（植物病理学专业论文）四种检疫性植物病毒的胶体金免疫层析试纸条的研究.pdf

摘要 胶体金免疫层析技术目前技术比较的成熟，也有许多关于胶体金灵敏度的报 道。将它与e l i s a 方法的灵敏度进行比对后的得出结论，胶体金免疫层析试纸 条的灵敏度与e l i s a 基本相近，许多实验的灵敏度都可达到l n g m l 或更低水平。 胶体金免疫层析试纸条最大的优点在于无需借助实验室的设备和专业技术 人员，只需要取少量的植物汁液滴在试纸条上的样品垫上，便可以在十五分钟内 得到检测结果，它适合对一些检疫性植物病毒当场、即时地进行检测。 菜豆荚斑驳病毒、南方菜豆花叶病毒、烟草环斑病毒和番茄环斑病毒是我国 重要的进境检疫性有害生物。就检疫的南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒而 言，运用e l i s a 或者是r t - p c r 检测这两种病毒时，由于种皮，胚，或胚乳中 病毒的含量较低或者含有某些e l i s a ，r t - p c r 反应抑制物，因而检测的难度较大 运用，而运用胶体金免疫层析技术在一定程度上可以弥补上两种方法的不足【l 训。 为解决r t - p c r 方法很难直接检测大豆病种子中含有病毒的问题，将简便快 捷的胶体金免疫层析技术( g i c a ) 和高灵敏度的普通r t - p c r 方法相结合，建 立了胶体金免疫层析试纸条和反转录聚合酶链式反应( g i c a - r t - p c r ) 检测方法， 即先用g i c a 捕获病毒，将捕获的病毒直接进行r t - p c r 扩增，简化了检测的步 骤，提高了检测的灵敏度。本实验将所研究的四种植物病毒制备了胶体金免疫层 析试纸条，并用试纸条分别对病叶，感病的种皮一一经行了检测。 结果表明：用该方法比单用g i c a 检测大豆种皮中的t r s v 和s b m v 灵敏 度至少提高了1 0 0 0 0 倍，b p m v 至少提高了1 0 0 倍。用该方法检测四种植物病毒 的病叶灵敏度均比单用g i c a 方法也有所提高。 同时该方法也可以拓展到其他的应用领域，如人体，动物携带病毒的检测等。 该方法的一个突出之处就是应用性能比较好，因此可以进行技术推广。 关键词：植物病毒，多克隆抗体，胶体金免疫层析试纸条，g i c a - r t - p c r a b s t r a c t g i c ai sr e l a t i v e l ym a t u r e ，t h e r ei sa l s om u c ha b o u tt h es e n s i t i v i t yo fc o l l o i d a l g o l dw e r er e p o r t e d i ti sc o n c l u d e dt h a tt h es e n s i t i v i t yo fg i c aw a ss i m i l a rw i t ht h e e l i s aw h e nc o m p a r e dt h e m ，t h es e n s i t i v i t yo fm a n ye x p e r i m e n t sa b o u tg i c ac a nb e r e a c h e dln g m ll e v e lo rl e s s t h ea d v a n t a g eo fg i c ai st h a tt h e r ei sn on e e do fs p e c i a le x p e r i m e n ta p p a r a t u s e s 6 rs p e c i a l t r a i n i n gw o r k e r sw h e np l a n tv i r u s e sd e t e c t i n g w i t ht h eg i c a o n l yn e e dt o t a k es m a l la m o u n t so fp l a n tj u i c e sd r i po nt h es a m p l e sc o n j u g a t er e l e a s ep a d ，t h et e s t r e s u l t sc a nb er e c e i v e di n15m i n u t e s i ta d a p t st oan u m b e ro fq u a r a n t i n ep l a n tv i r u s e s o nt h es p o t ，r e a l - t i m ed e t e c t i o n b p m v ，s b m v ，t r s va n dt o r s va l la r ei m p o r t a n te n t r yq u a r a n t i n ep e s t s t o r e s o l v et h ep r o b l e mw h i c ht h er t - p c rm e t h o di sd i f f i c u l tt od e t e c tv i r u st h a ti n s o y b e a ns e e dc o a t t h u s ，w et o g e t h e rt h es i m p l ea n de f f i c i e n tt e c h n o l o g yg i c a w i t h t h eo r d i n a r yh i g hs e n s i t i v i t yr t p c rm e t h o d ，a n de s t a b l i s ht h eg i c a - r t p c r d e t e c t i o nm e t h o d ，t h a ti s ，t h ev i r u si sc a u g h tb yg i c af i r s ta n dd i r e c t l ya m p l i f i e db y r t - p c r t h ed e t e c t i o no fs t e p si s s i m p l i f i e da n dt h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yi s i m p r o v e d t h i se x p e r i m e n ti sa b o u tg i c a - r t - p c rf o rf o u rq u a r a n t i n ep l a n tv i r u s ，i t d e t e c t si n f e c t e dl e a v e sa n ds o y b e a r ls e e dc o a tr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h i sm e t h o di ss e n s i t i v i t yt h a ng i c ad e t e c tt r s va n d s b m vt h a ti ns o y b e a ns e e dc o a ta tl e a s t10 ，0 0 0t i m e si n c r e a s e d ，a sw e l la sb p m va t l e a s t10 0t i m e si n c r e a s e d c o m p a r e dt h i sm e t h o dw i t hg i c a t h es e n s i t i v i t yi s i m p r o v e d ，w h e nd e c e t ef o u rt y p e so fp l a n tv i r u s - i n f e c t e dl e a v e s a tt h es a m et i m e ，t h em e t h o dc a na l s ob ee x t e n d e dt oo t h e ra p p l i c a t i o nf i e l d ，s u c h a st h ed e t e c t i o no fv i r u sw h i c hh u m a no ra n i m a l si n f e c t e d i nv i e wo ft h eo u t s t a n d i n g a p p l i c a t i o np e r f o r m a n c eo ft h i sm e t h o d ，t h i st e c h n o l o g yc a n b ep o p u l a r i z e d k e yw o r d s ：p l a n tv i r u s ，p o l y c l o n a la n t i b o d i e s ，g i c a ，g i c a r t - p c r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 韭瞳置 时间：2 0 0 9 年6 月1 0 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间：2 0 0 9 年6 月1 0 日 时间：2 0 0 9 年6 月1 0 日 文献综述 1 植物检疫性病毒的检测和鉴定方法 植物检疫性病毒是在研究植物病毒的基本特性、特征理论基础上，运用先进 的仪器设备和技术，应用现在的科学方法对进、出境植物和植物产品的有害生物 病毒类病害进行检验检疫和监督处理的研究、应用，支持国家植物检疫法规的实 施。保护国家的农业生产安全；同时又严防有害生物病毒类病害传播、扩散，维 护本国和本地地区的贸易信誉，促进国际、国内贸易往来和种质组、资源的交流。 高效的发展生产、发展经济【l 】。 植物检疫病毒学作为生命科学前沿的一个分枝领域。近2 0 年来，在改革开放 政策推动下，得到了迅速的发展。国际间交流和种质资源交换频繁，给进口种子、 苗木传带病毒的检疫工作提出了更高的要求，在植物病毒检疫工作提出更高的要 求。 从18 9 2 年植物病毒被人类发现至今，仅一百多年的历史，但对它的研究、认 识和控制进展很快，这是因为它对农业生产带来越来越严重的危害，引起世界各 国的关注。 植物病毒病一旦发生便很难根治，目前防治植物病毒病害有效的方法是预防 传播，而检疫、检测是预防的关键【l 】。准确而快速地对病原物进行检测和鉴定是 诊断植物病害和对其有效控制的关键。传统上检测方法有两大类。一类是生物学 测定，一类是以免疫为基础的血清学检测技术，如e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) ，包括p l a t - t r a p p e da n t i g e ne l i s a 和d o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c h e l i s a 等、免疫双扩散、点免疫原位杂交技术等。近年来又发展了以核酸为基 础的检测技术，如：p c r 、r t p c r 、n a s b a 、r e a l t i m ep c r 和探针法【4 1 1 。病 毒的检测和鉴定方法越来越多，已形成一个系统的体系，现就有关进展综述如下。 1 1 生物学测定 生物学测定是病毒检测鉴定的重要方法之一。它是利用病毒的寄主范围、传 播方式和寄主被病毒侵染后症状表现的差异等来进行的一种病毒鉴定方法，其目 的是确定病原的侵染性，用实验的方法证明病毒与病害的直接相关性。寄主范围 和症状表现每种病毒都有一定的寄主范围，并在这些寄主上产生一定的症状。生 物学测定中应用最多的鉴别寄主，是指接种某种病毒后能在叶片等组织产生典型 症状的寄主。凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可用 作鉴别寄主。组合使用的几种或一套鉴别寄主称为鉴别寄主谱。鉴别寄主谱中一 般包括可系统侵染的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。依靠这些鉴别寄 主上所表现的不同症状反应，可以明确有无侵染性病毒的存在，并初步确定病毒 的种类及归属【47 1 。 这种方法比较灵敏，而且简单易行，但工作量较大，要求较大的温室，耗时 并且易受气候及其他条件的影响而使症状表现不稳定。病毒在自然界中的传播方 式是病毒检测鉴定的重要依据之一，大多数植物病毒都能汁液传播，许多病毒通 过专一性介体传播，因此有关介体的种类及其传毒特性在病毒鉴定上有重要意 义。有些病毒没有专一性介体或介体不详，有的主要通过花粉、种子、无性繁殖 材料传播，这些也都是分类的参考指标【l 】。确定病毒的传播方式不仅可以为病毒 的检测鉴定提供依据，同时也可以为病毒病的防治及进一步研究提供方便。生物 学测定虽然受工作量大、症状表现不稳定等诸多因素限制，但目前仍是病毒检测 鉴定的重要方法之一，早期的植物病毒研究者在这方面积累了大量的经验和实验 材料，是进行植物病毒检测鉴定的重要依据。 1 2 血清学测定 植物病毒的外壳蛋白等蛋白具有免疫原性，因此可以用作抗原制备抗血清， 根据抗原抗体的特异性反应可以检测到某种病毒的存在与否。血清学方法有沉淀 法、凝集法、免疫扩散法、酶联免疫吸附法、免疫电泳、免疫电镜等，目前应用 较广泛的是酶联免疫吸附法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 。 e l i s a 是一种采用固相( 主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附，将免疫反应和酶的高效 催化反应有机结合的方法，酶标抗体与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合 物，酶遇到相应的底物时，催化无色底物发生水解、氧化或还原反应，生成可溶 性或不可溶性的有色产物，颜色的深浅与抗原含量正相关。用肉眼观察可定性地 判断结果，还可以用分光光度计测定底物降解量，或者用酶联读数仪( e l i s a r e a d e r ) 直接读数，从而可以定性、定量测定样品中的病毒。与其它 方法相比较，e l i s a 具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。常用的e l i s a 方法有：直接法、间接法、双夹心法、双抗体夹心法，三抗体夹心法等。 植物病毒抗血清分为多克隆和单克隆抗体，单抗与多抗相比，每种单抗只针 对单一的抗原决定簇，能够精确地研究抗原即病毒间的相互关系和生物大分子的 抗原结构，故特异性强。k o h l c r 等人1 9 7 5 年建立的单克隆抗体技术的应用就避免 了病毒种或株系间的交叉反应，进一步提高了检测、鉴定的特异性和灵敏度。由 于植物病毒株系繁多，要真正从血清学反应上区分病毒的株系，就必须进行单克 隆抗体的制备。目前，几种植物病毒的s p a e l i s a ( 用酶标a 蛋白取代酶标抗抗 体的e l i s a ) 诊断试剂盒已被陈京等研制成圳引。 1 9 8 2 年h a w k e s 等建立了点免疫结合测试法( d o ti m m u n o b i n d i n ga s s a y ，d i b a ) ， 检测原理类似于e l i s a ，但酶与底物反应生成不溶性产物，在硝酸纤维素膜 2 ( n c m ) 上形成有色斑点，斑点颜色的深浅与抗原的含量成正比。周雪平等认 为d i b a 用n c m 代替酶联板，使检测更为简便、快速、经济。陈南海等用d i b a 法检测提纯的t m v ，其最低检出量为0 1 8 4n g m l ， 北h i b i 等报道的高出5 4 4 倍【4 引。 n c m 比酶联板便宜而且携带方便，进行田间病害诊断时可直接用病毒粗汁液进 行大量样本的测定【6 4 引。 血清学检测可以定性、定量测定样品中的病毒，是实现“快速、准确、经济 鉴定病毒的最好手段之一。但是，血清学技术也有其局限性，对一些病毒含量低 和含有干扰测定物质的样品不能做出准确的测定。 1 3 电子显微镜技术 病毒粒子的形态、大小、表面微细结构、有无包膜以及寄主植物受病毒侵染 后所发生的细胞超微病理变化尤其是内含体的形态结构都是植物病毒检测鉴定 的重要依据。随着病毒提纯条件的改善，超薄切片技术的发展，电子显微镜观察 已成为检测鉴定植物病毒的重要手段之一。现在不仅仅可以直观地用提纯的病毒 来观察病毒粒体，而且还可以从介体和感病组织的超薄切片中观察。 病毒的内含体及细胞的超微结构等细胞病理学变化【4 9 1 。病毒观察最常用的是 负染法和超薄切片法。所谓负染j 是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样 品外周的电子密度，使样品显示负的反差，从而衬托出样品的形态和大小。与超 薄切片( 正染色) 技术相比，负染不仅快速简易，而且分辨率高，目前已经广泛 应用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的 观察及免疫学和细胞化学的研究工作中，尤其对于病毒的快速鉴定及其结构研究 是一项必不可少的技术。 超薄切片法是观察病毒在细胞内的分布及细胞内含体等病变特征的最基本 方法。观察各种病毒引起的寄主细胞病变特征，有助于鉴别病毒种类甚至株系， 并了解病毒侵染和增殖过程。目前已知至少有八个病毒属( 科) 的成员产生不同 的内含体，可以与其它属或科区分开来，最典型的如马铃薯y 病毒科的风轮状 内含体、烟草花叶病毒属的结晶体和x 体、番茄丛矮病毒科的多泡体等。有些 细胞病变特征还有助于区别病毒的株系，如马铃薯y 病毒属一些成员的不同分 离物可引起不同类型的细胞质柱状内含体。由于电镜电子束的穿透力弱，要求样 品必须在1 0 n m 一- , 1 0 0 n m 之间，所以电镜观察需要特殊的载网和支持膜，需要复 杂的制样和切片过程，因此该方法受仪器设备和操作技术熟练程度等条件的限制 比较大，而且样本量大时这种方法存在一定的困难。 1 4 分子生物学技术 植物病毒粒体主要由核酸和外壳蛋白构成，外壳蛋白和核酸是检测鉴定植物 病毒的主要依据，研究核酸和蛋白质的分子生物学技术大多可用于植物病毒的检 3 测鉴定。血清学技术利用的是病毒外壳蛋白( c p ) 的抗原性，检测的目标是病 毒粒子的蛋白。由于病毒的核酸才有侵染性，仅仅检测到蛋白并不能肯定病毒有 无生物活性( 如豆类、玉米种子中的病毒大多失去侵染活性，但仍保持血清学阳 性反应) 。因此，核酸检测技术是鉴定植物病毒的更可靠方法，其中的核酸杂交、 聚合酶链式反应( p c r ) 、d s r n a 分析法等比较常用。 核酸杂交 核酸杂交是将待测核酸固定在膜( 硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上，用序列已知 的核酸探针和固定在膜上的待测核酸进行杂交，使杂交体带上标记而被检测出 来，所用探针必须标记，以便示踪和检测。朱水芳等、李尉民等分别应用核酸杂 交成功的检测了番茄环斑病毒( t o r s v ) 和南方菜豆花叶病毒( s b m v ) 【2 j 。核 酸检测不仅可以检测到目标病毒的核酸，而且还可以检测出相近病毒( 或核酸) 间的同源程度。核酸分子杂交法特异性强，灵敏度高，可检测到l p g 的d n a ，可 同时检测大量的样品，但操作技术要求高，且步骤比较繁琐。 聚合酶链式反应( p c r ) p c r 是一种在体外快速扩增特定基因或d n a 序列的技术，是近二十年来发 展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。p c r 技术发明后，不断衍生出许多 新的技术，使其应用范围不断扩大，特异性和灵敏度也不断提高。植物病毒中 r n a 病毒占7 0 以上，所以r t - p c r 在检测鉴定病毒方面应用非常广泛。复合 r t - p c r 是在同m r t - p c r 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目标片段。 2 0 0 0 年n a s s u t h 等应用复合r t - p c r 同时检测葡萄藤提取物中的4 种病毒【2 6 j ， n i e 等也应用复合r t - p c r 技术同时检测了马铃薯的5 种病毒和1 种类病毒【列j 。 复合r t - p c r 与单一r t - p c r 做相同数目的病毒检测相比，节约了时间和试剂。 p c r e l i s a 方法是将核酸的纯化、扩增一步完成，然后利用酶的放大作用将不 可见的分子反应变为可见的颜色变化。p c r 和荧光测定相结合的实时荧光定量 p c 不仅可避免假阳性的出现，而且提高了检测灵敏度，还能进行实时定量检 测。r r o b e r t 等用实时荧光定量r t - p c r 可检测少至5 0 0f g 的番茄斑萎病毒 ( t s w v ) 。e u n 等采用复合荧光定量r t - p c r 法可同时检测少至5 龟的建兰花叶 病毒( c y m m v ) 和齿兰环斑病毒( o r s v ) 4 。p c r 对病毒检测的优点是它特 别灵敏，可检测的病毒含量达到龟水平，可直接对任何材料，包括坏死、鲜活、 甚至很微量材料进行检测。但植物病毒多为r n a 病毒，r n a 很容易降解，提取 相对较为困难，大多数核酸抽提程序不能除去植物的多糖或多酚化合物，而这些 物质对p c r 扩增反应有一定的抑制作用。只有那些序列已知的病毒才能做直接 p c r ，且实验时需要昂贵的试剂和特殊的设备。 基因芯片 4 基因芯片技术是近十年来发展起来的应用于分子生物学研究的一项新技术。 即将无数预先设计好的寡核苷酸、e d n a 、基因组d n a 宅e 芯片上做成点阵，与样 品中的同源核酸分子杂交。基因苍片在核酸序列测定、基因突变的检测、基因表 达的分析等诸多领域的研究中应用非常广泛，但由于使用成本高，国内研究只是 处于起步阶段，国内外学者也正致力于植物病毒检测的基因芯片的研究和开发。 相信不久的将来基因芯片会在快速、灵敏地检测大批量植物病毒样品上发挥重要 作用。 综上所述，各种方法、技术尽管各有其优点，但同时也存在不足之处。生物 学测定程序较为繁琐并且耗时，植物病毒血清和核酸检测技术中存在设备、技术 依赖性强的难点，限制了植物病毒病害样品的快速、简便、大众化的应用。而在 医学等领域应用的胶体金免疫层析技术具有克服上述难点的优势，从原理上可用 于植物病毒的检测。 2 胶体金免疫层析技术的基本原理 2 1 胶体金免疫屡析试纸条组成圈以及原理围 胶体金免疫层析试纸条具体原理如下图所示试纸条的构造 z _ 吸橼 丰抗鬼i 贼：f = ；羹：+ 懒冁璜 妖一黼锄。+ 一 ；一玻一囊晨 u t 线能显色的原因：胶体金试纸条t 线上喷有抗植物病毒的特异性抗体，采 用的是双抗体夹心法的原理。用g i c a 检测病材料时，则样品中的病毒与抗体一 胶体金结合后，形成复合物a u a b l v i r u s ，层析时该复合物被t 线上的病毒特异 性抗体所捕获，形成a u a b l - v i r u s a b l 结构而使t 线显色。 c 线能显色的原因：胶体金试纸条的c 线上喷有羊抗兔抗体，采用的是间接 法原理，能显色的原因形成a u - a b l a b 2 或a u a b l ( v i r u s ) a b 2 复合物。用 g i c a 检测病材料时，形成a u a b l v i r u s ，该复合物先被t 线上病毒特异性抗体 a b l 所捕获，形成a u - a b ! 一( v i r u s ) 一a b l ，多余的复合物或没有完全被t 线捕获 的，则被随后的c 线所捕获形成a u _ a b l - ( v i r u s ) 一a b 2 复合物，所以c 线显色。 但用g i c a 检测健康的大豆材料或缓冲液时，c 线所捕获的只是a u - a b l ，形成 a u a b l a b 2 ，而显色。 2 2 胶体金和免疫层析的概念 免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的 一种新型免疫标记技术。胶体金颗粒之间因为静电作用形成一种稳定的胶体状 态，也称金溶胶。胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包 被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团静电吸附而 形成牢固结合。用还原法何以方便地从氯金酸制备各种不同粒径，也就是不同颜 色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以是葡萄球菌 a 蛋白，免疫球蛋白，毒素，糖蛋白，酶，抗生素，激素，牛血清蛋白多肽等非 共价结合，因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具。 胶体金是氯金酸在还原剂作用下聚合成的颗粒还原材料，常用的还原剂有柠 檬酸三钠，鞣酸，抗坏血酸，白磷，硼氢化钠等。根据还原剂的类型以及还原作 用的强弱，可以制备0 8 n m - 1 5 0 n m 不等的胶体金。胶体金具有呈色性，微小颗粒胶 体金呈红色，但不同大小的胶体金呈色是有一定的差别最小的胶体金( 2 - 5 n m ) 是 橙黄色，中等大小的胶体金( 1 0 2 0 n m ) 是酒红色的，较大颗粒的胶体金( 3 0 8 0 n m ) 则是紫红色的。 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条的一端的 液体慢慢向另一端渗移，在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免 疫金的颜2 0 - 3 0 n m 胶体金颗粒的制备取1 氯金酸0 6 m l ，加3 0 m l 超纯净水加热煮 沸。一次性快速加入1 柠檬酸钠0 9 m l ( 3 7o c 预温) ，溶液由蓝逐渐变为紫红色， 煮沸3 - 5 m i n ，补水至原体积。冷却后，用0 2 m o l l 碳酸钾调p h 至7 2 7 5 。用 0 2 2 u m 滤膜无菌注射器压滤。免疫胶体金免疫层析实验简称免疫层析色而显示 出来。测试的样品加缓冲液，经研磨后，低速离心取上清( 未离心的样品在测试时。 一些大颗粒物质的存在，易影响液流的上行，从而使得检测效果不佳。) 每一样品 需3 0 0 - 4 0 0 u l ，以能走完试制条为宜，测试样品体积过多，。可稀释胶体金使得测试 效果不好。测试前将试制条恢复至室温。将试制条含胶体金复合物的一端插入到 样品中，样品液不要超过胶体金试制条的m a x 线。测试观测的时间以1 0 2 0 分钟 为宜。对于样品浓度低的样品时间可适当延长。 质控点( 线) 显粉红色，测试点( 线) 也显粉红色，检测结果为阳性。 质控点( 线) 显粉红色，测试点( 线) 未显色，检测结果为阴性。 质控点和测试点( 线) 均未显色，说明试制条失效，检测结果无效u 1 1 3 1 。 2 3 胶体金层析技术的的发展历史 从酶联免疫层析开始，免疫层析由单一膜发展到复合膜使用的标记物有乳胶 6 颗粒，胶体金，胶体硒，今后可能还会出现新的标记物，进一步提高免疫层析的灵敏 度。 2 4 胶体金的发展方向 定量，半定量的检测定性检测的结果只有阴性和阳性，容易引起误解，为了 某一物体内部某种物质的准确的含量，报道的定量检测有：血中茶碱和胆固醇的检 测，他们都以酶显色为基础，以层析条上现色高度对照标准曲线来定量半定量检 测则是，在膜间隔一定距离包被上几条平行的抗体带，层析后观察显色条的数量， 从而把待测物含量确定在某一范围。 此外，可以在精确控制加样量和抗体包被量的条件下，以显色时间的长短来 定量；使用简单的仪器如比色计，亦可以定量。 多元的检测在同一条膜同时检测多种物质的多元检测，对有联检意义的多 个指标的检测有很大的应用价值。在上个世纪的九十年代，b u e s h l e r 等用一膜包 被多元抗体带的( 包括阳性和阴性对照) 研制出能同时检测7 中病毒的免疫层析试 制条。b u e s h l e r 等还采用一膜包被多条抗体带药物【3 9 1 。s t e r l i n g 等则是用多膜复 合，在膜的不同位置，使用不同的膜和不同的酶来进行待测物的分离和显色，同时 检测血中的血红蛋白，葡萄糖的胆固醇三种物质【37 1 。我国目前这方面的报道还比 较的少，抗h c v 对献血员的筛选，h b s a g 抗h b e ，h b e a g 三项指标检测乙肝等。 2 5 胶体金试纸条在各领域的应用 目前国内外应用免疫层析原理制作免疫层析测试条的种类已经很多，该技 术在医学上得到广泛的应用，大多数人人的传染病已经研制成免疫胶体金检测方 法，在兽医诊断领域也开始使用，但是在植物病害的检测和防治方面还是应用的 比较的少。近些年理制备的试剂盒对其特定的样品进行定性而非定量的检测。下 面对免疫层析试制条的应用范围及其应用效果做一下介绍。 在人类疾病的应用 德国b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司生产的“c t n t , 快速测试试剂盒 ，可及时检 测出急性心肌梗塞病人中c t n t , 对急性心肌梗塞的病人及时进行诊断。 免疫胶体金法能快速，准确，简便测定r v 抗原在1 5 1 例r v 阳性标本中总 检出率为4 9 o 对于明确抗原，控制传播，制定有效治疗措施，防止滥用抗生素等 都是具有非常重要的意义：特别是用于基层医院，可作为对r v 腹泻常规的检测， 为临床治疗提供依据，有利于减少并发症，从而减低病死率。 美国的p a np r o b ei n c 生物技术公司生产的“快速一步法胶体金尿检试 条”，它可以检测出尿液中，吗啡、海洛因、苯丙胺、大麻、安定等药物含量，国 际大赛中的违禁药物尿检就采用了这项技术。在禁毒的工作期间，检测病毒，采 用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒，标记甲基苯丙胺单克隆抗体，制成免 7 疫层析试制条，建立快速自测式胶体金免疫层析法，并用于尿液中甲基苯雨胺的 检测。结果显示，甲基苯丙胺层析测试条只与甲基苯丙胺发生特异性反应，符合 中国药品生物制品的检测甲基苯丙胺标准品的标准，灵敏度为1 0 0 0 ，与典型的麻 醉药物和镇静药物无交叉反应。 动物疫病检测的应用 用布鲁菌纯蛋白衍化物为检测板的包被抗原，建立了用胶体金标记抗原，利 用间接法检测人和不同动物血液样品中的抗布鲁菌抗体的新方法。郑鸣等首先建 立了猪瘟病毒抗体检测免疫层析试制条【9 1 。 采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒，标记纯化的鸡新城疫抗体，并包被在 玻璃纤维素膜上，另外江纯化的新城疫抗体和纯化的兔抗鸡抗体包被在硝酸显微 膜上，组装成新城疫快速检测试制条，对收集的2 4 份样品检测，结果与h a 结果 是一致的符合率10 0 5 | 。 植物病害方面的检测 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记烟草环斑病毒的抗体，制成免 疫层析检测试制条。检测粗提纯病毒的灵敏度为1 0 0 n g m l 病汁液稀释1 0 0 0 倍之 后仍然可以快速检测 1 l 】对烟草叶片的各个不同成分以及酸碱度对试纸条灵敏度 的影响，得出当t m v 浓度小于5 0 n g m l 时，无论是否加入别的成分，都不会被检 测到。并得出植物叶片的成分对试纸条灵敏度没有明显的影响的结论。 环境检测方面的应用 2 0 世纪9 0 年代的初期，国外已经建立了多种针对多种有机污染物进行了 分析检测，利用免疫胶体金快速诊断来初测农产品或者是环境中的重金属离子的 含量，可以节省时间大大的加快检测的进程【l6 1 。 小分子物质的检测的应用 免疫层析技术广泛应用于食品安全监测的各个领域，如动物源性食品污染中 的有机磷类和氨基甲酸酯类的残留检测，该方法对s m z 标准溶液的灵敏度达到 5 0 n g m l ，试制条显色结果清晰，反映灵敏整个过程在5 1 0 m i n 内完成，稳定性和重 复性良好p j 。 应用胶体金快速测试试纸条，能检测饲料中的莱克多巴胺检出限为 o 0 0 5 n g k g 。这种方法简便快捷，是一种值得推广的定性筛选的方法。 以2 0 ，1 0 ，0 5 o 转基因大豆标准品提取的d n a 为模板，经p c r 扩增，扩增的产物分别用金标免疫层析测试条和琼脂糖凝胶电泳检测。结果 2 o ，1 o ，o 5 转基因大豆的标准品的扩增产物在i c t 条上呈现红色检测带， 而阴性标样和空白对照未出现特异性检测带。 可以看出胶体金免疫层析试纸条的灵敏度还是比较高的，而且开发出的试剂 8 盒具有很大的市场的潜在的价值。但是目前根据免疫层析法还是主要用于法医鉴 定，动物源性病毒检测以及人体的病毒检测等方面。而且用于植物病毒检测的测 试条研制工作还是比较少的。英国的中央科技实验室( c e n t r a ls c i e n c e l a b o r a t o r y , c s l ) 的p d 系列植物病原快速检测试剂盒( p o c k e td i a g n o s t i at m ) 是采 用免疫层析技术制成。包含诊断多种植物病原( 包括病毒、细菌、真菌) 的检测试 剂盒。目前还没有相关文章公开发表。而国内目前很少有人做有关植物病毒检测 免疫金试剂盒这方面的研究工作，所以开发植物病毒检测免疫金试剂盒是必要的 也是重要的。 表1 试纸条的种类及其应用的范围和效果 t a b l elc o l l o i d a lg o l dt e s tp a p e r t y p e 9a p p l i c a t i o na n da p p l i c a t i o ne f f e c t 9 引言 1 9 7 1 年f a u l k 将胶体金被引进免疫化学后，派生出来的有免疫电镜的应用， 免疫金光镜分析以及免疫金标记组织和细胞，免疫金试纸膜和试剂盒检测法。近 十年来胶体金标记已经发展成为一项重要的免疫标记技术。其在药物检测生物医 学，动植物检验检疫已经得到发展，技术也是日益的完善。同时在环境检测，农 业生产，和医药卫生等领域有所应用。 运用e l i s a 或者是r t p c r 检测南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒这两 种病毒，由于种皮，胚，或胚乳中病毒的含量较低或者含有某些e l i s a ，r t p c r 反应抑制物，因而检测的难度较大运用，而运用胶体金免疫层析技术在一定程度 上可以弥补上两种方法的不足【2 。 菜豆荚斑驳病毒( b e a np o dm o t t l ev i r u s ，b p m v ) 属于豇豆花叶病毒科 ( c o m o v i u s ) 该病毒可以侵染豆科少数的几个属，主要是菜豆和大豆，经甲虫传毒， 对大豆产量影响严重【l 】。诊断寄主：大豆( g l y c i n em a x ) 严重的系统斑驳，豆荚 和种皮斑驳；菜豆( p h a s e o l u sv u l g a n s ) t e n d r g r e e n 品种，叶片和豆荚严重褪绿 斑驳；该病毒主要分布在美国【5 l 】力口拿大【5 2 】巴西和秘鲁【5 3 】等美洲国家，在北美 地区发生严重。b p m v 已列入我国新修订的植物检疫性有害生物名单中【5 1 。 南方菜豆花叶病毒s b m v ( s o u t h e r nb e a nm o s a i cv i r u s ) 是南方菜豆花叶病 毒属( s o b e m o v i r u s ) 的典型成员，主要分布在非洲和美洲【l 】，可以感染危害大豆、 菜豆、南瓜等1 2 个属的2 3 种植物【2 】。南方菜豆花叶病毒病常在田间普遍发生 s b m v 传播途径多，危害严重，甲虫传播再侵染，南方菜豆花叶病毒主要存在在 大豆的种皮中，并能引起侵染。s b m v 侵染菜豆致病主要症状时斑驳，花叶，品种的 差异甚大，有的为系统发病；有的是局部发病，有的症状很轻微，有的还产生皱缩和 沿脉变色等症状。丹麦、澳大利亚、埃及、东非等一些国家和地区将其列为检疫 对象。我国具有扎根、繁殖、扩散的条件，所以一旦传入，后患无穷。已将该病 毒列为我国二类进境检疫目录，从1 9 9 2 始依法实施检疫【1 4 1 。 烟草环斑病毒( t o b a c c or i n g s p o tv i r u s ，t r s v ) 为豇豆花叶病毒科 ( c o m o v i r i d a e ) 线虫传多面体病毒属( n e p o v i m s ) ，该病毒寄主范围广，可侵 染5 4 科2 4 6 种植物，是蔬菜、花卉等经济作物等的重要病害之一【4 】，能引起多种 植物病害，严重时导致绝产。大豆受烟草环斑病毒侵染后病株生长受阻，植株矮 化叶片小而质次，产量下降，大发生时可使产量损失5 0 。1 9 7 8 年印度茄子受 t r s v 侵染损失5 5 2 7 0 3 。烟草环斑病毒的危害引起世界各国的关注，前苏 联、德国、澳大利亚、加拿大、南非等国家和地区将其列为检疫对象，依法对能 携带t r s v 入境的植物和产品等实施检疫 4 】。t r s v 为我国进境检疫法规中明确 规定的二类检疫性有害生物【l 】。 1 0 番茄环斑病毒( t o p a t or i n g s p o tv i r u s ，t o r s v ) 为豇豆花叶病毒科 ( c o m o v i r i d a e ) 线虫传多面体病毒属【1 1 ( n e p o v i r u s ) ，主要分布在北美温带地区。 此外欧洲、南美洲一些国家和日本、土耳其、澳大利亚也有分布。寄主范围广泛 可3 5 科1 0 5 属1 5 7 种以上的单子叶和双子叶植物。在接种寄主番杏上的主要表 现为系统退绿斑、坏死环斑，严重时顶芽枯死，最后茎秆和叶柄基部和茎节处产 生褐色条纹，乃至坏死条纹。 随着我国加入世界贸易组织之后，同世界各国的农业产品的贸易越来越频 繁，这无疑当中加大了进出口检验检疫的工作量，也对检验检疫提出了更高的要 求，因此就必须要求更快，更准确的对于植物进行检验检疫。目前，针对植物病 毒的研究方法层出不穷，主要有生物学，血清学，电子显微镜，分子生物学，研 究也正在逐步的深入，但是目前依然血清学占主要地位。生物学和分子生物学的 检验周期相对较长，对于农作物的进出口不利。因此本实验对于快速、简便、经 济的胶体金免疫层析试纸条进行了研究，并对该方法做了进一步的改进。 材料与方法 1 抗血清的制备及纯化 1 1 毒源的繁殖 1 1 1 试验材料 s b m v 毒原引自日本，接种在大豆上保存，带毒大豆种子为 e s s e x ”品种由 接种后的大豆所得；t r s v 毒原引自英国，接种在白肋烟( n i c o t i a n a t a b a c u m c v w h i t e b u r l e y ) 上保存，带毒大豆种子为“齐黑1 号”品种由本实验室保存；b p m v 毒源引自接种在大豆上保存，带毒大豆种子为“e s s e x ”品种由接种后的大豆所 得；t o r s v 毒源引自接种在番杏上保存。 1 1 2 摩擦接种方法 取本实验室保存的毒源加少量的水后在研钵中磨碎，加少量的硅藻土搅匀，在第 一片真叶上摩擦接种( 以大豆为例) ，接种完毕后用蒸馏水冲洗 1 2 抗血清的制备 1 2 1 实验材料和用具 ( 1 ) 植物材料接种s b m v 三周以上的e s s e x 大豆； ( 2 ) 缓冲液0 2 5m 和0 0 1 m 的p b 缓冲液p h 7 0 1 ( 3 ) 化学试剂正丁醇、聚乙二醇( p e g 6 0 0 0 ) 、氯化钠； ( 4 ) 玻璃器皿量筒、烧杯、三角瓶、漏斗、滴管、吸管； ( 5 ) b a c k m a n 高速离心机、b a c k m a n 超速离心机磁力搅拌器； ( 6 ) 蔗糖密度梯度柱的制备； 1 2 2 实验方法 蔗糖的配置方法 ( 1 ) 用蒸馏水配置4 0 的蔗糖母液 ( 2 ) 用蒸馏水将母液分别配制成1 0 、2 0 、3 0 蔗糖溶液( v v ) ( 3 ) 在b e c k m a ns w 4 0 t i 转头4 0 转头的离心管中，按3 m 1 ( 4 0 ) 、3 m 1 ( 3 0 ) 、 3 m 1 ( 2 0 ) 和3 m 1 ( 1 0 ) 的比例由高浓度开始加入管中 粗提纯 ( 1 ) 采收接种s b m v - - - - 周后的大豆病叶2 5 0 9 ； ( 2 ) 力f l l 0 0 0m lp h 7 0 的0 0 5 m o l l - 1 的p b ( 内含0 1 的巯基乙醇) ，用组织捣 碎机捣碎，双层纱布过滤，调节p h i l j 4 5 ，加1 0 的正丁醇； ( 3 ) b e c k m a n j a 1 4 转头8 0 0 0 r m i n 1 ，离, 1 ) , 1 0 m i n 。取上清 1 8 ( w v ) p e g 6 0 0 0 ， 3 ( w v ) n a c i 和2 5 的t r i t o n ，搅拌溶解，置4 c 的冰箱中过夜； ( 4 ) j a 一1 4 转头8 0 0 0r r a i n - 1 ，离, 1 ) , 1 5 m i n ； 1 2 ( 5 ) 沉淀用8 0 m l 的0 0 1 m o l l 1 ，p u 7 0 的p b 悬浮，4 搅拌3 h ； ( 6 ) j a - 1 7 转头8 0 0 0r m i n 1 ，离, 1 1 0 m i n ，弃沉淀留上清； ( 7 ) 用b e c k m a ns w 4 0 t i 转头3 5 0 0 0r m i n 1 离心2 5 h l ( 8 ) 沉淀用7 m l ，0 0 1 m o l 【广lp h 7 0 的p b 悬浮后，4 搅拌6 h ； ( 9 ) 用j a - 2 1 转头8 0 0 0r m i n - 1 离, t 2 0 m i n ，留上清； 精提纯