（水生生物学专业论文）神经肽y与脑肠肽对斜带石斑鱼生长与摄食量的影响.pdf

中文摘要 n e u r o p e p t i d ey ( n p y ) 是由3 6 个氨基酸组成的单链活性多肽，在生物体内 参与多种生理活动，包括对摄食行为的调节，促进下丘脑的促性腺激素释放激素 的分泌，以及促进垂体细胞生长激素的释放等等。 g h r e l i n 是目前已知的唯一的一种具有食欲促进作用的消化道分泌激素，并 广泛参与生物体内多种生理功能，包括促进摄食行为，促进g r o w t hh o r m o n e ( g h ) 的释放。此外g h r e l i n 还参与体内能流代谢，降低耗氧量，促进能流正平衡；调 节糖脂代谢，增加食物中脂肪摄取和体内脂肪的合成；水的摄入调节，以及机体 免疫等方面的功能。 本实验在开始时，已获得根据斜带石斑鱼自身序列合成的n p y 和g h r e l i n 的 活性肽。在此基础上，本文通过腹腔注射以及投喂的方法探讨这两种活性肽对于 石斑鱼生长以及摄食行为的影响。在腹腔注射实验中，给斜带石斑鱼分别注射生 理盐水、溶于生理盐水的n p y ( 2 0 0 n g g 体重) 以及溶于生理盐水的g h r e l i n ( 2 0 0 n g g 体重) 。在注射后的1 5 小时，3 小时以及6 小时分别采集下丘脑、垂 体以及肝脏等组织，并通过r e a l t i m ep c r 检测n p y 、g h 、g r o w t h h o r m o n e r e l e a s i n gh o r m o n e ( g h r h ) 以及i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r - i ( i g f 一1 ) 的表达 量。结果表明，腹腔注射n p y 以及g h r e l i n 均可促进斜带石斑鱼下丘脑n p y 以 及垂体g h 的表达。垂体g h 表达量分别在实验鱼注射n p y l 5 h 和注射g h r e l i n3 h 后显著升高，其中g h r e l i n 促进g h 表达量增加的效果更为显著，可能与g h r h 的参与有关。 随后，通过后喷涂方法将两种活性肽添加到饲料中，开展为期8 周的养殖实 验。每组饲料设置了5 个平行组，对斜带石斑鱼采取一天两次饱食投喂。结果表 明，n p y 与g h r e l i n 组摄食量以及增重率比对照组有提高，但均未达到显著性。 全鱼等营养组成方面没有显著性差异，肝体比、肠脂比等均没有出现显著差异。 这可能与n p y 和g h r e l i n 的添加的剂量有关，实验用鱼初次重量均高于前人实验 i i 的终重，可能需要更高剂量的n p y 和g h r e l i n ，或者需要更长的投喂时间。通过 r e a l q i m e p c r 对下丘脑的n p y 、g h r h 、o r e x i n 和垂体的g h 检测，结果表明 n p y 组的n p y 以及g h r h 的表达量有显著提高，证明了n p y 可以通过摄食被 肠道吸收，并参与石斑鱼生理功能的调节。 关键词：斜带石斑鱼、n p y 、g h r e l i n 、定量p c r 、摄食 i i i a b s t r a c t n e u r o p e p t i d ey i sa3 6a m i n oa c i dp e p t i d eo r i g i n a l l yd i s c o v e r e di nt h ep o r c i n e b r a i n ，w h i c hb e l o n g st ot h en p yf a m i l yi n c l u d i n gt h ep e p t i d ey y ( p y y ) ，t e t r a p o d p a n c r e a t i cp o l y p e p t i d e ( p p ) a n dt h ef i s hp a n c r e a t i cp o l y p e p t i d eyn p y h a sm a n y f u n c t i o n sa s s t i m u l a t i n g f o o dc o n s u m p t i o n ，a f f e c t i n gb l o o dp r e s s u r e ，i n d u c i n g a n x i o l y s i s ，e n h a n c i n gm e m o r yr e t e n t i o n ，a n da f f e c t i n gc i r c a d i a nr h y t h m n p yi so n e o ft h em o s tp o t e n to r e x i g e n i cf a c t o r sk n o w nt od a t e n p yp e p t i d ei sr e l a t i v e l yw e l l c o n s e r v e da m o n gv e r t e b r a t e s ，i n c l u d i n gf i s hs u g g e s t i n gs i m i l a rp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s f o rn p y n p yh a sb e e ni d e n t i f i e di nan u m b e ro ff i s hs p e c i e s ，i n c l u d i n go r a n g e s p o t t e dg r o u p e re ta 1 a n ds e v e r a ls t u d i e sh a v ed e m o n s t r a t e dt h a tn p y i si n v o l v e di n t h er e g u l a t i o no ff o o di n t a k ea n dg r o w t hi nt e l e o s t s i nm o s tm a m m a l s ，g h r e l i ni sa2 8a m i n oa c i dp e p t i d ef i r s td e t e c t e di nt h e s t o m a c ho fr a t s i th a sau n i q u ea c y lm o d i f i c a t i o ni nt h et h i r dr e s i d u e ，s e r i n eo ft h e m a t u r ep e p t i d e t h en - o c t a n o y l ( o = - c o - c h 2 6 - c h 3 ) i st h em o s tc o m m o n l yf o u n d a c y l m o d i f i c a t i o nw h i c hi se s s e n t i a lf o rm o s to f t h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e so ft h ep e p t i d e i nm a m m a l s ，g h r e l i ni sp a r t i c i p a t e di nv a r i o u sp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，o t h e rt h a ng h r e l e a s e ，i n c l u d i n gt h er e g u l a t i o no ff e e d i n g ，e n e r g ym e t a b o l i s m ，c a r d i o v a s c u l a r p e r f o r m a n c e ，a n di m m u n er e s p o n s e s i nt h ee a r l ys t u d y , w eh a dg o tt h ep r o t e i no fn p ya n dg h r e l i nw h i c hs y n t h e s i z e d a c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c e so fn p y a n dg h r e l i no ft h eo r a n g e s p o t t e dg r o u p e r t h e nw ea d m i n i s t r a t e dn p ya n dg h r e l i nb yu s i n gi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o nt o e x a m i n e dt h ew a yt h e yf u n c t i o n e d ，w h i c hd e t e r m i n e db ya n a l y s i s i n gt h ee x p r e s s i o n f e a t u r e so fn p y , g h ，g h r ha n di g f - 1i nt h eh y p o t h a l a m u s ，p i t u i t a r ya n dl i v e r t h r o u g hr e a l t i m ep c rm e t h o d w es a m p l e dh y p o t h a l a m u s ，p i t u i t a r ya n dl i v e r t i s s u e sa t1 5 h ，3 ha n d6 ha f t e ri p i n j e c t i o nr e s p e c t i v e l y l a t e r , w ee x a m i n e dc h a n g e s o ft h ee x p r e s s i o nl e v e l so fn p y , g h r h ，g ha n di g f l sm r n a a c c o r d i n gt ot h e r e s u l t s ，i p i n j e c t i o no ft h ep r o t e i no fn p ya n dg h r e l i nc a l lb o t hs t i m u l a t e dt h e e x p r e s s i o no fm r n ao fn p ya n dg hi nh y p o t h a l a m u sa n dp i t u i t a r y n p yc a n t v s t i m u l a t et h ee x p r e s s i o no fg h sm r n ai nas h o tt i m e h o w e v e r , g h r e l i nc a l l s t i m u l a t et h ee x p r e s s i o no fg h sm r n ai nam o r ee f f e c t i v ew a y a f t e rt h ee x p e r i m e n t1 ，w eu s e dt h ed i e t sw h i c hs p r a y e db yn p ya n dg h r e l i nt o f e e dg r o u p e r f i v ep a r a l l e l ss e tf o re a c hd i e t 5 6d a y sl a t e r , w ew e i g h e da l lt h e g r o u p e r sa n ds a m p l e dh y p o t h a l a m u sa n dp i t u i t a r yt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fn p y , g ha n dg h r h w ef o u n dt h ew ga n df io fn p ya n dg h r e l i ng r o u pa r eh i g h e rt h a n t h ec o n t r o lg r o u p s h o w e v e r ，t h ed i f f e r e n c ed i d n tr e a c hs i g n i f i c a n tl e v e l ，w h i c hm a y d u et oh e a v yi n i t i a lb o d yw e i g h ta n dl o wd o s eo ft h ep r o t e i n s b e s i d e s ，e x p r e s s i o no f n p ya n dg h r hg e n eo fn p y g r o u pi ss i g n i f i c a n th i g h e rt h a no t h e r s ，w h i c hp r o v e d s m a l lp e p t i d e sc a i lb ea b s o r b e db yt h ei n t e s t i n a lo fg r o u p e r st h o r o u g h l yw i t h o u t b r o k i n gd o w nt h es t r u c t u r eo ft h ep r o t e i n t h ea d e q u a t ed o s eo fp r o t e i na n df e e d i n g t i m en e e dt ob ei n v e s t i g a t e di nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：g r o u p e r , n p y , g h r e l i n ，r e a l t i m ep c r ，f o o di n t a k e v 论文原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成 果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人 承担。 一i ，1 ， 学位论文作者签名：笔锪诊 日期：劢年5 月西日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或者其指定机 构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被 查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可 以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：疆导师签名：戮f 鞭 日期缈年扩月够日 日期：么啤f 月吐日 1 n p y 研究进展 1 上j l 刖雷 n p y 是1 9 8 2 年由t a t e m o t o 等人由猪脑中首次发现提纯的3 6 个氨基酸组成 的单链活性多肽，n p y 与y 肽( p y y ) 以及胰多肽( p p ) 在结构上相似，同属 于胰多肽家族。n p y 广泛分布在脊椎动物的中枢神经系统与外周组织中。前期 研究发现，中枢神经系统中，n p y 通过与多个g 蛋白偶联家族受体结合，调节 机体能量以及营养代谢过程，促进摄食和生长，同时参与心血管系统，免疫系统 以及性腺轴的功能。在硬骨鱼类中，已经在金鱼【l 】、斑马鱼网、鲤鱼【3 1 、斜带石 斑鱼【4 1 、斑点叉尾鲴【5 】以及褐牙鲆【6 】中鉴定出n p y 基因。 1 1 n p y 的结构以及分布 1 1 1 n p y 的空间结构 n p y 是一种由3 6 个氨基酸组成的多肽，由于富含酪氨酸故称为神经肽酪氨 酸，分子量为4 2 7 1 。n p y 属于胰多肽家族，家族成员还包括p y y 、p p 以及p y 。 前期研究发现，n p y 和p y y 在所有鱼类中均有发现，然而p y 仅存在于部分鱼 类当中，包括黑鲈等；p p 则只在四脚动物中被发现【7 1 。n p y 和p y 被认为是起 源于脊椎动物进化中的染色体重复。 通过x 射线衍射法测得的n p y 结构与胰多肽的结构相似，在水中保持三维 立体构象。3 6 个氨基酸组成两个相互反向平行的螺旋区，包括一个含脯氨酸的 区域以及一个。螺旋，两个区域通过疏水键作用维持其三级结构( 图1 1 ，n p y 的氨基酸组成如下： t y r - p r o s e r - l y s - p r o a s p a s n - p r o - g l y g l u a s p a l a - p r o a l a g l u a s p m e t - a l a - a r g t y r - t y r - s e r - a l a l e u a r g h i s - t y r - i l e - a s n l e u i l e - t h r - a r g g i n a r g t y r - n h 2 ) 。其 1 中，c 末端区域具有发卡式的空间结构，一般称为p p f o l d ，此结构是由脯氨酸 延伸构成的脯氨酸螺旋( p r o l i n e h e l i x ) 通过一个转折后与2 个酪氨酸构成的0 螺 旋交叉形成们，而a 螺旋结构的稳定性取决与p h 值的变化。n p y 其n 端以及 c 端各有一个酪氨酸残基和酪氨酰胺残基，c 端的酰基化对其保持活性至关重要， 其初级结构非常保守【8 】，而n 端的酪氨酸残基对于结合受体以及保持三级结构的 稳定性有重要的作用 1 l , 1 2 】。 图1 1 人类n p y 基因结构图中n p y 呈p p - f o l d 本图来源l a s s o n ( 2 0 0 7 ) 1 3 】 1 1 2 n p y 的分布 在哺乳动物中，n p y 广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统，特别在端脑、 视前区、视顶盖以及丘脑中含量丰富【1 4 j 。定位研究显示n p y 在下丘脑的浓度含 量很高，主要分布于弓状核( a r c ) 神经元，少量分布于室旁核( p v n ) 以及背中核 ( d m n ) 等区域。而在外周神经系统中，n p y 与儿茶酚胺共存于囊泡中，一起释 放以起到神经递质的作用。同时在循环系统中，全身各部位的血管均有n p y 阳 性神经分布，血浆以及血小板中同样含有n p y 。血浆中的n p y 主要来源于肾上 2 腺中的链质嗜铬细胞。而当血小板受到胶原刺激聚集时，会释放出n p y 。此外， 如骨骼肌、肝脏、肺、脾脏、甲状腺以及消化道等也均有表达【1 5 17 1 。这也反映出 n p y 可能参与了广泛的生理功能。 k a he ta 1 ( 1 9 8 9 ) 在金鱼中首次证明了鱼类n p y 基因的存在，并通过 n o r t h e m b l o t 、原位杂交以及r i b o n u c l e a s ep r o t e c t i o n a s s a y 的方法，研究了n p y 在 金鱼脑部不同部位的表达情况。结果显示，下视丘的前视区、嗅球、丘脑以及中 脑的视觉盖、蓝斑都有较高的n p y m r n a 的表达【1 9 】。c e r d 6 一r e v e r t e re ta 1 ( 2 0 0 0 ) 运 用3 5 s - u t p 标记的探针对海鲈的脑组织进行原位杂交发现，n p ym r n a 不仅在 前视区、嗅球以及中脑视觉盖有表达，端脑的背侧以及内侧、下视丘、大脑脚盖 和后脑同样有表达：可见，n p y 在主要神经组织中广泛表达，表明其在硬骨鱼 的垂体分泌方面可能起到重要作用【2 0 1 。n p y m r n a 集中在神经中枢有着较高的 表达量，在牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 2 2 1 、斑马鱼( d a n i or e r i o ) 2 3 1 、大马哈鱼 ( o n c o r h y n c h u st s h a w y t c h a ) t 2 4 1 、斑点叉尾鲴( 尼脚“，螂p “玎c 柳螂) 【2 5 1 、罗非鱼( 乃厶矽妇 m o s s a m b i c a ) 2 6 1 、鲤鱼( o 矿f 聆淞c a r p i o 三) 【2 7 】和鲑鱼( o 切c o 咖聍c 办螂k e t a ) 1 2 8 】等鱼类中 都报道出相似的结果。陈蓉在检测斜带石斑鱼( o r a n g es p o t t e dg r o u p e r , e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) 的n p y m r n a 组织分布表达时，在外周组织中，眼、性腺、 胃、心脏、皮肤、鳃和血液均有n p y 表达，反映出鱼类可能可以通过自分泌或 旁分泌对外周组织进行调节【2 1 1 。 1 2 n p y 受体 n p y 释放后主要通过与受体结合发挥作用，其受体具有多种亚型，目前已克 隆出的n p y 受体亚型均属于g 蛋白耦连受体超家族【2 9 】。此类受体家族成员在构 型上有着典型的特征，均具有7 个疏水的。螺旋组成的跨膜结构。n 末端位于胞 外，c 末端位于胞质溶胶内( 图1 2 ) 。当配体与受体结合时，受体会通过改变胞内 构型将外部信号转变为细胞内信号到达下游目标f 3 0 】。 图1 2g 蛋白受体跨膜结构图，本圈来源l a s s o n ( 2 0 0 7 ) 1 i n p y 此类受体可通过抑制腺苷酸环化酶生物合成，最终动员或抑制钙离子的 释放起作用；还可激活胞膜上的磷脂酶c o l c ) ，产生二酰甘油( d a g ) 以及三磷 酸肌醇( i f 3 ) ，三磷酸肌醇( 峨) 可调节钙的转运；研究n p y 传导途径发现- 其亦 可激活蛋白激酶c 口k c ) 以及促分裂原活化蛋白( m a p ) 起作用。 目前哺乳动物中已发现的n p y 受体亚型包括y i 、y 2 、y 3 、y 4 、y 5 、y 6 ， 除y 3 外，均已成功被克隆口目，而在硬骨鱼类和两栖类中发现了一个y 7 亚型， 至今尚未在其他哺乳动物中有发现。脊椎动物的n p y 受体可以分为三个亚类， 包括y 1 ，y 2 以及y 5 亚类，三个亚类间的同源性大约为3 0 。而鱼类中至今已 被鉴定的n p y 受体主要属于y 1 以及y 2 两类，其中y 2 类受体仅在极少数的种 类中有所发现。这些受体在鱼类的眼部以及肠道等周围组织中均有分布田】。 1 2 1 y 1 型受体 y 1 型受体成员包括y 1 ，y 4 ，y 6 和被命名为y b 以及y c 硬骨鱼中发现的 y 8 a 和y 8 b t i 。第一个被克隆的y 1 受体是由小白鼠中得到的”i ，是这些受体中 4 特征功能研究最清楚的一个。该受体在中枢神经系统以及外周组织中均有分布， 对n p y 以及p y y 有着相同的亲和力，并广泛参与多种生理功能：参与情绪调节， 并调控摄食以及血压1 3 6 。8 1 。s t a r b i 4 c k 在斑马鱼中克隆得到了y a 受体，该受体同 样属于y 1 型受体，被认定为是哺乳动物y 4 的同源基因【3 9 】。 1 2 2y 2 类型受体 y 2 类型受体只有两个成员，分别为y 2 和y 7 。而第一个y 2 受体则是在1 9 9 5 年第一次被克隆得到【4 0 j 。此类型受体对于n p y 以及p y y 有着较高的亲和力【4 1 1 。 y 2 受体集中分布在脑部，而参与的功能与y 1 型受体往往相反，能提高血压以 及增加焦虑感【4 2 4 3 1 。哺乳动物当中，当p y y 与y 2 型受体在a r c 处结合时，还 会抑制摄食行为。此外，y 2 受体在生物体内可作为突出前体起着抑制神经递质 释放的功能，并对于记忆的形成有着重要作用m 】。而在硬骨鱼、两栖类以及鸡 当中发现的y 7 受体的作用，至今尚未研究明确。 1 2 3y 5 类型受体 y 5 受体由g e r a l d 于1 9 9 6 克隆得到，是y 5 类型受体家族的唯一成员。其在 第三跨膜处拥有的较延展胞内环状结构，这一显著特征使其在构型上明显不同于 y 1 以及y 2 型受体家族【4 5 1 。在多数种类中发现，y 5 受体基因位置与y 1 受体基 因位置相邻，二者以反向方式共转录 4 6 1 。y 5 类受体在功能上，主要参与摄食调 节过程。 1 3n p y 的生物学功能 1 3 1 对摄食的调节 n p y 在生物体内参与多种生理活动的调节，当中研究最多，描述相对确切的 就是其对摄食行为的调节。在哺乳动物中，摄食行为由来自中枢神经系统以及外 周组织的调节信号在下丘脑整合进行调节。而n p y 神经元则主要分布在下视丘 部分的脑干、弓状核( a r c ，a r c u a t e ) 以及背内侧核( d m n ，d o r s o m e d i a ln u c l e i ) 。 5 起源于脑干部分的神经元会将信号投射到a r c 、d m n 以及腹内核( v m n ， v e n t r o m e d i a ln u c l e u s ) 和室旁核( p v n ，p a r a v e n t f i c u l a rn u c l e u s ) 。之后a r c 中的 n p y 神经元也会将信号再依次投射到p v n 以及v m n 。a r c 、d m n 、v m n 以 及p v n 这四部分在摄食调节中有着非常重要的作用。此外，摄食行为还受到来 自外围的信号的影响，例如胰岛素、瘦素和g h r e l i n 都参与了摄食行为的调节【4 7 1 。 另一方面n p y 调节系统本身也对自身在下视丘的信号传导有自调节作用。其中， 下视丘中的y 2 型受体当接收到p y y 肽片段的刺激时，就会下调n p y 的释放反 应 4 8 ，4 9 】。y 4 受体与p p 肽接合时也会产生相似的反应【5 0 1 。此外，抑制n p y 向 阿片促黑素细胞皮质素原( p o m c ，p r o o p i o m e l a n o c o r t i n ) 神经释放的过程中， y 2 受体起到自受体的作用。研究表明n p y 以及p o m c 在生理活动的很多方面 都会相互影响。例如，当n p y 神经元激活时，会促进刺鼠相关蛋白( a g r p , a g o u t i g e n e r e l a t e dp e p t i d e ) 的表达。而a g r p 对于位于p v n 神经元上的黑皮质素4 型 受体，是一种天然的拮抗物【4 。丌。n p y 的y l 和y 5 两种受体对于摄食行为均有促 进作用。但是二者起作用的方面并不相同。y 1 型受体主要是提高生物体觅食行 为的主动性。而y 5 型受体则是对消化有促进作用1 5 1 , 5 2 】。 多项研究已经证明，在硬骨鱼中，n p y 也参与摄食行为的调节。在对金鱼进 行脑部注射哺乳动物或者鱼类的n p y 时，金鱼会表现出摄食行为的增强f 5 7 ， 同样的现象在鲑鱼以及斑点叉尾鲴中亦有报道【5 引。而对金鱼脑部注射低剂量的 y 1 受体或者y 5 受体的拮抗物时，均会诱导金鱼摄食量的提高，但是注射y 2 受 体的拮抗物时并没有同样的效果产生。此外，对金鱼进行y 1 受体和y 5 受体拮 抗物混合注射时，摄食量也会提高，且每种拮抗物的剂量有累加作用。阻断一个 受体并不会影响另一个受体的反应【5 6 1 。这些研究表明，在金鱼中，n p y 对摄食 行为的促进作用，是通过对y 1 以及y 5 受体的不同路径共同起作用。通过对金 鱼、鲑鱼以及鲶鱼进行饥饿处理，发现下丘脑n p y 的m r n a 表达水平会有一定 程度的提高。而在经过7 2 小时饥饿后，对金鱼进行投喂，会逆转由饥饿引起的 n p y m r n a 表达水平的提高阱】。金鱼体内n p y 的m r n a 的表达水平是一个动 态变化的状态。在摄食之前的一段时间，脑部的端脑视前区以及下丘脑的n p y 的m r n a 水平会上升；而摄食后，n p y 的m r n a 表达水平会逐步下斛5 7 j 。大 6 量营养物质的摄入也会对金鱼脑中的n p y 的基因表达水平产生影响。当饲喂高 糖或者高脂饲料时，金鱼脑部的n p y 基因表达水平会产生变化；而不同蛋白质 水平的饲料投喂金鱼，并不会对金鱼脑部的n p y 基因表达水平产生影响【5 8 】。 总体上，鱼类摄食的调节也同哺乳动物的调节相似，n p y 与其他一些摄食调 节因子，诸如可卡因一安非他明调节转录肤( c o c a i n e a n da m p h e t a m i n e - r e g u l a t e d t r a n s c r i p t ，c a r t ) ，促肾上腺皮质激素释放因子( c o r t i c o t r o p i n - r e l e a s i n gf a c t o r f a m i l yo f p e p t i d e s ，c r f ) ，瘦素( 1 e p t i n ) ，o r e x i n s ，包括o r e x i n a 及o r e x i n b ，速 激肽( t a c h y k i n i n s ) 以及g a l a n i n ，g a l ，通过相互影响，共同调节摄食行为。 1 3 2n p y 对性腺轴活动的调节 促性腺激素释放激素( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e ，g n r h ) 细胞集中分 布在下丘脑的基底部，而此处亦有丰富的n p y 神经纤维分布。目前多项研究已 证明了n p y 对于下丘脑的促性腺激素释放激素的分泌有着重要作用。在哺乳动 物中，下丘脑弓状核( a r c ) 的n p y 神经元与位于视前区的g n r h 的神经元存 在紧密联系，二者的神经纤维在弓状核的正中隆起处存在直接输入1 5 9 , 6 0 。而在鱼 类中，通过免疫化学分析等方法，在虹鳟( r a i n b o wt r o u t ，o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 、 褐鳟( b r o w nt r o u t ，s a l m ot r u t t a ) 以及胡鲶( c l a r i a sb a t r a c h u s ) 中均发现n p y 与g n r h 的调节有紧密的联系6 1 , 6 2 , 6 3 。对大鼠的研究中发现，对下丘脑部注射 n p y ，可以使发情期的大鼠提前产生g n r h 的脉冲峰；若做抗血清阻断处理， 则会抑制脉冲峰的形成【6 4 , 6 5 。 在鱼类中，由脑下腺分泌的促性腺激素( g o n a d o t r o p i ch o r m o n e ，g t h ) 对性 腺以及生殖细胞的发育成熟有着至关重要的作用。对金鱼的研究发现，g n r h 会 与g t h 的细胞受体接合，促进g t h 的分泌【6 6 】。n p y 可以通过刺激g n r h 的释放， 进一步提高g t h 的分泌，进而对性腺以及生殖细胞的发生与成熟产生影响。 1 3 3n p y 与鱼类生长激素( g h ) 研究发现，鱼类中当垂体细胞受到n p y 的刺激时，会释放g h 。但就该反应 7 的明确机制，现在尚未研究清楚6 5 1 。目前已知的研究结果显示，脑部g h 的分泌 机制是由两部分共同调节控制，即会受到生长抑素( s s ) 以及生长激素释放激 素( g h i m ) 共同影响，同时自身也会进行反馈调节。此外，鱼类下丘脑部位， 除n p y 之外，还有多种激素参与g h 分泌的调节，包括促性腺激素释放激素 ( g o n a d o l r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e ，g n r h ) 、去甲肾上腺素( n o r e p i n e p h r i n e ，n e ) 、 5 羟色胺( s r e o t o n i n ，5 - h t ) 、生长激素释放因子( g r o w t hh o r m o n e - r e l e a s i n gf a c t o r , g i 强) 等。 1 3 4n p y 的其他作用 n p y 在外周组织中，经常伴随去甲。肾上腺素一起释放。研究发现，n p y 可 通过y 1 受体引起血管收缩，在板鳃鱼以及大西洋鳕鱼中都已经得到了验i j e l 6 6 , 6 7 】。 相继的一些研究发现，n p y 对于小鼠血压的调节也起到非常重要的作用6 8 】。n p y 可以通过抑制心肌l 型钙电流以及钠钙离子交换电流对钾离子电流进行增强。 钾电流的增强会缩短动作电位恢复时间，提高心肌动作电位的复位速度，使得心 肌电平台期的钙离子内流减弱，从而影响心肌的收缩以及自律。 此外，n p y 还参与生物体的学习以及记忆行为。通过对啮齿类的不同的脑区 注射n p y 可以观察到，脑部的特定区域会出现反应。通过进一步对y 2 受体基 因敲除小鼠的研究证明，脑区特定反应是由n p y 通过y 2 受体介导引起的6 9 1 。 2 g h r e l i n 的研究进展 在脊椎动物中，消化道激素参与了调节食欲以及能量平衡方面的多项生理活 动。g h r e l i n 是目前已知的唯一的一种具有食欲促进作用的消化道分泌激素。在 哺乳动物中，g h r e l i n 是由2 8 个氨基酸构成的活性多肽，且在第三位s e r 位置有 酰基化的结构。而其在哺乳动物体内不仅参与生长促进g h 的释放以及摄食调 节，还参与记忆、免疫以及生殖系统的功能调节等多项生理功能【7 0 , 7 1 】。现在很多 研究已经证明，g h r e l i n 在鱼类、两栖动物、爬行动物以及鸟类当中都广泛分布， 且参与多种生理功能调节。硬骨鱼中，金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 、日本鳗鲡 ( a n g u i l l a j a p o n i c a ) 、鲶鱼( 1 c t a l u r u sp u n c t a t u s ) 、虹鳟( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 、 尼罗罗非( t i l a p i ao r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) 、莫桑比克罗非( o r e o c h r o m 西 m o s s a m b i c u s ) 、黑鲷( a c a n t h o p a g r u ss c h l e g e l i ) 、黑鲈( d i c e n t r a r c h u sl a b r a x ) 、 r 以及斜带石斑鱼( e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) 中都已经鉴定出了g h r e l i n 基因的存在。 2 1 g h r e l i n 的发现 b o w e r s 以及他的助手于1 9 7 6 年发现一种不具有类吗啡肽活性的类吗啡肽衍 生物，此种衍生物可以微弱的促进g h 的释放活动，被称为促生长激素释放素 ( g r o w t hh o r m o n es e c r e t a g o g u e ，g h s ) 1 7 2 】。第一个确定的g h s 的氨基酸构成为 t y r - d r r p g l y p h e m e t - n h 2 ，可以直接通过作用与垂体促进g h 的释放【7 3 1 ，而其 中的d t r p 对于g h s 与受体的接合起着重要作用。但是早起发现的g h s 对于 g h 的释放作用刺激性较弱，只能在离体实验中观察到。随后，于1 9 8 4 年，b o w e r s 合成了一种六肽g h r p 6 ，在体内以及离体实验中均可以观察到强烈促进g h 的 释放，使人们看到g h s 应用于临床的可能【7 4 】。在后来的研究中，p a t c h e t t 合成了 一种非肽类的g h s m k 0 6 7 7 ，即使通过口服依旧能保持活性，成为了一个成功 应用于临床研究的g h s 7 5 j 。 垂体的g h 释放之前被认定为受下丘脑的g h r h 调节，所以外源性的g h s 对于g h 的促进作用被认定是通过其他的途径起作用【7 纠。g h r h 通过与受体接 合，提高胞内的c a m p 的水平实现对g h 的促释放作用。g h s 则是通过与受体 接合，提高胞内的c a 2 + 水平通过i p 3 的信号传导途径参与调节g h 的释放( 图2 1 ) 。 g h i q 图2 1 垂体g h 释放的调节过型7 1 】 9 h o w a r d 于1 9 9 6 年在人类以及猪中发现g h s 会与一种孤立的受体接合，且 g h s 与其接合后会提升胞内c a 2 + 的水平，他将此受体命名为g h s r l a 。同时还 发现另一种较为惰性的剪接体g h s r l b ，功能尚未明确【7 7 1 。而鱼类中，g h s r 首先在河豚( p u f f e r f i s h ，s p h e r o i d e sn e p h e l u s ) 中被发现。河豚的g h s - r 与人类 的受体有5 8 的同源性。通过与人类的对比表明，g h s r 的结构是高度保守的 【7 8 】。k o j i m a 等于1 9 9 9 年在人体以及老鼠的胃中发现了g h s r l a 的内源性配体， 由2 8 个氨基酸组成，且在n 端第三位的s e r 处有酰基化修饰。这一内源性配体 被命名为g h r e l i n t7 0 l 。g h r e l i n 的发现史见表2 1 。 表2 i g h r e l i n 的发现史f 8 l j 2 2 g h r e l i n 的结构 2 2 1 g h r e u n 的基因 人类g h r e l i n 基因的构成包括3 个内显子和4 个外显子，且定位在染色体 3 p 2 5 2 6 位置【8 2 1 。t a n r k a 8 3 1 发现老鼠的g h r e l i n 基因由4 个内显子以及5 个外显 子组成，其第一个外显子较短且无编码能力。人类以及老鼠的基因序列都具有相 似的1 9 b p 的区域以及一个t a t ab o x 相似的t a t a t a a 序列在启动子区域。这表 明，g h r e l i n 的外显子以及内显子结构以及启动子的序列在哺乳动物中是非常保 守的。人类的g h r e l i n 结构见图2 2 1 0 瓣咽捶n 撼可_ 一 lt r a n s c r i p t i o n g h r e l i nm r n a ls p l i c i n g t r a n s c d p t - a m a t u r eg h r e l i nm r n a 一嗡【二】二二二_ t r a n s c r i p t - b lt r a n s l a t i o n 11 1 7 g h r e l i np r e c u r s o r ic l e a v a g ea n da c y l - m o d i f i c a t i o n o 。掣c 嘲越 1 审1 52 8 g s s f l s p e h q r v q q r k e s k k p p a k l q p r n - o c t a n o y lg h r e l i n 图2 2 人类g h r e l i n 基因结构以及蛋白剪切图【7 l 】。 首个非哺乳动物的g h r e l i n 基因是在金鱼中鉴定出来的。其结构与人类的 g h r e l i n 基因相同，均由3 个内显子以及4 个外显子构成。特别之处在于，金鱼 的内显子结构均特别短，外显子都有编码能力，不存在短且无编码能力的外显子 存在晔】。而虹鳟中，g h r e l i n 的基因同老鼠相似，有4 个内含子和5 个外显子。 虽然虹鳟与金鱼的基因结构存在一定程度的差别，但是整体来说，g h r e l i n 的基 因构成在鱼类中是高度保守的。 2 2 2 g h r e l i n 的前体蛋白 g h r e l i n 的前体蛋白是由一个信号肽、g h r e l i n 的成熟肽以及c 末端组成。在 不同种类的生物当中，其氨基酸的构成数目也不尽相同，例如在金鱼中，g h r e l i n 的前体蛋白含有1 0 3 个氨基酸残基，而在乌龟中数目则达到1 2 4 个。大多数生物 的g h r e l i n 成熟肽在其c 末端往往拥有一个a r g a r g 的结构。而火鸡的结构较为 特殊，其c 端为p r o a r g 结构，此外鲈形目包括罗非、海鲈和石斑鱼等在其g h r e l i n 的c 末端结构为单独a r g 。哺乳动物g h r e l i n 的前体蛋白通过内质网切掉信号肽， 并经激素原转化酶在心9 2 8 a l a 2 9 位置切开前体蛋白形成g h r e l i n 成熟