（法医学专业论文）荧光标记8个ministr及amelogenin复合扩增体系的建立.pdf

荧光标记8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 荧光标记8 个m inis t r 及a m eio g e nin 复合 扩增体系的建立 专业：法医学 硕士研究生：冯冬亮 导师：刘超教授 摘要 目前，p c r - s t r 技术已经广泛应用于国内外法庭d n a 实验室，成为个人识 别和亲权鉴定最主要的技术手段。在实际工作中，受气候、环境、物理及化学等 多种因素影响，该技术对降解检材进行s t r 分型时经常出现优势扩增或者大片段 基因座漏扩。如何提高降解d n a 样本s t r 分型成功率成为国内外法医d n a 专家 关注的热点。m i n i s t r 技术通过重新设计引物，使引物更靠近重复序列，减少片 段长度，能提高降解检材s t r 分型的成功率。目前法医学上广泛使用的c o d i s 核 , l , s t r 基因座等位基因数较多，片段长度跨度较大，构建m i n i s t r 复合扩增体系 时只能同时扩增较少的基因座，一次扩增的系统效能较低。为此，寻找c o d i s 系统之外的适于建立m i n i s t r 体系的基因座，建立高效的m i n i s t r 复合扩增体系 十分必要。本研究筛选了11 个非c o d i s 系统的m i n i s t r 基因座进行单个基因座的 研究，从中选了多态性较好的8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 建立荧光标记的复合扩 增体系，显示出良好的应用前景。 本研究通过查找文献及网站，合成p c r 引物进行扩增，应用聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离p c r 产物，银染法显带，初步筛选了1 1 个m i n i s t r 基因座： d 2 0 s 1 0 8 2 、d 6 s 4 7 4 、d 1 2 姒6 3 、d 9 s 1 1 2 2 、d 2 s 1 7 7 6 、d 1 s 1 6 2 7 、d 3 s 4 5 2 9 、 d 2 s 4 4 1 、d 4 s 2 3 6 4 、d 4 s 2 4 0 8 、d 1 g a t a l l 3 。根据复合体系中各基因座的分布， 调整部分基因座的引物，合成1 1 个基因座的荧光标记引物并进行单个基因座扩 增，产物应用毛细管电泳检测，检验了广州汉族1 0 0 个无关个体的血样，获得 荧光标 i 5 8 个m i n i s t r , k a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 1 1 个基因座的群体遗传学数据。选择了其中多态性较高的8 个基因座d 2 0 s 1 0 8 2 、 d 6 s 4 7 4 、d 1 2 a t a 6 3 、d 9 s 11 2 2 、d 2 s 1 7 7 6 、d 1 s 1 6 2 7 、d 3 $ 4 5 2 9 、d 2 s 4 4 1 ， 加入性别鉴定的a m e l o g e n i n 基因座，经引物调整和组分优化后构建荧光复合扩 增体系。然后，应用分子克隆技术，对9 个基因座的5 8 个等位基因进行克隆， 调整各基因座等位基因的含量，制备该体系的等位基因分型标准物。最后，对该 体系的灵敏度、种属特异性、可重复性等进行评估，并对陈旧、腐败降解检材 d n a 的检验能力进行研究。 荧光标记单个基因座的研究结果显示，1 1 个m i n i s t r 基因座均能检出分型 明确的图谱。在1 0 0 名广州汉族无关个体中d 2 0 s 1 0 8 2 、d 6 s 4 7 4 、d 1 2 a t a 6 3 、 d 9 s l1 2 2 、d 2 s 1 7 7 6 、d l s l 6 2 7 、d 3 $ 4 5 2 9 、d 2 s 4 4 1 、d 4 s 2 3 6 4 、d 4 s 2 4 0 8 、 d 1 g a t a l1 3 基因座分别检出9 、6 、8 、8 、7 、6 、5 、9 、5 、5 、和4 个等 位基因。通过f i s h e r 精确检验，该1 1 个基因座的基因型数据均符合 h a r d y - w e i n b e r g 平衡检验( d - o 0 5 ) 。11 个m i n i s t r 基因座的杂合度在0 6 0 7 8 - o 813 7 之间，个人识别率在0 7 7 8 4 - - 0 9 2 4 1 之间，非父排除率在0 3 0 0 4 - 0 6 2 4 8 之间、多态性信息总量在0 5 3 2 9 0 7 7 0 2 之间。 本研究成功地建立了荧光标记8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 复合扩增体系， 对常见的各类检材均能检出很好的s t r 分型图谱。按公式计算，该体系8 个 m i n i s t r 基因座的累计个人识别率为0 9 9 9 9 9 9 9 3 ，累计非父排除率为0 9 9 2 2 8 7 。 该体系的检测灵敏度为0 0 5 n g 模板d n a ，具有种属特异性和组织同一性，对肯 定亲缘关系3 0 例父母子样本进行检测未发现违反孟德尔遗传规律的现象。对 5 0 份陈旧血样的比对检验显示，该体系对降解检材有良好的扩增效果，较常规 试剂盒的分型成功率高( p o 0 5 ) 。 本研究调查了1 1 个非c o d i s 系统m i n i s t r 基因座在广州汉族人群的多态 性分布，并建立了荧光标记8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 复合扩增体系。该荧光 复合体系可应用于a b i3 1 0 0 3 1 3 0 检测平台，操作简便，分型明确，重复性好， 对腐败降解检材d n a 分型的成功率较高，易于在法医d n a 实验室推广应用， 在法医物证中具有较好的实用价值，可有效补充现有商品化试剂盒。 关键词：法医物证学；m i n i s t r ；复合扩增；遗传多态性；降解d n a 荧光标- , z , 8 个m i n i s t r t a a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 d e v e l o p m e n to faf l u o r e s c e n c el a b e l e dm u l t i p l e x a m p l i f i c a t i o ns y s t e mf o r8m i n i s t r l o c ia n d a m e l o g e n i ng e n e m a j o r ：f o r e n s i cb i o l o g y n a m e ：d o n g l i a n gf e n g s u p e r v i s o r ：p r o f c h a ol i u a b s t r a c t c u r r e n t l y , p c r s t r ，a sa ni m p o r t a n tt e c h n i q u ei np e r s o n a li d e n t i f i c a t i o na n d p a t e r n i t yt e s t i n g ，h a sb e e nw i d e l yu s e di nn u l n e r o u sd o m e s t i ca n df o r e i g nf o r e n s i c d n a l a b o r a t o r y i np r a c t i c a lw o r k , t h ei m p a c t so fc l i m a t e ，e n v k o n m e n t , p h y s i c sa n d c h e m i s t r yr e s u l t e di np e a ki m b a l a n c ea n dl a r g ef r a g m e n ta l l e l ed r o p o u ti ns o m e d e g r a d e ds a m p l e s t h e r e f o r e ，an e wa p p r o a c hc a l l e d m i n i s t r w a sd e v e l o p e db y r e d e s i g n i n gp r i m e rp a i r sc l o s e rt ot h er e p e a tu n i t so f t h es t rl o c i 、i 廿ls m a l l e rs i z e d p c r p r o d u c t s an u m b e ro fs t u d i e sh a v ed e m o n s t r a t e dt h a tm i n i s t rt e c h n o l o g yc a l l i m p r o v et h es t rt y p i n gs u c c e s sr a t eo fd e g r a d e ds a m p l e s h o w e v e r , d u et ot h e l i m i t e dl e n g t ho ft h es m a l la m p l i c o n s ，t h e r ec o u l db ef e w e rs t rl o c iw i t h i nt h es a m e s y s t e m ，e s p e c i a l l yf o rt h ec o d i s c a ) r el o c i t h u s ，w ef o c u s e do n11n o n - c o d i s m i n i s t ra n dd e v e l o p e das y s t e mo f8n o n c o d i sm i n i s t rl o c ia n da m e l o g e n i n n o n - c o d i sr n i n i s t rl o c iw e r es e a r c h e dt h r o u g ht h el i t e r a t u r ea n dw e b a f t e r i n i t i a lt e s t i n gb yp a g ea n ds i l v e rs t a i n i n gs y s t e m ，w ef o c u s e do n11r n i n i s t rl o c i ( d 2 0 s 1 0 8 2 ，d 6 s 4 7 4 ，d 1 2 a t a 6 3 ，d 9 s 1 1 2 2 ，d 2 s 1 7 7 6 ，d 1 s 1 6 2 7 ，d 3 s 4 5 2 9 ，d 2 s 4 4 1 ， d 4 s 2 3 6 4 、d 4 s 2 4 0 8 、d 1 g a t a l1 3 ) f o rf b r h e rc h a r a c t e r i z a t i o n f l u o r e s c e n t l yl a b e l e d p c r p r i m e r sw e r es y n t h e t i z e df o rs i n g l e l o c u sa m p l i f i c a t i o na n dt h ep r o d u c t sw e r e g e n o t y p e db y313 0 x lg e n e t i ca n a l y z e r a l l e l ef r e q u e n c i e sa n df o r e n s i cp a r a m e t e r sf o r t h e s el o c iw e r ei n v e s t i g a t e di nas a m p l eg r o u po f10 0u n r e l a t e dh a nc a n t a o n e s e t h e n , w es e l e c t e da m e l o g e n i na n d8l o c i ( d 2 0 s10 8 2 、d 6 s 4 7 4 、d12 a t a 6 3 、d 9 sl12 2 、 d 2 s17 7 6 、d1s16 2 7 、d 3s 4 5 2 9 、d 2 s 4 41 ) t oe s t a b l i s ht h ef l u o r e s c e n tm u l t i p l e xs y s t e m i i i 荧光标 , 5 8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 s o m ep r i m e r sa n dr e a g e n t sw e r eo p t i m i z e d m o l e c u l a rc l o n i n gt e c h n i q u ew a s e m p l o y e dt oc o n s t r u c ts t a n d a r da l l e l i cl a d d e r t od e m o n s t r a t et h ea p p l i c a b i l i t yo ft h e s y s t e mt of o r e n s i cc a s e w o r k ，ar a n g e o fv a l i d a t i o ns t u d i e sw e r ep e r f o r m e d t h es t u d yd e m o n s t r a t e dt h a ts a t i s f i e dp r o f i l e sw e r eo b t a i n e du s i n gs i n g l e l o c u s a m p l i f i c a t i o nw i t hc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s a m o n gt h e10 0s a m p l e s ，t h ea l l d e n u m b e rf o rd 2 0 s 1 0 8 2 ，d 6 s 4 7 4 ，d 1 2 a t a 6 3 ，d 9 s 1 1 2 2 ，d 2 s 1 7 7 6 ，d 1 s 1 6 2 7 ，d 3 s 4 5 2 9 ， d 2 s 4 4 1 、d 4 s 2 3 6 4 、3 4 s 2 4 0 8 、d 1 g a t a l l 31 0 c iw e r e9 、6 、8 、8 、7 、6 、5 、9 、5 、5 、 a n d4r e s p e c t i v e l y a l ll o c iw e r eo b s e r v e dt ob ei nh a r d y - w e i n b e r ge q u i l i b r i u mu s i n g t h ee x a c tt e s t a n dt h eh e t e r o z y g o s i t y , d i s c r i m i n a t i o np o w e r , p o w e ro fe x c l u s i o n , p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n tw e r eo 6 0 7 8 - 0 8 1 3 7 ，o 7 7 8 4 - 0 9 2 4 1 ，o 3 0 0 4 - 0 6 2 4 8a n do 5 3 2 9 - 0 7 7 0 2 ，r e s p e c t i v e l y w eh a v es u c c e s s f u l l yd e v e l o p e da n8m i n i s t ra n da m e l o g e n i nf l u o r e s c e n t m u l t i p l e xs y s t e m t h et o t a ld i s c r i m i n a t i o np o w e ra n dc o m b i n e dp o w e ro fe x c l u s i o n f o rt h e8i n c l u d e dl o c ir e a c h e dt o0 9 9 9 9 9 9 9 3a n d0 9 9 2 2 8 7r e s p e c t i v e l y t h es t u d y d e m o n s t r a t e dt h a tt h es y s t e mh a dg o o ds p e c i f i c i t ya n dt h es e n s i t i v i t yw a s5 0 p gd n a t e m p l a t e a l lt h em i n i s t rl o c iw e r ei nl i n ew i t ht h em e n d e l sl a wo fi n h e r i t a n c e t h i s s y s t e mc o u l db eu s e df o rt h ea n a l y s i so fa l lc o m m o ns a m p l e sw i t hf u l lp r o f i l e s c o m p a r e dt oc o m m e r c i a ls t rk i t s ，t h i sa p p r o a c hr e s u l t e di nc o n s i d e r a b l yh i g h e r s u c c e s sr a t e sf o rt y p i n gh i g h l yd e g r a d e ds a m p l e s t h i sr e s e a r c hh a si n v e s t i g a t e dt h eg e n e t i cp o l y m o r p h i s m so f11n o n - c o d i s m i n i s t rl o c ii nc a n t o n e s eh a n p o p u l a t i o n , a n dh a se s t a b l i s h e das y s t e mf o r8 m i n i s t ra n da m e l o g e n i n t h en e w m u l t i p l e xs y s t e mw a sd e v i s e db a s e do n m u l t i c o l o rd y et e c h n o l o g ya n ds u c c e s s f u l l yu s e di nt h ea b i310 0 313 0d e t e c t i o n p l a t f o r m t h es y s t e mw a s a ne a s i l y - r e g u l a t e d ，l o wc o s tm u l t i p l e xs y s t e mw i t hh i g h s e n s i t i v i t y , a c c u a r c y , t i s s u l a ri d e n t i y , s p e c i e ss p e c i f i c i t ya n de f f e c t i v et os t rt y p i n g f o rd e g r a d e dd n as a m p l e ，w h i c hw a so fh i g hv a l u ei nf o r e n s i ca p p l i c a t i o na n dc o u l d s e r v ea sa ne f f e c t i v es u p p l e m e n t a r yo fc o m m e r c i a ls t rk i t s k e y w o r d s ：f o r e n s i cb i o l o g i c a le v i d e n c e ；m i n i s t r ：m u l t i p l e xp c r ；g e n e t i c p o l y m o r p h i s m ；d e g r a d e dd n a i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：厦i 泉看1 日期：砗年n r o 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：舀糸瓦 日期：雄年z 月，矿日 导师签名：勉战 日期：彩年占月p 日 荧光标记8 个m i n i s t r ) 爰a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 第1 章引言 1 1 人类基因组d n a 的多态性及其在法医学的应用 在人类进化过程中，基因组d n a 发生突变、缺失、插入或置换。当这些基 因改变以等位基因形式在群体中得以保留，并能够从亲代传给子代，可形成个体 间的遗传差异。在基因组d n a 中，这种由不同碱基结构的等位基因所形成的多 态性称为d n a 多态性( d n ap o l y m o r p b i s m ) 。 基因组d n a 碱基序列差异是不同个体间最本质的遗传差异，在特定的基因 座上等位基因之间碱基序列差异构成的d n a 多态性称为序列多态性( s e q u e n c e p o l y m o r p h i s m ) 。法医学应用序列多态性分析作个人识别的典型实例是线粒体序 列分析【l 】。 同一个基因座中各等位基因之间d n a 片段长度差异构成的多态性称为长度 多态性( 1 e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 。1 9 8 5 年，英国遗传学家j e f f r e y s 等应用限制性片 段长度多态性( r f l p ) 分析技术检测多基因座的r f l p 图谱，对人基因组进行 “d n a 指纹( d n af i n g e r p r i n t ) 分析。随着p c r 技术的普及应用，扩增片段长 度多态性分析( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，a m p f l p ) 广泛应用于法 医学研究。a m p f l p 技术最初应用于可变数目串联重复序列( v a r i a b l en u m b e r so f t a n d e mr e p e a t s ，q t r ) 的多态性分析【2 ，3 】；从2 0 世纪9 0 年代中期后，广泛应用于 微卫星短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) 的多态性分析【4 ，5 1 ，即p c r s t r 分型技术。 1 2 s t r 基因座在法医学应用的优势 s t r 基因座广泛存在于人类基因组中，大多数位于非编码区，蕴藏丰富的遗 传多态性信息量，具有高度多态性，是一种理想的区分个体d n a 遗传标记。s t r 基因座可用于人类遗传学中群体的迁移和群体间的遗传关系等研究，还被广泛用 于疾病基因定位和物种多态性研究、组织移植评价等诸多领域【6 】。 目前，s t r 基因座是法医物证中应用最广泛的遗传标记【7 】。随着p c r 技术 荧光标- , 5 8 个m i n i s t r 殁a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 及毛细管电泳技术的普及，p c r - s t r 己成为亲权鉴定和个人识别的主要检测方 法。s t r 基因座在法医应用中具有以下优势：在人类基因组中分布广泛，基因 座的多态性好；检测简便，通过p c r s t r 技术易于被检测，检材适应性强； 检测的灵敏度较高，可适用于降解、陈旧和腐败检材的分型；分型方法简便， 判型准确，可实现d n a 分型的标准化和自动化；s t r 遗传标记结构简单，片 段较短，可进行复合检测；s t r 分型结果简单，可转化为简单的数字形式，易 于统一并建立标准；各地己建立起以s t r 基因座为核心的d n a 数据库，用于 案件及亲缘关系比对，是公安局侦破案件必不可少的技术手段【8 d 0 1 。 1 3s t r 分型技术在法医学中的应用 1 3 1 常染色体s t r 基因座 目前，常染色体s t r 基因座是在法医物证中应用最广泛的一类基因座。这 些s t r 基因座分布在人类2 2 对常染色体上，符合孟德尔遗传定律，多态性较高。 在日常检案及亲权鉴定中，通过1 5 个常染色体s t r 基因座的检测分型，一般可 以满足法庭科学个人识别及亲权鉴定的需要【1 1 1 。 1 3 2 性染色体s t r 基因座 y - s t r 位于y 染色体非重组区，在减数分裂时不会与x 染色体的相应区段 进行交换、重组，具有高度保守性和特异性，呈典型男性伴性遗传。y - s t r 不仅 在父权鉴定、男女混合斑检验和不同男性个体混合斑分析中具有独特作用，还可 以用于群体遗传学研究。冯冬亮等研究了广西4 个少数民族1 7 个y - s t r 基因 座的多态性分析，显示该1 7 个y - s t r 基因座在广西4 个少数民族人群中均具有 较高的多态性，在法医学、群体遗传学等方面有重要的应用价值。 x s t r 基因座遗传不同于常染色体s t r 和y - s t r 。男性个体为x r y ，其x - s t r 来自母亲；女性个体为) o ( ，其x s t r 一半来自父亲一半来自母亲。x s t r 分 型在某些特殊的亲缘关系鉴定中具有重要作用【1 3 1 4 1 。 性染色体s t r 基因座属于伴性遗传，其遗传特征不同于常染色s t r ，因此， 其法医学统计方式与常染色体不同。由于部分s t r 基因座相互连锁，不符合孟 德尔遗传规律，仅能以等位基因单倍型表达遗传差异性，排除率较低。在个人识 别和亲权鉴定中，性染色体s t r 往往作为常染色体s t r 基因座的一种补充手段。 2 荧光标 i z , 8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 1 4s t r 技术存在的不足 在日常d n a 检验中经常碰到不同降解程度的生物检材。现场检材受环境的 温度、湿度、光、化学及生物因素，尤其是酸、碱、高温、潮湿、暴晒、微生物 等因素的影响，使完整的d n a 链断裂，降解成不同长度的d n a 片段，影响s t r 分型结果 1 5 】。这种现象在陈旧的骨骼、牙齿以及腐败的肌肉组织中很常见，由 于d n a 模板降解为小片段，且存在p c r 抑制剂，检测时大片段s t r 基因座的 等位基因经常缺失。 因此，国内外学者着手应用新的技术手段作为常规s t r 技术的补充。其中， m i n i s t r 技术和s n p 技术成为两种候选的技术【1 6 1 。研究证明，这两种技术都能 在不同程度解决这一难题。由于s n p 技术操作步骤繁琐，分型命名较斛1 7 1 ，且 难以准确分析混合检材的分型，在应用及推广上不如m i n i s t r 技术。m i n i s t r 技术，作为s t r 的改良技术，在降解检材的d n a 分型中更具潜力。 1 5m i n i s t r 技术的概述 目前，常规s t r 技术还存在一些不足，例如对降解d n a 样本进行检测时往 往出现“优势扩增”或者“无效扩增。虽然可利用线粒体d n a 高变区( m t d n a - h v ) 测序技术对腐败降解的检材进行分析，但线粒体d n a 的检测费时费力成本高， 另外线粒体d n a 是单倍体母系遗传，个人识别率较低且存在异质性，难以满足 实际需要【1 8 1 9 】。如何从严重降解的检材特别是骨组织、指甲等白骨化检材中提 取纯化d n a 模板，并进行d n a 分型，一直是困扰国内外法医遗传工作者的棘 手问题。为此，很多学者开始关注m i n i s t r 技术 2 0 , 2 1 】。m i n i s t r 技术设计的引 物更靠近核心重复序列，缩短了扩增片段的长度，而重复单位数目不变，其分型 结果与s t r 分型结果相同。由于对模板的要求降低，其灵敏度更高，对腐败降 解检材的检出率更高。为弥补现有s t r 技术的不足提供了很好的思路。 1 6m i n i s t r 技术的发展历程 1 9 9 4 年，英国法庭科学服务机构( f o r e n s i cs c i e n c es e r v i c e ) 在处理田纳西州韦 科镇( w a c o ，t e x a s ) 火灾中的遇难者遗骸d n a 时发现选用更小片段的s t r 基因座 3 荧光标记8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 具有更高的扩增效率2 2 1 。1 9 9 7 年，飞行时间质谱技术( t i m e - o f - f l i g h tm 弱s s p e c t r o m e t r y , t o f m s ) 2 3 】为较小的p c r 产物的s t r 分型提供了技术支持。1 9 9 8 年，h e r m a n n 2 0 】重新设计了基因座f e s ，t h 0 1 和t p o x 的荧光标记引物，对腐败 毛发进行了成功分型。2 0 0 0 年，m c c o r d 等【2 4 】应用荧光标记的引物扩增，并在 a b 公司的遗传分析仪上进行m i n i s t r 短小片段的基因分型。 2 0 0 2 年b u t l e r 等为1 3 个c o d i s 系统s t r 及p e n t a d 、p e n t a e 共1 5 个基因 座重新设计m i n i s t r 引物，建立了5 个复合扩增体系，每个体系有3 个m i n i s t r 基因座，分别用3 种荧光标记。其中2 个体系组合为“b i g m i n i 2 5 1 ( 包括t h 0 1 、 c s f l p o 、t p o x 、f g a 、d 2 1 s l l 和d 7 s 8 2 0 ) ，被纽约州法医总局正式使用， 对“9 1 1 ”事件的样本进行d n a 分型，推动了遇难者个人识别工作的进行，并 证明在2 5 u l 体系时用l u 的t a q g o l d 酶及2 8 个循环，灵敏度为0 5 n g 。d r a b e k 等【2 6 】对m i n i s t r 复合扩增体系与商品化s t r 试剂盒之间的同一性进行了研究； c h u n g 等【2 5 1 则研究了m i n i s t r 对降解d n a 模板的扩增效率。此后， b o d e t e c h n o l o g yg r o u p 建立了2 个体系：b o d e p l e x1 ( d 1 3 s 3 1 7 ，d 2 1 s l l ，d 7 s 8 2 0 ， d 1 6 s 5 3 9 和c s f l p o ) 和b o d e p l e x 2 ( t p o x ，f g a ，d 7 s 8 2 0 和d 1 8 s 5 1 ) ，这两个复 合扩增体系在世贸中心大厦遇难者的骨及组织的个人识别中发挥了非常重要的 作用。 由于c o d i s 系统的s t r 基因座等位基因较多，片段长度的相差较大，单次 扩增通常只能检测3 4 个基因座。为进一步提高m i n i s t r 复合扩增体系的单次 扩增信息量，国内学者刘超【2 刀等重新设计了d 5 s 8 1 8 、d 8 s 1 1 7 9 、d 1 6 s 5 3 9 、 d 1 3 s 3 1 7 、d 2 1 s 1 1 、v w a 基因座的m i n i s t r 引物，其中体系1 ( d 5 s 8 1 8 、d 8 s 1 1 7 9 和d 1 6 s 5 3 9 ) 仅对正向引物的5 端进行荧光标记；体系2 ( v w a 、d 2 1 s l l 和 d 1 3 s 3 1 7 ) ，采用荧光素和生物素分别标记正向和反向引物的5 端。将2 个 m i n i s t r 扩增体系在同一试管扩增，然后应用链霉亲和素磁珠对两个复合扩增体 系的p c r 产物分离后分别电泳，效果良好，分型准确，与商品化试剂盒得到的 基因分型完全一致。该技术一方面使扩增产物的长度明显缩短，均小于2 0 0 b p 另一方面应用了链霉亲和素磁珠技术对重叠的扩增产物进行有效分离，既降低了 成本，也减少了p c r 污染。 为了进一步提高m i n i s t r 的应用范围和使用价值，越来越多学者研究非 荧光标- , l 8 个m i n i s t r ， , a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 c o d i s 系统的m i n i s t r 基因座。2 0 0 5 年，c o b l e 等 2 9 】筛选了6 个c o d i s 以外的 基因座，建立了2 个体系n c 0 1m i n i p l e x ( d 1 0 s 1 2 4 8 ，d 1 4 s 1 4 3 4 ，d 2 2 s 1 0 4 5 ) 和 n c 0 2 m i n i p l e x ( d 4 s 2 3 6 4 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ) ，对4 7 4 名美国人进行多态性研 究，对陈旧腐败检材进行了应用研究，结果显示分型可靠，灵敏度高，可对降解 检材进行成功分型。随后a s a m u r a 、y o n g 、m a r t i n 、r o c c h i 和c h u n g 等1 3 0 3 6 】分别 研究了这6 个m i n s t r 基因座在日本、新加坡、西班牙、意大利、和韩国人群中 等位基因的分布，结果显示这6 个m i n i s t r 基因座在不同群体多态性均较好。 2 0 0 6 年，这6 个m i r t i s t r 基因座被e d n a p ( e u r o p e a nd n ap r o f i l i n gg r o u p ) 纳 入标准基因座的备选范卧3 7 ，3 8 1 。同年，h i l l 在a a f s ( a m e r i c a na c a d e m yo ff o r e n s i c s c i e n c e s ) 上介绍了2 7 个新的非c o d i s 系统m i n i s t r 基因座，建立了9 个复合扩 增体系，每个体系包含3 个m i n i s t r 基因座【3 9 1 。2 0 0 6 年a b 公司推出了商品化 的m i n i s t r 试剂盒m i n i f i l 一】。m i n i f i l e r 包括了8 个c o d i s 基因座( d 1 3 s 3 1 7 、 d 7 s 8 2 0 、d 2 s 1 3 3 8 、d 2 1 s 1 l 、d 1 6 s 5 3 9 、d 1 8 s 5 1 、c s f i p o 、f g a ) 及性别位点 a m e l o g e n i n ，片段长度范围为7 4 一- 2 4 5 b p 。国内外专家 4 0 , 4 1 1 对此系统进行了评 估性研究，表明该试剂盒提高了微量及降解检材的检出成功率，其检验成功率高 于i d e n t i f i l e r 试剂盒，对于2 5p gd n a 模板经m i n i f i l e r 试剂盒扩增后，能够进 行准确d n a 分型，已经应用于法医实践。 1 7 立题依据及研究思路 目前，法医d n a 检验中常用的m e t l t i f i l e r 、s i n o f i l e r 和p o w e r p l e x1 6 等商品 化试剂盒所检测的片段长度通常在1 0 0 b p - - 5 0 0 b p 之间。对血痕、唾液斑、精斑 等常规检材进行检验时往往能得到准确清晰的图谱。但对于某些疑难检材，例如： 陈旧烟头、鞋帽的脱落细胞、无名尸的腐败组织、长埋多年的长骨等检材往往由 于环境及生物因素，d n a 链发生断裂，导致扩增失败，或者r f u 峰值过低。因 此，如何解决各种疑难微量降解检材的s t r 分型成为国内外法医专家研究的重 点和热门。 m i n i s t r 技术，把引物设计在更靠近核心重复序列的两侧翼，缩小扩增片段 长度，为解决这一难题提供了很好的思路。而且m i n i s t r 技术是基于现有实验 室条件，方法与程序都与s t r 相似，具有较好的衔接，推广较易。 5 荧光标记8 个m i n i s t r g t h m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 由于m i n i s t r 扩增产物的片段短，各基因座等位基因相互重叠的机率比较 多，因此复合扩增时，每种荧光标记的基因座有限，一次扩增的效能不高，想达 到商品化s t r 试剂盒同样的个人识别能力，必须进行多基因座分析，增加复合 扩增的次数，这并不适合于d n a 量较少的检材【4 2 1 。 对于父母子三联的亲权鉴定，现有商品化试剂盒的s t r 基因座往往足够， 不需要另外增加其他基因座。随着亲缘关系鉴定范围的扩展以及某些基因座突变 的出现，仅利用现有商品试剂盒的s t r 基因座是不够的，须寻找更多非c o d i s 系统的s t r 基因座作为补充。 虽然y - s t r 和x - s t r 在某些亲权鉴定中有独特作用，国外也有y 二1 1 1 i 1 1 i s t r 【4 3 ， 删和x 1 1 1 i i l i s t r 【4 5 】的研究报道，但其基因座相互连锁，以单倍型表达遗传差异 性，认定能力较低，应用价值不如常染色体s t r 。因此，本课题主要研究常染色 体的非c o d i s 系统m i n i s t r 基因座。 综上所述，本研究首先合成p c r 引物进行扩增，采用非变性p a g e 及银染 显色检测，对非c o d i s 系统m i n i s t r 基因座进行初步筛选。其中11 个m i n i s t r 基因座合成荧光标记的引物进行p c r 扩增，通过31 3 0 x l 遗传分析仪进行毛细管 电泳检测，调查各非c o d i s 系统m i n i s t r 基因座的等位基因分布及计算各法医 学参数。然后选择其中多态性较好、扩增条件相近的8 个非c o d i s 系统m i n i s t r 基因座，并加入了判断性别的a m e l o g e n i n 基因座，建立了扩增片段均小于2 0 0 b p 的荧光标记8 个m i n i s t r 及a m e l o g e n i n 复合扩增体系，每种荧光标记3 个基因 座。应用分子克隆法制备了该体系的等位基因分型标准物，并对该体系在法医物 证学中应用的可行性进行了评估。 6 荧光标记8 个m i n i s t r t l a m e l o g e n i n 复合扩增体系的建立 2 1 材料 2 1 1 主要实验仪器 p c r 扩增仪： 定量p c r 仪： 高速台式离心机： 电泳仪： 超纯水仪： 遗传分析仪： 热孵化仪： 电子天平： 物证检材仪： 核酸提取工作站： 2 1 2 主要实验试剂 第2 章材料和方法 9 7 0 0 型( a p p l i e db i o s y s t e m ，美国) a b ip r i s m 7 5 0 0 ( a p p l i e db i o s y s t e m ，美国) z k l 5 、z k 3 0 ( s i g m a ，美国) b i o r a d 公司( 美国) m i l l i p o r e ( 法国) 313 0 x l ( a p p l i e db i o s y s t e m ，美国) e p p e n d o r ft h e r m o m i x e rc o m f o r t ( e p p e n d o r f , 德国) a a - 16 0 ( d e n v e r ) b s d 6 0 0 d u c t ( b s dr o b o t i c s ，澳大利亚) f r e e d o me v o1 5 0 8 ( t e c a n ，瑞士) d n a t q 系统： 10 p c rb u f f e r ： d n t p s ： g o l dd n a t a q 聚合酶： 2 5 p mm g c l 2 ： t r i sb a s e ： c h e l e x 1 0 0 ： e d t a t e m e d ： a p s ： 10 b pd n al