（特种经济动物饲养专业论文）丝素粉的制备及其理化性质的研究.pdf

： 十 。， 。 丝素粉的制备及其理化性质的研究 中文摘要 本研究运用物理粉晚法及中性盐法、酸法、碱法和酶法对脱胶 丝进行处理后，运用普通烘干法、冷冻干燥法和喷雾干燥法，制备 了多种丝素粉，并对丝素粉的性质进行了比较研究。研究探明了各 种丝素粉的产率，水溶性和自度，同时用原子吸收光谱法( a a s ) 测 定了丝素粉中p b 和a s 两种重金属的含量。并用扫描电镜( s e m ) 对 丝素粉的外部形态结构进行了观察比较，用热重法( t g ) 和差示扫描 量热法( d s c ) 对丝素粉的热化学特性进行了分析研究，用傅立叶变 换红外光谱( i r ) 对丝素粉进行了分子结构分析。 ( 研究表明，适当控制水解条件均可制备出产率和水溶性较高的 丝素粉。但水解的程度不同，所得丝素粉的白度有差异，盐法、酶 法、物理粉碎法所制备的丝素粉的确白度较高，酸法和碱法所得丝 素粉的白度偏低。a a s 测定结果表明丝素粉内的重金属p b 和a s 的含量均小于0 1 m g k g 。 i r 测定表明，随制备方法的不同，丝素粉的1 3 折叠结构、a 一 螺旋结构、无规卷曲结构含量会发生变化，并导致丝素粉结晶程度 的改变。由于结构发生了转变，各种丝素粉的d s c 曲线和t g 曲 线也发生了变化，在曲线上吸热分解的峰点温度和拐点温度也对应 不同。 本研究结果为丝素粉的进一步丌发利用提供了依据，对拓宽蚕 丝用途有重要意义。 关键词：丝素蛋白质。制备水解酶冷冻干燥喷雾干燥 理化性质a a ss e md s ct gi r 渐江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 引言 蚕丝是长蛋白纤维，质地柔软，其织物( 丝绸) 穿着舒适，具有华 丽的光泽，在蚕丝开发利用的几千年历史中，主要被用作服饰用品， 千百年来一直处于供不应求的状态。但到本世纪2 0 年代末，蚕丝业第 一次出现全球性生产相对过剩。蚕丝发达的日本为了维护其蚕丝生产 的国际地位及促进本国蚕丝业的健康发展，从1 9 3 3 年起，农林省蚕丝 试验场将有关蚕茧新用途的研究列入政府预算，开始了蚕茧新用途的 开发研究。由于蚕丝用作纺织原料时，其染色的坚实度、耐洗性、耐 日光性、抗皱性、耐污性差，最初的研究大都围绕蚕丝的应用性能和 实用机能而展开。进入7 0 年代末，日本国内蚕丝业开始不断萎缩，生 产形势面临严重危机，于是许多学者开始重新考虑蚕丝的多用途开发 利用问题，同时也引起了其他蚕丝生产国家的关注。 蚕丝中的丝素( f i b r o i n ，丝素蛋白) ，是蚕丝的主要组成部分，约 占蚕丝含量的7 0 8 0 。长期以来，人们认为其分子是以g l y a l a 。 g l y a l a g l y x ( x 是包含s e r 残基的其他氨基酸残基) 的氨基酸序列 的重复构造为主体的一根长链分子。但近几年来随着丝素蛋白分子生 物学研究的进展，已认识到丝素蛋白是由大小两个多肽链通过二硫键 缔合而成，犬的肽链叫重链( h 链) ，小的叫轻链( l 链) 1 2 1 。h 链是 由结晶区和非结晶区段交互排列构成，其亲水区域中存在的2 个c y s 残基与l 链亲水区域中的c y s 残基通过极性基团阳j 的相互作用而靠近， 并最终缔合在一起。在特定的处理条件下，丝素蛋白分子会发生无规 堑望盔堂塑圭兰垡鲨塞 一 卷曲结构与b 折叠结构的相互转变，其形态可相应的表现为纤维状、 粉状、膜状、凝胶状以及溶液状，而目这些形态之i i i j 亦可相互转变。 随着对丝素结构研究的不断深入，丝素作为结构蛋白其非服饰功能被 逐渐发现和认识，对其开发利用的研究领域也不断拓宽，逐渐延伸到 食品、发酵工业、新材料、生物制药、临床诊断治疗、环境保护、能 源利用等许多方面，呈现出欣欣向荣的景象川。蚕丝新用途的拓宽对于 促进丝织行业中的废物利用，充分利用资源，防止环境污染等具有十 分重要的意义。 2 丝素蛋白的开发利用研究现状 2 1 蚕丝蛋白在化妆品领域的开发利用 由于蚕丝蛋白具有良好的保湿性、吸湿性，有助于皮肤调节水份， 与皮肤的角朊蛋白具有良好的亲和性，同时，它还能够吸收紫外线， 防止太阳辐射，因此，7 0 年代日本就开发丝素粉并用于粉底材料。有 关丝素作化妆品的最佳分子量范围，在8 0 年代初，据日本有关资料介 绍，采用一定浓度的硫酸将丝素部分水解后，用碱中和制得分子量在 3 0 0 8 0 0 的丝素肽，当它与中性盐制备的分子量在1 0 0 0 3 0 0 0 的肽混 合使用时，能够增加毛发的自然光泽及弹性，对皮肤起到保湿作用。 盛家铺【5 】综合国内外的研究，通过用葡聚糖凝胶层析法进行丝素分子量 的测定，提出了当丝素被降解为分子量在1 0 0 0 6 0 0 0 范围时，既容易 透过人体的表皮细胞膜而被皮肤吸收，又对减少皮肤局部细微皱纹及 抑制黑色素有一定的作用。从8 0 年代初，中国江苏无锡利用丝素粉制 成丝素膏，产品远销东南亚。8 0 年代中期，山东、浙江等地研究出在 日用化工、医药工业上有多种用途的丝( 素) 精，把它配入镇痛消炎 浙江大学硕士学位论文 的皮肤外用药膏中，可起到愈合伤口、防止皮肤干燥、促进皮肤吸收 的作用。到1 9 9 2 年时，日本利用蚕丝丝素粉已经成功开发出粉底、 粉饼、香波、固形剂、洗发剂、头发保护剂、唇膏等一系列化妆品【6 l 。 2 2 蚕丝在工艺品上的应用 1 9 9 0 年以前，日本每年从古巴和印度尼西亚进1 3 海龟甲壳7 5 吨， 但是由于海龟是濒i | 缶灭绝的野生动物，华盛顿条约在国际范围内禁止 海龟交易后，日本龟甲协会与香川县的四国工业研究所受通商产业省 的委托，开始从事利用蚕丝蛋白制作龟甲代用品方面的试验研究。1 9 9 2 年1 0 月3 0 目在朝日新闻中宣布获得成功。该法将预先制备的透明蚕 丝蛋白膜，在水蒸汽中进行真空压榨，从而获得与龟甲相似的板状原 材料，当材料吸附金属的微粒或用染料着色后，即成龟甲特有的颜色， 由此制成的工艺品深受消费者的欢迎【7 1 。 2 3 丝素蛋白的抗菌性 r h e es k 等8 1 将丝素蛋白水解后分别配成0 3 、0 6 、0 9 的浓度， 然后加入到辣泡菜中，可显著抑制乳酸菌的生长，这表明丝素具有一 定的抗菌性。 2 4 丝素的保健功能及其食用开发 丝素由1 8 种氨基酸组成，从营养学和医学的角度来看，丝素蛋白 中丰富的氨基酸及其构成的短肽对人体有特殊的保健作用，从而有可 能开发具有特殊功能的保健、医疗食品睁”1 。 堑兰三查堂塑堂笪迨塞 2 4 1 丝素蛋白的保健功能 2 4 1 1 解酒作用 丝索蛋白质中有2 8 ( 摩尔百分率，下同) 的丙氨酸，而丙氨酸 对酒精有促进分解作用。平林漯等1 通过动物实验，研究了丝素蛋白 水解液对酒精的促代谢作用。试验中给大白鼠添食酒精之前先喂食一 定量的蚕丝水解物，经过一段时间后调查血液中的酒精浓度随时间发 生变化的情况，结果表明预先喂食丝素蛋白的大白鼠血液中的洒精浓 度明显低于没有喂食水解物的大白鼠，从而证明了蚕丝水解物具有促 进酒精代谢的效果。 平林漯等 1 2 - 14 1 进一步研究了丝素蛋白的解酒机理。当人喝醉酒时， 体内酒精含量比较高，此时在肝细胞中脱氢酶的作用下，酒精可被代 访 为乙醛和n a d h ，当肝脏中糖原贮备不足时，丙氨酸向糖原转化， 激活乙醛和n a d h 分解链，从而使酒精分解，避免恶醉，同时也起到 保肝护肝的作用。另外，水溶性丝素蛋白粉末的解酒作用明显强于丙 氨酸。因此可以推断，丝素蛋白中丙氨酸及其它氨基酸共存，起作用 的是丙氨酸及其它氨基酸一起发挥的协同作用。 2 4 1 2 降低血液胆固醇 丝素蛋白具有很强的吸附作用，尤其较大分子量的丝素蛋白易发 生胶化，通过吸附凝固胆汁酸来促进对胆固醇的分解。k s u g i y a m a 等1 认为，丝素蛋白有降低血液中胆固醇的功能，起作用的主要是丝素蛋 白中含量高达3 6 的甘氨酸。通过丝素蛋白对大白鼠血液中胆固醇浓 度的影响研究，发现当饲料中的蛋白质为酪蛋白时，大白鼠血液中的 胆固醇浓度在喂食后呈急剧上升的趋势，与此相反，当饲料中的蛋白 质为丝素蛋白时，胆固醇浓度的上升却被大大地抑制，可见丝素蛋白 具有降低血液中胆固醇的作用。另外又发现，当甘氨酸单独存在时， 4 浙江大学硕士学位论文 其降低胆固醇的效果明显低于丝素蛋白，说明起作用的是丝素蛋白中 甘氨酸和其它氨基酸及短肽的协同作用。而血液中胆固醇的降低可以 防治高血压和脑血栓，因此，丝素蛋白可用作药用食物。 2 4 1 3 促进胰岛素分泌 丝素蛋白可以促进胰岛素的分泌。平林漂2 1 通过实验发现，给大 白鼠喂食丝素蛋白后，与喂食前相比，血液中的胰岛素水平明显增加， 这说明丝素蛋白能促进胰岛素分泌。但水解丝素蛋白比未水解的丝素 蛋白效果要好，当分别以两种丝素蛋白喂食大白鼠后，观察其门脉中 所产生的游离氨基酸浓度的变化，发现喂食水解丝素蛋白的大白鼠门 脉中游离氨基酸含量明显高于喂食未水解者，说明经水解之后，丝素 蛋白被降解成低聚肽和氨基酸，易被消化吸收，极易进入血液发挥作 用。 丝素蛋白促进胰岛素分泌的机理有这样一种解释。由于丝素蛋白 降解后，其氨基酸序列中含有与胰岛素受体蛋白结构相似的氨基酸序 列。胰岛素感受器的一级结构一般被认为是按一g l y x g l y x 一的 次序排列的，而蚕丝结晶区的氨基酸排列顺序为- - g l y a l a g l y a l a 一，这两种结构是相似的。因此，当蚕丝肽的一g l y a l a g l y a l a 一结构进入胰腺后，胰岛细胞将其误认为感受器，从而加速了胰岛素 的分泌。其机理是否真正如此，还有待于进一步研究确认。 丝素蛋白可以促进胰岛素的分泌，而胰岛素又可以促进人体内的 糖分代谢。当人体内糖分含量过高时，补充丝素蛋白可以促进胰岛素 对糖分代谢的调节，从而达到防治糖尿病的效果，这与资料表明的给 大自鼠喂食丝素蛋白可降低其血糖值的报道相一致l ”】。 2 4 1 4 降低血压 t a n i g u c h ik o u k i c h i 等”7 1 利用凝胶层析方法、高效液相色谱等方法， 5 浙江大学硕士学位论文 从平均分子量为3 0 0 0 的丝素降解物中分离出两种多肽( a s i 和a s i i ) ，其氨基酸序列分别是：一g i y v a l g l y a l a g l y t y r 一和 一g l y a l a g l y t y r 一，这两种多肽具有血管紧张肽转化酶( a c e ) 的抑制活性，a c e 可以催化血管紧张素i 转化为血管紧张素i i ，而血 管紧张素i i 是已知作用最强的内源升压肽。a c e 抑制剂的存在能够阻 止血管紧张素i i 的生成，从而起到降低内源血压的功能。所以，丝素 蛋白可以进一步开发以用作降低血压的药物食用。 2 415 防治帕金森氏症 丝素蛋白中含有6 的酪氨酸，它在酪氨酸脱氢酶的作用下可生成 多巴，而多巴在酶的作用下可转化成多巴胺，从而对帕金森氏症有防 治效果。多巴胺可以抑制中枢神经系统的神经传导，而帕金森氏病患 者由于多巴胺的不足，神经处于兴奋状态，肌肉紧张而引起手足颤动， 脸部变形，很难保持正确的姿态，因此患者需要服用多巴胺。但是， 多巴胺不能通过脑血管的阀门，而脑血管的前驱物多巴是能够通过这 一阀门的。帕金森氏病患者由于体内酪氨酸氢化酶含量低或者缺乏， 不能将酪氨酸转化为多巴，从而发病，但是没有酪氨酸也不能产生多 巴，对帕金森氏病患者来讲，酪氨酸是一种必需氨基酸。所以补充含6 酪氨酸的丝素蛋白可以有效地防治帕金森氏症3 “4 “”。 2 4 2 丝素食品的开发现状 丝素蛋白经过酶降解或酸水解后，可成为氨基酸与低聚肽的混合 物f l 。用大白鼠进行动物实验表明，大白鼠对酶降解后的丝素蛋白粉 的消化率为7 0 ，对酸水解后丝素蛋白粉的消化率为9 l 。但如果用 丝素蛋白水溶液和未降解丝素蛋白粉饲喂，其消化吸收率分别可达 4 7 4 和2 7 6 l 。可见，丝素蛋白不仅具有多种功能性，其水解后 塑坚盔堂塑主鲎垡迨塞 的丝素蛋白肽和氨基酸在体内容易被消化吸收，这在功能性食品的应 用方面具有较大的开发潜力。 同本早在1 9 8 3 年就着手蚕丝食用化的研究，最早的产品为蚕丝果 冻，目前日本利用丝素蛋白已经开发出了一系列产品。1 9 9 6 年底，日 本加悦开发公司开始规模化生产丝素蛋白粉并向食品生产厂家销售。 而一些含有丝素粉的食品如丝素蛋白蛋糕、面条、冻果胶、冰淇淋、 糖果、稀饭、饮料、酱油等已经有很多种类产品面世，以其独特的品 质而深受消费者青睐，也成了日本新一代的保健食品。 我国具有丰富的废丝资源，有关蚕丝食品的研究开发报道较多。 李德远等1 2 0 将经过n a ：c o ，溶液脱胶处理后获得的丝素蛋白质在c a c l 2 溶液中进一步溶解处理，经透析脱盐制得丝蛋白溶液。并以此为原料 制备的饮料和果冻口感良好，色泽透明，食用卫生安全。另外，李辉”、 任赓夫等1 2 “，也用丝蛋白质为原料制得含丝面粉、丝精等。但是，由 于蚕丝功能性食品中含有多种生理活性物质，且不同条件下获得的丝 素蛋白粉理化性质差异较大，它在人体内发挥生理功效的作用机理尚 未完全阐明，所以该方向的研究仍方兴未艾。 2 5 丝素蛋白在生物医学领域的开发研究 丝素蛋白在生物医学领域的研究比较活跃，并取得了许多有实用 价值的成果。蚕丝的主要成分丝素是由结晶区和非结晶区共同构成的 一种蛋白质，它具有良好的生物亲和性，通过人为地控制非结晶区的 扩散可以调整丝素的生物亲和性以及对氧气和水蒸汽的透过性能。这 使丝素在新型生物材料、生物医药开发方面呈现出勃勃生机。 浙江大学硕士学位论文 2 5 1 丝素蛋白在生物酶防护剂上的研究 农药可通过抑制人体中的乙酰胆碱酯酶的水解而侵害人体。用丝素 蛋白溶液为材料合成生物酶防护剂后，它可直接和有毒物质( 有机磷 酯) 发生反应，结合成稳定的磷酰化胆碱酯酶而阻断毒剂对人体的侵 害。杨旭红等2 3 1 以乙酰胆碱酯酶为材料，以丝素蛋白溶液为载体制得 防护剂，并测定了经防护剂保护后酶的活性，经过9 个月后，丝素蛋 白溶液保存的乙酰胆碱酯酶仍然具有活性，而以蒸溜水为防护剂载体 的乙酰胆碱酯酶则完全丧失活性。这表明以丝素蛋白溶液作为生物酶 防护剂是可行的，它具有较好的防毒效果，可使酶具有较长的保存寿 命。 2 5 2 丝素蛋白在抗凝血物质上的研究 动物内脏中肝磷脂具有较强的抗凝血活性，它是一种硫化多糖， 其分子中的硫酸基对抗凝血活性起重要作用| 2 4 】。而丝素蛋白主要是由6 种氨基酸残基交替排列的结构( 一g l y a l a g l y a l a g l y s e r 一) ，当用浓硫酸 处理丝素水溶液时，在规定时间内恒温下搅拌，使之发生反应，经n a o h 中和反应液并透析脱盐，冷冻干燥后获得硫酸化丝素粉。然后用傅立 叶红外光谱( f t i r ) 和核磁共振( 1 k i n m r ) 检测硫酸处理的丝素中 被导入硫酸基的情况，结果表明丝素蛋白分子中的酪氨酸或丝氨酸的 羟基被硫酸酯化，形成的硫酸酯基在l1 0 0 1 4 0 0 c m 。1 处有强烈吸收峰， 说明丝素蛋白中被导入了硫酸基。硫酸处理的丝素蛋白与未处理的相 比，显示出抗凝血活性。由于这种物质可低价制造，不仅可作为防止 血液凝固的试用药，也可利用其来提高人工血液的抗凝固机能， t a m a d a l 2 ”已经开发出此类抗凝血药并申请了专利。 2 5 3 丝素蛋白治疗自我免疫疾病的作用 掘n i s h i m u r a 等1 2 ”的研究，丝素的酶水解产物非常有用，当被用 r 、 塑至盔堂堑堂焦堕塞 一一 作食品或者复合药物时，它对遗传性的过敏性皮肤炎、组织狼疮红斑 等类似疾病有治疗作用。这是因为当人体发生自我免疫疾病时，同时 伴随产生大量的抗体形成细胞，而丝素的酶水解物可抑制体内5 l 的 抗体形成细胞，因此可以用来治疗自我免疫疾病。 2 5 4 丝素蛋自在药物缓释载体上的研究 丝素蛋白的生物亲和性较好，闵思佳等【2 7 进行了丝素蛋白用于药 物载体方面的研究。在丝素蛋白溶液中添加l 一乙基一3 一( 3 - 二甲氨基丙 撑) 后获得多孔性丝素水凝胶。分别用其包埋阳离子型药物水晶紫 ( c r y s t a lv i o l e t ) 、阴离子型药物锤虫蓝( t r y p a nb l u e ) 和非离子型药物 丝裂霉素c ( m i t o m y e i nc ) ，然后在不同p h 缓冲液中测定水凝胶的药物 透过行为和药物释放行为，以及水凝胶的溶解性和酶分解性。结果表 明其凝胶具有一定药物透过性，在释放药物时，具有一定程度的p h 响 应性，在作为药物缓释载体时，具有一定的酶分解性。 2 5 5 丝素蛋自在人工皮肤上的研究 人的皮肤由表皮层和真皮层构成，表皮层在外层，真皮层在内层， 当真皮层被破坏后，皮肤不会再生，这时需要进行皮肤移植，除了患 者本人，移植来的皮肤一般极难生长愈合，因此，现在人工皮肤的开 发研究也仅能用来治疗真皮尚存的情况m 】。而张幼珠等m 1 研制的丝素 创面保护膜，具有良好的柔韧性、透水性、透气性、与创面的粘附性 以及与人体的生物相容性，可将药物从膜中先快后慢的释放出来，具 有抑菌杀菌作用和保护创面的作用。 2 5 6 人工肌腱与韧带的开发 蚕丝的强度和弹性系数与生物体的肌腱相近，具有良好的生物亲 和性，适合于开发人工肌腱与韧带 3 0 1 。在丝素蛋白中导入带电化合物 后，可加速其与钙、磷酸基团的凝集，进一步将带有负电荷的羧基、 浙江大学硕士学位论文 磷酸基导入丝素蛋白材料，可使其达到改质要求，改质以后的丝素蛋 白可与生物骨基质中主要无机成分羟磷灰石结晶中的基团紧密凝聚， 其钙的凝集量比无处理的丝素蛋白有大幅度的增加，特别是导入磷酸 基的丝素蛋白中，钙的凝聚量比无处理的丝素蛋白高1 0 倍以上，可望 用于开发人工肌腱与人工韧带。 2 5 7 丝素蛋白在软组织相容性材料上的研究 将丝素水溶液凝固得到的块状物质用旋盘切削研磨，或者在丝素 水溶液中添加重合开始剂( 如甲醇等) 、乙烯基化合物等，再放入模 具内使之发生重合反应，可制得一种优质丝素膜，在含水状态下其透 氧率与现在隐形眼镜使用的羟乙基异丁烯酸酯化合物几乎同等。当用 甲醇处理丝素膜时，膜的氧气透过系数依赖于甲醇处理的时间。这是 因为随着甲醇处理时间的增加，膜的结晶度提高，膜内形成微结晶而 影响透氧性。此种丝素膜的可见光线透过率可达9 8 以上，它与软组 织间具有较好的生物相容性，可望被开发用作隐形眼镜1 ”i 。 2 5 8 丝素用作手术缝合线 外科手术的缝合线一般都使用真丝线，而最近尼龙、涤纶等合成 纤维的使用在增加，但真丝缝合线细度小、拉伸强度大，易打结且结 头不易散开，对人体无过敏性，所以真丝线的使用仍具有相当大的比 例，在伤口不能有疤痕的眼科、整形外科，细度小、强度大、屈性好 的真丝缝合线更合适l ”。 2 5 9 丝素蛋白用作功能性细胞培养基质 丝素蛋白有结晶区和非结晶区混合结构存在，整体上带负电，带 负电的生物材料生物相容性较好。丝素非结晶区有许多碱性氨基酸， 对细胞有一定程度的吸附作用，故能吸引细胞附着在其上面。 m i n o u r a 等【3 2 1 学者研究了株化纤维芽细胞l 一9 2 9 在丝素膜上的接附 1 0 塑坚盔堂堡主堂焦迨丕 和增殖情况，证实了丝素蛋白用作哺乳动物细胞培养基质的可行性。 甲斐丰健等m 1 学者进行了人体肝细胞( h e p a t o c y t a ) 在丝素膜上的活体 ( i nv i t r o ) 培养。在丝素膜上播种肝细胞2 4 h 后，用位相差显微镜可 观察到细胞沿基质表面和内部的网状结构作多重结构的接附。谷。苯转 氨酶( g o t ) 和谷丙转氨酶( g p t ) 化验结果显示，接种1 7 d ，丝素 膜上附着的肝细胞的g o t 和g p t 活性值几乎没有变化。丝素膜上培 养的肝细胞的氨处理能和肝细胞蛋白分泌能也不低于目前最好肝细胞 培养基胶原( c o l l a g e n ) 。因此，如果用添加交联剂等方法控制细胞的 接附和增殖性，丝素膜可被用作人体细胞的培养基质。 2 6 丝素在固定化载体材料上的研究 2 6 1 丝素作为周定化载体的研究 酶( 或微生物) 的固定化是指通过物理或化学方法将酶( 或微生 物) 固定在某种载体上，使其成为仍具有催化活性的酶( 或微生物) 或酶的衍生物的过程，它在食品、生物医药等领域的应用日趋广泛。 由于丝素蛋白具有独特的分子结构、优异的机械性能、良好的吸湿和 保湿性能以及抗微生物性能，同时又可以容易制成粉状、纤维状及膜 状及交联多孔水凝胶等形态，是一种优良的固定化载体。 2 6 1 1 用丝素粉作为固定化酶的载体 y o s h i m i z u t “。5 l j 哿含蔗糖酶的水溶性丝素溶液在4 0 。c 条件下形成 丝素水凝胶后，将其进行真空冷冻干燥、研磨从而获得用作固定化酶 载体的丝索粉。在含有酶的丝素水溶液中添加7 0 浓度的甲醇后，用 同样的方法将其冷冻干燥并研磨而获得丝素粉固定化酶。然后分别用 红外光谱、”c n m r 、e s r 对用作酶载体的上述丝素粉进行研究。发 、 浙江大学硕士学位论文 素抗体膜的膜电位，表明样品血清膜与阴性血清膜的膜电位与a f p 的 浓度呈对数线性正相关关系，说明这是一种良好的免疫传感器。 26 24 神经递质传感器 脑内大部分神经递质及其代谢产物和一些神经肽化合物均可发生 氧化反应，可用电化学法测定其电位变化。在生理p h 条件下，神经递 质一般为阳离子，而代谢产物为阴离子。胡晓波等【6 7 1 利用丝素膜的两 性荷电特性，制备了丝素膜修饰电极，用以测定神经递质阳离子。在 生理p h 条件下，丝素膜荷负电，对神经递质脱氧酰苷( d a ) 和解一羟 色胺( 5 - h a ) 有检测信号，而在p h 3 溶液中对抗坏血酸( 5 - a a ) 和5 一 羟基吲哚乙酸( 5 - h i a a ) 有检测信号。这表明丝素膜可用于开发神经 递质传感器。 3 丝素粉的制备研究现状 丝素是蚕丝新用途开发研究的重要原料和前体物，具有何种理化 特性，将是进一步开发功能性材料的重要依据。因此通过物理、化学 相结合的方法，把下茧、废丝等原料制成蚕丝蛋白深加工的前体物丝 素粉，比较分析丝素粉的理化特性，探讨最佳制备工艺条件，可为进 一步开发利用提供依据。 t a k e u c h i t 6 8 1 用中性盐( c a c i ，) 在1 0 0 。c 条件下，将高分子量的丝 素溶解1 h 后，用蛋白酶等在5 0 。c 条件下继续处理7 2 h ，然后用电渗析 进行脱盐处理，可获得含量高达8 7 8 的丝素肽，这样获得的丝素肽 中，有7 2 分子量小于或等于5 0 0 。它可以被用作食品或化妆品。而c h e n k a i l i 等1 用2 m o l 1 的h c i 水解丝素，最终制得寡肽含量占4 0 和氨基 酸含量占6 0 的丝素粉，该丝素粉含有少量的油脂，除了铜外，不含 浙江大学硕士学位论文 其它重金属，符合食品卫生指标，可被用作食用材料。 平林潆【7 0 1 在中国讲学时提到了用盐酸水解法和酶解法制备丝素 粉。盐酸水解法制成的丝素粉呈黄褐色，含有6 0 的氨基酸和4 0 的 低聚肽，该丝素粉会随着氨基酸的分解而产生恶臭，虽可用活性碳进 行脱色、脱臭处理，但收率减少。 陆旋等1 分别利用中性盐( c a c i ：2 h 2 0 ) 溶解和稀硫酸水解的方 法制备丝素粉，然后用红外吸收光谱和x 射线衍射法测定丝素粉的二 级结构，用毛细管粘度计测其粘度，用热分析的方法测定分解温度， 同时测定用丝素粉制作成的固形物的密度、吸湿性、拉伸强度等物理 指数，显示出良好的性能。 隙朗利 7 2 1 等研究了用盐酸水解丝素获得水溶性丝素粉的制作方 法。结果表明，水解程度会影响丝素粉中的低聚肽的分子量和自由氨 基酸的数量，进而影响丝素粉的水溶性。 隙阴利1 7 3 1 等研究了影响丝素粉水溶性的因子，该研究分别采用盐 酸水解法和酶水解法降解丝素，结果发现当分子量大于1 万时丝素粉 的溶解性很差，这主要是由于受结晶区和疏水氨基酸的影响，而丝素 粉若由无定形区和亲水氨基酸组成时，即使分子量较大，也会获得较 好的水溶性。 秋山大二郎等1 用甲醛和胺基甲酸酯在1 5 0 。c 条件下分别处理丝 素粉，结果发现处理后的丝素粉其热稳定性增加，其吸水性能亦优于 其它树脂。 s a n o i 75 1 在聚胺酯和聚苯乙烯等热可塑性薄膜内加入一定量的丝素 粉后，可使该薄膜手感柔软，具有良好的湿度透过性。而1 w a m o t o 7 6 1 在原纤化后的纤维素中粘附一定比例的丝素后，可以制得一种新型纤 维，该纤维具有可生物降解性，它在燃烧时不会产生剧毒气体，因此 1 6 浙江大学硕士学位论文 对保护环境，防止污染具有重要意义。 综上所述，国内外在蚕丝蛋白应用的大量研究中，大部分是以丝 素粉为原料进行的，由于制备丝素粉的方法多样，同方法制备丝素 粉的条件又不尽相同，且不同的保存条件对丝素粉性质又会有不同的 影响，因此，探讨丝素粉的制备方法，测定丝素粉的理化学特性，并 对不同制备方法所得丝素粉的特性进行比较研究，对进一步加以开发 利用，具有十分重要的意义。 、 堂翌盔堂堡土堂垡堡塞 一 第二章丝素粉的制备和性质、结构的测定 摘要；本章主要介绍了用物理法、中性盐法、酸法、碱法、酶法等方 法制备丝素粉，测定了丝素粉的白度、产率、水溶性和重金属含量， 并测定了丝素粉的热特性和分子结构。 关键词：丝素粉制备性质结构 丝素粉的制备方法已如前述有较多报导，而各种制备方法的系统 分析研究尚少，本章主要是利用物理法、酸法、碱法和酶法制备丝素 粉，同时测定丝素粉的一般理化性质和结构。 1 丝素粉的制各 1 1 物理粉碎法制备丝索粉 1 1 1 材料l 1 1 1 1 原料：蚕茧壳，蚕蜂科学系应用化学与经营教研室提供 11 1 2 试剂：n a 2 c 0 3 ( 分析纯) ，上海虹光化工厂 11 1 3 仪器： s o v 型球磨机，海宁新华医疗器械厂 8 4 1 1 型电动振筛机 标准筛( 1 0 0 目、2 0 0 目2 8 0 目、3 2 5 目) ，杭州蓝天化验仪器厂 m d 一2 0 0 3 型上皿电子天平，上海天平仪器厂 1 i 2 方法 用物理粉碎法制备丝素粉的工艺流程如下： 、 浙江大学硕士学位论文 蚕茧壳一脱胶一烘干、剪碎一填料于球磨机一回收 一过筛一丝素粉一称重 112 1 脱胶丝的制备 将剥去茧衣的蚕茧用剪刀剪成4 块并烘干然后投入浴比1 ：1 0 0 的 o 5 n a ：c o ，溶液中煮沸，脱胶3 0 m i n ，用自来水冲洗后，重复操作一 次。将经过2 次脱胶后的茧丝用蒸馏水洗净，置8 0 。c 烘箱内烘干，即 获得脱胶丝( 下同) ，同时计算脱胶率。 1 1 2 2 脱胶丝的粉碎 蚕丝是一种长蛋白纤维，其质地柔软，韧性强，经过n a ，c o ，脱胶 处理之后，虽然其韧性下降，脆性增加，但是常规粉碎方法仍很难将 其粉碎。本试验选用球磨机作为粉碎脱胶丝的设备，是因为球磨机适 应性强，对大多数物料都能粉碎；能连续操作，可满足规模生产的需 要：其粉碎比大，一般情况下可达3 0 0 目以上，超细磨情况下可达1 0 0 0 目以上；同时该机型结构简单，机械可靠性强，工艺成熟，可标准化； 有较好的密封性，可有效防止外界环境对样品的污染。 1 1 2 2 1 球磨机工作原理【7 7 1 球磨机是水平放置在两个大型支承装置上的低速回转的筒体，它 依靠电机经减速机驱动简体以一定的转速旋转。简体内装有衬板，用 以保护简体并将机内研磨体提升到一定的高度，赋予其位能及抛射动 能；然后，具有一定初始速度的研磨体按照抛物线轨迹降落，冲击和 研磨从磨机进料端喂入的物料，如此周而复始，使处于研磨介质之间 的物料受冲击作用而被粉碎。实验表明磨机简体的回转速度对于磨矿 介质粉碎物料的磨矿作用有很大影响。当用不同的转速转动同一条件 的磨机时，衬板的提升摩擦力赋予磨矿介质以一定的高度，因而磨矿 介质具有较大的冲击动能。在抛落式状态工作的磨机中，物料在圆曲 1 9 浙江大学硕士学位论文 线运动区受到介质的磨剥作用，在介质落下的地方，物料受到介质的 冲击和强烈翻滚着的介质的磨剥作用，从而使其粉碎效率达到最高。 11 2 22 丝素粉制备 将干燥后的脱胶丝用剪刀剪碎，投入球磨机的简体内，密封筒口， 开启电源，粉碎成丝素粉。待粉碎后将丝素粉移入1 0 0 目、2 0 0 目、2 8 0 目、3 2 5 目标准筛内，置于电动振筛机上过筛，待粒度不同的丝素粉互 相分离后，收集，称重，密封保存。 1 2 中性盐法制各丝素粉 1 2 1 材料 1 2 1 1 原料：脱胶丝 1 2 1 2 试剂：c a c l 2 2 h 2 0 ( 分析纯) ，上海泗联化工厂 1 2 1 3 仪器： 透析带( 3 5 k u ，1 0 k u ) ，p i e r c e 公司( 美国) f w 8 0 型万能粉碎机，河北省黄家骅齐家务科学仪器厂 m d 一2 0 0 3 型上皿电子天平，上海天平仪器厂 l g j 0 5 型真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂 1 叭一2 型不锈钢数显电热鼓风干燥箱，上海浦东跃欣科学仪器厂 2 x z 一2 型旋片真空泵，浙江黄岩求精真空泵厂 b d 一1 4 5 型冷冻箱( 华美牌) ，杭州冷柜厂 q z 一5 型移动式高速离心喷雾干燥机，江苏无锡喷雾干燥机厂 1 2 2 方法 将脱胶丝按浴比l ：2 0 投入浓度为4 2 的沸腾c a c l ：溶液中，溶解 1 0 r a i n 后，冷却，分别装入3 5 k u ( 截留分子量，下同) 和1 0 k u 的透 析带中，在流水中透析3 d ，浓缩后各取部分溶液进行常温干燥( 4 0 。c ) 、 2 0 淅江大学硕士学位论文 真空冷冻干燥( 一5 0 ) 和喷雾干燥( 7 0 ) 。然后，根据需要分别用 球磨机和万能粉碎机磨碎成粉末，即制得丝素粉，并称重保存。 1 3 酸法制备丝索粉 1 3 1 材料 i 3 1 1 原料：脱胶丝 1 3 1 2 试剂：h c l ( 分析纯) ，中国巨化集团公司试剂厂 n a o h ( 分析纯) ，浙江萧山化学试剂厂 1 3 1 3 仪器： h h s2 卜6 型电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂 p h s 一2 5 型p h 计，上海雷磁仪器厂 s h z d ( i i i ) 型循环水式真空泵，河南巩义英峪予华仪器厂 t c 一1 5 型套式恒温器，浙江新华医疗器械厂 r e 一5 2 c 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂 h h sl 型电热恒温水浴锅，上海浦东跃欣科学仪器厂 1 3 2 方法 1 3 2 1 将脱胶丝分别置于9 8 水浴恒温加热的3 m o l l 、4 m o l lh c l 溶液中，然后分别降解3 0 h 、4 0 h ，用4 m o l l n a o h 中和。 1 3 2 2 将脱胶丝分别置于用1 1 0 。c 恒温加热3 m o l l 、4 m o l lh c l 溶液 中，降解8 h 后，用4 m o l l n a o h 中和。 1 3 2 3 将上述( 1 3 21 和1 3 2 2 ) 获得的溶液取部分分别置3 5 k u 和 1 0 k u 的透析带中透析，透析液浓缩后进行真空冷冻干燥；部分溶液置 于4 0 。c 干燥箱内烘干，将产物粉碎后称重。 1 4 碱法制备丝素粉 14 1 材料 浙江大学硕士学位论文 1 4 1 1 原料：脱胶丝 14 12 试剂：h c i ( 分析纯) ，中国巨化集团公司试剂厂 n a o h ( 分析纯) ，浙江萧山化学试剂厂 1 4 1 3 仪器：同酸法 1 4 2 方法 取一定量脱胶丝分别置于1 1 0 浓度为3m o l l 、4m o l l 的n a o h 恒温溶液中，降解6 h 后，用4m o l lh c l 中和。去除沉淀后取部分溶 液分别用3 5 k u 和1 0 k u 的透析带透析7 2 h ，将透析液浓缩后冷冻干燥， 剩余溶液置4 0 。c 干燥箱内烘至恒重，将干燥产物粉碎后称重。 1 s 酶法制备丝素粉 由于酸法和碱法在降解丝素的过程中，使色氨酸( t r y ) 、丝氨酸 ( s e r ) 、苏氨酸( t h r ) 残基等遭到部分破坏，生成的水解物色泽较差，并 伴有不愉快的气味。虽可采用活性炭进行脱色脱臭处理，但处理后， 丝素粉的最终产率会减少。利用酶催化蛋白质水解，对组成蛋白质的 氨基酸不会破坏，而且它具有专一性，不同的酶水解可获得不同的产 物，并容易控制丝素的水解程度。本试验选用了三种酶：a 一胰凝乳蛋 白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶。a 一胰凝乳蛋白酶可降解酪氨酸( t y r ) 、 苯丙氨酸( p h e ) 、色氨酸( t r y ) 、亮氨酸( l e u ) 、蛋氨酸( m e t ) 和丙 氨酸( a l a ) 参与形成的肽段，胰蛋白酶可作用于赖氨酸( l y s ) 和精 氨酸( a r g ) 参与形成的肽段，而木瓜蛋白酶可降解甘氨酸( g l y ) 、色 氨酸( t r y ) 、精氨酸( a r g ) 、组氨酸( h i s ) 、谷氨酸( g l u ) 和赖氨酸 ( l y s ) 参与形成的肽段，以上几种氨基酸在丝素蛋白的氨基酸组成中 全部含有，故用其降解丝素是可行的。酶的用量及处理时间参考王志 民”1 、杨兰等。 2 2 浙江大学硕士学位论文 l51 材料 15 1 1 原料：盐法制备丝素粉( 见1 2 ) 1 5 12 试剂：n a i l 2 p o 。2 h 2 0 ( 分析纯) ，浙江湖州化学试剂厂 n a ：h p o 。1 2 h ：o ( 分析纯) ，浙江湖州湖试化学试剂有限公司 a 一胰凝乳蛋白酶( 0 一c h y m o t r y p s i n ) ， 4 5 u m g ，w o r t h i n g l o n 公 司( 美国) 胰蛋白酶( t r y p s i n ) ， 2 5 0 0 u m g ，w o r t h i n g t o n 公司( 美国) 木瓜蛋白酶( p a p a i n ) ， 2 0 u m g ，w o r t h i n g t o n 公司( 美国) 1 5 1 3 仪器 2 5 6 9 型振动水浴锅， f o r m as c i e n t i f i c 公司( 美国) x w 一8 0 a 型旋涡混合器( v o r t e x ) ，上海医科大学仪器厂 1 5 2 方法 1 5 2 1取三份盐法制备的丝素粉加入锥形瓶中，各加入1 0 0 m l 磷酸 缓冲液( p h = 8 0 ) ，待丝素粉溶解后分别加入3 3 m g 、6 6 m g 、9 9 m g 胰 凝乳蛋白酶，4 5 c 处理6 h 后进行酶失活处理。 1 5 2 2 取2 5 m g 、5 m g 、5 m g 三份盐法制备的丝素粉加入锥形瓶中， 各加入5 0 m l 、1 0 0 m l 、1 0 0 m l 磷酸缓冲液( p h = 8 0 ) ，待丝素粉溶解后， 再各加入1 8 5 m g 、3 7 5 m g 、3 7 5 m g 胰蛋白酶，4 5 处理5 h 后进行酶 失活处理。 1 5 2 3 取盐法制备的丝素粉2 9 ，溶于1 0 0 m l 磷酸缓冲液( p h = 8 o ) ， 加入2 5 m g 木瓜蛋白酶，5 0 。c 处理6 h 后进行酶失活处理。 浙江大学硕士学位论文 2 丝索粉的性质测定 将各种方法制备的丝素粉分别进行产率的计算、进行水溶性、白 度等测定。用原子吸收分光光度计( a a s ) 测定丝素粉的重金属含量。 2 1 材料 21 1 原料：各种方法制备的丝素粉( 见1 1 1 5 ) 21 2 仪器： 1 7 0 2 型s a r t o r i u s 电子天平，德国g m b h 公司 x w 一8 0 a 型旋涡混合器，上海医科大学仪器厂 y qz 一4 8 型白度颜色测定仪，杭州光学仪器厂 g g x 一6 a 型原子吸收分光光度计，北京地质仪器厂 2 2 方法 22l 产率计算 根据不同条件下脱胶丝的用量和最终产量计算丝素粉的产率。 2 2 2 水溶性测定 将丝素粉干燥至恒重后用电子天平准确称量o 5 0 0 克三份，溶于 1 0 m l 蒸馏水中用旋涡混合器混合均匀，溶解1 0 h 后，置于4 5 水浴锅 中继续溶解5 h ，然后用漏斗过滤，1 0 5 烘4 h ，称重，计算溶解量。 2 2 3 白度测定 2 2 3 1 白度仪的测定原理1 ”l 白度是用来衡量物体表面可见光全波长辐射的反射率的。它广泛 应用在纺织、丝绸、造纸、化工等工业和日常生活中。纯白是理想的 完全反射物体，其反射率为1 。从纯白到纯黑之间线性地排列着各种深 塑垩盔堂塑堂焦堡塞一一一 浅不同的灰色，从而构成了色度学中的白黑系列，白黑系列图与物体 表面的光谱反射率是相对应的。由于现实生活中不存在纯白和纯黑物 体，所以通常将光谱反射率达8 0 ，9 0 以上的物体称为白色体，反射率 小于4 的称黑色体。物体的白度可由它与标准白色体的光谱反射率相 对比而得出。本试验所用白度仪是利用三刺激原理进行色值分析丽得 到白度值。该仪器的主要功能是进行色值( 包括色度、色差、色调等) 的测定，白度是其中的一个数值，它可测定物体的z 白度和i s o 白度。 z 白度是指立体空间内某一区域的颜色白度，而1 s o 白度是指特定区 域转化成个白度平面后而测出的白度值。本试验测定的是丝素粉末 的i s o 白度( 用r 45 ，表示) 2 2 3 2 白度测定 本试验测定丝素粉的i s o 白度( 用r 。，表示) 时，所用标准白板 的白度值( 1 s o 白度) 为1 0 6 2 ，即r 。，= 1 0 6 2 ，调零后测定样品，测 定5 次后取平均值。 2 2 4 原子吸收法( a a s ) 测定丝素粉的重金属含量 取试样1 0 9 一凯氏烧杯里一加2 0 m lh n o ，和5 m lh 2 s 0 4 后慢慢 加热一溶液呈暗黑色时，适当追加少量h n o ，一强热一h n 0 3 白烟 一有机物完全分解一冷却一加5 m l 饱和草酸铵一加热产生强烈 白烟一冷却后定容在2 5 m l 容量瓶一测定a s 和p b 的含量。 3 丝素粉的结构测定 3 1 材料 对各种方法制备的丝素粉的外部形态结构进行扫描电镜( s e m ) 观察，同时对丝素粉进行差示扫描量热法( d s c ) 分析、热失重( t g ) 弋 浙江大学硕士学位论文 分析和红外光谱( i r ) 分析。 3 1 1 原料：各种不同方法制备的丝素粉( 见1 1 1 5 ) 3 1 2 仪器： 17 0 2 型s a r t o r i u s 电子天平，德国g m b h 公司 k y k y1 0 0 0 b 型电子显微镜，中科院科学仪器厂 d e l t as e r i e s 7 系列t g a 一7 型热分析仪，美国p e r k i ne l m e r 公司 d s c8 2 2 型差示扫描量热分析仪，瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 n e x u s4 7 0 f t i r 型红外光谱仪，美国n i c o l e t 公司 3 2 方法 3 2 1 丝素粉外部形态的扫描电镜( s e m ) 观察 将丝素粉置于样品台上，采用双面胶固定，真空渡膜后电镜观察 丝素粉的外部形态结构。 3 2 2 丝素粉的热失重分析( t g ) 丝素粉样品用量为3 1 4 m g ，温度范围为3 0 7 3 0 ，升温速率为1 0 。c m i n ，高纯氮气气氛，流量为4 0 m l m i n ，环境温度为2 0 。c 。 3 2 3 丝素粉的差示扫描量热分析( d s c ) 丝素粉的用量为o 8 8 m g ，温度范围为1 6 0 6 0 0 。c ，部分丝素粉温 度范围为9 0 6 0 0 。c ，升温速率为1 0 。c m i n ，冷却气体为高纯氮气气氛， 流量为2 0 m l m i n ，环境温度为2 0 。 3 2 4 丝素粉的红外光谱分析( i r ) 将制备的丝素粉分别以溴化钾和丝素粉末的重量百分比为1 5 0 ：l 制成片剂，用红外分光光度计测定波长范围为4 0 0 0 4 0 0 c m 。的吸收光 谱。 浙江大学硕士学位论文 第三章结果与分析 摘要：本章分析了不同方法制备的丝素粉的一般性状如白度、水溶性 等，测定了丝素粉中有无砷、汞，对丝素粉的热化学特性和结构进行 了分析，为进一步开发利用提供依据。 关键词：丝素粉制备方法性质结构 丝素粉因制备方法等的影响，其性质及结构等都会发生一定的变 化，现将各种方法所制备的丝素粉，进行产率和白度等一般性状的比 较，为获得产率高、水溶性强、成本省、操作制备方法简易的丝素粉 的生产提供依据。同时对丝素粉的热化学特性和结构进行了分析，为 进步开发利用提供依据。 1 蚕茧的脱胶率 原料茧脱胶率的测定结果见表3 - 1 。 表3 1原料茧的脱胶率 t a b l e3 - 1 d e g u m m i n g r a t i oo fr a wc o c o o n 浙江大学硕士学位论文 从表3 1 中可以看出，对原料蚕茧进行5 次脱胶，其脱胶率非常接 近，平均脱胶率为2 86 7 ，脱胶丝的平均得率为7 1 3 3 。蚕茧中丝素 的含量约占7 0 8 0 ，从试验的脱胶率可知，本试验脱胶比较彻底，这 是进一步制备各种丝素粉的基础。 2 丝素的性质测定 2 1 丝素粉的产率 2 1 1 物理粉碎法 物理粉碎法丝素粉的产率见