（无机化学专业论文）具有双阳离子侧臂的22联吡啶铜、锌配合物对金属酶的模拟研究.pdf

摘要 金属酶的活性除了与活性中心的金属离子及其配位的氨基酸残基有关之外， 还与该中心微环境的多重弱相互作用有关，如静电作用、疏水作用和氢键作用等。 对金属酶的模拟虽然已做了大量的工作，但大部分集中在对酶活性部位金属离子 配位构型和配体的模拟上，只有很少的一部分模拟研究考虑了弱相互作用的协同 效应。本文通过在2 , 2 - 联吡啶的5 ，5 ，- 位上进行修饰，设计合成出一系列具有功能 基团或多金属配位点的2 , 2 - 联吡啶衍生物作为配体，并与过渡金属离子c l l ( i i ) 或 z n ( i d 配位，得到一系列单核或三核的金属酶模型配合物，用以模拟金属酶的金属 中心及其催化过程所需的静电作用和疏水环境，以及研究多金属核之间的协同作 用和功能基团与活性中心的协同作用对金属酶和模型配合物活性的影响。本文的 内容包括以下几部分： 1 设计和合成了一系列具有不同修饰基团的2 , 2 - 联吡啶( b i p y ) 衍生物作为 配体，并通过元素分析、质谱、核磁共振和x 射线单晶衍射等技术表征了配体的 结构。用三乙胺和三正丁胺在b i p y 的5 ，5 ，位上进行修饰，得到具有双季铵离子侧 臂的配体l 1 和l 2 ( l 1 = 5 , 5 - - - ( - - - - 7 , 铵基甲基) 2 , 2 - 联吡啶，l 2 = 5 ，5 ，二( 三正 丁铵基甲基) - 2 , 2 - 联吡啶) ，季铵离子侧臂可以模拟金属酶活性中心周围的静电 作用和疏水环境；采用不同的配位基团在2 ，2 ，- 联吡啶的5 ，5 ，位上进行修饰，得到 三核配体l 3 和l 4 ( l 3 = j = m r 四( 2 吡啶甲基) 5 ，5 - - 胺甲基- 2 , 2 - 联吡啶，i l 4 = l m 一四( 羧基甲基) 一5 ，5 - 二胺甲基- 2 , 2 - 联吡啶) ，将两端侧臂的弱相互作用变 成强作用。为了比较，还合成了一个三角形的三核配体r ( r = m m 肥，：， 六( 2 吡啶甲基) - l ，3 ，5 三胺甲基苯) 。 2 设计和合成了两个具有不同链长烷基季铵离子侧臂的2 ，2 ，联吡啶铜配合 物并表征了它们的晶体结构： c u ( l 1 h 0 3 0 1 5 + ( 1 ) 和【c u ( l 2 ) 2 r ) 】2 + ( 2 ) 。热变性 实验结果显示，配合物1 和2 都表现出比未修饰的2 , 2 - 联吡啶铜配合物 ( c u ( b i p y ) 2 2 + ) 较强的d n a 亲和力，三个配合物对c td n a 的亲和力顺序为：1 2 c u ( b i p y ) 2 2 + ，说明正电性季铵离子侧臂的引入可以增大配合物与d n a 负电性 磷酸根骨架之问的静电作用。通过在自由基猝灭剂存在下测试配合物对 i p b r 3 2 2 d n a 的断裂，初步证实d n a 断裂机制为水解模式。水解断裂p b r 3 2 2d n a 的研究显示，与未修饰的联毗啶配合物相比，l 的催化效率提高了十倍，证明三 乙基季铵离子侧臂可以通过静电作用促使配合物更易与d n a 结合，从而加速d n a 的断裂。晶体结构数据显示，配合物的三个作用位点之间的距离和排列方式与 d n a 链上的磷酸根骨架相匹配，这就使两端季铵离子侧臂与中, g c u - o h 活性物种 之间的协同作用成为可能。2 未能显示出理想的催化效率，则是由于丁基产生的 空间位阻阻碍了配合物与d n a 的结合。 3 为了直接模拟天然核酸酶活性中心的锌离子，又以z n ( i i ) 代替配合物1 和2 中的c l l ( i i ) 与l 1 和l 2 反应得到了配合物【z n ( l 1 ) 3 】3 + ( 3 ) f r l z n ( l 2 ) 2 ( b r ) 5 + ( 4 ) 。晶体 结构分析表明，z n ( i d 易与具有较小侧臂的配体l 1 形成1 ：3 的配合物，而与具有较 大侧臂的配体l 2 则形成l ：2 的配合物。配合物4 的结构与c l l ( i d 配合物1 和2 相似，其 侧臂上带正电荷的氮原子与配位溴离子处于一条直线上，正电荷季铵离子和溴之 间的距离与d n a 链上相邻的两个磷酸根之间的距离相匹配。通过测试配合物在不 同p h 值条件下的1 hm 4 r i 着，证实了配合物在水溶液中会发生配体与水分子的交 换，从而产生进攻d n a 的活性物种 z n ( l h ( o h ) 】5 + 。水解断裂p b r 3 2 2d n a 的研究 发现配合物3 和4 对d n a 的断裂能力均随着配合物浓度的增大而增大，在p h6 9 的范围内呈现“钟”型变化，在p h = 7 5 时达到最大值。与c u ( i i ) 配合物的情况明 显不同的是，配合物3 和4 催化断裂d n a 的效率相差不大，这可能是因为配体l 1 与 z n ( i i ) 形成3 ：1 配合物的强烈倾向，降低了活性物种【z n ( l m o 固r 的浓度，因此侧 链基团较小的配合物3 未能表现出比配合物4 更高的活性。 4 设计和合成了三个具有不同正电荷和空间构型的三核c u ( n ) 配合物：两端 为正电荷基团并具有线形结构的 c u 3 ( r ) r ( 5 ) 、两端为电中性基团且具有线形 结构的 c u s ( l 4 ) 】2 + ( 6 ) 和具有三角形结构i 拘 c u s ( l s ) 6 + ( 7 ) 。c td n a 热变性实验 结果显示，这些配合物具有较强的d n a 亲和力，在较高的浓度下均可降低d n a 双螺旋的稳定性。通过在自由基猝灭剂存在下测试配合物g ：j p b r 3 2 2 d n a 的断裂， 初步证实断裂机制为水解模式。水解断裂p b r 3 2 2 质粒d n a 的研究显示，配合物5 比配合物6 的核酸酶活性高1 0 倍以上，说明两端的侧臂基团带有正电荷时有利于 催化d n a 断裂；对于正电荷数目相同的两个三核配合物而言，线形的配合物5 比 三角形的配合物7 活性高大约3 0 倍，说明线形捧列的三个金属离子有利于与d n a 链上呈线形捧列的磷酸根骨架同时发生作用，从而通过多金属中心的协同作用更 为有效地水解断裂d n a 。 5 以z n ( i d 代替配合物5 中的c u ( n ) 合成出一个线形的三核锌配合物 z n 3 ( l 3 ) o - 1 2 0 m 6 + ( 8 ) 并表征了其晶体结构。水解断裂p b r 3 2 2d n a 的实验结果显 示，配合物8 具有较高的核酸酶活性。采用量子化学从头计算法和密度泛函理论 对配合物8 水解断裂d n a 过程中可能形成的各种中间体进行了几何结构优化，预 测了中间体的最稳定结构。结果显示，结构与核酸链上的磷酸根骨架相匹配的线 形三核z n ( i i ) 配合物可以形成一种由三个z n ( i i ) 离子同时与磷酸根配位而稳定的过 渡态，并通过其中的两+ z n ( i i ) 离子的协同作用促使磷酸酯键发生水解断裂。 6 由于配合物1 和2 中铜离子周围的正电性和疏水性环境具有c u , z n - s o d 活 性中心的微环境特征，因此对配合物1 和2 进行了s o d 模拟研究。首先测定了配合 物1 和2 以及【c i l ( b i p y ) 2 】2 + 的电化学性质，结果显示，季铵离子侧臂的引入使配合物 的e l a l 甸正电位方向发生了移动，可能是由于正电荷侧臂的吸电子作用使c u ( i d 离 子上的电子密度大大降低所致，并采用量子化学自然成键轨道理论分析了体系的 电子结构和电荷分布，验证了上述实验结果。用黄嘌呤黄嘌呤氧化酶- n b t 法测 定了配合物的s o d 活性，结果显示配合物2 具有非常高的s o d 活性，高于文献报 道的模型物，是天然b e s o d 的一半，与文献报道的山葵s o d 活性相同。大幅提高 的s o d 活性可归结于：( 1 ) 带正电荷的季铵离子可以直接吸引底物超氧离子接近 活性中心的c l l ( i d 离子；( 2 ) 季铵离子侧臂的诱导吸电子效应使配合物中c u ( i i ) 的 氧化还原电位升高，从而增强t c u ( i d 将0 2 。氧化为0 2 的能力；可见，配合物中的 季铵离子可以发挥c u , z n - s o d d p a r g l 4 1 的作用。( 3 ) 季铵离子上丁基侧链提供的 适宜疏水环境有利于超氧离子与配位水分子的竞争。通过控制反应条件，合成了 c u ( i i ) - 与l 1 和l 2 的比例为l ：l 的配合物【c u ( l 1 ) ( b 0 2 1 2 + ( 9 ) 和【c u 口) ( b r 脚斗( 1 0 ) ， 对这两个配合物进行s o d 模拟研究，所得结果与1 ：2 的体系相同，进一步验证了上 述结论。 关键词：2 , 2 - 联吡啶衍生物，铜( i d 配合物，锌( i i ) 配合物，核酸酶模拟，s o d 模 拟 ， i l l m i m i co fm e t a l l o e n z y m e sb yc o p p e rz i n cc o m p l e x e s o f2 ，27 - b i p y r i d i n ew i t hd i c a t i o n i cp e n d a n t s n a m e ：y a h a n s u p e r v i s o r ：p r o f z o n g - w a nm a o m a j o r ：i n o r g a n i cc h e m i s t r y a b s t r a c t m a n ys t u d i e sr e v e a l e dt h a tt h ea c t i v i t i e so fm e t a l l o e n z y m e sd e p e n dn o to n l yo n t h em e t a li o n sl o c a t e di na c t i v es i t e sa n dt h ec o o r d i n a t e da m i n oa c i dr e s i d u e s b u ta l s o o nt h em u l t i p l ew e a ki n t e r a c t i o no ft h em i c r o e n v i r o n m e n ts u r r o u n d i n gt h ea c t i v es i t e , s u c ha se l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n , h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o na n d h y d r o g e nb o n da ss oo n b u ts of a r , m o s tr e s e a r c h e sf o c u s e do nt h ec o o r d i n a t i o ns t r u c t u r e so f m e t a li o n sa n dt h e s i m u l a t i o no ft h el i g a a d s l i t t l em i m i ci sr e l a t e dt os y n e r g e t i ce f f e c t so ft h ew e a k i n t e r a c t i o n i nt h i sw o r k , as e r i e so f2 2 - b i p y r i d i n ed e r i v a t i v e sa n dt h ec o r r e s p o n d i n g m o n o n u c l e a ro rt r i n u c l e a rm e t a lc o m p l e x e sh a v eb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dt o m i m i ct h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o na n dh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n ts u r r o u n d i n gt h e a c t i v es i t ea n dt h em u l t i - m e t a lc e n t e r so ft h em e t a l l o c n z y m e s ，t oi n v e s t i g a t et h e s y n e r g e t i ce f f e c t so f t h ec e n t r a lm e t a l sa n df u n c t i o n a lg r o u p s 1 as e r i e so f2 , 2 - b i p y r i d i n ed e r i v a t i v e sh a v eb e e nd e s i g n e d , s y n t h e s i z e da n d d 擒瑚i c lc e ：r i 擂db ye a ，e s i - m s ，1 hn m ra n dx - r a yc r y s t a l l o g r a p h y t h e ya r eb i d e n t a t e l i g a n d sw i t hd i c a t i o n i cp e n d a n t s ，l 1a n dl 2 ( l 1 = 5 , 5 - d i ( t r i e t h y l a m m o n i o m e t h y l ) - 2 , 2 - d i p y r i d y lc a t i o na n dl 2 = 5 , 5 - d i ( t r i n - b u t y l - a m m o n i o m e t h y l ) - 2 , 2 - d i p y r i d y lc a t i o n ) a n dt r i n u l e a r l i g a n d sw i t h d i f f e r e n tm e t a l b i n d i n g p e n d a n t s l 3a n dl 4 ( l 3 = n , n v , n t e t r a ( 2 p y r i d y l ) - m e t h y l 5 ，5 b i s ( a m i n o m e t h y l ) - 2 2 - d i p y r i d y l , h 4 l 4 = n , , n , n , n - t e t r a ( c a r b o x y m e t h y l ) - 5 ，5 l b i s ( a m i n o m e t h y l ) - 2 , 2 l i p y r i d y l ) f o rc o m p a r i s o n , t h ea - i a n g n l a rl i g a n d l 5 = n , n , n , n , n , n - h e x a ( 2 - p y r i d y l ) - m e t h y l 1 ，3 ，5 - t r i s ( a m i n o m c t h y l ) - b e n z c n e ) 懈a l s os y n t h e s i z e d 2 t w oh i g h l yc h a r g e dc a t i o n i cc o p p e r ( n ) c o m p l e x e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e da n d c h a r a c t e r i z e ds t r u c t u r a l l y ： c u ( l 1 ) 2 ( b r ) 】5 + ( i ) a n d c u ( l 2 h ( b r ) 针( 2 ) x - r a ys t r u c t u r e s s h o wt h a ti nb o t hc o m p l e x e s ，t w on i t r o g e na t o m so ft h ee l e c t r o p o s i t i v ep e n d a n t sa n d c o o r d i n a t e db r o m i d ei o na r r a yi na s t r a i g h tl i n e t h e i rc l o s ed i s t a n c e so f n b ra t o m s a l e5 7 7 2a n d5 5 9 4ar e s p e c t i v e l y , w h i c hi s c o m p a r a b l et ot h a to fa d j a c e n t p h o s p h o d i e s t e r si nb f o r md n a ( c a 6 舢i nt h ea b s e n c eo fr e d u c i n ga g e n t , t h e s u p e r c o i l e dp l a s m i dd n ac l e a v a g eb yt h ec o m p l e x e sh a sb e e np e r f o r m e da n dt h e i r h y d r o l y t i cm e c h a n i s m sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d t h ep s e u d om i c h a e l i s - m e n t e nk i n e t i c p a r a m e t e r s ( 毛曲，4 1 5h 1f o r1 ，0 4 3h - 1f o r2a n d0 6 1h 1f o r c u ( b i p y ) 2 2 + a 把 o b t a i n e d t h i sr e s u l ti n d i c a t e st h a t1e x h i b i t sm a r k e d l yh i g h e rn u c l c a s ea c t i v i t yt h a n2 a n d c u ( b i p y h 2 + m g ha b i l i t yo f d n a c l e a v a g ef o r1c a nb ea t t r i b u t e dt ot h ee f f e c t i v e c o o p e r a t i o no ft h em e t a lm o i e t ya n dt w op o s i t i v ep e n d a n t ss i n c et h ea r r a yo fl i n e a r t r i - b i n d i n gs i t e sa g r e e sw i t ht h a to f t h r e ep h o s p h o d i e s t e rb a c k b o n eo f n u c l e i ca c i d 3 ，c o p p e ri o n sh a v eb e e nr e p l a c e dw i t hz i n ci o n sa n dt h e na1 ：3 ( 豳( l 1 ) 3 】3 ) a n da1 ：2 ( z n ( l 2 h ( b r ) 5 + 4 ) z n ( 1 1 ) - lc o m p l e xh a v eb e e ni s o l a t e df o rl 1a n dl 2 ， r e s p e c t i v e l y b o t hc o m p l e x e se x h i b i th i 曲n a c l e a s ea c t i v i t i e st o w a r d sc l e a v a g eo f s u p e r c o i l e dp l a s m i dd n a w i t ht h ea c t i v i t yb e i n gt h em a x i m u mu n d e rp h y s i o l o g i c a l p h t h ee f f e c t i v ed n ac l e a v a g em a ya t t r i b u t et ot h es t r o n ge l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no f t h em e t a lm o i e t ya n dt w op o s i t i v ep e n d a n t sw i t hp h o s p h o d i e s t e rg r o u p so fn u c l e i c a c i d 4 t h r e et r i n u c l e a rc o p p e “i dc o m p l e x e sw i t hl i n e a ro rt r i a n g u l a rs t r u c t u r e sa n d d i f f e r e n tm e t a l b i n d i n gp e n d a n t s ， c u 3 ( l 3 ) “( 5 ) ， c u 3 ( l 4 ) 2 + 旧a n d c u 3 ( l s ) 6 + ( 7 ) ， h a v eb e e ns y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r l g e d i n t e r a c t i o n so ft h e mw i t hc td n ah a v e b e e ni n v e s t i g a t e db ym e a s u r i n gt h ec h a n g e si nt h em e l t i n gt e m p e r a t u r e t h eo b t a i n e d 4 死v a l u e si n d i c a t et h a ta l lt h et h r e ec o m p l e x e se x h i b i tv e r yh i g ha f f i n i t i e st o w a r d s d n aa n ds t r o n gd e s t a b i l i z a t i o no fd n a i nt h ea b s e n c eo fa n yr e d u c i n ga g e n t , 5 s h o w sm a r k e d l yh i g h e rn u g l e a s ea c t i v i t yt h a n6a n d7 ，a n di t sh y d r o l y t i cp r o c e s sh a s b e e nf i l l 恤e rc l a r i f i e di nt h ep r e s e n c eo faf e wo fr a d i c a ls c a v e n g e r s t h ep s e u d o v m i c h a e l i s - m e n t e nk i n e t i cp a r a m e t e r s ( 蚴a 船d e t e m d n e d t ob e6 0 5 ，0 3 6a n do 1 9h 1 f o r5 6a n d7r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dh 卿啪n5a n d7 ，m u c hh i g h e rn u c l e a s ea c t i v i t y o f5i sp r o b a b l ya t t r i b u t e dt oi t sl i n e a rm u l t i p l em e t a ls i t e st h a tf i tw e l lt ot h e p b o s p b o d i e s t e rb a c k b o n eo f n u c l e i ca c i d a n dt h em u c hh i g h e rn u c l e a s ea c t i v i t yo f5 t h a nt h a to f 6i n d i c a t e st h a tt h ep o s i t i v ec h a r g e sm a yb eb e n e f i c i a lt ot h ec a t a l y s i s 5 c o p p e ri o n sh a v eb e e nh e r er e p l a c e dw i t hz i n ci o n sa n dt h e na ne x p t o d l i n e a rt r i n u c l e a rz i n cc o m p l e x z n 3 ( l 3 x h 2 0 ) s r ( 8 ) h a sb e e ni s o l a t e da n ds t r u c t t w a l l y c h a 聪吣t e f i z e db yx - r a yc r y s t a l l o g r a p h y t h ec o m p l e xe x h i b i t sav e r yh i g hn u c l e a s e a c t i v i t y t h e o r e t i c a le v a l u a t i o nt op o s s i b l eh y d r o l y s i sp a t h w a y si n d i c a t e s t h a tt h e t r i n u c l e a rc o m p l e xf i t t t n gt ot h ep h o s p h o e s t e rb a c k b o n eo fn u c k i ca c i dc a nc a t a l y z e t h ep h o s p h o e s t e rh y d r o l y s i st h r o u g had i n u c l e a rc o o p e r a t i v ei l l t a m e d i a m e t h a ti s s t a b i l i z e db ya l lt h r e ez i n ci o n s 6 t h es o d - l i k ea c t i v i t i e so f1 ，2a n d c u ( b i p y ) 2 ”h a v eb e e ni n v e s t i g a t e db y x a n t h i n e j x a n t h i n eo x i d a s e - n b ta s s a y o b t a i n e dl c s ov a l u e si n d i c a t et h a tt h es o d l i k e a c t i v i t i e so fa l lc o m p l e x e si n c r e a s ei nt h eo r d e r c u ( b i p y ) 2 ” 1 2 c o m p l e x2 e x h i b i t sm u c hh i g h e rs o d - l i k ea c t i v i t yt h a no t h e rr e p o r t e ds o dm i m i c s t h e e n h a n c e ds o d a c t i v i t yo r i g i n a t e sf r o mt h ed i c a t i o n i cp e n d a n t ss t e e r i i l gt h es u p e m x i d e s u b s t r a t ea n de n h 趾c i n gr e d o xp o t e n t i a l sa n dab e f i t t i n gh y d r o p h o b i ce n v k o n m e n t a r o u n dt h ec u ( i i ) i o n a l la n a l y s e sa t es u p p o r t e db yt h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o n 日峙l ：l c o ( n ) lc o m p l e x e s 【c u ( l 1 x b r ) 2 2 + ( 9 ) a n d c u ( l 2 x b r ) 2 2 + ( 1 0 ) f o rl 1a n d l 2h a v e b e e ni s o l a 似la n de x a m i n e da ss o d 棚越c s t h er e s u l t sa r es i m i l a rt oc o m p l e x e s1 a n d2 ，w h i c hi m p r o v e st h ea b o v e - m e n t i o n e dc o n c l u s i o n k e y w o r d s ：2 , 2 - b i p y r i d y ld e r i v a t i v e s ，c u ( i i ) c o m p l e x e s , z n ( i i ) c o m p l e x e s , n u c l e a s e m i m i c s ，s o dm i m i c s v 1 原创性声明 本人郑重声明：所里交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作的成果。除文中已经注明 引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全 意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名喜蓝 日期：2 0 司年月日 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人 在导师指导下完成的成果，该成果属于中山大学化学与 化学工程学院，受国家知识产权法保护。在学期间与毕 业后以任何形式公开发表论文或申请专利，均需由导师 作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以任 何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论 文成果。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名毫蒸 日期：凋年月f 日 中山大学博士学位论文 1 1 引言 第1 章前言 生物体内存在很多金属酶，它们是金属蛋白中执行特殊催化功能的一个亚 族，对生命体系中的底物分子起着特定的催化作用，催化生命体内每时每刻都进 行着的复杂的生化反应，比如糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素以及无机盐的 合成与代谢，这些反应能在温和的条件下快速进行，都得益于各种不同类型金属 酶的参与。金属酶催化效率高、选择性好、反应条件温和，是理想的催化剂，这 无疑引起了众多化学家、生物学家和医学家的广泛兴趣。但是由于天然金属酶结 构复杂、稳定性差、反应条件比较苛刻，而且价格昂贵、使用时间短，大大限制 了对它们的应用和研究。因而用化学的方法设计和合成一些比较简单和更为稳定 的金属配合物作为金属酶模型来模拟金属酶对其底物的催化作用，就为研究生命 体系中的化学过程提供了广泛的可行性。 1 2 金属酶及其催化功能 具有催化功能的金属蛋白称为金属酶。金属酶是一个复杂的配合物，含有一 个或少数几个金属离子，却含有几十甚至几百个氨基酸，而直接与金属配位的只 有几个特定的氨基酸，其他氨基酸为金属酶提供特殊的微环境，对金属酶的配位 催化起着不可或缺的复杂作用。 金属酶中的金属主要是元素周期表中第一过渡系的金属( v 、c r 、b i n ；f e 、 c o 、n i ；c u 、z n ) ，它们在金属酶中所起的作用包括结构作用、催化中心作用和 电子传递作用。金属离子的配位多样性是金属酶具有不同催化性能的基础。金属 离子是金属酶的活性中心，底物需配位在金属离子上催化反应才能进行。金属离 子的正电荷可以中和或屏蔽底物上的负电荷，改变其表面的电荷分布，加速反应 第l 章前言 进行；过渡金属离子的变价起到电子传递作用，这是金属酶能作为电子载体，在 生物体内传递电子的基础，是氧化还原酶催化作用的基础。 金属酶对生命体系中的底物起着多种多样的催化作用，表1 i 归纳了某些金属 酶的催化反应，并按其功能分类【l - 6 。 表1 i 一些重要的金属酶及其功能 水解类金属酶能够催化加成或者消除底物分子中水的成分，著名的例子有促 进c 0 2 水解的碳酸酐酶、催化肽键水解断裂的羧肽酶a 和催化磷酸酯分解的磷酸酯 酶。另外，许多金属酶催化的反应包括底物的氧化、还原或歧化。例如，细胞色 素p - 4 5 0 单加氧酶的铁卟啉中心可催化烃氧化到醇的反应；核苷酸还原酶可以将核 苷酸还原为脱氧核苷酸；固氮酶可催化分子氮还原为氨；超氧化物歧化酶可催化 超氧离子自由基歧化为氧气和过氧化氢。本文主要关注磷酸酯酶和超氧化物歧化 酶的结构、催化机理以及模拟研究。 1 2 i 磷酸酯酶 磷酸酯酶( p h o s p h a t a s e ，p p ) 包括磷酸单酯酶、磷酸二酯酶及多种核酸酶， 2 中山大学博士学位论文 它们都能催化磷酸酯键的水解断裂。自然界包括很多种金属磷酸酯水解酶，表l - 2 列举了一些常见的天然磷酸酯酶，并归纳了它们的催化底物以及酶活性部位的金 属离子。 表i - 2 一些常见的天然磷酸酯酶 这类金属酶的一个共同特点是，它们通常具有两个或两个以上非氧化还原活 性的金属离子，下面举例介绍磷酸酯酶的结构特征及催化机理。 1 2 1 1 碱性磷酸酯酶 碱性磷酸酯酶【7 。埘( a l k a l i n ep p ，a k p ) 的活性中心含有两个z n ( i i ) 离子，另 外还含有一个不直接参与催化的m g ( i i ) 离子，其结构如图1 1 所示。其中z n l 与分 别来自两个组氨酸( h i s 3 3 1 ，h i s 4 1 2 ) 的氮原子，一个天冬氨酸( a s p 3 2 7 ) 的两个 第1 章前言 氧原子以及一个水分子配位，z n 2 与分别来自两个天冬氨酸( a s p 5 1 ，a s p 3 6 9 ) 的 氧原子，一个组氨酸( h i s 3 7 0 ) 的氮原子，一个丝氨酸( s e r l 0 2 ) 的氧原子以及 一个水分子配位，都形成五配位的几何构型。 图1 1 碱性磷酸酯酶f l l l ( p d b i d ：l a l k ) 的结构( a ) 和活性中一t = c , r e 位构型( b ) 。 碱性磷酸酯酶催化水解的典型底物是磷酸单酯，如对磷酸硝基苯酯，其反应 如式( 1 - 1 ) 所示。 r - - o - - p 0 3 2 + h 2 0 r o h + h p 0 4 2 。 ( 1 - 1 ) 碱性磷酸酯酶的一对z n ( i d 离子和底物端梢的磷酸酯基团结合，丝氨酸的氢氧根处 于活性部位，进攻磷酰基，是断裂酯的官能团。在这一过程中，磷酸酯转移到酶 上，形成磷酰基丝氨酸残基。该磷酸酯被配位的氢氧根离子水解，完成催化循环。 上述步骤通常被称作“秋千”机理，简示于图1 2 中，水解过程中，活性中心附近 的正电性精氨酸残基( a r 9 1 6 6 ) 与底物负电性的磷酸酯之间的静电作用使底物定 向结合在活性部位上，与z n ( i i ) 离子配位的氢氧根进攻磷酰基丝氨酸酯使其发生断 裂。 4 中山大学博士学位论文 图1 2 碱性磷酸酯酶水解断裂磷酸单酯的“秋千”机理图示 1 2 1 2 紫色酸性磷酸酯酶 紫色酸性磷酸酯酶 1 2 - 1 7 l ( p u r p l ea c i dp p ，p a p ) 的活性中心通常含；f f z n ( i i ) 离 子和f e ( m ) 离子，也有少数p a p 的活性中心含有f e ( i i ) 离子和f e ( i i i ) 离子，而且两 个金属离子被天冬氨酸残基上的羧基氧原子桥联。例如，图1 - 3 是四季豆紫色酸性 磷酸酯酶的结构和活性中心金属离子的配位构型。如图所示，z n ( i i ) 离子与分别来 自两个组氨酸( h i s 2 8 6 ，h i s 3 2 3 ) 的氮原子，个天冬氨酸( a s p l 6 4 ) 的一个氧原 子，一个天冬酰胺( a s h 2 0 1 ) 的一个氧原子以及一个水分子配位，f e ( i i i ) 离子与 天冬氨酸( a s p l 6 4 ) 的另一个氧原子，天冬氨酸( a s p l 3 5 ) 的一个氧原子，组氨 酸( h i s 3 2 5 ) 的一个氮原子，酪氨酸( t y r l 6 7 ) 的氧原子以及一个水分子配位， 都形成五配位的几何构型。 5 第l 章前言 匿1 1 - 3 四季豆紫色酸性磷酸酯酶【1 ”( p d b i d ：4 k b p ) 的结构( a ) 和活性中心配位构型( b ) 催化磷酸单酯水解的p a p 在弱酸性的条件下( p h4 9 6 o ) 活性最大，故此 而得名。其分子中的两个金属离子被天冬氨酸残基的羧基氧桥联，每个金属离子 留有一个空的配位点，这个配位点也可能被水分子占据着。在催化底物水解时， 由f e ( i i d 离子活化的h 2 0 或o h 亲核进攻底物的磷原子，形成配位几何构型为三角 双锥的过渡态，z n ( i i ) 离子和f c ( i i d 离子主要提供静电稳定作用，这一过程示于图 l - 4 中。 图l - 4 紫色酸性磷酸酯酶水解断裂磷酸单酯的机理图示 6 中山大学博士学位论文 在催化底物水解的过程中，活性中心附近的几个组氨酸残基( h i s 2 0 2 ，h i s 2 9 5 ， i i i s 2 9 6 ) 起到了非常重要的作用，这些组氨酸残基上的氢离子通过与磷酸酯底物 上的氧离子之间形成氢键，从而利于中间过渡态的结构稳定，并促使水解产物易 于离去。 1 2 1 3 核酸酶p l 核酸酶p l 【1 9 - 2 5 】( n u c l e a s ep 1 ) 中含有三个z n ( i i ) 离子，图1 5 是核酸酶p l 的结 构和金属离子的配位构型。如图所示，z n l 与分别来自两个组氨酸( h i s 6 0 ，h i s l l 6 ) 的两个氮原子，分别来自两个天冬氨酸( a s p 4 5 ，a s p l 2 0 ) 的两个氧原子以及一 个水分子配位，z n 3 与一个来自组氨酸( h i s 6 ) 的氮原子，来自色氨酸( t r p l ) 的 一个氧原子和一个氮原子，天冬氨酸( a s p l 2 0 ) 的另一个氧原子以及与z n l 配位 的水分子配位，z n 2 与分别来自两个组氨酸( h i s l 2 6 ，h i s l 4 9 ) 的两个氮原子，一 个天冬氨酸( a s p l 5 3 ) 的氧原子以及两个水分子配位，都形成畸变三角双锥的五 配位几何构型。 图1 - 5 核酸酶p 1 1 2 6 1 ( p d b i d ：l a k 0 ) 的结构( a ) 和活性中心配位构型( b ) 7 第1 章前言 核酸酶p l 中的两个z n 0 i ) 离子( z n l 和z n 3 ) 被天冬氨酸残基的羧基氧和一个 水分子桥联构成双核单元，另一个单核的z n ( i i ) 离子( z n 2 ) 是酶的催化活性中一f i , ， 双核单元作为辅助基团起着维持结构的作用。它能水解d n a 或r n a 中的磷酸二酯 键，生成5 - 核苷酸或5 - 脱氧核苷酸，被广泛地用来研究核酸的二级结构，是基因 工程研究中的一种工具酶。 1 2 2 超氧化物歧化酶 在具有氧化还原活性的金属离子与双氧发生反应时，有若干步骤产生的活性 物种含有未成对的电子，特别是超氧离子0 2 等对生物体有害的自由基。而超氧 化物歧化酶( s u p e m x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 能如式( 1 - 2 ) 所示有效地催化超氧离 子0 2 歧化生成0 2 和h 2 0 2 ，清除代谢过程中潜在的有毒副产物，从而呵护生物体 对双氧的利用1 2 7 - 3 0 1 。 2 0 2 。+ 2 i - i + h 2 0 2 + 0 2 ( 1 2 ) 已知超氧化物歧化酶具有氧化还原活性的锰、铁、铜或镍中心，下面分别介 绍含有不同金属离子的超氧化物歧化酶。 1 2 2 1 铜- 锌超氧化物歧化酶 铜锌超氧化物歧化酶( c u , z n - s o d ) 是研究的最为广泛的超氧化物歧化酶 1 3 t - 5 1 1 ，已通过结晶制得，并用x 射线衍射技术测定了它的晶体结构，其结构如图 1 - 6 所示。c u , z