相似之处，即由5 端非编码区、信号肽编码区、多肽 编码区和3 1 端1 卜编码区组成。人、猪和牛i f n 吖前体为1 6 6 个氨基酸残基，其中前2 3 个氨基酸为 信号肽，成熟蛋白大小为1 4 3 个氨基酸，鸡i f n r 前体由1 6 4 个氨基酸残基，其中前1 9 个氨基酸 为信号肽，成熟蛋白大小1 4 5 个氨基酸。各种动物i f n 糖基化位点数目不同，糖基化位点对i f n 的抗病毒功能是非必需的，但与i f n 在体内的半衰期有关。成熟i f n - 1 均有两个糖基化位点，不 同动物糖基化位点位置稍有不同( j o s e p hc ，1 9 9 8 ) ；不同i f n 半胱氨酸的数量和位置也不同，冈而 形成不同数目的二硫键，二硫键的形成对于i f n 的生物学活性和结构稳定性等是十分重要的。 i f n y 通常形成分子量为3 4 k d a 二聚体形式，几乎很难检测出其单体形式，而且单体形式没有生 物学活性。每一个单体含六个o 【螺旋，其中四个装配成短链螺旋细胞冈子，但不含l j i 折叠结构。 这两个亚单位以一种反平行方式相互作用。 中圉农业科学院顾十学位论文 第一帚绪沦 1 1 2i f n - y 产生及诱导剂 一般情况下，正常细胞不能自发产生干扰素，干扰素基因处于被抑制的静止状态，只有机体 受到外界抗原、有丝分裂素等刺激时，由活化c d 4 + t h l 、c d 8 + t 细胞及n k 细胞所分泌。最近研 究发现：n kt 细胞、树突状细胞和巨噬细胞也能产生i f n - ? ( e l e w a u td ，2 0 0 0 ；s c h i n d l e rh 2 0 0 1 ) ， n kt 细胞是i f n - y 产生细胞中的一个新的成员，它表面既具有n k 细胞的激活和抑制受体，也 具有t 细胞的表面受体。树突状细胞和巨噬细胞都是抗原提呈细胞，它们也能产生l f n 叫，它们 产生i f n 吖的过程受剑许多其它细胞因子的调控。a p c 产生的l f n 吖和n k 细胞所产生的i f n y 一样，在机体感染的最初阶段是在特异性免疫建立之前起着重要的作用，在机体特异性免疫和非 特异性免疫之间起着重要的联系作用( f u k a ot 。2 0 0 1 ) 。 目前发现的i f n 诱生剂有多种，主要分为以下几类：病毒诱生剂：病毒复制时，通过某些细 胞内的毒性成分直接引起宿主细胞蛋白合成抑制，由于宿主细胞中的i f n y 抑制物为不稳定蛋白 质，其合成速度稍微降低就会导致其自身迅速耗尽，从而使i f n 吖转录活化因子与p r di 和p r d i i 结合，导致i f n - q 的转录合成。一般情况下r n a 病毒诱生i f n 的能力较d n a 病毒强，带囊膜的 病毒比不带囊膜的病毒的诱生能力强，有些病毒灭活以后也能诱生i f n ，如新城疫病毒和r o u s 肉瘤病毒等，有的灭活病毒甚至比活病毒的i f n 诱生能力更强，说明病毒诱导i f n 时不一定进行 复制，但另外一些病毒，如森林脑炎病毒，灭活后即丧失其i f n 诱生能力。 代谢物诱生剂：代谢激活物如促有丝分裂原( p h a 、c o n a ) 、细胞冈子能够诱导未定型的 淋巴细胞产生i f n - y ( s c h i n d l e rh ，2 0 0 1 ) ，特异性抗原可以诱导定型的淋巴细胞产生i f n - y 。 其它i f n 吖诱生剂还有细菌内毒素、布氏杆菌、李氏杆菌、支原体、原虫、立克次氏体和合 成的多聚物等。 1 1 3i f n - f f 生物学活性及其作用机制 y 干扰素具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。i f n - 7 具有较强的免疫调节活 性，约为i 型干扰素的1 0 0 t 1 0 0 0 0 倍，而其抗病毒活性仅为i 型干扰素的1 ：1 0 l ：1 0 0 0 。 1 1 3 1 抗病毒活性 1 f n 吖是由宿主细胞编码的蛋白质，具有抗病毒活性，但是i f n - 丫本身并不能直接灭活病毒， 而是作用丁靶细胞，激活靶细胞内的基因翻译出抗病毒蛋白而发挥其活性，因而具有广谱抗病毒 活性。 近年来研究发现，i f n - y 是通过激活i f n - y 刺激反应区段而发挥其功能，位于i f n - 7 刺激基 因的一1 3 6 一1 6 7 区段，其序列高度保守，可被i f n - t 诱导。目前发现i f n 吖在被细胞内在化和 降解后，形成3 种特异性因子，分别称为i f n 刺激基因因子l 、2 、3 。这3 种冈子与相应的i f n 刺激反应区段结合后，去除抗病毒蛋白基冈的转录抑制( g e r o t t om ，2 0 0 0 ) 。 干扰素的抗病毒活性依赖于细胞表面干扰素受体介导的信号转导途径和特异抗病毒蛋白的 表达。特异抗病毒蛋白主要包括：m x 、2 ，5 腺苷酸合成酶、核糖核酸酶l 、双链r n a 依赖的蛋白 激酶( p k r ) 和一氧化氮合成酶。 2 中同农、i p 科学院顾f 学位论文 镑辛绪论 m x 蛋白是i f n - 丫诱导的g t p 酶，定位丁胞浆和胞核，是最先发现的抗流感病毒蛋白，其抗 病毒功能因病毒而异，鼠m x l 蛋白能有效阻断病毒m r n a 的合成而抑制a 型流感病毒和其它正 粘病毒的复制，m x 蛋白还能在转录水平抑制水疱性口炎病毒、麻疹病毒的复制。2 , 5 腺茁酸合 成酶，它能使a t p 聚合成2 , 5 腺苷酸，2 ，5 腺苷酸被磷酸化后能激活核糖核酸酶( r n a s el ) 而使 s s r n a 降解，从而抑制病毒复制。人们已证明，当用i f n y 处理细胞时，r n a s e l 水平增高2 0 倍 以上，但是r n a s el 的作用无特异性，它可以同时降解病毒和宿主细胞m r n a ，在m r n a 分子上 切开1 2 个切口，使其降解。双股r n a 依赖的蛋白激酶主要位于i f n 吖诱导的细胞胞浆内，p k r 具有双股r n a 结合位点，通常是不活跃的，但是一旦结合了d s r n a ，就进行磷酸化和随后的不 依赖d s r n a 的底物磷酸化。活化的p k r 能使蛋白质合成的起始因子e l f 2 发生磷酸化，磷酸化 的e l f 一2 即被灭活，使蛋白质合成迅速停止：p k r 基冈的启动子区域含g a s 和ii s r e 位点，在i f n 一1 ， 作用下转录增加。腺嘌呤核苷酸氨基酶是由i f n 吖诱导产生的r n a 特异性的腺嘌呤脱氨基酶， 它能催化d s r n a 的腺嘌呤a d e n o s i n e 的c 一6 发生脱氨基而形成肌苷i n o s i n e ，影响m r n a 的正常 翻译，从而抑制病毒的繁殖。i f n - 丫能诱导细胞内n o 合成酶的合成，此酶能催化l 精氨酸转化 为l - 瓜氨酸并释放n o ，n o 是细胞内重要的抗病毒分子，它能使新合成的病毒蛋白的半胱氨酸、 苏氨酸残基亚硝基化而干扰其二硫键的形成和蛋白的正确折叠。 1 1 3 2 免疫调节活性 i f n 吖具有较i 型i f n 更强的免疫调节活性，主要表现在促进抗原提呈细胞提呈抗原、调节 t h 细胞分化和诱导宿主细胞产生多种酶抑制病原等方面。 i f n y 以上调m h c 分子的表达、促进抗原提呈为最主要的免疫调1 了活性( g e r o t t om ，2 0 0 0 ) 。 i f n - 7 对m h c1 分子表达及抗原提呈的调控主要表现在促进m h c1 分子合成、对i 类分子抗原 提呈过程中辅助分子表达的调控和对参与抗原多肽加上形成过程的酶类及其辅助分子的调控等 方面( t a n a h a s h in ，1 9 9 7 ) 。i f n 吖能将m h ci 类分子在组成型表达该类分子的细胞中的表达量 增加2 - 4 倍。l f n 吖对m h c1 1 分子及其参与的抗原提呈过程的调控主要是通过其诱导细胞产生的 转录因子c i i t a ( c l a s s i i t m n s a c t i v a t o r , c i i t a ) 来实现的( h a n o nj a ，2 0 0 0 ) 。c i i t a 是在i f n 吖 二聚体与细胞表面的i f n g r l 结合后，导致j a k l 和j a k 2 磷酸化，继而与s t a t i 形成磷酸化的 二聚体，转移到核内，与m h c1 1 分子基因区中a i r 1 ( a c t i v a t o ro f i m m u n er e p o n s e 1 ) 位点的g a s 序列结合后，诱导所产生的；同时，c i i t a 的产生也需要另外两个调节因子的参加，一个是i f n 1 ， 诱导产生的干扰素调节因子i r f l ( i f n r e g u l m i n gf a c t o r1 ，i r f 1 ) ，一个是上游刺激冈子u s f 1 ( u p s t r e a ms t i m u l a t o r yf a c t o r1 u s f 一1 ) ( m u h l e t h a l e r - m o t t e ta ，1 9 9 8 ) 。i f n - 7 能诱导m h ci i 类分子 在m h c 缺陷型细胞中的表达，但i f n - y 却抑制m h c i i 类分子在b 细胞中的表达。 i f n 吖能间接调节c d 4 + t 细胞特异性亚型的分化。当机体的c d 4 4 t 细胞遇到被抗原提呈细胞 提呈的抗原时，即被激活，从t h o 细胞分化为分泌i l 1 、i f n - 7 和t n f p 的t h l 细胞及分泌i l 4 、 i l 5 的t h 2 细胞。t h l 细胞应答主要与机体对胞内病原体的细胞免疫反应和活化巨噬细胞有关， 而t h 2 主要影响机体对持续性抗原如寄生虫的体液免疫和变态反应( m u r p h yk m ，2 0 0 0 ；r h o d e s s g ，2 0 0 2 ) 。i f n 一7 是1 1 1 1 分泌的效应冈子，而且对t h l 厂r h ! 分化及平衡具有调节作用，内源性的i f n y 能大大增强和加快l l 1 2 对t h l 分化的刺激效应。 3 巾罔农、l k ：1 学院顺f 。学位论文 第一辛绪论 此外，i f n 吖能增加高亲和力f c 受体在单核巨噬细胞表面的表达，促进这些细胞参与抗体依 赖的细胞毒反应( a n t i b o d y d e p e n d e n tc e l l m e d i a t e dc y t o t o x i c i t y a d c c ) 。 1 1 3 3 抗肿瘤活性 肿瘤细胞的增殖分裂火控是肿瘤发生的重要原因，体外试验结果证实i f n - y 在许多肿瘤细胞 上均可表现山抗增殖和有丝分裂的作用，但在s t a t i 基冈突变或缺火的肿瘤细胞上，这种活性 消失，随后导入s t a t l 基冈后活性恢复，i f n 吖与受体结合后激活一些编码参与细胞分裂周期的 一些抑制因子，阻止了细胞的分裂增殖( c h i ny e ，1 9 9 6 ；b r o m b e r gi f ，1 9 9 6 ) 。近年来研究发现， i f n - t 抗肿瘤的机制之一就是通过抑制肿瘤的血管生成而实现的。i f n - y 还可以通过激活机体参与 先天免疫应答的多种细胞，发挥其抗肿瘤作用。巨噬细胞被激活后能够通过多种机制诱导其对肿 瘤细胞的非特异性杀伤作用。( w i l e ys r ，1 9 9 9 ) 。 1 1 4i f n - q , 的应用及发展前景 1 1 4 1 在疾病诊断和免疫学检测方面的应用 i f n 吖是免疫调节活性最强的一类i f n 。研究表明，内源性i f n 吖水平的高低在很大程度上 可以反映机体的细胞免疫状态，而特异性i f n 吖反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的免 疫状态指标。应用不同标记物标记的单克隆抗体和检测技术，已经建立了多种方法，如酶联免疫 吸附法，酶联免疫斑点法，流式细胞术分析法等( l i e b a n ae ，1 9 9 8 ；a s a it ，2 0 0 0 ；n u m ay ，1 9 9 1o 目 前，i f n 吖体外检测试验已经j “泛地应用于基础研究、临床免疫学( r o d r i g u zm f ，1 9 9 8 ) 、疫苗 免疫效果评估( a g g e re m ，2 0 0 1 ) 、器官移植( t a r y l e h m a n nm ，1 9 9 8 ) 、过敏反应( k u b o t ay ，1 9 9 9 ) 以 及多种病原感染的诊断( b e n y o u c e fs ，1 9 9 7 ) ，尤其是牛羊结核病和副结核病的诊断( w a l r a v e n sk 2 0 0 2 ；k a l i sc h ，2 0 0 3 ) 。 抗原特异性i f n 吖试验与t s t 相比具有很多优点：由于抗原特异性i f n 吖试验是体外试验， 检测过程不受外界影响，结果判断的主观性较小，整个检测过程只需和被检者接触一次。以特异 性抗原为检测的抗原特异性i f n y 试验被认为比以p p d 为检测抗原的t s t 试验具有更高的特异 性。目前抗原特异性i f n - 1 , 试验已经被应用于多个领域，如：诊断活动性结核病、鉴别诊断结核 菌的感染、作为机体保护性免疫的一个相关指标，对治疗效果进行监测等。( a n d e r s e n p 2 0 0 0 ；b a r n e s ，2 0 0 4 ；l a l v a n i ，2 0 0 3 ) 酶联免疫吸附测定( e n z y m el i n k e di m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l l s a ) 是建立在抗原与抗体反应 基础上的一种免疫学检测方法，它可以用于检测抗原也可以用下检测抗体。 酶联免疫斑点检测( e n z y m el i n k e di m m u n o s p o ta s s a y ，e l i s p o t ) 技术是一种在细胞悬液中定 量检测细胞因子生成细胞的分析方法。在微孔板的p v d f 膜上能显示蓝黑色的沉淀，即在细胞因子 出现的位置形成斑点，每个斑点代表单个分泌待测冈子的细胞。斑点可以在e l i s p o t 阅读仪上计数 或在显微镜下人工计数。分泌i f n - y 的t 淋巴细胞在病毒感染和疫苗免疫中起到重要作用，其数量 和分泌i f n 丫的量可以反映疫苗的免疫效果，e l i s p o t 可以在单个细胞水平上定量分析i f n y ，并 在临床上得到广泛应用。 流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 是一种可以对细胞或细胞结构进行快速测量的新型分 4 中固农、l k 科学院硕十学1 t 论文 第一辛绪论 析技术和分选技术。f c m 与细胞内细胞冈子( i n t r a c e i l u l a rc y t o k i n e i c k ) 染色技术的结合，提供 了一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法。 i f n - i 是体内重要免疫调一例因子，对机体免疫系统具有极人的调节作用，是机体发挥免疫功 能，清除体内病原体不可缺少的成分。正常情况下，i f n 吖的表达和分泌受到机体严格的调控， 在病理或免疫状态下，i f n - 丫会出现异常表达，冈此，检测i f n - 1 , 对于某些疾病的诊断，和免疫 监控具有重要价值。利用各种方法标记抗i f n y m c a b ，通过各种免疫学方法，在体外定性、定量 检测i f n 吖以及产生i f n - 1 , 细胞的分类和定位，在临床上得到，“泛应用。 最近，许多学者对外周血t 淋巴细胞对结核菌特异性抗原的i f n 吖反应在结核病诊断中的应用 进行了研究。结果表明，抗原特异性i f n 吖试验与传统的t s t 相比具有许多优点( l a l v a n ia 2 0 0 4 ) ， 由于抗原特异性i f n - y 试验是体外进行，无需皮肤硬结的观察，结果判断的主观性较小，而且整个 检测过程只需要和被检测者接触一次。 i i 4 2 作为疫苗免疫佐剂的应用 基于i f n - 1 ，在免疫调节中的重要作用，人们研究发现重组i f n 丫作为疫苗佐剂，不仅能特异性 的增强疫苗免疫效果，而且可增强机体抗感染能力，主要表现在：延长抗体持续时间、诱导机体 产生均一的免疫反应、使低浓度抗原被充分利用和降低机体的感染率。r a u t e n s c h l e i n 等( 1 9 9 9 ) 彭 大新等( 2 0 0 2 ) 以f p v 载体共表达m d v g b 和c h l f n 丫基冈，发现干扰素的表达可干扰f p v 的复制。 程坚等( 2 0 0 3 ) 将a i v 的h a 基因$ i i l f n 一丫在鸡痘病毒中共表达，结果表明能够有效提高疫苗的免疫 效力和降低病毒载体的毒力。 1 1 4 3 在临床治疗方面的应用 i f n 吖可以治疗多种疾病，如免疫缺陷性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病及肿瘤等疾病。目 前，国内外均有商品化的重组人i f n 吖，如美国生产的a c t i m m u n e ，复星实业生产得复星克隆伽 吗等。i f n - 7 对类风湿性关节炎、过敏性皮炎和过敏性哮喘等免疫性疾病均有一定的治疗效果。 此外，i f n 吖对肝纤维化有一定的抑制作用，现已被作为抗纤维化的首选药物，l f n 吖还对一些肿 瘤如肾细胞癌、卵巢癌、黑色素瘤和慢性髓性白血病有一定的效果；与人i f n 吖相比，动物i f n 吖 研究相对滞后，用于临床治疗的甚少，但是最近研究发现重组猪i f n - 7 在m a r c 一1 4 5 细胞上能抑制 p r r s v 的复- ；若, j ( w a nj q ，2 0 0 2 ) ，杆状病毒表达重组牛i f n 吖能抑制牛白血病病毒的复制；叶秀华 等( 2 0 0 4 ) 研究发现重组鸡i f n 吖对减轻球虫感染所造成的生长性能下降，减少卵囊排出量有一 定的效果。还有研究表明：给大鼠肌肉注射大鼠i f n - 7 可以保护大鼠受致死性伪狂犬病病毒的感 染，连续两天给牛鼻内应用i f n - 7 ，然后削鼻病毒进行攻毒，发现应用i f n 丫的牛，只排少量病 毒，但无一例发生呼吸道症状，而对照牛则出现明显的临床症状。 1 2 干扰素一丫受体的研究进展 干扰素是在特定诱生剂的刺激下，由细胞产生的一类具有高度