（基础兽医学专业论文）嗜热链球菌超浓缩培养及生物学变化规律.pdf

摘要 为建立嗜热链球菌超浓缩培养技术，本研究首先在基础培养基的基础上进行了主要营养 物质和增殖因子的筛选，确定了超浓缩培养基成分绢成，并采剧离- t l , 半连续法进行超浓缩培 养，同时研究了嗜热链球菌对培养基中糖、蛋白质和脂肪三人营养物质代谢规律，并采用电 子显微镜、t u n e l 染色和琼脂糖凝胶电泳对最，在超浓缩培养过程中不同时间超微结构变化 与细胞凋亡进行了研究，为嗜热链球菌超浓缩培养技术提供依据。 本研究确定了嗜热链球菌的增殖培养基及培养条件，增殖培养基为1 5 乳糖、o 2 5 葡 萄糖、1 5 大豆蛋白胨、1 o 的水解乳蛋白、15 酵母浸粉、3 5 盐溶液、0 1 5 维生素c 、 0 1 赖氨酸、o 0 5 谷氨酸、00 5 精氨酸、5 麦芽汁、5 西红柿汁：增殖方式确定为、r 连续法培养，利_ 【 j 离心二次培养，菌数最高达到10 3 2 1 0 1 0 c f u m l ，比在基础培养基中培养 高l o 倍，让明此方法对嗜热链球菌来说是1 f 常有效的超浓缩培养方法。 结果表明，嗜热链球菌在营养丰富的培养基中的生长延滞期缩短，刮达对数生长顶点的 时间变短，稳定期的时间王正艮，当经过二次培养后，嗜热链球菌几乎不经过延滞期直接到达 对数期，平稳期持续的时间较短，很快到达衰亡j c | 】；嗜热链球菌在超浓缩培养过祥中二火营 养物质的代谢规律也同它的培养过程有很大的关系，菌数多，其代谢旺盛，菌数降低其代谢 速度减慢：嗜热链球菌在超浓缩培养过程中存在着明显的菌体形态变化，并可能存在着细胞 凋亡，与菌体增殖和产酸规律密切相关，随着培养时间延长，培养基中营养物质变得贫乏， 菌体形态变化和细胞凋亡的情况愈加明显。 关键词嗜热链球菌；超浓缩培养；生化代谢规律：细胞凋亡：超微结构 东北农业大学农学硕1 屿。位论文 s u p e r c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o na n db i o l o g i c a l c h a n g e so fs t r e p t o c c u st h e r m o p h i l u s a b s t r a c t i no r d e rt od e v e l o pa s u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o nm e t h o do f s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s 晦0 ， t h er e s e a r c hw a sc o n d u c t e dt os c r e e nt h em a i nn u t r i t i v es u b s t a n c e sf i r s t l yo nt h eb a s i so fb a s i c m e d i u m ，a n dt h e nt os c r e e nt h em u l t i p l i c a t i o nf a c t o r s ( m f s ) ，a sar e s u l t t h ei n g r e d i e n t so f s u p e r - c o n c e n t r a t e d s u b s t r a t u mw e r ed e t e r m i n e d t h em e t a b o l i cr e g u l a r i t i e so f s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u so nt h en u t r i t i v es u b s t a n c e so fs a c c h a r i n e ，p r o t e i na n df a ti nt h ec u l t u r em e d i u ma n d t h e 北a n g e so fu l t r a - s t r u c t u r ea n dt h ea p o p t o s i sd u r i n gs u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o nw e r es r u d i 列 b ya p p l y i n gt h em e t h o do fc e n t r i f u g e - s e m i c o n t i n u o u sp r o c e s sa n db yt h es u p e rm i c r o s c o p e ， t u n e ls t a i n i n ga n da g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( a g e ) ，r e s p e c t i v e l y ，a n dt h er e s e a r c hp r o v i d e dt h e f o u n d a t i o nf o rt h es u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o nt e c h n i q u eo f s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i t u s i nt h ep a p e r ，t h ee n r i c h m e n tc u l t u r ef o r m u l ao fs t r e p t o c o c c z a t h e r t n o p h i t u sa n di t sc u l t u r a l c o n d i t i o nw e r ed e t e r m i n e d t h ec u l t u r em e d i u mc o n t a i n e dt h ef o l l o w i n gi n g r e d i e n t s ：15 l a c t o s e 0 2 5 g l u c o s e ，1 ，5 s o yp e p t o n e ，1 o l a c t o a l b u m i nh y d r o l y s a t e ，1 5 y e a s te x t r a c tp o w d e r , 3 5 s a l i n es o l u t i o n ，0 1 5 v i t a m i nc ，0 1 y s l n e ，0 0 5 g l u t a m a t e ，o 0 5 a r g i n i n e ，5 m a l t w o r ta n d5 t o m a t oe x t r a c t t h ee n r i c h m e n tp r o c e d u r ew a sf o l l o w e db ys e m i - c o n t i n u o u sa p p r o a c h a n dt h eb a c t e r i ac o u n tc o u l dr e a c hu pt o1 0 3 2 1 0 1 0 c f u m lb yt h ec u l t u r em e t h o do fs e c o n d a r y c e n t r i f u g a t i o n ，a b o u t1 0t i m e sh i g h e rt h a nt h eb a s a lc u l t u r em e t h o d ，a n di tw a sp r o v e dt ob eav e r y e f f e c t i v es u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o nm e t h o df o rs t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s i nc o n c l u s i o n ，t h el a gp h a s eo f s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sw a ss h o r t e ni nt h ee u t r o p h yc u l t u r e m e d i u m ，a n dt h et i m ea c h i e v i n gt h ec u l m i n a t e dp o i n to fl o g a r i t h m i cp h a s ew a ss h o r t e da l s o ，a tt h e s a m et i m e ，t h es t a t i o n a r yp h a s el e n g t h e n e d a f t e rs e c o n d a r yc u l t u r e ，s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i i u s r e a c h e dd i r e c t l yt h el o gp h a s eh a r d l yt h r o u g ht h el a gp h a s e ，a n dt h e nq u i c k l yr e a c h e dt h ed e c l i n e p h a s e t h e r ew e r em o r er e l a t i o n so ft h em e t a b o l i cr e g a l i t i e so ft h et h r e ek i n d so fn u t r i t i v e s u b s t a n c e sw i t ht h es u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o np r o c e s so f s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ：t h em o r e t h en u m b e ro f t h eb a c t e r i a ，t h eq u i c k e rt h em e t a b o l i n g ，w h i l et h ef e w e r , t h es l o w e rt h em e t a b o l i s m m o r e o v e r , t h e r ea p p a r e n t l ye x i s t e dm o r p h o l o g i cc h a n g e si nt h i sc o u r s e ，a n dt h e r em a y b ee x i s t e dt h e a p o p t o s i s ，w h i c hc o r r e l a t e dw i t hb a c t e r i ap r o p a g a t i o na n da c i dp r o d u c i n gw i t ht h ec u l t u r et i m e p o s t p o n e d ，t h en u t r i t i v es u b s t a n c e si nt h ec u l t u r em e d i u ml a c k e da l s o ，a n dt h em o r p h o l o g i cc h a n g e a n da p o p t o s i sa p p e a r e dm o r eo b v i o u s l y 【i k e y w o r d ss t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ，s u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o n ，m e t a b o l i cr e g u l a r i t y a p e p t o s i s ，u l t r a - s t r u c t u r e c a n d i d a t e ：y u a nx i a o h a n s p e c i a l i t y ：b a s i cv e t e r i n a r ys c i e n c e t u t o r ：a s s o c i a t ep r o f g a ox u e j u n 引言 1 引言 乳酸菌是一群能从可发酵性碳水化合物中产生人量乳酸的革兰氏刚性细菌的通称，广泛 存在于人、畜、禽肠道、许多食品、物料及少数临床样品中。乳酸菌不仅可以提高食品的营 养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且，近年来乳酸菌的特殊生理活性和 营养功能，正日盏引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、 保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆捌醇，控制内毒素，抑制肠道内腐 败菌生氏繁殖平l | 腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、 生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反戍、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应激 反戍等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。可以说，如果 乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌被广泛崩丁轻一r 业、食 品、医药及饲料， ：业等许多行业上。 1 1 乳酸菌的生物学特性 乳酸茵具有一些基本特征：细胞为革兰氏阳性：细胞形态呈球状或杆状；过氧化氢酶为 阴性；消耗的葡萄糖5 0 以上产生乳酸；不形成芽孢；不运动或极少运动；分解蛋白质，但 不产生腐败产物：脂肪分解能力较弱。 嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ，s f ) 特征为：形态为球形或卵形，直径小于 1 岬，一般成对或成链状生长；培养基利培养温度可影响其形态，在1 5 时不能生k ，在 4 5 c 时培养会增加不规则细胞的产生；大多数菌株在5 0 ( 2 下能够生民，在6 0 。cf 加热3 0 m i n 仍能存活；均为革兰氏阳性菌，无运动性，厌氧同型乳酸发酵，利用乳中的乳糖生产l ( + ) 型乳酸、乙醛和丁二酮；一些菌株能够产生胞外多糖( e x t r a c e l l u a r - p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) ， 维生素b 和一些氨基酸能够促进e p s 的产量；在弧甲基蓝存在的情况f ，或者在p h 9 6 时 不能生长：细胞肇的肽聚糖结构为l y s - a l a 2 3 ：目前还没有关丁血清学方面的免疫抗原 鉴定。 1 2 乳酸菌功能与应用 1 2 1 乳酸菌在食品中应用 1 1 2 1 1 乳酸菌在酸乳和干酪制品中的应用 利用乳酸菌发酵牛奶等乳制品，其历史是非常久远的。几个世纪以来这些发酵产物己发展 成为今天具有独特风味的千酪、酸牛奶、发酵稀奶油等发酵乳制品。发酵乳的产值已达到包括 酒精饮料在内的所有发酵制品的2 0 。在品种繁多的发酵乳制品中，以酸牛奶最为酱及。它具 有特殊的风味，是以乙醛作为主要特征风味组分的产品。酸乳的制造原理是：乳酸菌生长繁殖 发酵乳糖产生乳酸，使乳的p h 下降，使酪蛋白胶粒中的胶体磷酸钙变成可溶性磷酸钙，其稳 定性下降，促进了凝乳的形成。酪蛋白在等电点p h = 4 6 4 7 时产生沉淀胶凝作剧。 酸奶发酵荆是用于发酵酸奶的微生物菌种所组成的培养材料，是酸奶发酵的源头。嗜热链 球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 和保加利亚乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 是酸奶生产 中制各发酵剂的常用乳酸菌种( 炅荣荣，2 0 0 3 ) 。嗜热链球菌和保加利弧乳杆曲的相对比例通 常为1 ：1 。保加利弧乳杆菌与嗜热链球菌之间存在共生现象( m u t u a l i s m ) ：保加利亚乳杆菌由 于具有较强的蛋白水解活性可在发酵初期分解乳中酪蛋白而形成缬氨酸等氨基酸和多肽以促 进嗜热链球菌的生长；在嗜热链球菌生长过程中产生的甲酸能够刺激保加利弧乳杆菌生长( 顾 瑞霞，1 9 9 9 ) 。 干酪是在乳中( 也可用脱脂乳或稀奶油) 加入适量的乳酸菌发酵剂剌凝乳酶，使蛋白质凝 垌后，排除乳消，将凝块压成块而制成的产品。用于生产于酪的发酵剥随干酪种类而异，最土 要的菌种有乳酸链球菌、乳油链球菌( s t rc r e m o r i s ) 、干酪杆菌( c a s e i ) 、j 二酮链球菌( s t r d i a c e t i l a c t i s ) 、嗜酸乳杆菌( l a c i d o p h i l u s ) 等，通常选用其中两种以上的乳酸菌配成混合发 酵剂，加入杀菌乳中。利用这些乳酸菌发酵产生酸的目的，就是促进凝乳酶的作用，形成凝块， 使凝块收缩，容易排除乳清，在制造中及成熟时防止有害微生物的污染，使制品的形体及组织 状态良好，并且在成熟过程中调1 适于酶作阁的酸度，更由丁菌体内外的酶作用分解酪蛋白、 脂肪等使干酪成熟，产生风昧( 余焕玲，2 0 0 0 ) 。 1 2 1 - 2 乳酸菌在发酵香肠和泡菜中的应用 乳酸菌能将发酵香肠中的碳水化合物分解成乳酸，降低原料的p h 值是发酵荆的必需成 分，对产品质量的稳定性起决定作用。同发酵香肠一样在泡菜的发酵过群中也有多种乳酸茵 在同时起作用，乳酸发酵贯穿于泡菜的整个泡制过程。 利用乳酸菌的发酵作用，可将乳酸菌应用于多种发酵食品，如发酵蔬菜汁、发酵豆乳、发 酵冷冻乳等。还有一些乳酸菌生成物的利崩，对乳酸苗生成物的利用中，最普遍的莫过于绍菌 素。代表性的乳酸菌细菌素是乳酸链球菌肽( n i s i n ) 。它是一种很好的天然防腐剂，在较低 浓度下即可缓和杀菌条件，延长货架期。另一个是葡聚糖( d e x t r a n ) ，属于细胞外多糖( e p s ) 。 它具有生理活陛，有报告称它具有抗肿瘤活性。另外还有一种称为b i f i d i n 的抗菌物质，是a n a n d 等从两双歧杆菌的代谢物中分出的一种抗体，主要成分为苯丙氨酸和谷氯酸，对黄色微球菌和 金黄色葡萄球菌的繁殖均有抑制作用。因此加强对细菌素的研究和利h j ，使其更好地服务于人 类，也将是未来乳酸菌研究的一个方向。 1 2 2 乳酸菌在医药方面的应用 乳酸菌在体内发酵乳糖，产生人量的乳酸、乙酸等有机酸，使肠道内的p h 值降低。肠 内处于酸性环境，对沙门氏菌、变_ 形杆菌和大肠杆菌等致墒菌有明显的抑制作用：除致病菌 外，对肠内腐败菌抑制力也很强，酚、胺和靛基质等对机体有毒害作剧的腐败产物相应减少。 低p h 值有利丁肠道蠕动，维持i e 常生理功能，阻【l 病原菌的繁殖。近几年来临床常使用的 乳酸菌素片在治疗肠炎、调整消化力、延缓机体衰老、抗癌等方面深受好评。杨晨炜( 2 0 0 1 ) 应用乳酸菌素片治疗小儿腹泻8 7 例，并与庆大霉素 f f 疗的7 9 例作对照。结果显示，治疗组 总有效率( 8 5 1 ) 显著高于对f c 组( 6 7 1 ) ( p 0 叭) ，治愈时间( 2 7 4 - _ 0 2d ) 亦较对照 组( 3 8 4 - 0 3d ) 明显缩短( p a ，一酪蛋白和b 一酪蛋白 s i n g h 和s h a r m a ( 1 9 8 3 ) k 一酪蛋白和a 。一酪蛋白 8 一酪置 h e g a z i ( 1 9 8 7 ) 】，5 2 2 肽酶 酪蛋白首先在凝乳酶和蛋白酶的作用f 降解为大分子的肽类，在肽酶的继续作用r 产生小 分子的肽和氨基酸。大部分肽酶属于金属类酶类。柠檬酸和其它羧基酸影响肽酶的活力( o l s o n nf ，1 9 9 0 ) 。金属肽链内切酶是嗜热链球菌中被报道最多的内切酶，不过最近s h a h b a l 等f1 9 9 3 ) 在两种嗜热链球菌苗株中发现了另外的内切酶，这种内切酶雨j z6 的很相似，伉丁细胞肇上， 而且在c a c l 2 存在时会停【上分泌。 1 5 3 乳酸菌的脂类代谢 培养基中脂肪含量的减少或者脂肪酸含量的增加都是微生物对脂类代谢的结果。2 0 世纪 6 0 7 0 年代一些科学家在嗜热链球菌中发现了脂肪酶活性，这些酶都是由其作川底物命名的， 如丁酸甘油酯酶、甘油酯水解酶以及酯酶等。1 9 8 4 年r a o l l r e d d y 的研究发现，用嗜热链球菌 对全脂奶发酵，饱和脂肪酸和油酸含量有所增加、游离脂肪酸增加、亚油酸和麻酸减少、单 酸甘油酯完全消失。 乳酸菡产生的代谢产物，能为食品提供芳香风味雨f 良好质地，可防j e 乳、肉制品的腐败 变质，减少蔬菜利青贮饲料在发酵过程中的营养损火。抑制发酵食品中可能的病原菌的生长， 直垂长产品的货价期。 8 1 6 细菌的细胞凋亡 1 6 1 细胞凋亡的概念 有核细胞一方面存在受遗传控制的细胞分裂、增殖的功能，另一方面也具有使细胞主动 发生死亡的机制，即细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 哭称细胞群序性死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) 。 细胞凋亡的概念首先由英国k e r r 等丁1 9 7 2 年提出，h ；以描述一种在形态上有别y - 细胞坏死 的细胞死亡过程。组成机体的细胞不但需要不断地与环境进行物质、信息干能量的交换，而 且这些细胞本身也处在不断的更新中。这种更新是以细胞数量上的恒定为前提，因此是一种 动态平衡状态。显然，各种细胞数鼍上的稳定，不但保证了机体各组织器官具有形态学上的 稳定性，同时也是机体生理功能或内环境稳定的必要条件。冈此生命不仅需要细胞增殖，而 且还需要细胞夕e 亡。细胞凋亡的主要目的是清除一些不再需要的细胞：如变态时的蝌蚪尾部 细胞、雄性哺乳类的穆勒式管、9 5 的前淋巴细胞等。 】6 2 细菌细胞凋亡的机理 细菌是单细胞生物体，其死亡是如何发生的，国际上已经进行了“泛的研究。根据传统 观点，认为细菌不存在凋亡，但最近在人肠杆凶基冈组中发现了凋亡系统，而且住其他细菌 也可能存在。细菌凋亡系统的发现，表明细菌的死亡可能具有类似其他细胞的凋亡方式 ( e n g e l b e r g ，1 9 9 8 ；h a z a nr ，2 0 0 i ) 。 细菌的凋亡是由特殊的基闪介导，这些基因组成“沉溺摸块”( a d d i c t i o nm o d u l e s ) ，义称 为自杀模块( s u i c i d a l m o d u l e s ) ，它们存在丁质粒或前噬菌体中。m a r i a n o v s k v l ( 2 0 0 1 ) 发现 它们可在不良条件下( 如营养缺乏或抗生素存在) 触发，从而导致细菌培养中发生凋亡。每种 模块均由一对基冈组成，下游基因编码一个稳定的毒素，上游基阏编码一个不稳定但具有特异 性的抗毒素。例如人肠杆i 萄r 1 0 0 质粒i - n p e m 操纵子含有p e r ui ： l l p e mk 两个基冈；p e r ui 编 码抗毒索p e r uhp e mk 编码毒素p e r uk 。如细菌丢火了这些基因，则会冈为不稳定的抗霉素的 降解速度比稳定的致死毒素快而被选择性杀死。 1 6 3 细胞凋亡的检测 常h j 的细胞凋亡的检测方法有d n a 电泳、t l 肘e l 测定法、流式细胞分析等，它俐各有各 的特点，现介绢如卜：d n a 电泳。真核细胞发生凋亡时，d n a 发生特殊性的核小体间的断 裂，产生大小不等的片段。但都是1 8 0 2 0 0 b p 的整数倍。凋亡细胞中提取的d n a 在进行常规的 琼脂糖凝胶屯泳，并用澳化乙锭进行染色时，这些人小不同的d n a 片段就现出梯状条带。 绝大多数凋亡细胞中d n a 的断裂都表现出这种特征。 t u n e l 测定法，t u n e l 1 0 定法是 t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e ( t d t ) m e d i a t e ddu t pn i c ke n dl a b e l i n g 的缩写，意指 末端脱氧核苜酸转移酶介导的du t p 缺口末端标记测定法。这一方法能对d n a 分子中3 o h 断 裂缺口进行原f = 1 7 = 标记。凋亡的核d n a 产生的3 o h 末端，可借助一种可观测的标记物，如荧 光素进行原位标记，并j 【 荧光显微镜进行观察。流式细胞分析，最常h j 米分析细胞凋亡的流 式细胞技术是根据凋亡细胞d n a 断裂和丢失，碘化丙锭使d n a 产生激发荧光，川流式细胞仪 9 东北农业夫学农学顶十学位论文 检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状况。 1 7 研究的目的和意义 国外对微生物发酵剂的研究时间较早，新型发酵剂的研究始f 十九世纪末至_ = 十世纪初， 但真正商品化则经历了一个比较长的时间，大约在二十世纪五六十年代以后，才真正用丁大 规模工业化生产。商业化超浓缩乳酸菌发酵荆的生产始于1 9 6 3 年。到现在已经涌现出一批知 名的发酵剂制造商，如丹麦h a s e r 公司，法国r o d i a 公司、美国m a r s h e l l 公司和 m a u r i f o o d 公司、澳大利亚c s i r o 研究所、荷兰n i z o 研究所等，它们生产的发酵剂性 能优良、形态各异，遍布世界各地的乳品企业。如丹麦已有近百年的历史，法国、日本也有 几十年的历史。目前住乳品发酵荆方面，丹麦的h a s e r 实验室在研究和生产技术方面处于 世界领先地何。在乳酸苗技术领域，国际上的研究已超越了单纯改善发酵乳制品风味、口感 范围，更进一步地将传统科学与新技术平微生物学、化学、营养学很好地结合起来，比如利 用发酵剂或箍生菌的作用而得剑所需的特定成分，从而开发山高附加值的功能性乳制品。 我国在发酵乳方面与国外的差距巨人，基础研究方面不足以支撑新产品开发。迄今为止， 国内已有实验室制备超浓缩酸奶发酵剂技术的报道，如高松桕等( 1 9 9 1 ) 首7 父发表了高效嗜 酸乳杆菌发酵剂的研究报告，作者利州缓冲盐进行了嗜酸乳杆凶的培养，使培养基中的细胞 数达到6 ，5 1 0 9 个，m l 。刘字峰等( 1 9 9 5 ) 利用碳酸钙作为缓冲剂的脱脂乳培养酸奶发酵荆， 菌体浓度可达5 6 9 x 1 0 个r n l 。但超浓缩酸奶发酵刹的制备技术还不很完善，细胞存活率低， 保存时间短，特别是i ：业化生产技术还未开发出来，商业化超浓缩酸奶发酵剂在国内还没有 厂家能够生产。目前国内企业采用的发酵剂大多数是国外生产的，包括丹麦h a s e r 、法国 r o d i a 等几大品牌。我国尚无这方面的研究，而我国止在研制的类似产品尚术产业化。从长 远发展来看，国产发酵剂( 如直投式发酵剂) 的研究干开发势在必行。 本课题以法国r o d i a 公司的直投删e z a l m y 9 6 菌种中的嗜热链球菌为试验菌株，通 过对其培养基中的糖、蛋白质、氨基酸、维生素等进行了单冈素的筛选，找剑适台菌体人域 生长的增殖培养基及适合的培养条件，以适合产业化生产；并通过对超浓缩培养过样中的培 养基玄除代谤 产物进行二次培养研究进一步提高凶体浓度的方法；本试验还对培养基中的 糖、有机酸、蛋白质水解产物笛代谢产物进行分析，以确定其代谢规律对嗜热链球细胞凋 亡进行初步研究和对其超微结构变化进行初步观察，掌握其代谢规律，为嗜热链球曲的超浓 缩培养提供理论依据。 0 2 材料与方法 2 1 实验材料和主要仪器设备 2 1 1 菌种 嗜热链球菌( s t r e p t o c c u st h e r m o p h i l u s ，s ，) ，本实验室分离、鉴定千保藏。 2 1 2 材料与试剂 2 1 2 1 生化试剂 s d s 、溶菌酶、蛋白酶k 、n a c i 、c t a b 、氯仿、异戊醇、酚、乙醇、t e ( t r i s h c ie d t a ) ， 以上试剂均为分析纯，购自上海华舜。 乳糖、葡萄糖、蔗糖，北京化工厂；大豆蛋白胨、水解乳蛋白、蛋自胨、聚蛋向胨、酵 母提取物，北京奥博星生物技术责任有限公司：抗坏血酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，原天 津南开化j 二厂：b 一甘油磷酸二钠，瑞十分装：甘油，a m r e s c o 分装：琼脂粉，s i g m a 分装： 过氧化氢( 3 0 ) ，天津市化学试剂一厂：无水氯化钙，哈尔滨新春化一r 厂：七水硫酸镁、硫 酸锰、氢氧化钠，天津市化学试剂三厂；柠檬酸氢_ 二铵，天津市大河化学试剂厂：无水碳酸 钙、碳酸氢纳、乙酸钠、氯化钠，天津市化学试制一厂；3 ，5 一二硝基水杨酸，两吴精细化 工有限责任公司：l 谷氨酸，中国上海试剂二厂；精氨酸，瑞士分装；赖氨酸、缬氨酸，英 国分装；番茄汁( 自制) ；啤酒汁、麦芽汁，由青岛啤酒集团有限公司惠赠；磷鸽酸负染色液， 东北农业大学电镜中心制各。 2 1 2 2 试剂盒 乳酸测定试剂盒、乳酸脱氢酶测定试剂盒，总氨基酸测定试剂盒、蛋白质测定试剂盒、 脂肪酶测定试剂盒，南京建成生物 _ 程研究所；甘油二脂测定试剂盒、总胆吲醇测定试剂盒， 上海荣盛生物技术有限公司；荧光细胞凋亡试剂盒( i ns i r ec e l ld e a t hd e t e c t i o nk i t ，f l u o r e s c e i n ) ， 德国r o c h e r 公司。 2 1 2 3 培养基 计数培养基( m 1 7 ) ：大豆蛋白胨0 5 、聚蛋白胨0 5 、酵母浸粉o5 、维生索co 0 5 、b 一甘油磷酸二钠1 1 、l m o l l 七水硫酸镁0 1 、p h7 1 ，1 2 1 灭菌备川。 基础培养基：蛋白胨o 5 、水解乳蛋白0 5 、酵母漫粉1 0 、盐溶液4 、乳糖0 5 、葡萄糖0 5 ，1 2 1 灭菌备用。 改良增殖培养基：乳糖i 5 、葡萄糖0 2 5 、人豆篮自胨1 5 、水解乳蛋白1 0 、酵 母浸粉1 5 、盐溶液3 5 、维生素c0 15 、赖氨酸01 、谷氨酸o0 5 、精氦酸o 0 5 、 麦芽汁5 、州红柿汁5 ，、p h70 ，1 2 i 灭菌备h 。 盐溶液成分：无水碳酸钙0 2 9 、七水硫酸镁0 a 8 9 、磷酸氢二钾1 0 9 、磷酸二氢钾1 0g 、 碳酸氢纳1 0 9 、氯化钠2 9 。将无水碳酸钙和七水硫酸镁混合溶解y - 3 0 0 m l 蒸馏水中，再加 5 0 0 m l 水，一边搅拌一边缓慢加入其它盐类，继续搅拌直到全部溶解加2 0 0 m l 蒸馏水， 混合后贮备于4 c 。 2 1 _ 3 主要仪器设备 光学显微镜( y s 2 h ，n i k o n ) ；微波炉( m 9 8 8 8 ，三星) ；紫外可见分光光度计( u v - 2 1 0 2 p c 型，u n i c o ) ：涡旋仪( q l 8 6 1 ，麒麟医仪) ：立式白动电热压力蒸汽灭菌器( l d z x 一4 0 b i 型，上海申安医疗器械厂) ：电热恒温鼓风干燥箱( d h g 9 0 7 6 a 型，上海精宏实验设备有限 公司) ；超纯水器( m i l l i q ，m i l l i p o r e ) ；恒温振荡器( t h z c 型，江苏太仓实验设备厂) ：- 7 0 冰箱( u l t l 3 8 6 3 v 3 0 ，s a n y o ) ：台式离一t l , 机( t g l 1 6 g ，上海安亭科学仪器厂) ：超净工 作台( s w - c j i f d ，苏卅【安泰空气技术有限公司) ：荧光显微镜( i x 5 1 o l y m p u s ) ；电子显 微镜( j e m 1 2 0 0 e x 型，日本) ；数码相机( f i n ep i x 2 80 0 0 z o o m 型，索尼) ；恒温培养箱( d h 40 0 0 a 型，天津市泰斯特仪器有限公司) ；高压灭菌器( y x q 一2 8 0 m d 型，上海经济区沈荡 中新电器厂) ；屯泳仪( g e 1 0 0 ) ；凝胶成像系统( g d s 80 0 0 ) ：离心机( t g l 1 6 g ，上海 安亭科学仪器厂) 。 2 2 实验方法 2 2 1 活菌数测定方法 将培养基按1 0 倍梯度进行系列稀释，取0 1 m l 以计数培养基y - 3 76 c 培养4 8 h ，每一稀 释度重复3 次，计数培养基活菌数( c f u m l ) 。 2 _ 2 2p h 值测定方法 采用s a r t o r i u s 标准型p h 计直接测定培养基p h 值。 2 _ 2 3 营养物质的单因素试验 2 2 3 1 糖类的单因素筛选 选择的糖类有乳糖、葡萄糖、蔗糖等，将它”j 以1 的龄分别添入基础培养基中，经灭 菌相席接入1 的s f ，4 2 培养4 8 h ，每隔8 h 测定p h 值及菌数，选择对促进sr 生k 影响 最大的糖类。 2 2 3 2 不同浓度乳糖、葡萄糖的完全交叉试验 以糖类筛选结果为基础，选出两个需要细分的冈素( 葡萄糖 h - ? l 糖) ，分别取3 个水平， 进行完全交义试验。乳糖选择0 5 、1 o 、15 3 个浓度，葡萄糖选择o 2 5 、0 5 、o 7 5 3 个浓度，每隔8 h 测定菌数及p h 值，选取对s f 生k 影响最大的复合糖组成水平。 2 2 3 _ 3 蛋白质的单因素筛选 本实验选用蛋白胨、水解乳蛋白、大豆蛋白胨，将它们以1 的嚣分别添入前面筛选的 培养基中，经灭菌相应接入1 的s t ，4 2 。c 培养4 8 h ，每隔8 h 测定p h 值及菌数，选扦对& ， 生长影响最大的蛋白种类。 2 2 3 4 不同浓度水解乳蛋白、大豆蛋白胨的完全交叉试验 以蛋白筛选的实验结果为基础，选出两个需要细分的冈索( 水解乳蛋白和人豆蛋白胨) ， 分别取3 个水平，进行完全交义试验。二者同时选扦0 5 、10 、1 5 的量进行试验。每 2 隔8 h 测定其菌数及p h 值，共测定6 个时间段。选抒对f 生长影响最大的蛋白茸。 2 2 3 5 酵母浸粉浓度的筛选 分别采用浓度为0 5 、i 0 、1 5 、2 o l i2 5 的酵母浸粉代替基础培养基中的酵 母浸粉，在4 2 。c 培养4 8 h ，每隔8 h 测定菌数及p h 值，选择对& ，生长影响最大的酵母浸粉 浓度。 2 2 3 ，6 盐溶液浓度的筛选 分蜘采用浓度为3 o 、3 5 、4 0d 、4 5 雨j50 的盐溶液代替基础培养基中的盐溶 液，在4 2 培养4 8 h ，每隔8 h 测定其菌数及p h 值，选择对工f 生长影响展大的盐溶液浓度。 2 2 3 ，7 维生素c 浓度的筛选 选择o 0 5 、0 1 、01 5 、o 2 雨0 2 5 5 个浓度的维生素c 培养s ，分别取3 个平 行在4 2 培养2 4 h 每隔4 h 测定p h 值及茁数，选择对sr 生长影响最大的浓度。 2 2 3 8 氨基酸对sr 培养的研究 选择谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和缬氨酸进行l 9 ( 4 ) 止交试验，这儿个因素的水平均设 定为0 、o 0 5 、0 1 ，兆9 组试验，每组3 个平行，4 2 。c 培养2 4 h 每4 h 测定其p h 值及 菌数。正交试验设计如下： 表2 - 1 各种氨基酸的止交试验设计 t a b l e 2 - 1o r t h o g o n a ld e s i g no f a m i n oa c i d s 2 2 3 9 天然营养因子的筛选 选择两红柿汁、啤酒汁平i l 麦芽汁进行l 9 ( 33 ) 正交试验，两红柿汁和啤酒汁的3 个水平 设定均为0 、5 、7 5 ；麦芽汁的3 个水平设定为0 、2 5 、5 ，共9 组试验，每组3 个 平行，4 2 c 培养2 4 h 每4 h 测定其p h 值及【嵩数。止交试验设计如r ： 表2 2 天然营养冈子止交试验设计 t a b l e 2 - 2o r t h o g o n a d e s i g no fn a t u r a ln e u r o t r o p h i cf a c t o r s 2 2 3 1 0 超浓缩培养基中增殖因子的最佳组合试验 根据以上因素筛选的结果，确定工，的优化培养基，肝确定工，在此培养基中的生殴曲线。 培养条件：4 2 。c ，2 4 h 。 2 2 4 半连续培养 将1 的最，接入灭菌的增殖培养基中，4 2 。c 培养 o h ，然斤无曲低温离心( 30 0 0 r m i n ) 1 0 r a i n ，再用等量新鲜培养基替换原培养基，将菌体继续培养8h ，每隔2 h 测定培养基中的 活菌数及p h 值。 2 2 5 超浓缩培养过程中生化代谢规律的分析 2 2 5 1 培养基中总糖含量变化分析 培养基中总糖含量变化分析采i 【 j3 ，5 一_ 二硝基水杨酸比色法( 黄洁，2 0 0 1 ) ，具体步骤如。f ： 工作曲线的绘制：分别取标准葡萄糖( 还原糖) 标定液0 m l o 4 m l ，o8 m l ，12 m l 1 ，6 r n l ，2 0 m l 丁2 5 m l 容量瓶中，分别补加水至2 0 m l 。各加入3 ，5 _ 二硝基水杨酸试剂2 m l ， 在沸水中煮5 m i n ，立即冷却用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用紫外分光测试仪，在波l 受为 5 5 0 n m 处测其吸光值，绘制标准曲线。 样液a 中还原糖的测定：估计样液a 中还原糖的含茸，称取w g 的a 液并稀释a 倍，取 此稀释液2 0 m l 置于2 5 m l 容量瓶中，按照上述绘制标准曲线的步骤测其吸光度，并由还原 糖工作曲线查得样品中的还原糖量g m g ，再由f 式计算样品中还原糖的含量： 还原糖含量( m g m l ) = g a 2 式中：a ，稀释倍数：g ，还原糖鼍( m g ) 2 2 ，5 2 培养基中蛋白质含量变化分析 取样：在s r 浓缩培养过程中每隔2 h 取一次样，每样3 个平行，丁室温、40 0 0r r a i n 离 心1 5 m i n ，取l m l 上清液作为测定样。 蛋白质定鼍测定，按试剂盒说明操作，具体过程按r 表 泥匀，3 7 。c 水浴1 0 0 m i n ，流水冷却后，波长5 4 0 n m ，光径l c m ，空白管凋零测各管 吸光度( o d ) 值。 计算公式：蛋白含鼙( m g m l ) = ( 测定管o d 值标准管o d 值) 蚩白标准浓度( m g m l ) 总氨基酸测定，按试剂盎说明操作，具体过程按f 表： 混匀，35 0 0r m i n 离心1 0 r a i n ，取上清液于6 2 0 n m 处，l c m 光径，空白管调零，比色 测定各管吸光度。 计算公式：总氨基酸含量2 裂墓善；筹器氨基酸标准液的浓度样品测试前稀释倍数。 2 2 5 3 培养基中脂肪含量变化的分析 取样：在s f 浓缩培养过程中每隔2 h 取一次样，每样3 个平行于室温、40 0 0r m i n 离 心15 m i n 取l m l 上清液作为脂肪含量测定样，沉淀作为脂肪酶活性测定样。 1 脂肪含量测定，按试剂盒上的说明操作，具体过程按下表： 充分混匀，3 7 水浴1 0o m i n 。在波氏为5 0 0 n m 处，以空白管( b ) 调零，读取校准管 ( c a l ) 及样品管( s ) 的吸光度( 爿) 值。 计算斌甘蚓删2 溅2 0 。 甘油三脂( m m o l l ) = m g d l 0 0 11 3 2 脂肪酶测定，按试剂盒说明操作，具体过程如f ： 将分光光度计丁4 2 0 n m 处以t r i s 缓冲液凋零；在待测试管中加入4 m l 底物缓冲液， 编号并放入3 7 。c 浴温5 m i n ；往相应编号以装有底物缓冲液的试管中加入o 0 5 m l 样本，迅 速用冰箱保鲜膜盖住管口再用拇指摁住，立刻颠倒混合5 次；迅速倒入比色皿中在分光 光度计4 2 0 r i m 处比浊，读取吸光