（分析化学专业论文）烟草中植物甾醇的形态分析和分布研究.pdf

摘要 摘要 本文旨在建立烟草中游离和结合态的植物甾醇( p h y t o s t e r o l s ) 的分离分析的 常规方法，并将其应用于烟草中植物甾醇分布规律的探讨中。依据大量的文献调 研并结合烟草化学成分分析的特点，研究建立了烟草中植物甾醇的气相色谱火 焰离子化检测器( g c f i d ) 分析方法，分析了各种典型烟叶中的植物甾醇含量、种 类以及形态分布：同时还初步探索了卷烟制丝过程中植物甾醇存在形态和含量 的变化。这些探索性研究为后续进一步的研究工作提供了相关参考信息。 论文主要工作总结如下： 1 将直接酸碱水解皂化引入到烟草中植物甾醇的分析测定中。系统的优化 了前处理过程中水解条件、萃取溶剂和萃取方式，并将实验方法与传统的索氏萃 取方法进行了对比分析，寻找到适合烟草复杂体系的简单、有效的样品前处理方 法，不仅简化实验步骤，节省溶剂，而且为吏全面准确地反映烟叶中植物甾醇的 存在状态和含量，尤其是糖苷态植物甾醇的含量提供了前提。 2 研究建立了植物甾醇的t m s 衍生化毛细管气相色谱火焰离子化检测器 ( g c f i d ) 的分析方法，通过优化仪器参数等最终确定了最佳的仪器测定条件， 并从线性范围、检测限、回收率等方面对分析方法进行了验证。实验结果表明，方 法具有较低的检测限和较宽的线性范围，五种甾醇检测限在o 1 0 o 3 5 g m l - l 的范围内，相对标准偏差在2 3 3 3 之间，回收率在8 7 9 9 之间，适合于 烟草植物甾醇的分析测定。 3 考察了烟草中植物甾醇的形态和含量分布。通过分析了一系列不同类型、 品种、不同产地、不同部位的烟草中植物甾醇，从烟草的遗传因素、生长环境以 及烟叶部位等方面探讨分析了其对烟草中植物甾醇的影响：同时通过对卷烟制 丝过程中植物甾醇形态及含量的测定，分析了卷烟制丝生产工序对烟草中植物 甾醇的形态和含量变化的影响。这些研究工作为研究甾醇含量和烟草类型之间 的关系以及烟草的种植和加工提供了有利的信息。 关键词：植物甾醇； 烟草； 气相色谱；形态 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i sp a p e rs e e k e dt oe x p l o r eas i m p l er o u t i n ea n a l y t i c a lm e t h o dt os e p a r a t ea n d d e t e l l n i n ef r e ea n dc o n j u g a t e dp h y t o s t e r o l si nt o b a c c o ，a n da p p l yt h i sm e t h o d o l o g yt o g i v ec o m p r e h e n s i v ei n f o r m a t i o na b o u tp h y t o s t e r o l s l e v e l sa n de x i s t e n tf o r m s d i s t “b u t i o ni nv 撕o u st o b a c c ol e a v e s t h r o u g hal o to fl i t e r a t u r er e s e a r c h e sa n d e x p e r i m e n t s ，a nh p r o v e da n ds i m p l em e t h o du s i n gc a p i l l a 巧g a sc 1 1 r o m a t o g r a p h y c o u p l e d 、圻t haf 1 啪ei o n i z a t i o nd e t e c t i o ns y s t e m ( g c f i d ) h a db e e nd e v e l o p e df o r q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp h y t o s t e r o l si nt o b a c c o ；e x p l o r e dt h ec o n t e n ta n dc o m p o s i t i o n o fp h y t o s t e r o l si nr e p r e s e n t a t i v ec u r e dt o b a c c ol e a v e s m o r e o v e r ，t h ei n f l u e n c eo f m a i nt e c l m o l o g yp r o c e s so nt h ed i s t r i b u t i o no fp h y t o s t e r o l sw a sa n a l y z e d 。t h e s e e x p l o r a t o 巧s t u d i e sp r o v i d e dr e f e r e n c ei n f o r m a t i o nf o rf u r t h e rs t u d i e s t 王l r e em a i na s p e c t sw e r ei n c i u d e di nt h ed i s s e r r t a t i o n ： 1 d i r e c ta c i da n da l k a l i n eh y d r o l y s i sw e r ef i r s ti n t r o d u c e di n t ot o b a c c oa n a l y s i s t o1 i b e r a t ef r e ep h y t o s t e r o l s 丘o mc o n j u g a t e s as e r i e so f o p t i z a t i o nw e r ed o n et on n d t h em o s te f l f e c t i v es a p o n m c a t i o nc o n d i t i o n ，e x t r a c t i o ns o l v e ma n dt e c h n 0 1 0 9 yf o r t o b a c c o s a m p l e ；c o m p a r e dw i t h t h et r a d i t i o n a l s a m p l ep r e t r e a t m e n t s ， s o x h l e t e x t r a c t i o np r i o rt o s a p o n m c a t i o na 1 1 df u n h e rp u r m c a t i o ns t e p ( s u c ha sc o l u i i m s e p a r a t i o na n ds o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ) w e r eo m i t t e d t m si m p r o v e dp r e p a r a t i o n p r o c e d u r ew a se f f e c t i v e ，r e l i a b l e ，s i m p l ea n dl o w c o s t ，a n dp r o v i d e dap r e m i s ef o r a c c u r a t eq u a n t i 母i n gd i f 佗r e n tf o r m so fp h y t o s t e r 0 1 si n t o b a c c o ，e s p e c i a l l yf o rt h e s t e 巧lg l y c o s i d e sa n da c y l a t e ds t e r y lg l y c o s i d e s 2 a ni r n p r o v e d ， s i m p l e a n dr o u t i n em e t h o d u s i n g g c f i dt m s e t h e r d e r i v a t i v e sf o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so ff r e ea n dc o n j u g a t e dp h y t o s t e r o l si nt o b a c c o l e a v e sw a s i n v e s t i g a t e d t h eb e s td e t e r m i n a t i o ne o n d i t i o n sw e r ec h o s e na r e ras e r i e s o fo p t i m i z a t i o n ，a n dt h em e t h o dw a sv a l i d a t e db y l i n e a r i t y ， l i m i to fd e t e c t i o n ， r e p e a t a b i l i t ya n dr e c o v e r y l o d so fp h y t o s t e r o l sv a r i e df r o m0 35t 00 10 “gm l ， r s dv a l u ew e r ef r o m2 3t o3 3 ，r e c o v e r yr a n g e df r o m8 7t o9 9 ；a l lt h e s ed a t a s s h o w e dt l l a tt h i si m p r o v e dm e t h o dw a sf e a s i b l ef o rt o b a c c oa n a l v s i ss v s t e m 3 t h ec o n t e n t so f 厅e ea n dc o n ju g a t e dp h y t o s t e r o l si nt o b a c c ol e a v e so fv a r i o u s i i i a b s t r a c t t y p e s ，p l a n t i n gl o c a t i o n ，v a r i e t i e s ， a n ds t a l kp o s i t i o n sw e r ea n a l y z e d ，a n ds o m e r e l a t i o n s h i p sw e r ed i s c o v e r e db e t w e e nt h a ta n dv a r i o u sf a c t o r s ，s u c ha sg e n o t y p e ， g r o w i n gr e g i o na n ds t a l kp o s i t i o n a n dt h ei n f l u e n c eo fm a i nc i g a r e t t ep r 。c e s s i n go n t h ed i s t “b u t i o no fp h y t o s t e r o l sw a sa n a l y z e d b a s i c a l l y ，w ep r e s e n t e du s e f u la n d c o m p r e h e n s i v ei n f o m a t i o na b o u tt h ep h y t o s t e r o ld i s t r i b u t i o n o fv a r i o u sc u r e d t o b a c c o1 e a v e s t h e s er e s u l t sw e r ei m p o n a n ti nt h ec o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o no fm e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h e m i c a lc o m p o s i t i o na n dt o b a c c oq u a l i t ya n ds a f e t y ，a sw e l la s t h em a n u f a c t u r eo fc o m m e r c i a lc i g a r e t t e s k e yw o r d s ：p h y t o s t e r o l ；r o b a c c o ；g a sc h r o m a t o g r a p h y ；s p e c i a t i o n i v 中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果与我一同工作的同志对本研 究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 作者签名： 砷年岁月讼日 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 1 1 植物甾醇概述 1 1 1 甾醇的结构和种类 甾醇( s t e r 0 1 ) 是广泛存在于自然界中的一类甾族化合物( s t e r o i d ) ，因其呈固态 又称固醇。它属于大分子醇类，其基本结构为环戊氢化菲体系，该结构又常称为 甾核。这些化合物通常由2 7 3 0 个碳原子组成，甾醇类化合物的共同特点是在 c 3 位上有羟基，c 1 7 位上有由8 l o 个碳原子构成的侧链，c l o 、c _ 1 3 上各有 一个甲基【i ，2 】。天然油脂中的甾醇以胪o h 为主，其基本骨架见图1 1 。 f i g 1 甾醇的基本骨架 甾醇的种类随着稠环体系上双键和支链的变化而不同。同时，a 环也可以变 化为五元环，同时r 2 直链上的c 一2 2 附近的支链可以变宽和变长。总之，根据甾 核c 4 位上连有甲基的多少，可以将甾醇分为4 无甲基甾醇，4 单甲基甾醇和 4 ，4 一二甲基甾醇三大类( 图1 2 ) ，其中研究最多的游离甾醇多为4 一无甲基甾醇 【2 - 4 1 o 根据来源的不同，可以将甾醇分为三大类，即动物甾醇、植物甾醇和菌甾 醇。发现最早和研究最多的动物甾醇为胆甾醇( c 2 7 h 。6 0 ) ，它是所有动物细胞的必 需成分，在神经组织中含量最高；血清中胆甾醇含量的增加会引起动脉粥状硬 化。植物甾醇广泛分布于植物界，它代表了植物代谢的一个终产物。其种类繁多， 代表性的有存在于玉米油中的谷甾醇，大豆油中的豆甾醇、菜油甾醇，棉籽油中 的菜籽甾醇等，属于植物甾醇的还有燕麦甾醇、菠菜甾醇和环木菠萝烯醇等等。 植物甾醇是植物体内构成细胞膜的成分之一，也是多种激素、维生素d 和甾族化 中国科学技术大学硕士学位论文 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 合物生物合成的前体。最初发现麦角中的麦角甾醇可以从酵母中得到，属于菌甾 醇，经辐射处理，可转化为维生素d 原，具有抗佝偻病的作用【5 7 1 。 f i g 1 2不同结构的甾醇骨架：( i ) 4 ，4 二甲基甾醇，环木菠萝烯醇；( i i ) 4 一甲基甾醇，钝叶醇； ( i l i ) 4 去甲基甾醇，菜油甾醇 本课题主要研究对象为植物甾醇，它是所有蔬菜食物中的生物活性的成份。 它们通常是2 8 一或2 9 一碳原子醇，并且碳骨架与目前研究最多的胆固醇相似( 在甾 核上的基础上，有3 o h ，5 ，6 双键) 具有稳定植物细胞膜中磷脂双分子层的作 用。植物甾醇包括了一个额外的甲基，乙基或双键。大多数的植物甾醇的支链碳 原子一般为9 l o 个，不同于胆甾醇的8 个。植物甾醇被划分为是胆甾烷系列的 4 一无甲基甾醇，它们都在c 一5 上有双键【8 - 1 1j 。 f 唔1 3植物甾醇的命名法：( e g s i t o s t e r o l = s t i g m a s t 5 e n 3 b o l = 2 4 r e t h y l c h o l e s t 5 e n 3 一o n 在植物中，目前报道的有超过2 0 0 多种植物甾醇，其中最主要的是一谷甾醇 2 中国科学技术大学硕士学位沦文 第l 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 ( 2 锄一乙基胆甾醇) 、菜油甾醇( 2 4 川一甲基胆甾醇) 和豆甾醇( 2 2 ，2 4 川一乙基胆甾 醇) 。麦角甾醇( 7 ，2 2 ，2 锄一甲基胆甾醇) 是酵母中主要的甾醇，并且在谷物、棉 籽、花生和亚麻籽油中1 1 3 】。目前通用的有两种命名方法分别是i u p a c i u b 在1 9 7 6 和1 9 8 9 年制定的【9 ，10 1 ，具体例子如图1 3 所示。 自然界中，甾醇以游离或结合态存在。当甾醇中的3 萨0 h 分别与酸酯化，或 是与己糖( 通常是葡萄糖) 或6 一脂肪酰基己糖糖基化时，分别生成甾醇的三种结 合态。其中配糖类的植物甾醇是谷类中最常见的形态，这类物质是植物甾醇的羟 基和葡萄糖分子中的一个一o h 失水得到的缩醛结构的化合物。糖昔分子中的糖 的部分称为糖基，非糖部分称为配基，连接糖基和配基的键称为苷。糖苷在酸性 条件下水解，但在温和的碱性条件下是稳定的，它仅在激烈的条件下才与碱的 水溶液反应，例如伊葡萄糖甲基苷在1 7 0 。c ，2 5m o l l 1n a o h 的水溶液中才缓慢 水解【怍1 8 】。除了水解的方法，酯键利用合适的酶作用也可以断裂，从而使游离 的植物甾醇从结合态中释放出来【1 9 】。 此外，植物甾醇中还有一小类是植物甾烷醇( p h y t o s t a n 0 1 ) ，在谷物( 玉米、小 麦、黑麦和大米) 、水果和蔬菜牛都有发现，但是含量一般比不饱和的植物甾醇 的含量低【4 ，1 1 】。 1 1 2 甾醇的性质【5 ，2 0 ，2 1 】 甾醇通常为片状或粉末状白色固体，经溶剂结晶处理的甾醇为白色鳞片状 或针状晶体，无臭无味，在化学结构上是三萜类化合物。甾醇分子中含碳原子数 一般为2 7 3 1 ，分子量约为3 8 6 4 5 6 ，具有旋光性。甾醇的熔点均较高，一般在 1 0 0o c 以上，最高可达2 1 5 0 c 。 t a b l e1 1 植物甾醇的基本物理常数 甾醇的密度略大于水，不溶于水、酸和碱，微溶于乙醇和丙酮，溶于氯仿、 己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯化碳和苯。在相同的溶剂中甾醇的溶解度随其种 类和温度的不同而不同。利用甾醇在各种溶剂中的溶解度，可以提取和分离不同 中国科学技术大学硕士学位论文 3 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 种类的甾醇【22 1 ，植物甾醇基本的物理常数见表1 1 。 植物甾醇具有疏水性，但又因为结构上带有的羟基基团使其具有亲水性， 即植物甾醇具有乳化性质。乳化性可通过对羟基基团进行化学改性而得到改善， 并且由于其具有两性使得植物甾醇具有调节和控制反相膜流动性的能力【2 3 2 4 1 。 1 1 3 植物甾醇的生理特性、功能与应用 1 1 3 1 在医学上的功能与应用 最初通过研究用胆固醇喂养的小鸡，发现大豆中的植物甾醇可以抑制血浆 和肝脏中胆固醇的增长，随后的研究表明植物甾醇可以降低动脉粥状硬化的症状 1 l 2 5 之7 1 。目前植物甾醇降低血清中胆甾醇的含量的研究已经有大量的报道【2 8 - 3 1 】， 甚至从二十世纪五十年代开始肛谷甾醇就开始作为一种降低血清中胆固醇的含 量的药物用于胆甾醇血症的患者 32 1 。从此，大量的临产试验被用来研究游离和酯 态的4 一去甲基植物甾醇对血脂的作用。这些化合物通过降低胆固醇的吸收来降 低总胆固醇( t c ，t o t a lc h o l e s t e r 0 1 ) 和l d l 低密度脂蛋白一胆固醇( l d l c ，l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i ns e m mc h o l e s t e r 0 1 ) 的含量，适当的溶解游离和酯化的植物甾醇 可以降低但甾醇的活性p 3 _ 36 1 。 植物甾醇和植物甾烷醇不仅可以抑制日常饮食中胆甾醇的摄取量，也会降 低人体自身肝脏中产生的胆固醇。尽管目前有许多的理论尝试解释这一现象，但 该现象的机理并未完全得到科学的解释，其中一个理论认为在人体的肠道中胆固 醇处于近饱和的状态，当人体附加吸收植物甾醇后，胆固醇沉淀为不溶的小颗 粒【37 引。另外的一个理论则是基于胆固醇必须进入含有胆汁盐和磷脂的混合胶束 中才能被吸收到血液中的事实。在这个胶束基团中，只有胆甾醇是可溶的，这样 就会被植物甾醇置换出来，从而阻止了胆甾醇的吸收【3 9 ，4 0 1 。 除了上述的可以降低血液中胆甾醇的功能外，植物甾醇存动物中还有下面 的活性：抗癌性( 对机体结肠癌和前列腺疾病有很好的抑制作用) 4 h 4 1 ，抗动脉粥 状硬化【4 5 】，类激素【4 6 ，4 7 1 ，消炎 4 8 】和抗氧化【4 9 】的作用。 1 1 3 2 在化；1 女方面的功能和应用【2 4 ，5 0 ，5 1 】 植物甾醇是一种w 0 性的乳化剂，具有温和的皮肤渗透性和促进皮脂分泌 的生理特性，能保持皮肤湿润和柔软，延缓皮肤的老化，防止皮肤晒伤，因此在 化妆品工业中也得到了较广泛的应用。此外，植物甾醇及其乙氧基化物可用作乳 4 中国科学技术大学硕士学位沦文 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 化剂、增稠剂、增溶剂和分散剂等等。 1 1 3 3 在饲料工业中的功能和应用【2 4 】 植物甾醇和核糖蛋白结合后，具有促进动物性蛋白质合成的功能，有利于 动物的生长与健康。因此可将植物甾醇添加到混合饲料中，提高禽兽的增长率。 日本利用植物甾醇解决了蚕人工饲养中，对混合性饲料的厌食性难题，从而摆 脱了养蚕业受桑叶生产、气候条件等因素的制约。 1 1 3 4 在食品工业的功能和应用【2 4 ，4 0 】 植物甾醇具有良好的抗氧化、抗腐败作用，可以用作食物添加剂。此外植物 甾醇可以降低血液中低密度的脂蛋白( l d l ) 和血液中总胆甾醇( t c ) 的含量这一 效果引起了大量关于食物和饮食中植物甾醇的研究，同时促进了添加植物甾醇 的功能性食品的发展。1 9 9 9 年，有许多独立的科学家组成的小组议定植物甾醇 酯可以被认为是公认安全的( g e n e r a l l yr e c o g n j z e da ss a f e ，g r a s ) 植物油成份， 含量最高可以达到1 3 3 的油重。在欧洲，食品科学委员会通过研究分析植物甾 醇以及其酯的安全性，批准了黄油类脂肪中游离植物甾醇的含量可以达到8 。 1 2 烟草中的植物甾醇 1 2 1 烟草中的植物甾醇的类型和存在形态 在烟草化学分析研究中发现有大量的醇类化合物，在烟叶和烟气中已鉴定 出近4 0 0 种醇，其中包括脂肪醇、芳香醇及植物甾醇。其中植物甾醇主要存在于 烟草细胞膜中，对于烟草的品质和安全性有着较大的影响【5 2 _ 5 4 1 。烟草中的植物甾 醇主要有三种，菜油甾醇、豆甾醇和肛谷甾醇，它们是植物细胞膜的基本组分， 此外在霉变的烟叶中我们也发现了少量的麦角甾醇【5 5 ，5 6 1 。：l 毋草中的植物甾醇以游 离态( f s ) 和结合态存在，结合态包括与脂肪酸结合成酯( s e ) 、与糖类的羟基形成 糖苷键的配糖类物质( s g ) 以及酰基配糖类化合物( a s g ) f l l 1 6 - 婚】。有研究报道，在 对1 5 2 个随机选择的烟草样品的研究中植物甾醇的含量变化范围在0 1 0 3 之 间蟑3 | 。烟草中主要的五种甾醇的结构以及四种存在形态结构如图1 4 和l 。5 所示 【8 ，5 7 】 中国科学技术大学硕士学位论文 第1 章烟：牛中植物甾醇的分析技术研究进展 c a m p e r s t e r os t ；g m a s i e r o i p - s i l o s t e r o le r g o s i e r o i f i g 1 4 常见的代表性甾醇的结构 f i g 1 5甾醇四种不同的存在形态( r 随着甾醇种类的不同而变化) 1 2 2 烟草中植物甾醇的生物合成 植物中甾醇类化合物的生理意义主要在于甾醇是细胞膜系统的组成成分并 月促进植物生长，烟草中甾醇类物质的生理功能也大致如此。具有生物活性的甾 醇类化合物统称为表油菜素内酯物( b r a s s i n o l i d e ) ，并以花粉组织中分离出来的甾 醇类内酯为代表。表油菜素内酯( 2 a ，3 仅，2 2 a ，2 3 a 四羟基2 4 a 甲基一高7 氧 杂5 n 胆甾烷6 酮) 可促进植株对植物生长激素的敏感性而有利于植株的生长发 6 中国科学技术大学硕士学位沦文 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 畜 5 2 ，5 3 】 h o 烟草通过乙酸酯到鲨烯的途径完成类甾醇的生物合成，已有较确切的证据 证明这一过程。将1 4 c 醋酸加到烟草植株培养液中，可观察到甾醇物质合成途径 中许多中间体的存在，如环阿电醇( c y c l o a r t e n 0 1 ) 。而用1 4 c 胆甾醇培养烟草，则可 以观察到胆甾醇转化为其它甾醇类物质【8 ，5 2 ，58 1 。 乙酸卜类萜中间体( c 5 ) 卜鲨烯( c 3 0 ) 卜环化产物( c 3 0 ) 卜胆吲醇( c 2 7 ) f i g 1 6胆固醇生物合成途径基本概要 c 5 c 1 0 c 1 5 c 1 5 一c 1 0 一c 5 p p i + c h 2 0 - 争。 器习一 p p i + n a d p + 、。一上。 f i g 1 7鲨烯的形成及鲨烯合成酶的催化机理 预鲨烯焦磷酸 类甾醇的生物合成途径可划分为二个阶段：由乙酰c o a 到鲨烯的形成和由 鲨烯环化开始类甾醇的生物合成。第一阶段实际上是类萜生物合成途径，鲨烯为 中国科学技术大学硕士学位论文 7 第1 章烟中：中植物甾醇的分析技术研究进展 三萜化合物；该阶段包括异戊烯焦磷酸( i p p ) 的生物合成及异戊烯单位缩合形成 链状萜类物质。第二阶段由鲨烯环化形成甾醇类化合物的四环三萜结构，然后经 去甲基化、双键重排等过程，生成各种类甾醇化合物。其中羊毛甾醇可生成胆甾 醇，而植物甾醇，如豆甾醇和谷甾醇等则是由环阿电醇转化而来【5 2 ，5 9 ，6 0 1 。 f i g 1 8 羊毛甾醇的形成 1 2 3 烟草中的植物甾醇及其对烟草品质和安全性的影响 烟草中植物甾醇归属于烟草脂类化合物，研究表明烟草的己烷萃取物是卷 烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体物【6 1 ，6 2 1 ，烟气中6 1 的苯并( a ) 芘( b a p ) 是由它 裂解产生的【6 引。不同于食品和植物其中的植物甾醇，烟草中的植物甾醇是通过卷 烟制品的烟草暴露于常温直至高达9 5 0 0 c 的温度以及变化的氧气浓度下进而被 人体吸收的【54 | 。研究表明约有2 0 2 5 的烟草植物甾醇完整的转移到烟气中， 其侧流主流比值在0 5 o 9 之间。这种转移或是通过游离甾醇的蒸馏，或是通过 酯态和苷态热解释放出游离甾醇而实现的。其余的植物甾醇，无论是游离的还是 结合的，都发生各种各样的降解而产生多种产物【6 4 1 。由于甾醇的结构中都含有羟 基，热解时其母体的四轮环戊烯 6 【】菲环结构可形成稠环芳烃，因此烟草中的甾 醇是一种潜在的影响人体健康的物质【65 1 。关于甾醇对于多环芳烃的影响的研究 工作至今仍然比较少，且都是使用的裂解方式来实现的。在j o s t o n e 6 6 】和 s t e d m a n 【5 6 j 的研究中都表明豆甾醇在7 5 0 。c 下热解生成苯并( a ) 芘；在b a d g e r 等 【67 ，6 8 】的研究工作中表明，在豆甾醇的裂解过程中，可能主要是发生了甾醇骨架的 一系列单分子反应后形成了菲、蒽等多环芳烃，他们认为多环芳烃的形成依赖于 8 中国科学技术大学硕士学位沦文 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 甾醇的多环骨架；在b r i t t 【6 9 】等的研究中表明使用闪式真空裂解法，豆甾醇以及 豆甾醇酯在7 0 0 0 c 下生成菲、蒽等多环芳烃的原因可能是由于缺乏双分子反应 产生的。d h o 胁a n 【6 z j 将烟叶石油醚提取物用硅胶柱层析分离成八个集份f l f 8 ， 其中f 2 3 包括了甾醇的高级脂肪酸酯，f 6 主要包括游离的甾醇和脂肪酸。对各 个集份进行裂解试验，发现甾醇对苯并( 反) 芘的贡献很大。 。 本实验室工作者【7 0 j 在热解模式研究基础上，通过外加法来研究卷烟中特定 烟气组分的形成机理和相关前体物对烟气成分的影响。实验以游离态的胆甾醇、 豆甾醇、伊谷甾醇和麦角甾醇为研究对象，按照一定的添加量加入到卷烟烟丝中， 考察卷烟烟气中多环芳烃释放量的变化，研究了甾醇对卷烟主流烟气中多环芳 烃释放量的影响，并探讨推测了多环芳烃的形成机理。实验结果表明，对于胆甾 醇而言，随着添加量的增加，卷烟主流烟气中三环的多环芳烃( 苊、二氢苊、芴和 菲) 的释放量明显增大，而四环、五环、六环的多环芳烃释放量则没有明显的变 化；谷甾醇随其添加量的增加，卷烟主流烟气中三环、四环多环芳烃的释放量 增大，而对五环、六环的多环芳烃的释放量没有明显的影响；豆甾醇添加量的增 加使得四环、五环和六环的多环芳烃均有不同程度的增加，特别是对于荧蒽、苯 并( k ) 荧葸、苯并 ) 芘和二苯并( a ，h ) 葸的贡献比较明显，但对三环的多环芳烃贡献 并不显著；随着麦角甾醇添加量的增加，除了茚并( 1 ，2 ，3 c d ) 芘之外，主流烟气中 的多环芳烃均呈现一定的增长趋势，特别是苯并( n ) 蒽、屈、苯并( a ) 芘和二苯并 ( a ，h ) 葸都有很大幅度的增长。对于各种多环芳烃( 除三环外) 的贡献率最高，其次 是豆甾醇和一谷甾醇。胆甾醇仅对三环多环芳烃释放量有特别大的影响，在所有 甾醇中其贡献率最高。而豆甾醇和麦角甾醇除了对小环的多环芳烃有一定的贡 献外，对于大环的多环芳烃贡献率更大，即影响更为显著。我们推测植物甾醇形 成多环芳烃的机理是先发生单分子的均裂反应，然后发生协同反应或者芳香化 反应，但是整个过程可能更多的倾向于发生高温热合成反应过程【6 5 1 。 基于上述烟草中植物甾醇对烟草品质以及安全性的影响，建立一种简单有 效的植物甾醇分析方法和对烟草中甾醇含量和存在形态的全面评估对卷烟的降 焦减害和配方研究具有一定的参考价值。 1 3 植物甾醇分析的研究进展 由于植物甾醇一般存在于复杂的食品或植物的脂类中，要准确的测定植物 中国科学技术大学硕士学位论文 9 第1 章烟华：中植物甾醇的分析技术研究进展 甾醇的含量，目前的测定一般要经过萃取分离，纯化富集然后检测定量的分析 步骤 3 川。其中植物组织或含油的种子中分离植物甾醇一般要先溶剂萃取、超临 界萃取( s f e ，s u p e r c r i t i c a if l u i de x t r a c t i o n ) 或是超临界流体分馏( s f f ，s u p e r c r i t i c a l f l u i df r a c t i o n a t i o n ) ，然后是各种各样的纯化步骤，最后对纯化物进行定量分析。 在定量方面，目前的植物甾醇分析一般是利用柱色谱( c c ，c 0 1 u m c h r o m a t o g r 印h y ) ，薄层色谱( t l c ，t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ) ，毛细管电色谱( c e c ， c a p i l l a r ye l e c t r o - c h r o m a t o g r a p h y ) ，气相色谱( g c ，g a sc h r o m a t o g r a p h y ) 或正反相高 效液相色谱( h p l c ，h i 曲一p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 。它们的检测器一般 使用氢离子火焰检测器( f i d ，n a m ei o n i z a t i o nd e t e c t i o n ) ，紫外检测器( u v ) ，蒸发 光散射检测器( e l s d ，e v a p o r a t i v el i 曲ts c a t t e r i n gd e t e c t i o n ) ，红外检测器( i r ， i n f r a r e dd e t e c t i o n ) ，核磁共振( n m r ，n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ) 和质谱( m s ，m a s s s p e c t r o m e t r y ) 。随着色谱技术的发展，复杂基质中植物甾醇的分析方法有了非常 大的发展。下面我们按照植物甾醇分析方法的不同回顾一下植物甾醇分析方法 的发展。 1 3 1 样品的保存 植物甾醇是一类彳i 稳定的物质，因此在分析测定前对样品的保存是非常重 要的。有文献报道，甾醇在没有冻干的物质中( 均质的食物) 储存在_ 2 0 。c 比储存 在4 。c 更稳定。这样条件下存放的样品经过六周后其甾醇含量下降并且其色谱 分析图中出现额外的杂峰【1 1 ，7 。 1 3 2 样品的分离和富集 样品的前处理是评价过程中不可缺少的步骤，无论最终植物甾醇以何种形 态和方法测定，样品必须经过把植物甾醇从复杂的植物基质中萃取出来，以减 少干扰物对分析植物甾醇的干扰。植物甾醇存在于植物的细胞膜中，它们一般以 游离态( f s ) 和结合态( s e 、s g 、a s g ) 存在。目前报道的分析方法大部分都采用在 测定之前将植物甾醇从它们的结合态中释放出来，测定游离的植物甾醇的含量。 通常分析复杂基质中植物甾醇的含量的前处理步骤包括脂类物质的萃取，酸铖 的皂化释放游离的植物甾醇，萃取非皂化的部分，纯化富集( t l c ，s p e ) 。在这一 系列的步骤中必须防止植物甾醇的氧化，可以充氮气或是加入抗氧化剂( 焦桔酸， 抗坏血酸) 来保护甾醇1 7 lj ，但是也有文献报道加抗氧化剂来防止甾醇氧化的作用 1 0 中国科学技术大学硕士学位论文 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 并不大【7 2 】。 1 3 2 1 溶剂萃取 6 1 - 7 1 】 溶剂萃取是一种经典的样品制备方法，对于植物化学成分的提取，它是根 据植物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大、对不需要溶 出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从植物组织内溶解出来的方法。当溶剂加 到适当粉碎的原料中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内， 溶解了可溶性物质，造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩 散，溶剂又不断进入植物组织细胞中，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡，可 把所需的成分较完全溶出或大部分溶出。由于样品基质的不同，所选择的萃取溶 剂和萃取方式也不同，一般最常用的有丙酮【7 3 7 4 1 、氯仿甲醇【75 1 、二氯甲烷【7 6 - 7 8 】 和己烷【7 9 8 2 1 。振荡萃取【8 3 8 6 1 、超声波萃取【7 9 ，8 1 ，8 7 ，88 1 、索氏萃取【7 4 ，7 9 】和加速溶剂萃 取陋9 0 1 都已用于植物等复杂分析体系的萃取。 a ) 索氏萃取( s o x h l e t ) ： 索式萃取是传统的液固萃取方法，且常作为新萃取方法的参照标准。样品经 过索式萃取后，通常需要对萃取液进行浓缩过程，浓缩过程通过k d ( k u d e m a - d a n i s h ) 浓缩器完成。烟草样品早期植物甾醇的测定大多数利用的是索 式萃取的方法将植物甾醇从烟草细胞壁中提取出来【7 4 ，8 3 ，9 1 ，9 2 1 。s t e d m a nr l 【7 4 】用 1 0 0m l 丙酮2 4h 索式萃取出1 5 3 5g 烟草中的植物甾醇。但是这种方法溶剂使 用量大，耗时长，并且由于是存高温下的萃取，植物甾醇容易被氧化【9 3 】。 b ) 振荡萃取： 振荡萃取是溶剂渗透，溶解出目标分析物的过程，借助机械的振荡增加溶 剂分子进入植物细胞壁的分子运动，使萃取进行的完全迅速。这一萃取方式在烟 草的大规模分析和工厂实验室的常规分析上是最常用的【悱8 6 】，它可以允许大批 量的处理样品，节省人力物力。虽然在目前的烟草植物甾醇分析研究中没有报道， 但是本文在优化前处理技术时，对这一方法进行了验证，实验证明它与超声波 萃取得到的结果没有显著性差异。 c ) 超声波辅助萃取( u a e ) ： 超声波辅助萃取( u l t r a s o u l l d a s s i s t e de x t r a c t i o n ) ，亦称为超声波萃取 ( u l 仃a l s o n i cw a v ee x t r a c t i o n ) 、超声波提取( u l t r a s o u n d a s s i s t e dl e a c h i n g ) ，是利用超 声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、 中国科学技术大学硕士学位沦文 1 1 第l 章烟单中植物甾醇的分析技术研究进展 扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿 透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行超声波能产生并传递强大 的能量，给予介质如固体小颗粒极大的加速度。这种能量作用于液体里，振动处 于稀疏状态时，声波在某些样品如植物组织细胞里比电磁波穿透更深，停留时 间更长。在液体中，膨胀过程形成负压如果超声波能量足够强，膨胀过程就会 在液体中生成气泡或将液体撕裂成很小的空穴。这些空穴瞬间即闭合，闭合时产 生高达3 0 0 0m p a 的瞬间压力，称为空化作用，整个过程在4 0 0 s 内完成。这种 空化作用可细化各种物质以及制造乳液，加速目标成分进入溶剂，极大地提高 提取率【8 7 ，8 8 】。除空化作用外，超声波的许多次级效应也都利于目标成分的转移和 提取【9 引。近年仅有的分析烟草中植物甾醇的文章大部分采用的超声波辅助萃取 【7 8 7 9 ，9 5 ，9 6 1 。j i ua i 在1 9 9 7 年短柱g c m s m s 快速分析烟草中游离植物甾醇时，用 二氯甲烷作为萃取溶剂3 5 0 c 下超声萃取加入内标的烟样1h ，然后直接进行色谱 测定【78 1 。 d ) 加速溶剂萃取( a s e ) 19 9 5 年，硒c h t e r 等【9 7 j 提出了一种全新的萃取方法一加速溶剂萃取法 ( a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ，a s e ) 。它是一种在较高温度( 5 0 2 0 0 。c ) 和较大压力 ( 1 0 3 2 0 6m p a ) 条件下用溶剂萃取固体或半固体的新颖的样品前处理方法，具 有有机溶剂用量少、萃取快速、样品回收率高等突出优点。它通过提高温度增 加溶剂对溶质( 被提取物) 的溶解能力，温度的提高能极大的减弱由范德华力、氢 键以及溶质分子和样品基质之间很强的相互作用力；减少解析活化能，使溶质 从基质中快速的解析进入溶剂；同时能降低溶剂和样品基质之间的表面张力， 使溶剂更好的进入样品基质，促进被萃取物与溶剂的接触。同时增加压力以提高 溶剂的沸点，使溶剂在萃取过程中始终保持液态。此外，增加压力还可以提高溶 剂对溶质的萃取速度，缩短分析周期。a s e 己被美国环保局( e p a ) 推荐为标准方 法，来替代索氏提取等传统方法，应用于环境、药物、食品和聚合物工业等领域 由【8 9 ，9 0 】 o 申今朝一驯利用a s e 分析了烟草中的甾醇类化合物，具体的实验步骤如下： 准确称取5g 烟末样品于3 3m l 样品池中，以石油醚在压力1 5 0 0p s i 、平衡时间 5m i n 、静置时间5m i n 和吹扣时间6 0 s 的情况下a s e 方法萃取并循环两次，萃 取温度分别为l o o 、1 2 5 和1 5 0 0 c 。通过对a s e 萃取条件的优化，分别比较了加 速溶剂萃取、超声微波辅助溶剂萃取和索氏萃取三种方式对甾醇萃取量，结果发 1 2 中国科学技术大学硕士学位论文 第1 章烟草中植物甾醇的分析技术研究进展 现索氏萃取和超声波辅助溶剂萃取具有相似的提取结果，并且对大部分的甾醇 的萃取量都在加速溶剂萃取量的数倍以上。 1 3 2 2 超临界流体萃取和分馏( s f e & s f f ) 超临界流体萃取( s f e ，s u p e r c r i t i c a ln u i de x t r a c t i o na n df r a c t i o n a t i o n ) 用于植物 分析是目前研究的一个热点【8 2 9 9 1 。大多数实验中s f e 的萃取效率和溶剂萃取 的效率相差不大。2 1 0g 研磨后的植物种子或是均一的样品在商品化的s f e 提 取器中利用超临界的c 0 2 进行萃取；c 0 2 的流速、压力、萃取温度和时间一般分 别设置为：2 2 5 0 0m lm i n 、5 0 0 0 1 2 0 0 0p s i