（药理学专业论文）黄芩苷对大鼠脂肪细胞生长的干预作用.pdf

东南大学学位论文独创性声明 i i i ijiijii i i ii ii i j iii ii i l 17 617 9 0 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生签名： 社日期：出可 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：乏鲣导师签名： j 期：趁2 垒：占。；。 中文摘要 黄芩苷对大鼠脂肪细胞生长的干预作用 中文摘要 研究目的： 1 比较前体脂肪细胞组织块培养法和消化培养法的差异。 2 观察黄芩苷对前体脂肪细胞增殖、分化过程的影响。 3 观察黄芩苷对成熟脂肪细胞分泌细胞因子( 脂联素、t n f ) 的作用，为黄芩 苷防治与肥胖相关的代谢病提供理论上的依据。 研究方法： 1 采用组织块法和消化法培养原代大鼠前体脂肪细胞。 2 以后采用消化法培养大鼠前体脂肪细胞，将其接种到9 6 孔培养板中培养至第3 天，用不同浓度黄芩苷( 0 ，5 ，1 0 ，2 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0l ag m 1 ) 干预，在2 4 ，4 8 ， 7 2h3 个时间点进行m t t 测定。 3 2 4 孔培养板中前体脂肪细胞培养至9 0 为成熟脂肪细胞，用不同浓度黄芩苷干 预，在干预3 6 ，7 2 h ，观察黄芩苷对前体脂肪细胞充脂程度的影响。 4 采用油红o 染色鉴定脂肪细胞。 5 用e l i s a 法测黄芩苷干预4 8 h 后细胞培养液中脂联素，t n f 0 【水平。 研究结果： 1 组织块法和消化法都能培养出前体脂肪细胞，但综合考虑消化法培养脂肪细胞 效果较佳，所以本次实验均采用消化法培养。 2 黄芩苷明显抑制前体脂肪细胞分化。但低浓度( 2 01 tg m 1 ) 黄芩苷抑制前体脂肪细胞增殖。 3 0 6 0l ag m l 黄芩苷干预组促进脂联素分泌，但8 0 1 0 0l ag m l 使脂联素分泌下降。 4 0 1 0 01 3 g m l 黄芩苷可以抑制脂肪细胞分泌t n f a ，并且呈剂量浓度依赖性。 研究结论： 1 前体脂肪细胞原代培养采用消化法培养比较好，使用动物年龄以乳鼠为最佳。 2 黄芩苷在一定范围内抑制脂肪细胞增殖、分化，并与细胞生长时间和黄芩甘浓 度成正比。 3 黄芩苷能升高保护性因子脂联素、剂量依赖性降低炎性因子t n f c 【的分泌，这 些作用可能有益于其在防治肥胖相关的代谢病中的应用。 关键词： 黄芩苷、组织块法培养、消化法培养、前体脂肪细胞、脂联素、肿瘤坏死因子0 【 ( t n f a ) 、肥胖 o c y t e s ， a n dt h e s e c r e t i o no fa d i p o c y t o k i n e s t h eo t h e ra i mi st os u p p o r tt h et h e o r e t i c a lf u n d a m e n t a l s t h a tb a i c a l i nc o u l di m p r o v eo b e s i t y r e l a t e dm e t a b o l i cd i s e a s e s 加强h o d s ： 1 t i s s u ec u l t u r em e t h o d sa n de n z y m e d i g e s t i n gm e t h o d sw e r eu s e di nt h ep r i m a r yc e l l c u l t u r eo fm i c ep r e a d i p o c y t e s 2 b y i n ge n z y m e d i g e s t i n gm e t h o d s ，p r i m a r yp r e a d i p o c y t e so fm i c ew e r ec u l t u r e di n 9 6 一w e l lp l a t e sf o rt h r e ed a y s a n dt h e nt h em i c ep r e a d i p o c y t e sw e r et r e a t e dw i t h0 ， 5 ，1 0 ，2 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0pg m lb a i c a l i nr a n d o m l yf o r2 4 ，4 8a n d7 2h o u r sr e s p e c t i v e l y m t ts p e c t r o p h o t o m e t r yw e r ea d o p t e dt od e t e r m i n et h ee f f e c to fb a i c a li no np r o li f e r a t i o n o fm i c ep r e a d i p o c y t e s 3 u n t i l l9 0 p r e a d i p o c y t e sd i f f e r e n t i a t e di n t oa d i p o c y t e si n2 4 - w e l lp l a t e s ，w eu s e d d i f f e r e n tt r e a t e db a i c a li nc o n c e n t r a t i o nf o r3 6 ，7 2 ht oe x p l o r et h ee f f e c t so fb a i c a li n o nd i f f e r e n t i a ti o n o fp r e a d i p o c y t e s 4 a d i p o c y t e sw e r ed e t e r m i n e db yo i lr e d0s t a i n i n g 5 t h el e v e l so fa d i p o n e c t i na n dt n 卜qi nt h ec u l t u r em e d i u mw e r ed e t e r m i n e db ye l i s a 砒 s 吣： 1 t i s s u ec u l t u r em e t h o d sa n de n z y m e - d i g e s t i n gm e t h o d sa r eb o t ht e l l a b l et oo b t a i n p r e a d i p o c y t e s e n z y m e d i g e s t i n gm e t h o d si sm o r es u i t a b l ef o rp r i m a r yc e l lc u l t u r eo f m i c ep r e a d i p o c y t e s ，s ow ea l lc h o o s e de n z y m e d i g e s t i n gm e t h o d si nt h i sr e s e a r c h 2 b a i c a l i n g r a d u a l l yi n h i b i t e dp r e a d i p o c y t e s d i f f e r e n t i a t i o n b u tt h el o w c o n c e n t r a t i o n s ( 2 0l ag m 1 ) i n h i b i t e dt h ep r o li f e r a t i o no fp r e a d i p o c y t e s 3 t r e a t m e n t so f0 - 6 0ug m lb a i c a li nc o u l di n c r e a s et h es e c r e t i o no fa d i p o n e c t i n ， w h i l ea d i p o n e c t i ns e c r e t i o nw a sd e c r e a s e db yt r e a t m e n t so f8 0 1 0 0ug m lb a i c a l i n 4 t r e a t m e n t so f0 - 1 0 0 “g m lb a i c a l i nc o u l dd o s e d e p e n d e n ti n h i b i t e dt h es e c r e t i o no f t n f ai nc u l t u r a la d i p o c y t e s c o n c l u s l 0 n ： 1 i nt h i sr e s e a r c h ，t h eb e s tc o n d i t i o nf o rt h ec u l t u r eo ft h em i c ep r e a d i p o c y t e sh a s b e e nf o u n d e n z y m e d i g e s t i n gm e t h o d si sb e t t e rf o rp r i m a r yc e l lc u l t u r eo fm i c e p r e a d i p o c y t e s ，a n dn e o n a t a lm i c ea r et h eb e s tc h o i e e 2 b a i c a li nc o u l di n h i b i t et h ep r o li f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fp r e a d i p o c y t e sb y s u i t e dc o n c e n t r a t i o n ，w h i c hi s p r o p o r t i o n a l t ot h et i m eo fc e l lg r o w t ha n dt h e c o n c e n t r a t i o no fb a i c a l i n 3 b a i c a l i nc o u l di n c r e a s et h es e c r e t i o no fa d i p o n e c t i n ，w h i l ed o s e d e p e n d e n t l yr e d u c e t h es e c r e t i o no ft n f - qi nc u l t u r a la d i p o c y t e s t h e s er e s u l t sm a yb eb e n e f i tt ot h e a p p l i c a t i o no fb a i c a li n i ni m p r o v i n go b e s i t y r e l a t e dm e t a b o l i cd is e a s e k e y 们r d s ： b a i c a l i n ；t i s s u ec u l t u r em e t h o d s ：e n z y m e d i g e s t i n gm e t h o d s ；p r e a d i p o c y t e s ； a d i p o n e c t i n ：t n f 0 【：o b e s i t y n 目录 目录 前言1日l j 舌l 文献综述3 1 脂肪细胞离体培养研究进展3 1 1 前脂肪细胞理论的形成3 1 2 白色脂肪和棕色脂肪的发生3 1 3 前体脂肪细胞增殖机制4 1 4 脂肪细胞分化机制4 1 5 影响脂肪细胞生长的因素6 1 6p r a ry 7 2 脂联素8 2 1 脂联素结构、功能8 2 2 脂联素受体9 2 3 脂联素分泌调节9 2 5 脂联素与胰岛素抵抗及糖尿病1 0 2 4 脂联素与肥胖1 l 2 6 脂联素与动脉粥样硬化1 1 3 肿瘤坏死因子一q 1 1 3 1t n f q 结构、功能1 2 3 2t n f q 受体( t n f r ) 1 2 3 3t n f q 分泌调节1 2 3 4t n f q 与胰岛素抵抗及糖尿病1 2 3 5t n f a 与肥胖? 1 3 4 概述1 5 第一章组织块法与消化法培养大鼠前体脂肪细胞的比较1 6 第一节材料与方法1 6 1 1 实验材料1 6 1 2 实验方法1 7 第二节实验结果2 0 1 3 实验结果2 0 第三节讨论2 6 1 4 讨论与小结2 6 第二章黄芩苷对鼠脂肪细胞的影响2 7 第一节材料与方法2 7 2 1 实验材料2 7 2 2 实验方法2 8 第二节实验结果3 3 2 3 实验结果3 3 第三节讨论与小结3 7 2 4 讨论3 7 2 5 小结4 1 结论4 2 参考文献4 3 i i i 缩略语表 缩略语表( a b b r e v i a t i o n s ) d m ( d i a b e t e sm e l l i t u s ) a p n ( a d i p o n e c t i n ) t n f q ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ) i l - 1 ，8 ( i n t e r l e u k i n1 , 6 ，8 ) s 1 汗( s t r o m a lv a s c u l a rf r a c t i o n ) h o m a i r ( h o m e o s t a s i sm o d e la s s e s s m e n to fi n s u l i n r e s i s t a n c e ) i r ( i n s u l i nr e s i s t a n c e ) f i n s ( f a s t i n gi n s u l i n ) p p a r - y ，a ( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o r - 7 ，a ) a m p k ( a m p - d e p e n d e n t a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) n f - kb ( n u c l e a rf a c t o rk a p p ab ) c c r p s ( c e l lc y c l er e g u l a t o r yp r o t e i n s ) m a p k ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ) s vc e l l s ( s t r o m a lv a s c u l a rc e l l s ) m s c ( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ) l p l ( l i p o p r o t e i nl i p a s e ) p r e f - 1 ( p r e a d i p o c y t ef a c t o r1 ) t 3 ，t 4 ( t r i i o d o t h y r o n i n e ；t h y r o i d ) g r ( g l u c o c o r t i o o i d r e c e p t a l ) i g f - i ( i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r - i ) t g f - b ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 ) f g f ( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ) p 1 3 k ( p h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e ) g l u t i ，4 ( g l u c o s et r a n s p o r t e rt y p e4 ) p d k 4 ( p y r u v a t ed e h y d r o g e n a s ek i n a s ei s o e n z y m e4 ) a c r p 3 0 ( a d i p o c y t ec o m ple m e n tr e l a t e dp r o t e i n 3 0 ) i r s 一1 ( i n s u l i nr e c e p t o rs u b s t r a t e1 ) e r k ( e x t r a c e l l u l a rr e g u l a t e dp r o t e i nk i n a s e s ) i v 糖尿病 脂联素 肿瘤坏死因子a 白细胞介素1 ，6 ，8 基质血管成分 稳态模型胰岛素抵抗指数 胰岛素抵抗 空腹胰岛素 过氧化物酶增殖物激活受体一y ，a 腺苷单磷酸活化蛋白激酶 核转录因子kb 细胞周期调节蛋白 有丝分裂原激活蛋白激酶 基质血管细胞 多能干细胞 脂蛋白脂酶 前脂肪细胞因子1 三碘甲腺原氨酸；甲状腺素 糖皮质激素受体 类胰岛素生长因子 转化生长因子b 成纤维细胞生长因子 磷脂酰肌醇3 激酶 葡萄糖转运子l ，4 丙酮酸脱氢酶激酶4 脂肪细胞补体相关蛋白 胰岛素受体底物 细胞外调：i 了蛋白激酶 前言 静= 当产 翮吾 体脂过度沉积能导致肥胖，肥胖症作为一种全身性内分泌代谢性疾病，与冠 心病、高血压、糖尿病、脂肪肝和动脉粥样硬化等密切相关，严重影响人类身心 健康，目前己成为医学界、生物学界迫切需要解决的问题。脂肪组织的总体积 取决于脂肪细胞数目的多少和脂肪细胞体积的大小，前体脂肪细胞增殖与分化失 常可引起脂肪组织过多沉积。抑制前体脂肪细胞增殖，不仅有助于降低体脂沉积， 还可以抑制脂肪瘤形成【2 】。随着对脂肪细胞深入研究，人们发现脂肪细胞不仅仅 是一个储存脂质的“仓库”，而且也是一个重要的内分泌组织。脂肪细胞分泌产 生的具有血管活性的激素和细胞因子统称脂肪细胞因子( a d i p o c y t o k i n ) 。包括脂肪 组织特异表达的脂肪因子如脂联素( a d i p o n e c t i na p n ) 、瘦素( 1 e p t i n ) 、抵抗素 ( r e s i s t i n ) 和非特异表达的脂肪因子如多种炎症因子：肿瘤坏死因子c z ( t n f a ) 、白 介素1 ( i l 1 ) 、白介素8 ( i l 8 ) 等，这些因子形成复杂的内分泌、自分泌、旁分 泌信号网络，参与了诸如胰岛素抵抗、糖尿病( d m ) 、高血压、动脉粥样硬化、 心血管疾病等的发生和发展p j 。 脂肪细胞包括在胞浆内聚集脂滴的成熟脂肪细胞和虽未在胞浆内聚集脂滴 但有这种潜能的前体脂肪细胞( 又称前脂肪细胞) 。成熟脂肪细胞呈圆形，失去分 裂及增殖的能力，外界机械损伤的抵抗力较小，前体脂肪细胞呈梭形，有分裂和 增殖的能力，对外界机械损伤的抵抗力较强。2 0 世纪5 0 年代，国际上就已经开 始对前体脂肪细胞进行形态学和功能学的研究。1 9 5 9 年，t r o w e loa 发现脂肪 细胞是由形态类似成纤维细胞的脂肪细胞的f j 体细胞( a d i p o c y t ep r e c u r s o rc e l l ) 在 合适条件诱导下分化而来的。1 9 7 1 年，p o z n a n s k iv a n 等对基质血管成分( s t r o m a l v a s c u l a rf r a c t i o n s v f ) 的系统研究形成了完整的的脂肪细胞理论。s m a scm 等研 究发现，不仅前体脂肪细胞在一定条件下向成熟脂肪细胞分化，成熟脂肪细胞也 可以退化成前体脂肪细胞【4 j 。 脂联素是脂肪细胞分泌的一种保护性细胞因子，具有拮抗胰岛素抵抗、改善 糖耐量及抗炎等作用。r e i n e h r 掣5 】对肥胖青少年体重减轻后发现，脂联素水平 相应提高，胰岛素抵抗出现下降，提示脂联素是脂肪和糖代谢中的重要调节因子。 有研究表明脂联素浓度与h o m a i r ( 稳态模型胰岛素抵抗指数) 及f i n s ( 空腹 胰岛素) 呈负相关，提示脂联素可改善胰岛素抵抗，脂联素可通过增加脂肪酸转 运蛋白1 和5 - a m p 活化蛋白激酶磷酸化活化等促进骨骼肌和肝脏中脂肪酸氧 化，减少血清中游离脂肪酸1 6 7 1 。 肿瘤坏死因子q 是一种重要致炎因子，主要由巨噬细胞分泌，脂肪细胞及前 体脂肪细胞均可分泌t n f a ，t n f 0 【分泌随脂肪细胞及前脂肪细胞数目与体积上 升而增加，其可诱导前体脂肪细胞和脂肪细胞的凋亡瞄j 。t n f 0 【引起胰岛素抵抗 机制与t n f 仅抑制过氧化物酶增殖物激活受体y ( p p a r - y ) 、葡萄糖转运因子一4 的功能和腺苷单磷酸活化蛋白激酶( a m p k ) 的活性，上调核因子kb ( n f - kb ) 功 能有关【9 1 。血浆t n f 0 【水平在肥胖患者中明显增高，且t n f a 水平与i r 、糖耐 量异常有相关性。另有研究证实t n f c 1 参与动脉粥样硬化进程。 黄芩苷( b a i c a l i n ) 是由唇形科植物黄芩( s c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i sg e o r g i ) 的 干燥根中提取的一种黄酮类化合物，分子式：c 2 】h 】8 0 1 1 ，现在药理研究表明黄芩 苷具有广泛的生物活性，包括清除氧自由基抗氧化、抗血栓形成、抗菌作用、抗 滤过性病原体、调节免疫、促进细胞凋亡等多方面均有作用。在调节体脂方面， 有研究表明【1 0 】黄芩苷能使大鼠血清游离脂肪酸由0 3 l 0 0 3 下降至0 2 1 o 0 4 m e q l ；黄芩苷还显著降低大鼠血清中甘油三酯及肝组织胆固醇和甘油三酯 东南人学硕士学位论文 浓度；成俊英( 2 0 0 4 ) 1 1 】研究表明，黄芩素能够剂量依赖性地抑制3 t 3 l 1 前体脂 肪细胞分化以及脂肪酸合成酶活性，提示黄芩素具有潜在的减肥降脂作用。益文 杰( 2 0 0 5 ) 1 1 2 1 等研究表明黄芩茎叶总黄酮对大鼠长期喂以高脂饲料所造成的血清 总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇的升高有明显的抑制作用，并使高密 度脂蛋白胆固醇的含量有一定程度的升高，表明总黄酮对大鼠实验性高脂血症有 明显的预防作用。这些研究结果提示黄芩苷对脂肪细胞聚脂功能有影响。另外对 血管系统，我们的前期研究证明，黄芩苷通过下调细胞因子t n f 0 t , ，i l 6 ，对离 体大鼠心肌缺血具有保护作用【l 引。有离体研究表明黄芩素可以抑制血管平滑肌的 增殖和脂氧化酶，可作为预防动脉粥样硬化药物应用【1 4 】。 脂肪组织作为一种新发现的内分泌组织，其分泌的各种细胞因子还有待进一 步的研究，本课题拟在传统研究基础上，直接体外培养原代脂肪细胞比较培养法 差异，并观察黄芩苷对脂肪细胞增殖分化的影响，以及对脂联素、肿瘤坏死因子 0 【等脂肪细胞因子分泌的影响，进一步探讨黄芩苷调节脂肪细胞生长和分泌的作 用机制，以及与肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的关系，从而在细胞水平上 为黄芩苷防治肥胖相关的代谢性疾病提供理论依据。 2 文献综述 文献综述 脂肪细胞增殖、分化及脂肪细胞因子 1 脂肪细胞离体培养研究进展 1 1 前脂肪细胞理论的形成 脂肪细胞离体培养的实验工作始于2 0 世纪6 0 年代，五十年来，先后建立起 的脂肪细胞培养系统有两大类即脂肪细胞株系和脂肪细胞前体细胞。t r o w e l lo a ( 1 9 5 9 ) 发现前体脂肪细胞形态类似成纤维细胞，可在合适条件下分化诱导成脂 肪细胞。1 9 6 1 年h a u n e rhg 等首先进行小鼠脂肪细胞离体培养的实验工作。 s m i t h t ”】在1 9 7 1 年首次描述了培养人脂肪组织中的“成纤维细胞样”细胞。以后 对基质血管成份( s t r o m a iv a s c u l a rf r a c t i o ns v f ) 系统研究形成了完整的前脂肪 细胞理论。用胶原酶消化脂肪组织形成细胞单体，再将组织悬液离心，其沉淀物 即是s v f 。s v f 和成纤维细胞比较培养发现，这两种培养物的增殖速率相似， 倍增时间约5 0h 左右，当向培养基中加入5 血清，s v f 迅速增殖，s v f 细胞内 脂肪聚成大滴，成纤维细胞的胞浆内只有少量的脂滴，证明了s v f 内含有前脂 肪细胞，具有增殖和向成熟脂肪细胞分化的性能。前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞 在一定条件下是相互转化的，u m e krm 等于1 9 9 1 年将成熟脂肪细胞在维持培 养基上培养时失去了大量的脂肪，获得了像s v f 那样的形态特征。v a n 等i j 刨在 1 9 7 6 年研究成人的s v f 前脂肪细胞，发现其具有比皮肤成纤维细胞更高的脂蛋 白脂酶活力；比成纤维细胞高2 倍的脂肪酸合成酶活力，揭示了前脂肪细胞尽管 在普通培养基上与成纤维细胞呈现一样的形态，但是一旦转移到合适的培养基上 即开始积聚脂肪，分化成典型形态的成熟脂肪细胞，而同样条件下的成纤维细胞 则不能。v a n 等【1 7 1 1 9 8 2 年从鼠的s v f 细胞分离出后体外培养5 代，用胸腺嘧啶 标记后回植到同一鼠的肌肉内，3 4 个月后形成了大体的脂肪组织。这样，关于 脂肪组织内含有脂肪细胞和前脂肪细胞两种成份，在一定条件下相互转化呈现动 态过程的事实便确认无疑。 1 2 白色脂肪和棕色脂肪的发生 脂肪细胞分化主要过程可分为脂肪细胞前体、前体脂肪细胞和成熟的脂肪细 胞三个阶段。c r y e r b 等【1 8 】对大鼠附睾脂肪挚白色脂肪细胞发生过程的研究，观 察到脂肪细胞前体为紧贴毛细血管壁的一种成纤维细胞样细胞，使用脂肪细胞分 离技术分离出来的这种细胞呈圆形，直径8 1 2 9 m ，有一个卵圆形的核，常有一 个不同深度的凹陷，有时可见核仁。胞质中可见发达的高尔基复合体和粗面内质 网，线性体大部分是圆的，有方向不定的短嵴，并可见许多多聚核糖体，部分细 胞含有小脂滴( 直径o 5 1 a m ) ，培养2 2 小时后，所有细胞都变长，大多数细胞都含 有小脂滴f 直径o 7 9 m ) 。培养4 天后，细胞可明显分为两种，一种为细长形含小 脂滴的细胞，另一种细胞含有大的脂滴( 直径达1 5 9 m ) 。培养9 天后，细长形细 胞数量减少，大多数细胞都含大的脂滴( 直径2 0 r t m ) ，有些脂滴开始融合，胞质 中还可以看到一些小脂滴。随后，发育成典型的白色脂肪细胞。研究中还发现， 与成年大鼠相比，年轻大鼠的脂肪细胞前体较大，含小脂滴的百分比也较高，发 育为成熟的脂肪细胞所需的时间也短得多。 1 9 7 3 年n i i t s u v ”】等研究，大鼠肩胛间棕色脂肪组织于妊娠第1 5 天开始发 生，在脂肪组织的原基处，间充质细胞聚积。第1 7 天形成原始脂肪小叶，光镜 东南大学硕_ ：学位论文 下可见细胞岛之间有血管网分布。电镜下可见岛内这些脂肪细胞前体中，含有许 多游离核糖体、粗面内质网、糖原颗粒、一些光滑小泡和有衣小泡、分散的小脂 滴，这时期的主要特征是线粒体较大( 直径0 8 1 7 m ) ，具有粗短的嵴和基质颗粒。 第1 8 2 0 天，细胞内糖原颗粒聚积明显可见。此后直到出生后1 周，线粒体占据 着无脂胞质的大部分，粗面内质网变得不明显。细胞内脂滴逐渐增大，最终发育 成为成熟的棕色脂肪细胞。 1 3 前体脂肪细胞增殖机制 f l o r e s 掣2 0 】将细胞增殖( p r o l i f e r a t i o n ) 定义为某一特定的细胞群产生新细胞 的过程，而不管产生的细胞类型。前体脂肪细胞具有一般体细胞的有丝分裂能力， 在接种细胞数量适宜的情况下，前体脂肪细胞经过潜伏期后便进入指数增殖期， 细胞数量不断增多，最后相互接触汇合成片。汇合期时前体脂肪细胞不断增多从 而发生接触抑制和密度抑制，进入细胞停滞期。前体脂肪细胞的生长停滞是在 g 1 s 期界限的停顿，前体脂肪细胞的生长停滞过程与脂蛋白脂酶的出现、o b 2 4 基因的表达有关。前体脂肪细胞的分裂增殖是通过细胞周期实现的。细胞周期 ( c e l lc y c l e ) 是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束止的活动过程，分为 间期与分裂期两个阶段，间期又分为三期，即d n a 合成前期( g 1 期) 、d n a 合 成期( s 期) 和d n a 合成后期( g 2 期) 。细胞是否增生( 细胞能否通过细胞周期中的 g 1 s 检验点) ，受细胞周期调节蛋l 刍( c e l lc y c l er e g u l a t o r yp r o t e i n s ，c c r p s 腔* 0 ， c c r p s 分为正c c r p s ( ! z n 周期素、周期素依赖性激酶) 及负c c r p s ( 如周期素激酶 抑制剂) 。前者的主要生物效能为促进细胞周期的运转，而后者的主要生物效能 为抑制细胞周期的运转。如果负c c r p s 对g 1 s 转换的抑制作用小于正c c r p s 的促进作用，则细胞增生。影响前体脂肪细胞增殖的因素有：生长因子与受体、 c a m p p k a 信号系统、磷脂酰肌醇信号系统、有丝分裂原激活蛋白激酶 ( m i t o g e n a c t i v a t - e dp r o t e i n k i n a s e ，m a p k ) 信号途径等。 1 4 脂肪细胞分化机制 1 4 1 脂肪细胞来源 人和动物的脂肪组织大约三分之一是脂肪细胞，其次是各型血细胞、内皮细 胞、上皮细胞、成纤维细胞及不同分化程度的脂肪前体细胞( a d i p o s ep r e c u r s o r c e l l s ) ，所以从形态学上对成纤维细胞和前脂肪细胞做出区别，或者对处于各种 不同分化阶段的前脂肪细胞做出区别比较困难。脂肪细胞的分化起始于多能干细 胞终于成熟脂肪细胞，最常用的有两种体外培养体系，一类是组织干细胞，另一 类为前脂肪细胞系。前者如脂肪组织的基质血管细胞( s t r o m a lv a s c u l a rc e l l s ，s v c e l l s ) 、骨髓间质干细胞( 在不同条件下，可分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经细 胞、心肌细胞、软骨细胞、肌健细胞等1 ；后者如来源于s w i s s 小鼠胚胎成纤维 细胞3 t 3 f 4 4 2 a 和3 t 3 l i 、a t l 和t a 2 ( 用5 一氮胞苷处理10 t 1 2 ) 大鼠胚胎成 纤维细胞、来源于小鼠附睾脂肪细胞的o b l 7 7 1 和o b l 7 、来源于小鼠棕色脂肪组 织的b f c 11 3 ，来源于c 3 h 小鼠胚胎成纤维细胞的c 3 h 1 0 t 1 2 、来源于c 3 h 小 鼠畸形瘤细胞的1 2 4 6 和来源于2 1 天胎鼠颅盖骨的r c 3 j 1 【2 1 1 。其中从小鼠胚胎 的s w s i s 3 t 3 细胞中诱导分化出来的3 t 3 f 4 4 2 a 和3 t 3 l 1 细胞系是最常用最有代 表性的两个前脂肪细胞系，能特异性地分化成脂肪细胞。 1 4 2 脂肪细胞的取材 4 文献综述 在犊牛前体脂肪细胞的原代培养中，相对于附睾脂肪垫组织和皮下脂肪组 织，小肠网膜具有易采集、易消化、分离细胞纯度高、细胞接种密度大、生长良 好及分化率高等诸多优点。因此，犊牛小肠网膜更适于原代前脂肪细胞的分离培 养【2 2 】。以鼠作为细胞来源，取材以附睾处脂肪组织为佳，因为此处的脂肪组织不 会与其他组织粘连。猪原代前体脂肪细胞可来源于胎儿、新生仔猪( 1 - 7d ) 皮下、 腹膜后的脂肪组织，而选取猪胎儿的脂肪组织效果更好。 1 4 3 脂肪细胞分化过程 脂肪细胞的分化起始于中胚层多能干细胞，终止于成熟脂肪细胞，多能干细 胞包括皮下、血管问质的间充质细胞、骨髓基质干细胞等，成熟脂肪细胞包括成 熟的白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞。分化过程为：多能干细胞( m e s e n c h y m a ls t e m c e l l s ，m s c ) 一脂肪母细胞( a d i p o b l a s t ) 一前体脂肪细胞( p r e a d i p o c y t e ) 一不成熟 脂肪细胞( i m m a t u r ea d i p o s ec e l l ) 一成熟脂肪细胞( m a t u r ea d i p o c y t e ) 【z j , 2 4 j 。 分化早期脂肪以多个小脂滴的形式贮存于脂肪细胞中，此时的脂肪细胞也称 多小室脂肪细胞( m u l t i l o c u l a rc e l l s ) 。这些小的脂滴逐渐融合成一个大的脂滴，最 终形成成熟的脂肪细胞，又称单室脂肪细胞( u n i l o c u l a rc e l l s ) 。成熟的脂肪细胞一 般以一个大脂滴充满细胞的大部分，而稍微扁平的细胞核则位于周围胞浆的狭小 区域中。 1 4 4 脂肪细胞分化的标志 前体脂细胞的特异性标志物a 2 c o l 6 p o b 2 4 在成脂分化早期表达，此后随 分化时间推移而下降，在前体脂肪细胞早期分化阶段开始有 a 2 c o l 6 p o b 2 4 m r n a 特异性基因表达，其序列与人类编码型胶原a 2 链 ( a 2 c o l 6 ) 的基因序列很相似。 p p a r y 是核激素受体超家族成员之一，有p p a r y1 和p p a r y 2 两种异构 体，p p a y 2 其n 端比p p a r y1 多3 0 个氨基酸，是脂肪细胞特异性分化转录因 子。目前认为，脂肪细胞的分化由p a p ry r x r 异二聚体、c c a a t 增强子结合 蛋i 刍( c e b p ) 及脂肪细胞分化决定因子l 固醇调控元件结合蛋白1 ( a d d i s r e b p ) i 共同调控。p p a ry 对脂肪细胞的分化起正向调节作用。 脂蛋白脂酶( l p l ) 是一个6 0 k d 的糖蛋白，在脂肪细胞分化早期( 前脂肪细 胞) 即有表达，并随分化进程表达逐渐增加，至分化晚期表达渐趋稳定。实验研 究发现a d s c s 在分化为前脂肪细胞阶段缺乏l p l 的表达，因此l p l 作为促进脂 肪细胞分化的重要因子之一，己成为干细胞分化为前脂肪细胞的经典标志。 前脂肪细胞因子( p r e f - 1 ) 则是脂肪细胞分化早期具有分化抑制作用的分子标 志，p r e f - 1 的持续高表达可明显抑制脂肪细胞分化，而其表达抑制则明显增强脂 肪细胞的分化，提示p e r f - 1 在前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中是一个重要 的抑制性分子标志。 脂肪细胞分化晚期标志主要包括：( 1 ) 甘油三酯代谢相关的酶类，如乙酞辅 酶a 脱羧酶、甘油三磷酸脱氢酶、脂肪酸合成酶等；( 2 ) 激素相关蛋白，如胰 岛素敏感性葡萄糖转运蛋白、胰岛素受体、1 3 肾上腺素能受体等；( 3 ) 成熟脂肪 细胞特异产物，如脂肪细胞脂结合蛋白、激素敏感酯酶、脂肪酸转运蛋白、脂周 素、瘦素、脂素、脂联素( a c p r 3 0 ) g l 抵抗素等，其中脂联素( a c p r 3 0 ) 作为成熟脂 肪细胞特异表达的蛋白，重组a c p r 3 0 可显著降低肥胖动物体内的血糖和游离脂 肪酸、增强脂肪酸氧化、减轻体重和改善胰岛素敏感性。 东南人学硕上学位论文 1 5 影响脂肪细胞生长的因素 1 5 1 血清不利于脂肪细胞分化 s m i t h l 2 5 】发现在脂肪组织的器官培养中如加入多于5 的血清会导致培养组 织成纤维细胞样分化。而在人脂肪细胞原代培养中，血清的存在几乎完全抑制人 的脂肪细胞分化，虽然诱导细胞增殖生长需要血清，但是在用于维持成熟细胞活 性的单独培养中并不需要血清。无论人或鼠的脂肪细胞，在有血清时，其脂源酶 活性和葡萄糖消耗都是无血清时的两倍。为消除血清中细胞因子和激素对前脂肪 细胞增殖和分化研究的干扰，寻找作为成熟脂肪细胞所分泌的某些细胞因子的体 外研究模型，研究者一直在努力寻找一种无血清的培养基，先后发现了胰岛素、 胰岛素样生长因子一1 、甲状腺素、糖皮质激素等可以使动物的原代前脂肪细胞在 无血清的培养基中增殖和分化【2 6 ，2 7 1 。d e s l e xs 等于1 9 8 7 年在无血清的条件下， 首次证实在原代培养的人前脂肪细胞的培养基中加入生物素、泛酸、胰岛素、糖 皮质激素等促使人前脂肪细胞的增殖和分化。国内学者王鸿也证实了无血清的培 养基中添加胰岛素、地塞米松、甲状腺素、i b m x ，可以使9 0 以上小鼠f f 脂肪 细胞3 t 3 l 1 达到分化。目前，人前脂肪细胞培养的一大进步，就是用化学控制 的无血清培养液来取代传统的含血清的培养液。而动物前脂肪细胞的培养仍然用 含血清的培养基，无血清培养基的应用少见报道。 1 5 2 胶原酶 胶原酶消化作用适度与否对脂肪细胞生长起重要的作用，当细胞被胶原酶过 度作用时，细胞的粘附能力和散播能力下降，因此消化过度会对细胞造成严重损 伤，应严格控制，避免过长时间的消化细胞。一般来说，在一个标准的消化程序 中，当酶浓度为2 0 0u m l ，而组织密度为3m l g 时，组织块在3 7 c 振荡水浴中 孵育时间大约为6 0 9 0m i n 。然而不同的公司生产的胶原酶效能有所不同，而且 同一公司生产的不同批次的产品也有差异。 1 5 3 激素 胰岛素、三碘甲腺原氨酸( t r i i o d o t h y r o n i n e ，t 3 ) 、甲状腺素( t h y r o i d ，t 4 ) 等 均能促进猪前体脂肪细胞的分化，胰岛素在前脂肪细胞转化中起相当重要的作 用，它既有本身促进脂肪的积聚又有支持其它药物的脂肪积聚作用i z 引。胰岛素不 仅延长脂肪细胞存活时间，而且能提高g p d h 脂源性酶的活性，起着将生脂酶 活性放大的作用。而这种作用是可逆的，因为去除胰岛素导致这些酶的活性快速 下降，而在原本缺乏胰岛素的培养液中加入胰岛素，可以刺激这些“饥饿”的细 胞重新合成脂源性酶。糖皮质激素对前体脂肪细胞的作用随糖皮质激素受体 ( g l u c o c o n i o o i d r e c e p t a l ，g r ) 数目的变化和胚胎年龄的增长而变化，加入胰岛素和 糖皮质激素后，原代培养的猪s v 细胞c e b p a 蛋白的表达在脂滴积聚之前或 刚开始时达到顶峰，而c e b pb 蛋白则与脂滴增长相关( h a u s m a n g j ，2 0 0 0 ) 。 糖皮质激素和胰岛素明显加快对t a i 细胞由前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化。 1 5 4 生长因子 1 9 8 9 年，h a u s m a ng t 发现类胰岛素生长因子( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r - i ， i g f i ) 口- 3 有效促进猪s v 细胞的增殖分化。猪正常血清中，i g f i 水平高于胰岛 素，垂体摘除后猪血清中i g f i 浓度降低而胰岛素水平正常，这说明i g f i 对脂 6 文献综述 肪细胞分化的促进作用大于胰岛素。当体内、体外缺乏生长因子( 主要是i g f i ) 时，均可抑制脂肪细胞分化，这与