（临床医学专业论文）epo在大鼠缺血再灌注急性肾损伤模型中对内质网应激的影响.pdf

目录 英文缩略词表3 中文摘要。4 英文摘要一6 论文正文一8 1 j 一 日舌8 材料与方法9 结果1 3 讨论二一2 8 结论3 2 文献综述3 3 参考文献_ 4 5 致谢4 8 2 英文缩略词表 缩略词英文全称中文全称 a k ia c u t ek i d n e yi n ju r y急性。肾损伤 a r f a c u t er e n a lf a i l u r e急性肾功能衰竭 a t n a c u t et u b u l a rn e c r o s i s急性肾小管坏死 e p 0 e r y t h r o p o i e t i n红细胞生成素 e p o r e r ”h r o p o i e t i nr e c e p t o r红细胞生成素受体 h i f 1 h y p o x i a - i n d u c i b l ef a c t o r - l 缺氧诱导因子l i h c i m m u n o h i s t o c h e m i s t 巧 免疫组织化学法 b u nb l o o du r e an i t r o g e n血尿素氮 s c rs e m mc r e a t i n i n e血清肌酐 n sn o n n a ls a l i n e生理盐水 i ei n s u l t + e p o损伤+ e p o 预处理 i ni n s u l t + n s损伤+ 生理盐水预处 理 i r i s c h e m i a - r e p e 向s i o n缺血再灌注 s es h a m + e p o假手术+ e p o 预处理 s ns h a m + n s假手术+ n s 预处理 i p i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n腹腔内注射 p b s p h o s p h a t e b u “e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 e r s e n d o p l a s m i cr e t i c u l 啪s t r e s s 内质嘲应激 u p ru n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e未折叠蛋白反应 c h o p c c a a t e n h a n c e r2b i n d i n gp r o t e i nh o m o l o g o u sp r o t e i nc c a a t 区增强子2 结合蛋白同源性蛋白 g r p 7 8 g l u c o s e r e g u l a t e dp r o t e i n7 8葡萄糖调节蛋白7 8 e r a d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ma s s o c i a t e dd e g r a d a t i o n 内质网相关蛋白降解 p e r kp k r 1 i k ee rk i n a s e p k r 类似内质网激酶 i r e i n o s i t o l - r e q u i r i n ge n z y m e 肌醇酶。 a t f k c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r 活化转录因子 x b p lx b o xb i n d i n gp r o t e i n lx 盒结合蛋白 w bw e s t e mb l o n i n g蛋白质印迹法 h e h e m a t o x y l i na n de o s i n苏木素与伊红 s p s ss t a t i s t i c a lp a c k a g ef o r t h es o c i a ls c i e n c e社会科学统计软件包 3 中文摘要 背景：急性肾功能衰竭主要表现为急性肾功能的改变，其主要原因之一为急性肾小 管损伤，是临床常见的疾病之一，总体死亡率高，目前以支持或替代治疗为主。红 细胞生成素( e r y t h r o p o i e t i n ，e p o ) 通过结合红系组细胞表面的e p o 受体( e p o r ) ， 促使红细胞存活、增殖和分化。近年来发现神经细胞、心肌细胞和肾小管上皮细胞 表面均具有e p o r 。研究发现e p o 对脑缺血和心肌梗塞均具有一定的治疗作用。近 年来e p o 在肾脏缺血再灌注中的研究也越来越多。e p o 的保护机制可能是激活 j a k 2 下游抗凋亡途径。内质网应激( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms 们s s ，e r s ) 是组织细 胞在亚细胞层面应对外界刺激的常见反应，主要通过未折叠蛋白反应( u n f o l d e d p r o t e i nr e s p o n s e ，u p r ) 起始p e r k 、a t f 6 和i r e l 信号途径，u p r 可能具有两面 性，早期起细胞保护作用，晚期则通过c h o p 、刷k 及c a s p a s e l 2 等促进细胞凋亡。 目的：探讨e p o 对缺血再灌注急性肾损伤的保护作用及e p o 对内质网应激和全身 炎症因子的影响 方法：将1 0 4 只3 0 0 3 5 0 9 雄性s d 大鼠随机分组，根据干预情况分为假手术+ 生 理盐水组( s h a m + n s ，n = 2 0 ) 、假手术+ 给药组( s h a m + e p o ，n = 2 0 ) 、缺血再灌注+ 生理盐水组( 1 r + n s ，n = 3 2 ) 及缺血再灌注+ 给药组( i r + e p o ，n = 3 2 ) ，同时根据再 灌注时间分为再灌注l 、3 、6 和2 4 小时组。其中假手术组在每个再灌注时间点为5 只大鼠，缺血再灌注组在每个灌注时间为8 只大鼠。在手术前2 小时根据分组给予 e p o 或n s 。真手术组，夹闭双侧肾蒂缺血9 0 分钟后行冉灌注。各组分别于再灌注 1 、2 、6 及2 4 小时后，留取下腔静脉血及肾脏组织标本并处死动物。检验科协助静 脉血检测血清肌酐和尿素氮。右肾组织行h e 病理检测、免疫组化测定c h o p ，以 及e l i s a 测定血清m c p 1 、l l 1b 、i l 6 和t n f c 【水平。 结果：( 1 ) 与s h a m + n s 组比较，i r + n s 组大鼠s cr 及b u n 水平于再灌注l 小时 即有显著上升( p o 0 0 1 ) ，并且随着再灌注时间的延长逐渐升高。( 2 ) 在缺血再 灌注损伤组的各个时i 、日j 点( 1 、3 、6 和2 4 小时) 中，e p o 干预后的s c r 、b u n 、 c h o p 以及全身炎症因子m c p 1 、i l 1d 、i l 6 和t n f 0 c 相较生理盐水对照组均有 下降趋势。与i r + n s 组比较，i r + e p o 组的s c r 、c h o p 于再灌注3 小时、2 4 小时 具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，b u n 、m c p 1 、i l 1 b 、i l 6 于再灌注2 4 小时具有统计 学意义( p o 0 5 ) 。( 3 ) c h o p 在再灌注l 小时组中，缺血再灌注组与假手术组无 明显的差异；在再灌注3 、6 和2 4 小时组中，i r + n s 组与s h a m + n s 组问具有显著 性差异( p 0 0 5 ) 。 结论：( 1 ) 缺血再灌注损伤对大鼠肾组织及肾功能造成显著损害。( 2 ) e p o 预处 理后，损伤组s c r 、b u n 及全身炎症因子m c p 1 、i l 1 d 、i l 一6 和t n f 仅均出现下 4 降趋势。( 3 ) 急性缺血再灌注可以诱导内质网应激，e p o 下调了e r s 标志蛋白c h o p 的水平。e p o 的。肾脏保护作用可能同抑制e r s 有关，此需要进一步研究。 关键词：缺血再灌注，急性肾损伤，红细胞生成素，抗凋亡，内质网应激，非折 叠蛋白反应 e f f e c to fe p 0o ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s si nr a t sm o d e l 6 f a c u t ek i d n e yi n j u 巧w i t hi s c h e m i a 二p e r 如s i o n 。 一 a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：a c u t er e n a lf a i l u r ei se q u a lw i t ha c u t er e n a lt u b u l a ri n ju 拶，w h i c hh a st l i 曲 m o n a l i t y u n t i l ln o w ，t h et h e r a p yf o ra r f i sm a i n l yw i t ho n l ys u p p o r to rr e p l a c e m e m t h e r a p y e r ”h r o p o i e t i n ( e p o )p r o m o t ee r ”h m i d c e l l s s u r v i v a l ，p r o l i f e r a t i o n a n d d i f i f e r e n t i a t i o nb yb i n d i n gt h ee p or e c e p t o r ( e p o r ) o nm ec e us u r f a c e i nr e c e n ty e a r s ， r e s e a r c h e r sf o u n dm a te p o rn o to n l yo ne r ”h r o i dc e ub ma l s oo nn e r v ec e l l s ，h e a r tc e l l s a n d 劬u l a re p i t h e l i a lc e l l s nh a sb e e nd e m o n s t r a t e dt h a te p oh a u st h e r a p e u t i ce f f e c to n b o t hc e r e b r a li s c h e m i aa n dm y o c a r d i a li n 胁c t i o n n o w t h es t u d yo fe p oi na k lw i t h i s c h e m i a - r e p e r f u s i o nh a sa l s ob e e ni n c r e a s i n g 1 ti s s u g g e s t e dt h a tr e n a lp r o t e c t i o n m e c h a n i s mo fe p om i g h tr e l a t et oa c t i v a t i o no ft h ed o w n s t r e 锄p r o a p o p t o t i cp r o c e s u r e o fj a k 2s i g n a lp a t h w a y e n d o p l a s m i cr e t i c u l 哪s t r e s s ( e r s ) i sc o m m o n l yr e s p o n dt o s t r e s si ns u b c e l l u l a u rl e v e l e r si n d u c eu n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e ( u p r ) ，t h e na c t i v a t e p e r k ，a t f 6a i l di r e 1p a t h w a y u p rh a sd o u b l ef a c e st h a tp r o t e c t sc e l li ne a r l ys t a g e a l l dh a v eap r o 印o p t o t i cr o l eb ya c t i v a t i n gc h o p ，ka n dc a s p a s e12d e a t hp a t h w a y o b j e c t i v e s ：t h i ss m d yw a st oe x 锄i n ew h e t h e rt h eb e n e f i c i a le f j f e c to fe r y t h r o p o i e t i no n i s c h e m i a - r e p e r 如s i o n i n d u c e da c u t e k i d n e yi n j u 巧w a sr e l a t e dt 0t h e i n h i b i t i o no f e r s u p rp a t h w a y m e t h o d s ：0 n eh u n d r e da n df o u r3 0 0 - 3 5 0 9m a l es dr a t s 、r er a l l d o m l ya s s i g n e di n t o4 e x p e r i m e n t a lg r o u p s a ss h 砌+ n s ( n f 2 0 ) ，s h a m + e p o ( n 2 2 0 ) ，f r 十n s ( n 2 3 2 )a 1 1 d j r + e p o ( n = 3 2 ) ，a n d4i s c h e m i a r e p e r 凡s i o np e r i o dg r o u p sa s 1h r ，3 h r ，6 1 1 ra n d2 4 h r t h e r ew a s5r a t si nt h es h 锄g r o u p se a c ha n d8i nt h ei s c h e m i a r e p e r m s i o ng r o u p se a c h i s c h e m i a r e p e r 如s i o np e r i o d as i n g l ed o s eo f5 0 0 0i u l ( ge p 0 o rt h es a m ev o l u m en s ， a c c o r d i n gt 0t h eg r o u p s ，w e r ei n j e c t e di n t r 印e r i t o n e a l l y2h r sp r i o rt oo c c l u s i o n f o rm e i s c h e m i a r e p e r 如s i o ng r o u p ，b i l a t e r a lk i d n e y su n d e n e n t9 0 m i ni s c h e m i ab yc l a m p i n g r e n a lp e d i c l e s a n i m a l s 、v e r es a c r i f i c e d a tj ，3 ，1 5a n d2 4 址sa r e rr e p e r f u s i o 且t oo b t a i n k d n e ya n dv e n o u sb l o o ds 绷p l e s t h es e m mc o n c e n t r a t i o no fc ra n db u nw e 他 m e a s u r e d p r o a p o p t o t i ce f f e c t w a se v a l u a t e da c c o r d i n gt o s e m i - q u a n t i t i v ea n a l y s i so f c h o pl e v e l sb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t 巧m e t h o d t h es e n l mc o n c e n t r a t i o no fm c p - l ， i l 一1p ，i l - 6a n dt n f - c 【w e r em e a s u r e db ye l i s a r e s u l t s ：( 1 ) s c ra n db u n l e v e li nt h ei r + n s g r o u pi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t1ha r e r r e p e r 凡s i o nc o m p a r e d w i t hs h a m + n s g r o u p ( p 0 0 0 1 ) ，a n d b e c 锄eh i g h e ra s 6 i s c h e m i a r e p e r f u s i o np e r i o dp r o l o n g e d ( 2 ) a tf o u rt i m ep o i m s ( 1 h r ，3 h r ，6 l l ra n d2 4 h r ) o f i s c h e m i a r e p e r 凡s i o ng r o u p sw i t he p 0a d m i n i s t r a t i o n ，t h ev a l u e so fs c r ，b u n ，c h o p a n dc y t o k i n e si n c l u d i n gm c p 1 ，i l 1d ，i l 6a 1 1 dn 4 f - 0 【w e r el o w e rt h a nn sc o n t r o l g r o u p s t h ev a l u e so fs c r a n dc h o pi n3a n d2 4h o u r si r 十e p og r o u p sa n dt h ev a l u e s o f b u n ，m c p 一1 ， i l 1p ，i l 6i n2 4h o u r si r + e p o 圉o u p sh a ds i g n i f i c a n t d i f 佬r e n c e ( p o 0 5 )c o m p a r e d w i t hi r j n s g r o u p s ， ( 3 ) i n 1h o u r g r o u p s ， i s c h e m i a r e p e h s i o ng r o u p sh a dn os i g m f i c a i l td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hs h a mg r o u p s i n3 ，6a n d2 4h o u r s 铲o u p s ，i r + n sg r o u p sh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t h s h a m + - n sg r o u p s ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：( 1 ) i s c h e m i a r 印e r m s i o ni n s u l tm a yc a u s e ds i g n i f i c a n ta c u t er e n a l i n j u 巧( 2 ) e p ot r e a t m e n tr e d u c e dt h es e r u ms c r ，b u n ，m c p - l ，i l lp ，i l - 6a n d i n f 一0 【l e v e l si n t h es c h e m i a r e p e r f u s i o nr a t s ( 3 ) a c u t ei s c h e m i a r e p e r f u s i o nc o u l di n d u c ee r s ，锄de p o d o w n r e g u l a t e dt h el e v e lo fc h o pe x p r e s s i o n t h er e n a lp r o t e c t i o no fe p o i sp m b a b l y r e l a t e dt oi n h i b i t i o no fe r s - u p rp a t h w a y i tn e e d st ob es t u d i e dm r t h e r k e yw o r d s ：i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n ，a c u t e r e n a li 哂u q ，e r y t h r o p o i e t i n ，a n t i a p o p t o s i s ， e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，u i l f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e 7 论文正文 e p o 在大鼠缺血再灌注急性肾损伤模型中 对内质网应激的影响 1 上1 一 刚舌 急性肾功能衰竭表现为急性的肾小球滤过率降低，临床上主要表现为迅速而持 续的血清肌酐和尿素氮升高。往往造成容量超负荷、高钾血症和代谢性酸中毒，从 而威胁到患者的生命安全。在临床实践当中，急性肾功能衰竭有较高的发病率和死 亡率。 红细胞生成素( e p o e r y t h r o p o i e t i n ) 通过抑制红系祖细胞的凋亡增加循环血 液中红细胞的数量。e p o 通过和红系细胞表面的e p o 受体( e p or e c e p t o r e p o r ) 结合后起作用。除血细胞外，动物体内的其他器官细胞亦具有e p o r ，近年来发现 e p o 对神经细胞、心肌细胞和肾小管上皮细胞均具有保护作用。许多研究发现在神 经损伤模型中，全身注射e p o 对中枢神经系统具有保护作用。体外研究亦发现了， e p 0 可以抑制神经细胞的凋亡。并且随着进一步的研究，e p 0 对心肌细胞和肾小管 上皮细胞均具有抗凋亡作用。 导致急性肾功能衰竭的主要原因之一是急性肾小管坏死。目前，治疗急性肾功 能衰竭的主要原则是纠正可逆的病因，预防额外的损伤。治疗的目的是维持体液和 电解质平衡、提供营养支持以及防止和治疗并发症。然而从多种药物对预后影响的 随机对照试验中发现袢利尿剂、多巴胺、利钠肽、胰岛素样生长因子1 以及甲状腺 素相对于安慰剂对肾脏的预后无明确的促进作用，持续肾脏替代治疗对比间断透析 也无明显差异，并且药物可能出现各种各样的副作用。这就为急性。肾衰的治疗提出 了新的要求。 与此同时，人们也开始关注e p o 在肾脏缺血再灌注损伤中的应用前景。y a l l g 等人在缺血f j i 2 4 小时单次给予3 0 0 0 i u k g 的e p o ，发现该预处理方案可以对肾脏 缺血再灌注损伤具有保护作用，能够减少细胞凋亡并促进组织修复。随后在多种急 性肾损伤( a c u t ek i d n e yi n j u r y ，a k i ) 模型中，以及多种治疗方案中均证明e p o 具有 不同程度的肾脏保护作用。 ， ， ， 在缺血再灌注损伤中，内质网作为细胞内合成蛋白质的主要场所，会发生内质 网应激( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，e r s ) ，并诱导未折叠蛋白反应( u n f o l d e dp r o t e i n r e s p o n s e ，u p r ) 以达到保护细胞或促进细胞调亡的作用。有研究发现内质网膜上存 在b c l 2 家族蛋白，并且此蛋白参与调控内质网内钙离子。以抑制钙离子依赖性的 分子伴侣起始e r s 引起的凋亡。 本研究主要通过e r s 下游促凋亡蛋白c h o p 的免疫组化染色分析e r s 在缺血 8 再灌注模型中的作用，以及e p o 是否可以通过抑制e r s 起到抗凋亡的作用。 材料与方法 一、实验材料 1 研究药物 益比奥( 重组人红细胞生成素)沈阳三生制约有限责任公司 2 实验动物 雄性s p r a g u e _ d a w l e y 大鼠北京实验动物研究中心 3 实验器材 眼科手术器械 组织冻存盒( 1 0 0 样) e p 管及e p 管盒( 1 5 m 1 ) 湿盒 抗原修复盒 沈瓶 加样器( 1 0 肛l 、1 0 0 “l 、1 0 0 0 肛1 ) 光学显微镜 电子天平 冰箱 微波炉 磨砂边载玻片+ 防脱涂层 盖玻片 4 实验试剂 兔抗鼠c h o p 多克隆抗体 山羊抗兔二抗试剂盒( p v 二9 0 01 ) 浓缩型d a b 试剂盒( z l i 9 0 3 2 ) 无水乙醇 二甲苯 h a r r i s 苏木素 封片剂 3 h ，o ， 北京协和医院动物实验中心提供 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 一北京中杉金桥生物技术有限公司 e p p e n d o eg e 肌a n o l y m p u s ，j a p a j l 北京赛多利斯天平有限公司 青岛海尔 连云港虹云 天合力恩化学试剂公司 三和新华玻璃实验仪器厂 s a n t a c r u z 美国 北京中杉会桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京化学试剂公司 北京世纪红星化工有限责任公司 天合力恩化学试剂公司 天合力恩化学试剂公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 9 磷酸盐缓冲液( p b s ，p h = 7 4 ) 柠檬酸盐缓冲溶液( p h = 6 0 ) 封闭用正常羊血清 戊巴比妥 中性甲醛溶液( 4 0 ) 5 实验溶液配制方案 1 ) 麻醉剂( 2 戊巴比妥) 戊巴比妥粉末：蒸馏水= 1 克：5 0 m l 2 ) 病理固定液( 1 0 中性甲醛溶液) 4 0 中性甲醛：生理盐水= 1 ：3 二、实验方法 1 动物模型建立方法 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京万润有限责任公司 北京化学试剂公司 1 ) 实验动物分组 将1 0 8 只3 0 0 4 0 0 克雄性s d 大鼠随机分组。 本研究采用的分组法：即按照实验处理方法分为单纯假手术组( s h 锄+ n s ，s n ) ， 假手术十给药组( s h a m + e p o ，s e ) 、单纯手术组( i r + n s ，i n ) 及手术+ 给药组( i r + e p o ， i e ) 等4 组；同时按照再灌注时间又分为1 小时、3 小时、6 小时、2 4 小时，总共4 个再灌注时间亚组。其中假手术组( s n s e 组) 中各亚组重复数为5 只，手术组( 1 n l e 组) 中各亚组重复组为8 只。分组后按照“再灌注时间实验分组重复批次”为实验 大鼠编号，例如6 s e 0 6 。 2 ) e p o 或n s 给药方法 本研究采用预处理治疗方案。 s h 锄+ e p o 组及i r + e p o 组大鼠，在缺血前2 小时经腹腔内注射e p o - ( 5 0 0 0 i u 瓜g ) 。s h 锄+ n s 组及i r + n s 组大鼠，则同时给予等体积的生理盐水。 3 ) 大鼠缺血再灌注模型建立 脚手术前1 0 分钟麻醉实验大鼠。按照5 0 m 埏剂量，经腹腔注射4 的戊巴 比妥溶液( 约0 4 m 1 ) 。 参啦必理消毒铺巾，无菌操作。腹正中切丌皮肽与肌肉两层，切口长3 c m ，上 缘据剑突下o ，5 c m 。翻出肠管，并用生理盐水湿纱布为其保湿。玻璃分针游离双侧 1 0 肾蒂。止血钳央闭双侧。肾蒂( 止血钳头套有胶皮管) 。肾脏变苍白证明缺血处理成 功。闭合腹壁，湿纱布覆盖，等待9 0 分钟： 再摧瑾处理至缺血9 0 分钟后，打开双侧止血钳。肾脏逐渐恢复原有色泽( 粉 红色) 证明再灌注处理成功。缝合腹壁，放回鼠笼，等待1 、3 、6 或2 4 小时。 4 ) 大鼠标本留取及保存 席缈、振线根据再灌注时间，提前3 0 m i n 麻醉大鼠，拆线开腹。 组织撑吞管孩止血钳央闭双侧肾蒂，切除双肾，去除肾包膜。水平及矢状面切 开肾脏分4 瓣，剪去肾盂。取右肾的l 4 置于1 0 的中性甲醛中固定待用。另3 4 右肾及全部左肾，经锡纸、纱布包裹，胶布标示，8 0 保存待用。 血液襻举经下腔静脉抽血( 约3 4 m l ) 。3 0 0 0 印mx1 0 分钟离心后取上清( 约 1 7 m 1 ) ，一8 0 保存待用。 趔黝物下腔静脉放血处死动物。 2 大鼠血清肌酐及尿素氮的测定 大鼠血清肌酐及尿素氮的测定，由北京协和医院检验科协助完成。 3 大鼠肾组织h e 病理切片的制备 大鼠肾组织h e 病理切片的制备，由北京协和医院病理科协助完成。 4 免疫组化测定大鼠肾脏c h o p 表达水平 勿鲈旌番制备石蜡包埋组织块切片，厚度3 岬，并以6 0 烤片1 2 0 分钟。二甲 苯脱蜡，1 0 分钟2 次，乙醇系列水化( 1 0 0 、9 5 、8 0 、7 0 乙醇1 0 分钟) ， 去离子水漂沈1 分钟。 办翠：统厉修复预先加热1 0 m m o l l 柠檬酸钠溶液( p h6 o ) ，将标本放入，在 微波炉中7 5 0 w 处理( 中高档) 1 5 分钟，室温冷却4 5 分钟p b s 漂洗5 分钟x3 次。 廖劭谤凝雒过氧纪物跨掰烂将组织切片放入湿盒中，3 过氧化氢溶液室温孵 育标本1 0 分钟，p b s 漂洗5 分钟鄹次。 ， ， 苈原影闭加入3 山羊血清于3 7 孵育6 0 分钟 + 柔芟_ 芴加入一抗兔抗鼠c h o p 多克隆抗体，4 过夜( 1 1 小时) ，3 7 复温 4 5 分钟，p b s 漂洗5 分钟3 次。 杂霓：二苈加入山羊抗兔二抗试剂盒试剂1 ( p o l y m o e rh e l p e r ) ，湿盒3 7 孵台 2 0 分钟，p b s 漂洗5 分钟3 次，加入山羊抗兔二抗试剂盒试剂2 ( p o l y h r pa n t i r a b b i t i g g ) ，湿盒3 7 孵育2 0 分钟。p b s 漂沈5 分钟3 次。 脚b 显彦加入d a b 显色液，显色5 分钟：自来水冲洗1 0 分钟，苏木素复染 1 0 s ，自来水冲洗1 0 分钟。 脱水，透劈、句片乙醇系列脱水( 8 0 2 0 秒、9 0 2 0 秒、9 5 3 分钟2 次、 l o o 乙醇5 分钟2 次) ，二甲苯浸泡2 0 分钟3 次，专用封片剂封片，标本切片 室温保存。 廖缓分笏应用i p p 图像分析系统，对免疫组化结果进行分析。每只动物的切片 在2 0 0 镜下随机取1 0 个视野，分析每个视野下阳性染色区域的积分光密度( i o d ) 和面积，用i o d 值除以面积计算平均积分光密度。 5 e l i s a 测定血清m c p 1 、i l 1 b 、i l 6 和t n f u 将5 0 0 p m l 、2 5 0 p m l 、1 2 5 p m l 、6 2 5 p m l 、3 1 2 5 p m l 、1 5 6 3 p m l 、7 8 1 p m 1 的标准品各o 1 m l 依次加入一排7 孔中，1 孔只加样品稀释液的作为零孔。每孔加 1 0 0 “l 已用样品稀释液稀释( 1 ：4 ) 的大鼠血清。 酶标板加上盖，3 7 反应9 0 分钟。反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体； 或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。 将准备好的生物素抗大鼠m c p 1 i l 1 d i l 6 t n f 0 【抗体工作液按每孔o 1 m l 依 次加入( t m b 空白显色孔除外) 。3 7 反应6 0 分钟。0 0 1 mp b s 洗涤3 次，每次 浸泡1 分钟芹右。 将准备好的亲和素过氧化物酶复合物( a b c ) 工作液按每孔0 1 m l 依次加入 ( t m b 空白显色孔除外) 。3 7 反应3 0 分钟。0 0 1 mp b s 洗涤5 次，每次浸泡 1 2 分钟左右。 按每孔9 0 “l 依次加入已在3 7 中平衡3 0 分钟t m b 显色液；3 7 避光反应( 3 0 分钟内) ，此时肉眼可见标准品的前3 4 孔有明显的梯度蓝色，后3 4 孔差别不明 显时，即可按每孔0 1 m l 依次加入t m b 终止液，此时蓝色立转黄色。 用酶标仪在4 5 0 m 测定o d 值。 一、 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。其实际浓度应该再乘以稀释倍数。 6 统计方法 实验数据采用单因素方差分析( o n ew a ya n o v a ) ，结果以均数土标准差表示。 使用s p s sl7 o 统计学软件完成分析工作。 结果 1 缺血再灌注损伤对肾脏功能及结构的影响 与假手术( s h 锄+ n s ) 组比较，缺血再灌注( i i h n s ) 组大鼠的s c r 及b u n 水 平在再灌注1 小时、3 小时、6 小时和2 4 小时均有显著增加( 非参数检验：p 0 0 5 ) ， 并且随着再灌注时间的延长逐渐升高( 表1 ，图1 ) 。 表l 缺血再灌注肾损伤后大鼠血清肌酐与血尿素氮水平的变化情况 实验分组 再毒挚时s c r ( p m 。l l ) b u n ( m m 。l l ) s c r ( u m o i l ) b u n ( m m o l l ) 间 。 s h a m + n s ( n = 5 )1 j 、时31 2 士3 55 7 6 士o 8 9 i r n s ( n = 8 ) 1 小时7 6 6 士7 9 +10 4 9 士1 0 8 + s h a m + n s ( n = 5 )3 叫、时 3 8 8 士4 5 7 0 8 士1 7 0 - i r + n s ( n = 8 ) 3 j 、i 对1 0 6 5 士2 1 9 +1 4 8 9 士1 7 6 + s h 锄+ n s ( n = 5 ) 6 j 、时4 5 0 士8 54 8 3 士1 ol i r + n s ( n = 8 ) 6d 、时l1 9 5 土2 3 4 1 8 8 8 士3 8 6 4 s h 锄+ n s ( n = 5 )2 4 小时 41 6 士9 8 6 2 7 士1 8 0 i r 十n s ( n = 8 )2 4 j 、时4 0 4 6 士6 6 2 +4 5 3 3 士8 5 2 + 母与s h 锄+ n s 组比较p o 0 5 ，n 表示实验动物数目 樽灌注时婀 鬟黔竹撤 口s h m + 惦 囝l r + 惦 冉激注时蜘 窖牧，绑 口惦 囝r + n s 图1 缺血再灌注损伤s c r 与b u n 的变化情况 与假手术( s h 锄+ n s ) 组比较，缺血再灌注( i r + n s ) 组火鼠的s c r 及b u n 水平在再灌注l 小时、3 小时、6 小时和2 4 小时均有显著增加( p 0 0 5 ) ，并且 随着再灌注时间的延长逐渐升高。拳p 0 0 5 ，与s h a m + n s 组比较 与正常肾组织比较( 图2 a ) ，在缺血再灌注早期( 1 、3 小时) 。肾小管上皮细 胞以非坏夕匕性病理改变为主( 图2 bc ) ，如细胞肿胀、刷状缘脱落、细胞变性等 病理改变，提示细胞受损。随着冉灌注时间延长至6 小时，肾小管上皮细胞出现坏 死性病理改变( 图2 defgh ) ，如细胞核浓缩、细胞坏死、细胞脱落到管腔、 基底膜暴露、管型形成等病理改变。至再灌注晚期( 2 4 小时) ，肾小管坏死、崩解、 脱落十分明显。 缺血再灌注2 4 小时后大鼠肾小管坏死、崩解、脱落十分明显。不同区域比较后 可见，缺血再灌注损伤最严重的区域出现在皮髓质交界处( 图3 ) 。 1 4 图2 缺血再灌注损伤所致各种a t n 病理表现( 箭头所示) 与正常肾组织比较( a ) ，在缺血冉灌注早期( 1 、3 小时) 肾小管上皮细胞以非坏 死性病理改变为丰，如肾小管细胞刷状缘脱落( b ) 、细胞空泡样变性( c ) 等病理改 变，提示细胞受损。随着再灌注时间延长至6 小时，肾小管上皮细胞出现坏死性病理 改变，如细胞脱落到管腔( d ) 、基底膜暴露( e ) 、细胞坏死( f ) 、管型形成( gh ) 等病理改变。 1 5 图3 缺血再灌注损伤对肾组织不同区域的影响 图中为缺血再灌注2 4 小时后大鼠不同组织区域的h e 病理表现。a _ b c d 依次为肾皮质至肾髓质。i r 损伤致使肾小管坏死、崩解、脱落明显，并伴有大量炎 细胞浸润。不同区域比较后可见，缺血再灌注损伤最严重的l 葛域出现在皮髓质交界 处。 2 e p o 对肾脏缺血再灌注的结构及功能的影响 在各个再灌注时间点，i i h e p o 组大鼠的s c r 及b u n 水平均低于i i h n s 组( 表 2 ，表3 ，图4 ) ，其中3 小时和2 4 小时s c r 和b u n 具有统计学意义。 实验分组 l h3 h6 h2 4 h 串与i r + n s 组比较p 0 0 5 ，与i i h n s 组比较p 0 0 0 l ，n 表示实验动物数日 1 6 表3 各实验组大鼠血清b u n ( m m o i 几) 变化情况 宰与i r + n s 组比较p 0 0 5 ，3 与i r + n s 比较p = 0 0 5 5 ，n 表示实验动物数目 w 灌注时列 i 7 贫钧勿缎 口s h a m + e p o 团i r + n s 口瞅+ 印o d i e e z 3 拇纛链时婀 复骏舒组 口s h 膏m 尹。 团聍+ n s 口r + e p o 图4e p o 治疗组大鼠s c r 与b u n 变化情况 i r + e p o 组s c r 及b u n 水平在各个再灌注时间点均低于i r + n s 组，且在3 小时 与2 4 小时的组间差异最为显著。与i r + n s 组相比：木p o 0 5 ，p 0 0 1 ，p = 0 0 5 5 ： 与难常肾组织比较，在缺血再灌注早期( 1 、3 小时) 肾小管上皮细胞以非坏死 性病理改变为主，如细胞肿胀、刷状缘脱落、细胞变性等病理改变，提示细胞受损。 随着再灌注时间延长至6 小时，肾小管上皮细胞出现坏死性病理改变，如细胞核浓 缩、细胞坏死、细胞脱落到管腔、基底膜暴露、管型形成等病理改变。至再灌注晚 期( 2 4 小时) ，肾小管坏死、崩解、脱落十分明显。在各个再灌注时间点，i r + e p o 组大鼠的非坏死或坏死性病理损伤程度均轻于i r + n s 组大鼠的( 图5 ) 。 1 8 - - 小 时 u 小 时 岔 小 时 n 小 时 s h a m + n si r + n si r + e p o 图5i r + n s 组与i r 十e p o 组大鼠肾组织损伤程度比较 与正常肾组织比较，在缺血冉灌注早期( 1 、3 小时) 肾小管上皮细胞以非 坏死性病理改变为主，如细胞肿胀、刷状缘脱落、细胞变性等病理改变，提示 细胞受损。随着冉灌注时间延长至6 小时，肾小管上皮细胞出现坏死性病理改 变，如细胞核浓缩、细胞坏死、细胞脱落到管腔、基底膜暴露、管型形成等病 理改变。至冉灌注晚期( 2 4 小时) ，。肾小管坏死、崩解、脱落十分明显。在 各个再灌注时间点，i r + e p o 组大鼠的非坏死或坏死性病理损伤程度均轻于 i r + n s 绢。 1 9 3 e p