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四川大学硕士学位论文 两种植物膜为载体的葡萄糖酶传感器的研制 研究生：杨晓凤 分析化学专业 指导教师：周在德副教授 中文摘要 酶是一种高效、高度专一的生物催化剂：但游离酶往往不稳定而且不能够 重复使用。2 0 世纪5 0 年代发展起来的酶固定化技术正是基于解决这一问题的 目的发展起来的。固定化酶的重点是将可溶性的酶与不溶性的载体结合形成不 溶性的固定化酶。虽然目前固定化酶的方法和固定化酶的载体已经被大大发展， 但进一步寻找实用、有效的酶固定化载体和固定化方法一直是人们追求的目 标。 番茄皮、竹腔膜这两种植物膜分别由于其表面的蜂窝状纤维结构、多孔型 结构能够为固定化酶提供微环境，保持固定化酶的活性。本实验采用戊二醛交 联法将葡萄糖氧化酶分别固定在番茄皮、竹腔膜上，该操作简单，酶的结合力 强，稳定性高。 在酶反应中： d - g l u c o s e + 0 2 + h eo 型竺型唑生斗d g l u c o n i ca c i d + h 20 2 氧气被消耗，溶氧含量降低，由氧电极测出溶液中溶氧的含量的变化。在一定 范围内，氧含量的变化率与葡萄糖浓度成正比。基于此，本文研制了电极式葡 萄糖酶传感器。该传感器具有快速的响应( 6 s ) ，良好的重现性( r s d = 1 8 ， n = 1 0 ) 、选择性、稳定性( 传感器对葡萄糖溶液测定3 0 0 0 次后，酶能维持初始 活性的8 5 以上) 等优点，适用于快速分析。 又由于氧气能够使荧光物质 r u ( d p p ) 3 ( 4 - c l p h ) g b 2 的荧光发生猝灭，而酶 反应中氧气被消耗，所以荧光物质 r u ( d p p ) 3 ( 4 - c l p h ) 4 b 2 的荧光强度增强。一 定范围内阿( d p p ) 3 ( 4 - c l p h ) 4 b 2 的荧光强度的变化率与葡萄糖浓度成正比，因 此，本文又研制成荧光式葡萄糖酶传感器。该传感器对葡萄糖的响应具有良好 四j i i 大学硕士学位论文 的重现性( r s d = 3 o ，n = 1 0 ) 、选择性和稳定性( 固定化酶膜在4 0 c 下储存 8 个月仍然可以使酶的活性保持在初始活性的9 5 以上) 等优点，己被成功地 检测商业葡萄酒、医用注射液中的葡萄糖含量。 关键词：葡萄糖传感器葡萄糖氧化酶固定化酶荧光酶电极番茄皮竹 腔膜 d e v e l o p m e n t o f g l u c o s ee n z y m e s e n s o r sb a s e do n g l u c o s eo x i d a s ei m m o b i l i z e d o nt w op l a n tm a t e r i a l s a n a l y t i c a lc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t e ：x i a o f e n gy a n g s u p e r vis o t ：a s s o c i a t ep r o f z a i d ez h o u a b s t r a c t t h e r ea r ec o n s i d e r a b l eh i g he f f i c i e n c ya n ds p e c i a l i z a t i o nf o rt h ee n z y m e c a t a l y s i s b u t ，t oo u rr e g r e t ，f r e ee n z y m e i su s u a l l yn o ts t a b l ea n dc a n n o tb ee a s i l y r e u s e d at e c h n o l o g yo fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o nm a k e st h es t u d yo fi n c r e a s i n g e n z y m a t i cs t a b i l i t ya n dr e u s m ge n z y m ef e a s i b l e i te m p h a s i z e st h ep m c e s st h a ta s o l u b l e e n z y m ec o m b m e sw i t h a l li n s o l u b l e s u p p o r tt o f o r ma ni n s o l u b l e i m m o b i l i z e de n z y m e t od a t ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sa n di m m o b i l i z a t i o nm a t e r i a l s h a v eb e e nl a r g e l ye n r i c h e da n dd e v e l o p e d n e v e r t h e l e s s , t h e r ei ss t i l lan e e dt os e a r c h f o rc h e a p e r , m o r ec o n v e n i e n ta n de f f e c t i v en 抢m o d sa n ds u p p o r t sf o re n z y m e i r a i n o b i l i z a f i o n p l a n tm a t e r i a l so ft o m a t op e e la n db a m b o os h e l li n n e rm e m b r a n e ，ar e g u l a r a r r a yo fm i c r o p o m u ss t r u c t u r ea n dac l e a rs t r i p ei m a g e ，r e s p e c t i v e l y , c a np r o v i d e m i c m e n v i r o n m e n tf o rt h ei m m o b i l i z e de n z y m es ot h a tt h ea c t i v i t yo ft h e i m m o b i l i z e de n z y m ei sr e t a i n e d g l u c o s eo x i d a s e ( c o x ) w a si m m o b i l i z e do nt h e t o m a t op e e la n db a m b o os h e l li n n e rm e m b r a n ew i t h g l u t a r a l d e h y d e a sa c r o s s - l i n k i n ga g e n t t h i si m m o b i l i z e dm e t h o di ss i m p l ea n dc o n v e n i e n t m o r e o v e r , 四川大学硕士学位论文 t h ee n z y m ew a st i g h t l yl i n k e db i o m a t e r i a l sw i t hac o n s i d e r a b l es t a b i l i t y t h et o m a t op e e li m m o b i l i z e dg o xw a sa p p l i e do nac l a r k - t y p eo x y g e n e l e c t r o d et of o r ma l l 曲z y m ee l e c t r o d e t h ed e t e c t i o nm e c h a n i s mo ft h es e n s o ri s b a s e do nt h ee n z y m a t i co x i d a t i o no f g l u c o s eb yo x y g e na sd i s p l a y e di ne q d - g l u c o s e + 0 2 + h 2 0巫竺! ! ! 竺! 苎! ! d g l u c o n i c a c i d + h e 0 2 a n dt h ed e p l e t i o no fd i s s o l v e do x y g e nc o n t e n tu p o ne x p o s u r et og l u c o s es o l u t i o n t h ed e c r e a s ei nt h eo x y g e nl e v e lw a sm o n i t o r e da n dr e l a t e dt ot h eg l u c o s e c o n c e n 删i o n t h es e n s o rs h o w e df a s tr e s p o n s e ( 6 s ) ，e x c e l l e n tr e p r o d u c i b i l i t y ( r s d = i 8 ，n = l o ) ，s e l e c t i v i t ya n dm o r em e a s t i r e m e n tt i m e s ( a f t e r3 0 0 0t i m e s d e t e r m i n a t i o n s ，t h ee n z y m ea c t i v i t yw a sr e t a i n e d8 5 o f i n i t i a la c t i v i t y ) d u r i n gt h ea b o v ee n z y m a t i cr e a c t i o no fg l u c o s e ，d i s s o l v e do x y g e nc a nb e f l u o m m e t r i c a u yd e t e c t e ds i n c eo x y g e nm o l e c u l e se f f i c i e n t l yq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c e o f r u ( d p p ) s ( 4 - c l p h ) 4 b 2 b a m b o oi n n e rs h e l lm e m b r a n ei m m o b i l i z e dg o xw a s a p p l i e do nf - 4 5 0 0s p e e t m f l u o m m e t e rt of o r maf l u o r e s c e n tg l u c o s ee n z y m es e n s o r t h ed e l e t i o ns c h e m eo ft h es e n s o ri sb a s e do nt h ed e p l e t i o no fd i s s o l v e do x y g e n c o n t e n tu p o ne x p o s u r et og l u c o s es o l u t i o na n dt h ei n c r e a s ei nt h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo ft h e r u ( d p p ) 3 ( 4 一c l p h ) 4 b 2a n dr e l i e dt ot h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n d u et ot h ee x c e l l e n tm p m d u c i b i l i t y ( r s d = 3 0 ，n = 1 0 ) ，s e l e c t i v i t ya n ds ：【a 】b i t i t y ( t h e g l u c o s eb i o s e n s o rr e t a i n e d9 5 o fi t si n i t i a lr e s p o n s er a t ea f t e r8 - m o n t hs t o r a g e p e r i o d sa t4 0 c ) ，t h eg l u c o s eb i o s e n s o r 哪s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n eg l u c o s e c o n t e n ti nw i n e sa n dg l u c o s ei n j e c f i o ns a m p l e s k e y w o r d s ：g l u c o s es e n s o r ；g l u c o s eo x i d a s e ；i m m o b i l i z e de n z y m e ；f l u o r e s c e n c e ； e n z y m ee l e c t r o d e ；t o m a t op e e l ；b a m b o oi n n e rs h e l lm e m b r a n e 四川大学硕士学位论文 1 引言 1 1 酶 酶是由细胞产生的具有催化能力的蛋白质，这些酶大部分位于细胞体 内，部分分泌到体外。新陈代谢是生命活动的最重要特征。一切生命活动都 是由代谢的正常运转来维持的，而生物体代谢中的各种化学反应都是在酶的 作用下进行的。酶是促进一切代谢反应的物质，没有酶，代谢就会停止。 1 1 1 酶的催化特性 酶是生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质。此类蛋白质表现出特 异的催化功能，因此，酶被称为生物催化剂。其特点表现在： 1 1 1 1 酶是高效催化剂 酶能在温和条件下，例如，常温、常压和近中性的p h 条件下，大大加 速反应；在可比较的情况下，酶的催化效率相对其他类型的催化剂而言，可 达1 0 7 1 0 1 2 倍。以h 2 0 2 分解为例： 2h 2 0 2 坞2 h 2 0 + 0 2( 1 1 ) 以铁离子催化，反应速度为5 6 1 0 m o l ( m o l s ) ；以血红素催化，接近6 0 x 1 0 m o l ( m o l 曲；而以过氧化氢酶催化时可达3 5 x1 0 6 m o l ( m o l s 1 。 1 1 1 2 酶具有高的作用专一性 所谓高的作用专一性，乃是指酶通常只能催化一种或一类反应，作用一 种或一类极为相似的物质。以谷氨酸可能进行的几种反应为例： ( 1 ) l 一谷氨酸+ n a d ( p ) + - - + o - - 酮戊二酸+ n h 3 + n a d ( p ) h ( 2 ) l 一谷氨酸+ 草酰乙酸一一酮戊二酸+ l 一门冬氨酸 ( 3 ) l 一谷氨酸一y 一氨基丁酸+ c 0 2 ( 4 ) l 一谷氨酸- * d - - 谷氨酸 这些反应如果用吡哆醛或铜催化齐，则后面三种反应，即反应( 2 ) ( 4 ) 都能加速，但用酶催化时，则不同的反应需要不同的酶：( 1 ) 需用谷氨酸脱 氢酶；( 2 ) 需用谷草转氨酶；( 3 ) 需用谷氨酸脱羧酶；( 4 ) 需谷氨酸异构酶。 酶的这种性质称为酶的底物专一性( 注意；酶学中反应物称为底物) 。在底 物专一性方面，有的酶显示“绝对”专一性；不过，更多的酶表现相对专 性，即容许底物分子上有小的变动。底物专一性的一个重要特征就是酶对底 物的立体异构体既有高度选择能力，表现立体专性和顺反专一性，就是说， 1 些型查堂堡圭堂笪丝苎 当酶作用的底物和形成的产物具有立体异构体或顺反异构体时，酶能够加以 识别，并选择地催化其中之一进行反应或催化其中之一形成。例如，l 一谷 氨酸脱氢酶只能作用l 一谷氨酸或催化l 一谷氨酸形成，而非d 一谷氨酸。 又如，延胡索酸酶催化的反应： l 一苹果酸一延胡索酸( 反丁烯二酸) + h 2o ( 1 2 ) 该酶在反应式的一端专一于反丁烯二酸，而在另一端专于l 一苹果酸。 1 ，1 。2 酶的活力单位及影响酶活力的因素 1 1 2 1 酶的活力单位 酶催化反应的速率通常称作酶速度。酶速度通常记录为时间为零时的值 ( v o ，单位为um o l m i n ) ，因为产物尚未出现，在这点上速率是最快的。这 是因为在任何底物转化为产物之前底物浓度是最大的。还因为酶可能受到它 本身产物的反馈抑制和或包括逆反应，而且反应产物将刺激。酶促反应形成 的产物对时间的典型的图表明，产物迅速行形成的起始期，构成图形的线性 部分( 图1 ) ，随后，酶速度缓慢下降，因为底物已用尽和或酶失去活力； v o 的获得是以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这直线的 斜率即等于v o 。 图1 酶促反应产物形成和时间之间的关系 【s 】 图2 底物浓度【s 】和起始反应速度v o 之 间的关系 酶活力单位可以用许多方式表示。最普通的是被催化的反应的起始速度 ( v o ) ( 如每分钟底物转换的物质的量，单位为t o o l r a i n ) 。也有两种酶活 2 些业查堂堡主堂焦堡三 当酶作用的底物和形成的产物具有立体异构体或顺反异构体时，酶能够加l 三l 识别，并选择地催化其中之进行反应或催化其中之一形成。例如，l - - 谷 氨酸脱氢酶只能作用l 一谷氨酸或催化l 一谷氨酸形成，而非d 一谷氨酸。 又如，延胡索酸酶催化的反应： l 一苹果酸一延胡索酸( 反丁烯二酸) - i - h 2 0 ( 1 - - 2 ) 该酶在反应式的一端专一于反r 烯二酸，而在另一端亏一于l 一苹果酸。 1 1 2 酶的活力单位及影响酶活力的因素 1 1 2 1 酶的活力单位 酶催化反应的速率通常称作酶速度。酶速度通常记录为时间为零时的值 ( v o 一单位为l jm o l m i n ) ，因为产物尚未出现，在这点上速率是最快的。这 是i 因为在任何底物转化为产物之前底物浓度是最大的。还因为酶可能受到它 本身产物的反馈抑制和或包括逆反应，而且反应产物将刺激。酶促反应形成 的产物对时间的典型的图表明，产物迅速行形成的起始期，构成图形的线性 部分( 图1 ) ，随后，酶速度缓慢下降，因为底物已用尽和或酶失去活力； v o 的获得是以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的 斜率即等于v 。 时i 畦n n 图1 酶促反应产物形成和时间之间的关系 s 圈2 底物浓度 s 和起始反应违度v 。之 间的关系 酶活力单位可以用许多方式表示。最普通的是被催化的反应的起始速度 ( v o ) ( 如每分钟底物转换的物质的量，单位为um o l t m i n ) 。也有两种酶活 ( v o ) ( 如每分钟底物转换的物质的量，单位为um o l m i n ) 。也有两种酶活 2 四川大学硕士学位论文 力的标准单位，即：酶单位( u ) 和“开特”( k a t ) 。酶的1 个活力单位是在 该酶的最适条件下，在2 5 c ，1m i n 内催化l 岬o l 的底物转化为产物的酶量。 “开特”是酶活力的国际单位( s i ) ，它规定在特定体系下，反应速度为每 秒转化l m o l 底物所需的酶量。在两种不同的酶活力单位之间可用 1um o l m i n = lu = 1 6 6 7n k a t 换算。 1 1 2 2 影响酶活力的因素 酶促反应的动力学是研究酶反应速度及各种因素对酶反应速度影响的 科学。其主要影响因素有：酶浓度、底物浓度、p h 值、温度等。 1 底物浓度 酶速度对底物浓度( f s l ) 的依赖关系的正常模式是，在低的底物浓度下， 【s 】增加1 倍，将导致起始速度( v 0 ) 也增加1 倍。然而，在较高底物浓度下， 酶被饱和，进一步增高【s 1 ，只导致v o 的微小变化。这是因为在有效的饱和 底物浓度下，所有酶分子已有有效地与底物结合，这时，总的酶速度依赖与 产物自酶解离下的速率，若进步加入底物对酶速度也将不发生影响。v o 对 s 】的关系图形成为双曲线( 图2 ) 。 2 酶浓度 在底物浓度饱和的情况下( 即所有酶分子都与底物结合) ，酶浓度的加 倍将导致v o 与酶浓度的关系图为直线图形。 3 温度 酶促反应也有一个最适温度，在最适温度，反应速度最高( 图3 ) 。人体 大多数酶的最适温度在3 7 左右。温度对酶促反应速度的影响，通常有下列 两种情况： ( 1 ) 当温度升高时，反应速度加快( 1 4 砣倍1 0 ) ，这仅限于0 - 4 0 范围。 ( 2 ) 温度升高使酶变性失活。大多数酶在6 0 c 以上完全变性，仅少数酶才 能耐受较高的温度，如牛胰核糖核酸酶加热至1 0 0 仍不失活。细菌淀粉酶 在9 3 下活性最高。最适温度以不是酶的特征常数，它与反应时间。底物浓 度、酶浓度、酶的干燥状况及p h 等因素有关。 四川大学硕士学位论文 图3 酶的温度效应 口h 图4 酶的p h 效应 4 p h p h 对酶促反应速度的影响是复杂的。它不仅影响酶的稳定性，而且还 影响酶活性部位中重要基团的解离状态，酶一底物复合物解离状态以及底物 的解离状态，从而影响酶促反应速度。在一定p h 下，酶促反应具有最高的 反应速度，此p h 称为该酶的最适p h 。如图4 所示，它与底物种类、浓度、 反应温度、缓冲溶液种类及浓度等条件有关。一般酶最适p h 在6 8 之间， 动物酶多在6 5 8 0 ，植物及微生物酶多在p h 为4 5 6 5 之间。但亦有例外， 如胃蛋白酶p h 为1 5 ，肝脏中的精氨酸酶p h 为9 7 。 p h 影响酶促反应的原因，除对酶分子底物、复合物，与产物解离状态 有影响外，还将影响酶蛋白的构象使酶失活。 1 2 酶的固定化方法 酶是一种由氨基酸组成的蛋白质，其高级结构对环境十分敏感，各种因 素如物理因素( 温度、压力、电磁场) 、化学因素( 氧化、还原、有机溶剂、 金属离子、离子强度、p h ) 和生物因素( 酶修饰和酶降解) 均有可能使酶丧 失生物活力。即使在酶反应的最适条件下，酶也会失活，随着反应时间的延 长，反应速度会逐渐降低，反应后不能回收，只能采用分批法进行生产等， 这说明对于现代工业来说，酶还不是一种理想的催化剂。 2 0 世纪5 0 年代发展起来的固定化技术正是基于解决这一问题的目的发 展起来的。固定化酶是指在一定空间内成封锁状态存在的酶，能连续地进行 婴型查堂堡主兰垡丝兰 反应，反应后的酶可以回收重复使用。它主要是将水溶性酶与不溶性载体结 合起来成为不溶于水的酶的衍生物。通常采用的固定化方法可大体概括为四 种类型：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。图5 为上述各种方法的示 意图。 蔫瓣 碰 ：) 黜法头价嚣轶法交璇击乜麟 图5 为上述各秘方法的示意图 1 ，2 。1 吸附法 这是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的 的方法。根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附和离子交换吸附。 物理吸附是通过氢键、疏水键和霄一电子亲和力等物理作用力将酶固定 于不溶性载体的方法。常用的载体有：高岭土1 1 2 1 、氧化铝1 3 1 等无机吸附剂， 纤维素【4 9 】、醋酸纤维素1 1 们、b 牛乳糖【1 1 】、水凝胶1 2 1 、接技淀粉1 剐等有机吸 附剂。 离子交换吸附法是指在最适p h 和离子强度条件下，利用酶的侧链解离 基团和离子交换基间的相互作用而达到酶的固定化的方法。最常用的交换剂 有d e a e 一纤维素1 1 4 , 1 5 】、d e a e 琼脂糖 1 6 , 1 7 1 等；其他离子交换剂还有各种合 成的树脂如酚醛树脂【1 8 1 、聚丙烯酸甲酪类大孔树脂等。 吸附法优点是：操作简便，条件温和，吸附剂可再反复使用。但是，酶 和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的p h 、高盐浓度、高底物浓度以及 5 四川大学硕士学位论文 高温条件下解吸脱落。因此必须控制好吸附与操作条件。 1 2 2 共价偶联法 这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载休的功能基团进行偶 联制备以固定化酶的方法。如此得到固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连 续使用，是目前应用和报道得最多的一类方法，其载体直接关系到固定化酶 的形成和性质。一般地说，亲水载体在蛋白质的结合量、固定化酶的活力和 稳定性上都优于疏水载体，而且亲水基的存在还可以减轻疏水基的有害影 响。理想的载体除了须具有好的亲水膨润性以外，还应有以下特点：结构疏 松；表面积大：有一定的机械强度；带有在温和条件下可与酶的侧链基团进 行共价偶联反应的功能基团：同时最好没有或者很少有非专一性吸附活性。 常用的载体有天然高分子衍生物如纤维素【2 叭、壳聚糖【2 1 1 等，也有合成的载体 如聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酰胺1 2 2 , 2 3 、聚丙烯氰1 2 4 1 、聚苯胺1 25 1 、交联烯丙基 葡聚糖凝胶【2 6 1 、醋酸纤维素“”、树脂1 2 8 啦! 等，还有无机载体如多孔玻璃等。 天然高分子衍生物的亲水性较好，但机械性能较差；反之，聚苯乙烯、尼龙 和玻璃等有强的机械强度，但有疏水结构的缺点。 1 2 3 交联法 即利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰住蛋白间或酶分子 与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。 双功能和多功能试青1 j 根据它们的功能基团相同与不同可分为“同型”和 “杂型”两类，前者如戊二醛、苯基二异硫氰、双重氮联苯胺一2 2 一二 磺酸，后者如甲苯一2 一异氰- - 4 - - 异硫氰等。其中戊二醛【3 3 4 7 l 应用最多。 交联反应可能发生在酶分子间，也可能发生于分子内。分子间交联和分 子内交联的比例在一定程度上和酶的浓度与交联试剂的浓度有关，也和p h 与离子强度有关，一般地说，在低的酶浓度下，主要形成分子内交联，交联 后酶通常仍保持溶解状态；在浓度升高条件下，分子间的交联比例上升，形 成的固定化酶往往变为不溶态。有人报道，当蛋白浓度为5 0 2 0 0m g m l ， 戊二醛的浓度0 3 o 6 时，通过交联形成的固定化酶具有高活性【4 羽。 交联法操作简便，但交联反应往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中 失效，酶回收率不高。为此需要采用某些保护措施，例如，在交联反应前先 6 哩坐查兰堡主竺些笙苎 用抑制剂或底物进行专一性掩护，或向交联反应系统中添加惰性蛋白如血清 蛋白f 4 引、明胶等。 1 2 4 包埋法 这是将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂( 包括交联剂) 的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的日的。包埋法主要有 以下几种类型：胶格包埋、微囊包埋和脂质体包埋。胶格包埋是将酶分子分 散包埋在聚合的胶格中，微囊包埋是将一定量的酶溶液包在半透性的微孔膜 内，而脂质体包埋是将酶包在脂双层结构中。 这里，着重阐述胶格包埋。胶格包埋最常用的包埋剂是聚丙烯酰胺凝胶、 胶原、k 一角叉菜胶【s 0 1 、海藻酸盐【5 1 埘3 、琼脂糖凝胶、聚氨基甲酰磺酸酯 水凝胶陋1 ，6 2 】、溶胶凝胶 6 3 、6 刀等，除此以外，还有聚吡咯膜【6 8 吖。埯。在制备 固定化酶时，可先将这些多聚物溶于合水介质，然后再和酶溶液混合，最后 分别通过各种办法使之胶化，形成胶包埋的固定化酶。对于胶原可以添加水 不混溶的有机溶剂如丁醇：对于角叉菜胶可以添加氯化钾溶液，然后冷却； 对于海藻酸可添加氯化钙溶液，使之作为胶的形式沉淀下来1 5 1 5 5 】。 各种固定化方法的优缺点可概括如表1 ，选择方法时要考虑各种方法的 特点，更重要的是应根据具体情况进行测定后作出分析。 表1 各种固定化方法 方法 优点缺点 吸附法 制作条件温和、简便，成本低，载结合力较弱，对p h 、离子强度、温 体再生可反复使用。度等因素敏感，酶易脱落，酶装载 容量般较小 共价偶联法载体与偶联方法可选择性大；酶的偶联条件激烈、易引起酶失效；成 结台力强，非常稳定。 本高；某些偶联试剂有一定的毒性。 交联法可用的交联试剂多，技术简易；酶 交联条件较激烈，机械性能较差。 的结合力强，稳定性较高。 包埋法包埋材料、包埋方法可选余地大，仅可用于低分子量的底物，不适用 固定化酶的适用面广。包埋条件较于柱系统，常有扩散限制问题，不 1 3 酶传感器 酶传感器是最早问世的生物传感器。远在1 9 6 2 年c i a r k 等【7 l 】就提出了 酶传感器原理，1 9 6 7 年u p d i k e 等【7 2 】发展制成为酶电极。它是把无机离子或 低分子气体作为测量对象而发展起来的电化学器件，如离：子选择性电极或气 敏电极，与同时期迅速发展起来的酶固定化技术相结合而产生的传感器。本 文以电极型酶传感器( 即酶电极) 为中心，就其组成方法、响应原理和应用 进行说明。 1 3 1 酶传感器的制作 试样注入口 醴充填柱 ； ； ； ； 一i 卜寸 卜一亡、二 一 泵 麦丢老鉴番 ( a ) 电极密接型 ( b ) 液流系统型 图6 酶传感器的构成 酶传感器结构如图6 所示，在电极的敏感面上装有固定化酶膜，它的原 理是：当酶膜中发生酶反应时产生电极活性物质，再由基础电极对之响应。 除这种密接型之外，还有一种分离型，即把固定化酶充填在反应柱内，组成 有反应柱的液流系统。在液流系统中也有的用分光光度计代替电极用作检测 器件。 1 3 2 传感器系统的设计 v u 川1 人学坝 ? 掌位论义 在酶反应中有的消耗氧，有的产生过氧化氢、氨、铵离子、二氧化碳、 氢离子和氰化物离子等。所以作为酶电极的基础电极要选择对过些离子或气 体有响应的电极。依电极的测量方法可分电位测量型( 电位法) 和电流测量 型( 电流法) 。电位测量型中由离子检出方式电极( p h 电极、氰化物离子电 极，碘化物离子电极等) 和气体检出方式电极( 氨电极、二氧化碳电极等) 。 在电流测量型中有氧检出方式电极和过氧化氢检出方式的电极。 1 3 3 酶的固定化 装在电极表面的酶膜有的是直接把酶的悬浮液用透析膜包覆固定，但多 数是用结合法把酶固定在水不溶性的高分子载体上。有关固定化酶的制备方 法在1 1 3 酶固定化中已详细阐述过，这里不再累赘。 1 3 4 传感器的组成 a c d 訾b 謦奠 龇，： l 、一番盛篮一7 ，d 窀爱垫 2 撇、i 等i 73 黼 垫 一透气囊一 一 。 图7 把酶膜装在各种电极上的酶传感器基础电极 a ，b ：白金电极；c ：固体膜电极：d ：氨电极或二氧化碳电极。c 是把电极倒立，在电 9 ，苗 ， 持：| 蜃了 、，_jj i f 匕l j 黼 嚣鼍撮丽黼 l_7一 一一 ! ! 业查兰塑生鲎些笙兰 _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ 。- _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - - _ _ - 。_ _ _ - _ - 。_ _ _ _ _ _ 。_ _ 。_ _ _ _ _ 。_ 。_ _ _ 。_ 。_ 。一一一 极敏感膜面上贴上酶膜再覆盖玻璃纸，用有一定宽度的胶圈嘲定。d 是在玻璃扳上作一 贴有塑料管的支持台，在支持台上装上气体电极( o r o n 厂制) 的衬垫萃j j 透气膜，在其 上贴上酶膜，再贴上和通透膜一样大小的玻璃纸。最币盖上电极薷，连同支持台一起颠 倒，去掉支持台则组成电极。 图7 是酶传感器的实例。图中a 是在氧电极上装有酶聚丙烯酰胺凝胶 膜【7 2 】；b 是把酶胶原膜装在氧电极的塔夫纶膜上；c 是在固体膜电极的敏 感面上涂有酶溶液，用透析膜包覆再用有一定宽度的胶环固定所构成的简单 型；d 是在氨电极的透气膜上用透析膜把酶溶液包覆而成的电极，用固定化 酶也可以。图8 是使用酶传感器的液流式系统。 缓冲液 圆定化酶 反应柱 试样注入口 一 - l r ，卜一一一i 卜 泵 图8 磷脂质传感器的液流系统 1 3 5 酶传感器的测定原理和响应 在浸有酶传感器的溶液中，加入底物溶液时，底物向酶膜内扩散并在膜 内发生反应。其结果，基础电极对电极活性的消耗物或产物的浓度变化产生 响应，可测得和待测的底物浓度相应的电流或电位变化。从这些变化值就可 以对底物定量。例如在葡萄糖或尿酸的氧化反应中，减少的氧量用测氧的白 金电极构成的酶传感器测量时，由于在酶膜中消耗氧，使氧分压减少，在白 金阴极处氧的还原电流则减少，此电流的变化量和底物的浓度成比例又如 用氨电极组成的酶电极定量地测定尿素时，在膜内生成的氨通过电极的透气 膜使氨电极内部液( 氯化铵溶液) 的p h 发生变化，装在内部的玻璃电极则 对此p h 变化作出响应。这时得到的电位变化量和底物浓度的对数成比例。 1 0 叫川大学硕1 ：学位论文 这些过程的模式如图9 所示。 a 0 2 + 2 1 1 2 0 + 4 e 一4 硼一 一白金酐极 一 逢氯冀 叫爵囊 底钧溶渡 d z 乙1 2 二：厶幺。! ：二乙：。：卜渊玻璃龟摄 m 3 。+ ，h + 2 0 一兰三三三兰| 臧、 一眦，+ o h 一= _ 二：= 一：二_ _ 二：二_ _ = i 一一 鬻雾雾r 。0 苌髦7 k 拶乏冷b l l 。- - j j l ： 黻 雹口国0 气p 礴遐 一雇钧溶液 口 硒 闻磕l “”“ 凹-目瘩铂- 产暂 。氯 从加入底物溶液到获得测得值的电信号所需时间叫响应时间。实际测量 时，响应时间越短越好。响应特性和基础电极的特性及酶反应的特性有关， 并受酶的活度、底物浓度、酶膜厚度、p h 、温度、离子强度和液体的搅拌状 态等所影响。通常，酶传感器的酶膜都选用酶活性高并尽可能薄的膜。此外， 在测定过程中需要搅拌器搅拌溶液，加快底物向酶膜的扩散速度，使在酶膜 内的反应加速进行，从而缩短响应时间。 酶反应一般都遵守下列m i e h a e l i s - - m e n t e n 型反应， 1i e + s = = = ：e s 叫e + p k - 1 ( 1 3 ) 式中，e ，s ，e s 及p 分别是游离的酶( 浓度为 e 】) 底物( 浓度为 s 】) 酶一 四川大学硕士学位论文 底物复合体( 浓度为 e s 】) 及产物( 浓度为【p ) 。k l ，k 1 及k 2 分别是e s 复 合体的生成反应和离解反应及从e s 离解为产物的反应速度常数，e 将再次 用来促进反应。 当底物浓度比酶量充分多时，从稳定状态法( d i e s l d t = 0 ) 可导出酶反 应的速度公式 d p 】d s 】 vm “【s 】 v 2 丁。丁2 i i 邪丁 ( 1 - - 4 ) 式中。叫做最大速度，j ，m 是m i c h a e l i s 常数，它是当速度v 变为1 2 。 时的底物浓度。 【s 】 k 。时，( 1 - - 4 ) 式表为v = 。= k 2 e 】。，反应从外表上看是零级 反应，即速度和底物浓度无关，标定曲线到了顶点。 象酶传感器那样在酶膜内发生酶反应时，还必须考虑底物向膜的扩散， 这就使得处理复杂化。 1 3 6 酶传感器的应用葡萄糖酶传感器 在酶传感器中，应用最广的是葡萄糖酶传感器。早在1 9 6 2 年，c l a r k 等 人就提出：通过检测其酶催化反应所消耗的氧气来测定葡萄糖的含量。其测 定原则可以表述为：( 1 ) 先将酶固定化( 如通过上述方法固定于电极表面， 制得酶电极) ，( 2 ) 将酶膜( 或酶电极) 浸入待测物的溶液中，催化待测物 的氧化或还原反应，( 3 ) 通过检测电流或电位的方法确定反应过程某一反应 物的消耗或生成物产生的量，从而求出待测物的浓度。例如对于葡萄糖氧化 酶( g o x ) 传感器，先将载有葡萄糖氧化酶的膜( 或酶电极) 浸入含有溶解 氧的葡萄糖待测溶液，通过g o d 催化葡萄糖氧化反应： d g l u c o s e + 0 2 + h 2 0 壁坚塑旦鲤d g l u c o n i c a c i d + h 2 0 2 ( 1 5 ) 同时溶液中剩余的氧气和产生的h 2 0 2 可以在传感电极( 如p t ，a g ) 上发生氧 化或还原反应。由于酶催化反应中氧气量的减少或h 2 0 2 量的增加，可以通 过电化学方法测定出反应物或产物浓度的变化，根据氧气还原电流减小的量 或h 2 0 2 氧化电流增加的量与测定溶液中葡萄糖的浓度成正比，可以间接测 1 2 一婴! ! 查兰堡主鲎垡笙兰一一 - - _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。- _ _ _ 。一。_ - - _ 。一。 定出葡萄糖的浓度。图1 0 为测定葡萄糖用的酶传感器的结构示意图【7 3 】。图 示的这种传感器在h ：o ：传感器的表面固定上g o x 酶膜，测定时，溶液中的 葡萄糖在酶膜的表面被氧化，生成的h 2 0 2 向膜中扩散，在铂阳极上发生氧 化反应，根据氧化反应的电流就可以确定葡萄糖的浓度。 一一。9 2 闰授 ? 氧气透过性膜 + 酶膜( g ) 整莓糖侥楚麓羲酸+ h 2 0 2 图1 0 葡萄糖测定用的酶传感器的基本结构 1 4 本课题研究目的及意义 酶是一种高效、高度专一的生物催化剂；但游离酶往往不稳定而且不能 够重复使用。2 0 世纪5 0 年代发展起来的酶固定化技术解决了这一难题，固 定化酶既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化能回收、反复使用等优点， 并且生产工艺可以连续化、自动化。固定化酶的重点是将可溶性的酶与不溶 性的载体结合形成不溶性的固定化酶。目前，固定化酶的方法和固定化酶的 载体已经被大大发展。虽然这样，但进一步寻找实用、有效的酶固定化载体 和固定化方法一直是人们追求的目标。 生物载体由于其能够为固定化酶提供微环境从而保持固定化酶的活性 的优点，是固定化酶的理想载体【4 2 卅】；戊二醛交联法由于其操作简单方便而 备受重视。利用戊二醛交联法，将葡萄糖氧化酶分别固定于番茄皮、竹腔膜 上，通过实验验证这两种载体在作为酶固定化载体方面的突出优点，即验证 该两种酶固定化方法是否能够保持酶的活性、延长酶的寿命。 1 3 四川大学硕士学位论文 2 实验部分 2 1 电极式葡萄糖酶传感器的研制 21 1 试剂与仪器 2 1 1 1 试剂 葡萄糖氧化酶( e c l 1 3 4 ，2 1 0 u m g ) 购于美国s i g m a 公司：戊二醛、 葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、d l 一丙氨酸、d 一果糖、乳糖、 柠檬酸、维生素c 、蔗糖均为分析纯，且没有再经过净化和提纯；实验所用 水均为二次去离子水。 2 。1 1 2 仪器 p a s c oc i 6 5 4 2 氧传感器( 美国科学工作室，图1 1 ) ，8 5 2 型恒温磁力 搅拌器( 上海司乐仪器有限公司) ，j s m 5 9 0 0 l y 型扫描电子显微镜( 日本电 子公司) ，p x s - - 2 1 5 型离子活度计( 2 3 l 0 1 型p h 玻璃电极，上海精密仪 器有限公司) 。 6 图1 1 氧电极结构图 l 一螺旋；2 a g 参比电极；3 一p t 电极；4 一聚四氟乙烯帽；5 一固定了葡萄糖氧化酶 1 4 婴型查堂堡主堂堡堡苎 的番茄皮；6 一绝缘材料 2 1 2 电极式葡萄糖酶传感器的研制 2 1 _ 21 葡萄糖氧化酶固定于番茄皮上 将番茄的果肉和皮分离取得番茄皮，用蒸馏水浸泡4 8 小时，以除去皮 上仍然残留的果肉：然后取出一片已完全除去果肉的皮，将其固定到氧电极 的聚四氟乙烯帽的顶部，并使其挨着果肉的那面朝外；待自然风干后，在此 片番茄皮朝外的那面上滴加1 0 0 此、4 2 m g m l 的葡萄糖氧化酶( 8 8 2 u ) 溶 液，待潮湿未干时，将1 0 0p lo 2 o ( w v ) 的戊二醛溶液滴于表面并停留1 2 h ， 再用2 0 0 r a m n a h 2 p 0 4 - - n a 2 h p 0 4 缓冲液漂洗5 分钟以洗去未交联的戊二醛。 最后，将固定了酶的番茄皮在干燥状态下储存于室温( 1 5o c ) ，备用。 2 1 2 2 电极式葡萄糖酶传感器的组建 在聚四氟乙烯帽内部，即在固定了葡萄糖氧化酶的番茄皮朝里那面的内 部滴入2 滴k c i 电解液，然后将聚四氟乙烯帽旋入电极主体，并固定在铁架 台上，即可测量。 2 1 3 实验方法 2 1 3 1 溶液配制 缓冲溶液：准确称取n a h 2 p 0 4 ，n a 2 h p 0 4 一定量，用二次水配制成不同 浓度的n a h 2 p 0 4 - - n a 2 h p 0 4 缓冲液，摇匀即可。 其他溶液：均准确称取所需药品一定量，分别溶解于2 0 0 m m 缓冲液中， 摇匀即可。 2 1 3 2p h 调节 首先将p h 玻璃电极于室温下用二次水浸泡2 4 小时使电极活化，然后 将待调节p h 的溶液倒入烧杯中，放在磁力搅拌器上搅拌，用p x s 一2 1 5 型 离子活度计测定p h ，再用n a o h 或h 3 p 0 4 调节到所需p h 。 2 1 3 3 实验过程 准确移取2 5 m l 、2 0 0 m m 缓冲溶液于2 5 m l 小烧杯中，并将其放到磁力 h 璺型查堂堡主兰垡笙塞 搅拌器上不断搅拌；用微量注射