（分析化学专业论文）单分子流式检测仪的研制.pdf

摘要 摘要 随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入了功能基因组和蛋白质组学 时代，越来越多的表征机体生理、病理状况的蛋白质生物标志物被发现，为疾病 诊断、预后、治疗监测、和药物筛选提供了强有力的研究手段。尽管蛋白质的表 达水平较信使r n a ( m r n a ) 更能准确地反映出生物体表型的异常，常规样品 如组织或体液中蛋白标志物的丰度一般都非常低，加上尚未找到类似于核酸聚合 链反应( p c r ) 的蛋白质扩增方法，发展蛋白质的超高灵敏检测技术成为生物标志 物得以实际应用的基础。单分子检测是生物检测技术的最高极限，我们拟结合单 分子流式检测技术和微珠免疫分析方法创建超高灵敏蛋白质免疫化学分析平台， 为实现疾病的早期诊断创造必要条件。本论文的工作是以目前应用于单个d n a 分子片断长度测定的流式细胞仪为模板研制单分子检测水平的流式检测仪，为超 高灵敏蛋白质免疫化学分析平台的建立提供硬件支持。 本论文共由三章组成： 第一章为文献综述，主要介绍单分子检测的常用技术、单分子荧光检测的原 理、单分子荧光检测技术的关键问题以及单分子检测的应用。在本章最后介绍了 本论文的研究目的、意义和主要内容。 第二章为单分子流式检测仪的研制，主要内容包括：1 ) 研制仪器所需主要 零部件的选购与功能介绍；2 ) 仪器光路系统、液流系统和检测系统的设计；3 ) 进样器和特殊安装部件的设计与加工；4 ) 仪器在a u t o c a d 软件中的模拟搭建， 确定各个光学元件之间的相对位置以及光学中心的高度；5 ) 信号采集和数据处 理软件的介绍，为后续的仪器操作及调试工作提供保障：6 ) 根据各个系统的设 计与模拟完成单分子流式检测仪的组装。 第三章为单分子流式检测仪的调试与性能分析。仪器的调试工作，主要包括 光路校准、流速调节以及数据采集参数的优化。对仪器的性能进行了考察，实验 结果表明自行研制的单分子流式检测仪达到了单分子水平的检测，具有良好的重 现性和稳定性，而且能够分辨不同大小的d n a 片断，即具有较好的分辨率。 本工作的主要创新点： ( 1 ) 结合激光诱导荧光和流体聚焦技术，研制出一台单分子流式检测仪， 摘要 成功地实现对单个d n a 片断和单个藻红蛋白的检测。 ( 2 ) 单分子流式检测仪成功地应用于d n a 片断长度的测定，与凝胶电泳 分离相比，分析速度和灵敏度分别提高一百和十万倍。 ( 3 ) 与单分子荧光显微术相比，流式分析将固定的标本台改为流动的单分 子悬液，大大提高了检测速度与统计精确性，更加适合生物样品的快速、超高灵 敏分析。 单分子流式检测仪除了可以应用于蛋白质的超高灵敏检测和d n a 片断长度 的测定，还可以对单个病毒、细菌、亚细胞器、细胞等生物颗粒的生化特性进行 检测，也可实现毛细管电泳分离的超高灵敏检测，与液相芯片结合实现多组分的 同时检测等，所以单分子流式检测仪将在生命科学领域得到重要应用。 关键词：单分子检测；激光诱导荧光；流体聚焦；藻红蛋白；d n a 片断测定 a b s t r a c t a b s t r a c t w i t ht h ec o m p l e t i o no fh u m a ng e n o m es e q u e n c i n gp r o j e c t ，l i f es c i e n c ee n t e r st h e e r ao ff u n c t i o n a lg e n o m i c sa n dp r o t e o m i c s m o r ea n dm o r ep r o t e i nb i o m a r k e r s r e f l e c t i n gb o d yp h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n s a lei d e n t i f i e da n dw i l l p r o v i d ep o w e r f u lr e s e a r c ht o o l sf o rd i s e a s ed i a g n o s i s ，p r o g n o s i s ，t r e a t m e n tm o n i t o r i n g ， a n dd r u gs c r e e n i n g a l t h o u g hp r o t e i ne x p r e s s i o nc a i lm o r ea c c u r a t e l yr e f l e c tt h e a b n o r m i t yo fo r g a n i s mp h e n o t y p e st h a nm e s s a g er n a ( m r n a ) ，t h ea b u n d a n c eo f p r o t e i nb i o m a r k e r si nc o n v e n t i o n a ls a m p l e ss u c ha st i s s u eo rb o d yf l u i da r eg e n e r a l l y v e r yl o w m o r e o v e rt h e r eh a sn o tb e e na n ym e t h o dt h a tc a na m p l i f yp r o t e i n s ，t h u st h e p r a c t i c a la p p l i c a t i o n o fb i o l o g i c a lm a r k e r s d e p e n d s o nt h e d e v e l o p m e n t o f u l t r a s e n s i t i v ep r o t e i nd e t e c t i o nt e c h n i q u e s s i n g l e - m o l e c u l ed e t e c t i o nr e p r e s e n t st h eu p p e rl i m i ti nb i o l o g i c a ld e t e c t i o n , s o w ep r o p o s et oi n t e g r a t es i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o nt e c h n i q u ea n dam i c r o s p h e r e - b a s e d i m m t m o a s s a yt od e v e l o pu l t r a s e n s i t i v ey e tr a p i di m m u n o c h e m i c a lp r o t e i nd e t e c t i o n p l a t f o r mf o rt h ee a r l yd i a g n o s i so fd i s e a s e s i nt h i sd i s s e r t a t i o n , t h es t u d yw a st od e v e l o pas i n g l e m o l e c u l ef l o wa n a l y z e r b a s e do nf l o wc y t o m e t e rm a i n l yu s e di nd n a f r a g m e n t ss i z i n g t h es i n g l e m o l e c u l e f l o wa n a l y z e rw i l lp r o v i d eh a r d w a r es u p p o r tf o rt h ee s t a b l i s h m e n to fu l t r a s e n s i t i v e i m m u n o c h e m i c a lp r o t e i nd e t e c t i o np l a t f o r m t h i sd i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e do ft h r e ec h a p t e r s ： i nc h a p t e ro n e ，a no v e r v i e wo fs i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o nt e c h n o l o g i e si sg i v e n , e s p e c i a l l yt h ep r i n c i p l e ，k e yi s s u e s ，a n da p p l i c a t i o n so fs i n g l e m o l e c u l ef l u o r e s c e n c e d e t e c t i o nt e c h n o l o g y i nt h ee n do ft h i sc h a p t e r ，o b j e c t i v e ，s i g n i f i c a n c ea n dm a i n c o n t e n t so ft h i sd i s s e r t a t i o na r ei n t r o d u c e d c h a p t e rt w od e s c r i b e st h ed e s i g na n dc o n s t r u c t i o no ft h es i n g l e m o l e c u l ef l o w a n a l y z e r ，i n c l u d i n g ：1 ) f u n c t i o ni n t r o d u c t i o no fm a i nc o m p o n e n t su s e di na p p a r a t u s c o n s t r u c t i o n ；2 ) d e s i g no ft h eo p t i c a l ，f l o w ，a n dd e t e c t i o ns y s t e m s ；3 ) d e s i g na n d m a n u f a c t u r eo fs a m p l eh o l d e ra n ds p e c i a lp a r t s ；4 ) s i m u l a t e da p p a r a t u sc o m s t r u c t i o n i a b s t r a e t w i t ha u t o c a ds o f t w a r et od e t e r m i n et h er e l a t i v ep o s i t i o no fa l lo p t i c a le l e m e n t sa n d t h eh e i g h to fo p t i c a lp a t h ；5 ) i n t r o d u c t i o no fd a t aa c q u i s i t i o na n dp r o c e s s i n gs o f t w a r e ； 6 ) c o m p l e t i o no fs i n g l e - m o l e c u l ef l o wa n a l y z e rc o n s t r u c t i o n c h a p t e r t h r e ed e s c r i b e st h e a d j u s t m e n ta n dp e r f o r m a n c e a s s e s s m e n to f s i n g l e m o l e c u l ef l o wa n a l y z e r a d j u s t m e n tw o r k sm a i n l yi n c l u d eo p t i c a lp a t h a l i g n m e n t ，f l o wv e l o c i t ya d j u s t m e n t ，a n dd a t aa c q u i s i t i o np a r a m e t e ro p t i m i z a t i o n p e r f o r m a n c eo ft h ea p p a r a t u si nt e r m so fs e n s i t i v i t y ，r e p r o d u c i b i l i t ya n dr e s o l u t i o n w e r e a s s e s s e d e x p e r i m e n t a l r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t t h eh o u s e - c o n s t r u c t e d s i n g l e m o l e c u l ef l o wa n a l y z e rh a sa c h i e v e ds i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yw i t h g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t y m o r e o v e r ，t h es i n g l e - m o l e c u l ef l o wa n a l y z e rc o u l d r e s o l v ed n a f r a g m e n t sw i t hd i f f e r e n ts i z e sw h i c h d e m o n s t r a t e dg o o dr e s o l u t i o n t h em a i ni n n o v a t i o n so ft h i st h e s i s ： ( 1 ) as i n g l e - m o l e c u l ef l o wa n a l y z e rb a s e do nl a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ea n d h y d r o d y n a m i cf o c u s i n gw a sd e v e l o p e di no u r l a bf o rw h i c ht h es i n g l em o l e c u l e d e t e c t i o ns e n s i t i v i t yw a sd e m o n s t r a t e db yt h es u c c e s s f u ld e t e c t i o no fs i n g l ed n a f r a g m e n t sa n ds i n g l ep h y c o e r y t h r i nm o l e c u l e s ( 2 ) t h es i n g l e m o l e c u l ef l o wa n a l y z e rw a sa p p l i e dt od n af r a g m e n ts i z i n gw i t h l i n e a rc o e l a t i o nb e t w e e nd n a f r a g m e n tl e n g t ha n dm e a nb u r s ts i z e c o m p a r e dw i t h g e le l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o n ，a n a l y s i ss p e e da n ds e n s i t i v i t yw e r ei m p r o v e d10 0a n d 10 0 0 0 0t i m e sr e s p e c t i v e l y ( 3 ) c o m p a r e dw i t hs i n g l e m o l e c u l ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，s a m p l ea n a l y l i z e d i nf l o wc a n g r e a t l y i n c r e a s et h e s p e e d a n ds t a t i s t i c a c c u r a c y t h e r e f o r e ， s i n g l e - m o l e c u l ef l o wa n a l y s i si sm o r es u i t a b l ef o rr a p i da n du l t r a s e n s i t i v ea n a l y s i so f b i o l o g i c a ls a m p l e s i na d d i t i o nt oa p p l i c a t i o n si nu l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no fp r o t e i n sa n dd n a f r a g m e n t ss i z i n g ，s i n g l e m o l e c u l e f l o wa n a l y z e rh a sp o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s i n f o l l o w i n gf i e l d s ：d e t e c t i o no fp h y s i o l o g i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f b i o l o g i c a lp a r t i c l e ss u c ha ss i n g l ev i r u s ，b a c t e r i a , s u b - c e l l u l a ro r g a n e l l e ，a n dc e l l ； u l t r a s e n s i t i v e d e t e c t i o no f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；c o m b i n e d w i t h m i c r o s p h e r e b a s e ds u s p e n s i o na r r a y ，s i n g l e - m o l e c u l ef l o wa n a l y z e rc o u l da c h i e v e w a b s t r a c t s i m u l t a n e o u sd e t e c t i o no fm u l t i p l eb i o m a r k e r s c o n s e q u e n t l y ，s i n g l e m o l e c u l ef l o w a n a l y z e rw i l lp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nl i f es c i e n c ef i e l d s k e y w o r d s ：s i n g l e - m o l e c u l ed e t e c t i o n ；l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e ；h y a r o d y n a m i c f o c u s i n g ；p h y c o e r y t h r i n ；d n af r a g m e n ts i z i n g v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：加羚殄 淞年么, e l 诱日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 千 j ( 日解密，解密后适用上述授权。 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：和矜谚 泗吕年6 月必日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 单分子检钡, o ( s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ，s m d ) 就是获得单个分子的信息，达到 物质检测的极限，这是物质含量检测技术中的最后一个里程碑【l 】。传统的化学实 验都是以分子的聚集体为目标，得到的是物质的平均性质，而平均性质往往掩盖 了许多特殊的重要信息，因此只有在单分子水平上进行实验，才能得到一个分子 的性质分布，研究复杂体系中的个体。s m d 既可以检测非均匀聚集体中的单个 分子，对它们进行识别、分类、定量描述，又可以对化学反应的途径进行实时监 测，特别是能在生理条件下对生物大分子进行探测并提供分子结构和功能之间的 信息，它对于推动细胞生物学、医学的研究和发展以及某些疾病的早期诊断具有 重要的理论和实际意义【2 ，3 1 。 1 2 单分子检测技术 目前用于单分子研究的技术很多，包括观察其构象的变化、功能活动以及与 其它分子相互作用的动力学过程，可揭示出以往检测多分子集体行为平均化所掩 盖的“个性”和蕴藏的丰富信息，从而深入了解生命活动的微观规律。目前单分子 检测技术主要有3 大类：扫描探针显微术、化学方法和光学方法。这些方法实现 单分子检测的共同特征是：( 1 ) 高空间分辨能力；( 2 ) 单分子性质和行为的捕获能 力；( 3 ) 能收集微弱信号并放大检测，并做相应的分析处理以获取可信的信息。 1 2 1 扫描探针显微术 扫描探针显微术包括扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p y ， s t m ) 、原子力显微技术( a i o mf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 和扫描电化学显微术 ( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ，s e c m ) 等。 s t m 利用针尖与样品在近距时的隧道电流，a f m 利用针尖与样品直接接 触时的力，s e c m 利用作为工作电极的探头上的氧化还原电流来获得单分子的图 第一章绪论 像f 4 】。由于这类技术可在常温常压下进行，而且空间分辨率很高( 1 0 。9 - - 1 0 郴m 水 平) ，因此对于显示单个分子的形貌具有很大的优越性。目前应用a f m 比较普 遍，它不仅可以观察处于溶液状态的单个分子，更接近于生理状态，而且可以测 量力谱，即和大分子一部分接触，并通过施力与距离的关系了解分子的力学性质， 特别适合于对生物分子折叠与解折叠的研烈3 1 。 1 2 2 化学方法 化学方法包括电化学检钡o ( s i n g l e m o l e c u l ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ，s m e d ) 和化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 检测等。 1 2 2 1 电化学方法 电化学方法检测主要是使用纳米微电极对电极附近纳米尺度范围溶液内的 分子进行电化学测定，或是利用极快速的电势扰动技术，使扩散层仅限于纳米范 围。b a r d 等【5 】在纳米微电极上对单个三甲铵甲基二茂铁( c p 2 f e t m a + ) 分子进行 电化学检测。a m a t o r e 等【6 】基于超高速电势扫描技术，在微米级电极上实现了纳 米尺度范围内的电化学检测。他们还将有6 4 个活性中心的枝状大分子( d e n d 一6 4 r u “r u m ( t p y ) 2 ) 吸附在半径约为5 01 t m 的铂圆盘电极上形成单层膜，用具备超 高速扫描功能恒电位仪研究了电子在这种枝状分子上氧化还原位点间的跳跃扩 散，测定了电子在分子内的活性位点之间的自交换转移速率常数。 1 2 2 2 化学发光法 化学发光具有分析速度快、灵敏度高、仪器简单、无需外加光源及信噪比高 等特点，已用于有机荧光染料分子及生物分子的检测，缺点是化学发光选择性差、 干扰严重。程介克等【7 ，8 】利用毛细管电泳在线化学发光检测对金属离子v ( 1 v ) 的检 测达到了分子水平。电化学发光是化学发光与电化学相结合的产物，它保留了化 学发光的大多数优点，同时又具有许多化学发光无法比拟的优点，如重现性好、 试剂稳定、容易控制和一些试剂可以重复使用等，从而引起了许多科学家的兴趣， 有许多文章对其进行了评述o ，1 1 1 。b a r d 掣1 2 1 将d n a 吸附到覆盖了一层烷基二 磷酸铝薄膜的电极表面上，用r u ( p h e n ) 3 2 + 进行标记，在三丙胺存在下r u ( p h e n ) 3 2 - 4 - 2 第一章绪论 被氧化产生电化学发光，从而对d n a 进行了检测。这为d n a 、蛋白质等生物单 分子的检测提供了一种可能的途径。 1 2 3 光学方法 光学方法包括共聚焦荧光显微法( 1 a s e rs c a n n i n g c o n _ f o c a lm i c r o s c o p y ， l s c m ) 、全内反射荧光显微术( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ， t i r f m ) 、扫描近场光学显微镜( s c a n n i n gn e a r - f i e l do p t i c a lm i c r o s c o p e ，s n o m ) 等。 1 2 3 1 共聚焦荧光显微术 在单分子光学检测中，共聚焦荧光显微术以其灵敏度高的特点成为目前应用 最广泛的检测手段。共聚焦成像原理如图1 1 所示：它是采用点光源照射标本， 在焦平面上形成了一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收 集，并沿照射光路返回到由双向色镜构成的分光器，分光器将荧光直接送到探测 器。光源和探测器前方各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔，约为o 1 0 2 岬，相对于焦平面上的光点，两者是共扼的，即光点通过一系列的透镜最终会 同时聚焦于照明针孔和探测针孔，这正是“共聚焦”含义所在【l3 1 。来自焦平面的光 可以汇聚在探测针孔范围之内，而其它来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在 探测针孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐 点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清 晰的整个焦平面的共聚焦图像。共聚焦显微镜具有非常小的检测体( 1 0 1 5l ) ， 因此具有很高的灵敏度。利用激光诱导荧光法检测单分子，最早是在1 9 7 6 年， h i r s c h f e l d 等【1 4 】在一个抗体分子上结合8 0 到1 0 0 个荧光分子，在低温下第一次探 测到液体中单个抗体分子的荧光，直到1 9 8 9 年，m o e m e r 掣”】在低温下首次观 测到分子晶体中掺杂的单分子荧光。另外共聚焦显微术辅以各类荧光探针或荧光 染料与被测物质特异性结合，不仅可以观察固定的细胞、组织切片i l6 j 和d n a 构 像动力学【1 7 】，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测【1 8 】。 * 一 绪论 雾绰i = = s - 图1 - 1 共聚焦荧光显微术的成像原理 1 2 3 2 全内反射荧光显微术 全内反射荧光显微术的原理为：当一束光从高折射率的光密介质照射至低折 射率的光疏介质时，在界面处入射光将有一部分发生反射，另一部分发生折射， 如图1 - 2 所示，入射角与折射角间满足s n e l l 公式r 1 1 1 ： n 1s i n e t = n 2s i n 0 2 ( 1 - 1 ) 式 0 1 和0 2 分别表示入射角和折射角，“l 和n 2 分别表示两介质的折射率， n 1 n 2 。 、射光 圈1 - 2 全内反射原理 i 9 泔 当入射角增大到临界角o c 时，这时的折射角为9 0 。；当入射角继续增大到夫 一。 第一章绪论 于临界角时，折射角消失，即发生了全反射。当0 2 = 9 0o 时，由公式( 1 1 ) 得： 0 c = s i n 1 ( n 2 n 1 ) ( 1 2 ) 此时由于波动效应存在，有少量的光能量会穿透界面渗透到光疏介质中，并 沿平行于界面的方向传播，产生倏逝波或隐失波( e v a n e s c e n i w a v e ) 。倏逝波的光 强度i z 在光疏介质中随界面距离z 以指数关系衰减( 公式1 3 ) ，图1 3 为i z 随z 衰减的示意图。 1 。- i o e x p - 班_ p 】 ( 1 - 3 ) d p 一4 羽l l s i n 2 色一研2 加1 ) 2 ( i - 4 ) 式中i o 为倏逝波在界面的入射光强度，九是入射光的波长，d d 为透射深度， 它等于界面处光强度衰减到i o e 时离界面的距离，以( 1 4 ) 式表示。i z 、i o 与0 l 有 关，d p 随入射光波长的增加、n 2 n 1 值的增加而增大。d p 一般小于2 0 0m ，对于 可见光约为1 0 0n l t l 。 04 z 图1 3 倏逝波光强度随界面距离的衰减曲线 全内反射荧光显微术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一， 利用全内反射产生的隐失场来照射样品，使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团 受到激发，而范围外的荧光团不受影响，所以全内反射荧光显微术具有其他成像 方法无法比拟的高信噪比，并且细胞的光损伤和光漂白也很小【l9 1 。这一技术己被 广泛用于细胞分泌位点的确定【2 0 1 、实时观察单个肌球蛋白分子的运动【2 1 1 、单个 蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( f r e t ) f 2 2 1 、a t p 酶的翻转 2 3 】、聚合物中单 个分子的结构变化及等离子体膜附近神经分泌的颗粒运动【2 4 1 、追踪量子点在细胞 内的运动【2 5 1 、c a m p 与受体的结合解离及阿米巴细胞的趋药性【2 6 】等方面。但是 第一章绪论 t i r f m 的缺点是不可能做到深度层析成像，它可以和别的显微术，例如明场显 微术、荧光显微术、共聚焦显微术、原子力显微术和荧光寿命成像显微术等结合 起来，达到特殊要求的成像效果。 1 2 3 3 扫描近场光学显微镜 近年来利用近场光学技术发展起来的扫描近场光学显微镜，突破了光学显微 镜的半波长极限的限制，分辨率可以达到1 0n n l ，可以分辨单个大分子。它是在 样品上扫描并检测反射光而做出图像，类似于焦点扫描的共聚焦显微镜。扫描近 场光学显微镜一出现就成为一个有力的单分子检测方法，目前它在单分子检测中 的应用主要有以下几个方面：( 1 ) 单分子光谱的研究，t r a u t m a n 等【2 7 】报道了聚合 物界面上的单个分子的近场荧光谱，揭示峰位置、宽度、时间等性质分布；( 2 ) 单分子在界面上的扩散，高分辨率的s n o m 和a f m 联用直接测量了a l e x _ 5 3 2 单分子在低浓度聚合物p m m a 表面2 5n m 范围内的荧光强度，并且考察了聚合 物表面形貌对a l e x分子荧光强度的影响；( 3 ) 单分子荧光共振能量转移的 研究，等【2 _ 9 】5 用3 2探测了 单2 8 1 s e k a t s k i is n o m d i p o l e个给体和q u a d r u p o l e 单个受体分 子对之间的能量转移，从理论上论证了这种转移的可能性并且得到荧光共振能量 转移光谱。其他还有诸如单分子荧光生色团及其寿命的研究，单分子的非荧光标 记研究等等。其不足是扫描时需要通过复杂的控制系统来保持适当的样品与探针 之间的距离，并且其近场激发对研究的生物体系有微扰作用，从而带来许多限制。 1 3 单分子荧光检测 1 3 1 单分子荧光的产生原理 单分子的荧光产生原理如图1 - 4 ：s o ，s l ，s 2 分别为基态、第一激发单重态、 第二激发单重态，t l 为第一激发三重态。分子吸收一个光子l a v a 后，被激发到较 高的电子态s l 或s 2 以上的能级后通过振动驰豫或内转换等非辐射跃迁快速弛豫 到s ，的最低振动能级，然后发射一个荧光光子h v f ，同时使分子弛豫到s o 的较 高振动能级，最后快速弛豫到s o 最低振动能级。由于弛豫过程造成了能量损失， 因此荧光光谱发生红移。同时，分子也可能从s l 无辐射系间窜跃到t l ，由于自 6 第章绪论 旋禁阻，其速率远低于从s l 到s o 的辐射跃迁，然后从三重态弛豫到基态并发射 一个磷光光子h v p 。单重态向三重态的跃迁会降低分子的荧光量子产率和缩短分 子的荧光寿命，当处于s l 态的电子弛豫到t l 态时，分子的荧光很弱，乃至没有 荧光，形成荧光暗态。一旦当电子从t l 态回到s o 态时，分子处于新的一轮激发 和发射的循环过程。因而形成一个发射暗态交替的量子跳跃过程，这种量子跳 跃过程是单分子荧光的主要特征之一【3 0 】。这一重要特征导致了实验中观察到的单 分子荧光光谱和荧光强度的涨落现象，并主要取决于单分子的局域环境及其猝灭 途径。因而测量单分子的荧光量子跳跃过程、荧光寿命和荧光量子产率可以提供 很多关于单个荧光分子所在的局域环境的特性和变化情况的信息。 s z s ， s o 缘 l l 量动触 一转叠 缘l l 罩一一罡 、i 、i 枉 h v 囊竞h v f 露光h 咋 钫-， i 图1 4 单个分子的荧光产生原理 单个荧光分子还具有唯一的固有荧光吸收跃迁偶极矩，分子只吸收那些偏 振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的光子，然后发出具有一定偏振方向的荧 光。荧光的偏振特性是单分子的另一重要特征【3 。在单分子探测的广泛应用中， 人们正是利用这种单个分子跃迁偶极矩的方向以及分子所处的环境的差异来研 究和推测生物大分子的结构和功能。 单分子光学检测法中，激光诱导荧光( 1 a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 以其灵 敏度高的特点成为目前应用最广泛的检测手段。l i f 的基本原理是：在激光照射 下，荧光分子从基态到激发态，发射荧光光子回到基态。由于荧光分子通过激光 7 第一章绪论 束的时间( m s 级) 比荧光的激发态寿命( 1 1 s 级) 大得多，因此一个荧光分子在通过 激光束的过程中可以被反复激发而在基态和电子激发态之间反复循环，发射出大 量的荧光光子，即“光子爆发( p h o t o nb u r s t ) ”。通过这种在短时间内发出大量光 子的“光子爆发”现象【3 2 】可以把单个荧光分子的荧光同很强的背景杂散光区别开 来，从而有效地探测单个荧光分子，并从这样的爆发中获取研究对象的相关信息。 根据荧光寿命和分子在激光束中的停留时间，可算出单个分子发射的最大光子数 为1 0 5 1 0 6 。目前光学检测系统收集、检测光子的效率约为1 【3 3 】或0 5 5 【3 4 】，故单个分子仍可被检测到数千光子信号，这些数目的光子不仅足以探测 到单个分子，而且足以进行光谱辨认和实时监测。 1 3 2 单分子荧光检测技术的关键 在稀溶液中，吸光光度法检测单个分子的吸光值的准确度较低，而荧光发射 检测因背景值较低，所以较为灵敏，信噪比较高。正如k e l l e r 所说“单分子检测 能力的高低与其说是检测灵敏度的提高，不如说是背景噪音的降低 【33 1 。 对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求【”】：( 1 ) 在被照射的体积中只有 一个分子与激光发生相互作用，这一点可以很方便地通过调整研究体系的浓度 ( 密度) 来达到；( 2 ) 确保单分子的信号大于背景干扰信号，这一点可以通过减 少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰来达到。杂散光背景是影响单 分子荧光检测信号的重要因素。为了有效地检测单个分子，必须大大降低杂散光 的干扰。杂散光的主要来源为：瑞乖u ( r a y l e i g h ) 散射光和光学器件的散射光； 溶液的拉曼( r a m a n ) 散射光；玻片、溶液杂质的荧光；源自样品内在成分 的荧光( 自发荧光) ；来自未结合或未特定结合的探针荧光；检测器暗电流【3 6 】。 因为单分子信号与探测体积无关，而背景则正比于探测体积，因此要获得理想的 信噪比需要将激发体积最小化。目前文献报道的流体聚焦、法【y 7 】的检测体积可达到 1 1 0p l 的级别；微滴法【3 8 】也可达到p l 级，共聚焦显微法【3 9 】的探测体积则在f l 至亚几级，因此背景可忽略不计，具有很高的信噪比，但这种方法由于布朗运 动导致分子进入探测区域的概率较小，使得分子检测的效率较低。如何平衡检测 体积的减小与检测效率的提高亦是单分子检测技术亟待解决的问题之一。另外， 还有人使用毛细管和微通道 4 0 , 4 1 来达到降低检测体积的目的。为了消除杂散光， 8 第一章绪论 还可以采用的方法1 3 2 】：( a ) 光谱滤波：有滤光片去掉其它颜色的杂散光( 如瑞利 散射光，光学器件散射光，溶液杂质的荧光) ；( b ) 幂l j 用荧光和杂散光在时间特性 上的区别来消除拉曼散射光。由于荧光强度是一条指数衰减曲线，荧光发射有几 个n s 的延迟，因此采用高重复频率的激光器并结合时间门符合技术可以把单个 染料分子的荧光信号同很强的背景杂散光区别开来。( c ) 使用单光子检测器。检测 器技术是单分子荧光探测的关键部分，由于单个分子的荧光很弱，这就要求荧光 检测器具有较高的量子效率和很低的暗计数。目前常用的超敏检测器是增强型电 感耦合装置( i c c d ) 和单光子计数模式的雪崩光二极管【4 2 l ( a v a l a n c h ep h o t o d i o d e ， a p d ) ，最终希望光子检测效率达到0 1 以上。 1 3 3 单分子荧光检测的应用 1 3 3 1 单分子对荧光共振能量转移( s p f r e t ) 荧光共振能量转移( f r e t ) 已被广泛地应用于生物化学和生物物理学的研 究。随着单分子技术的发展，单分子对荧光共振能量转移( s p f r e t ) 己成功地 应用于许多实验中h 3 4 4 。s p f r e t 方法在研究生物大分子催化、折叠等过程中构 象变化的动力学过程时是相当有效的。所谓单分子对荧光共振能量转移就是在一 个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基团，一个在能量转 移过程中提供能量，即供体；另一个接受能量，即受体，受体的吸收光谱与供体 的发射光谱相重叠。由于偶极一偶极相互作用，能量从供体传递到受体。这样， 通过检测能量传递效率，可确定两点间的距离，并且通过监测能量转移效率随时 间的变化可以推测由生物大分子在生命活动中构象变化所引起的两点间的距离 的变化。 最早实现这种测量的是h at 等【4 5 】对固定于硅烷化玻璃片上d n a 的相隔1 0 到2 0 个碱基对分别被t m r ( t e t r a m e t h y r h o d a m i n e ) 荧光分子作为供体和t e x a sr e d 荧光分子作为受体标记后进行f r e t 测量。他们还通过单分子荧光的偏振特性和 s p f r e t 方法研究了蛋白一抑制剂( p r o t e i n i n h i b i t o r ) 的结合，并证实这些方法 具有足够的精度来区分单个酶分子是否与抑制剂结合时酶的构象态【4 6 】。图1 5 是一典型的单对供体一受体体系标记的单个无抑制剂蛋白的能量转移的情形，它 直观地给出了供体与受体之间的能量转移过程。供体的荧光有效地转移给受体， 9 第一章绪论 当受体发生光漂白时，能量转移被阻断，供体自身发出荧光。 摄 七 图1 5 单对供体受体体系标记的单个无抑制剂蛋白的能量转移过程 n o b u a k is o h 等1 4 7 】贝0 是观察到被两个胸腺嘧啶连接的6 - f a m 和5 - t a m r a 分子能够发生由6 - f a m