（作物遗传育种专业论文）食荚豌豆雄性不育的遗传研究及生理生化分析.pdf

摘要 本文对国内首例食荚豌豆雄性不育突变体的不育度、遗传特点、稳定性及雌性育性进行研究， 并从植物激素和同工酶的角度对雄性不育机理予以初步分析，结果表明： 该雄性不育突变体的不育性是可以遗传的，属隐性单基因控制的核不育类型，与细胞质遗传 物质无关。用1 2 一k i 染色后，镜检花粉的可染性，发现不育株的花药内没有花粉粒，败育彻底， 为典型的“无花粉型”雄性不育。在不同年份、不同季节下，不育性状表现稳定。同可育株相比， 不育株的雌性育性正常。 利用该不育突变体选育出了育性稳定的核不育两用系9 3 0 0 2 a b 。该两用系的生育期为9 2 天， 株高9 8 3 厘米，1 2 - 1 3 节位现蕾，1 - 3 个有效分枝，白花，圆荚，无限生长习性。种子绿色皱粒， 百粒重3 0 4 9 克。 利用间接酶联免疫法( e u s a ) 对两用系9 3 0 0 2 a b 中不育株与可育株不同发育时期的花蕾和 叶片进行植物激素的检测，发现不育株花蕾和叶片中1 a a 、g a 3 、i p a 和a b a 含量的变化与可育 株有所不同。不育株花蕾的i a a 和i p a 含量在发育前期低于可育株，g a a 和a b a 在整个发育过 程中均高于可育抹，叶片中4 种植物激素含量的变化与花蕾基本一致。 莽j 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法( p a g e ) 对两用系9 3 0 0 2 a b 中不育株与可育株花蕾的雄蕊、雌 蕊、花瓣和花萼以及叶片进行过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( o 盯) 、酯酶( e s t ) 和过氧化 物歧化酶( s o d ) 同工酶分析。4 种酶的同工酶谱在不育株与可育株花蕾间有着明显差异，同可 育株相比，不育株花蕾c a t 同工酶的酶带数多，e s t 同工酶的酶带数少且活性较低，p o d 和s o d 同工酶的酶带数相同但话性较高，这种差异在雄蕊上尤为明显。4 种酶的同工酶谱在叶片问无显 著差异。 关键词：食英豌豆雄性不育，遗传规律，植物激素，同工酶 a b s t r a c t t h i sp a p e rw a sc a r r i e do ni no r d e rt os t u d yg e n e t i cc h a r a c t e r i s t i co ft h em a l es t e r i l em u t a n to fs u g a rp e a 僻s a t i v u ml v a t m a c r o c a r p o ns e r ) a n da n a l y s ei t sm a l es t e r i l em e c h a n i s mf r o mt w op o i n t so n p h y t o h o r m o n ea n di s o e n z y m e t h er e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s ： t h em a l es t e r i l ec h a r a c t e ro ft h i sm u t a n tw a sh e r i t a b l ea n dd u et oag e n i er e c e s s i v eg e n e w i t ht h e e x c e p t i o no fi t sa n t h e r sb e i n gl i g h t l yy e l l o wa n dh a l f - t r a n s p a r e n ta n dc o m p l e t e l yl a c ko fp o l l e n s ，i t s a p p e a r a n c ew a ss i m i l a rt ot h a to fn o r m a lf e r t i l ep l a n t t h i ss t e r i l i t yw a ss t a b l ei nd i f f e r e n ty e a r sa n d s e a s o n s t h e r ew a su os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h ef e m a l ef e r t i l i t yo ft h em a l es t e r i l ep l a n t sa n d l h a to ft h en o r m a lf e r t i l eo n e s g e n i cm a l es t e r i l el i n e9 3 0 0 2 a bw h o s ef e r t i l i t yw a ss t a b l eh a db e e nd e v e l o p e db ym e a n so ft h i s m a t es t e r i l em u t a n ti ns u g a rp e a i t sg r o w i n gt i m ei sn i n e t y - t w od a y s ，a n dp l a n th e i g h ti s9 8 3 c m ，a n d f i r s tf l o w e rb u de m e r g e sf r o mt h et w e l f t ho rt h i r t e e nn o d e ，a n du s e f u lb r a n c hi s1t o3 a n df l o w e r sa r e w h i t e ，a n dp o d sa r er o u n d ，a n dg r o w t hi si n f n i t e ，a n ds e e d sw e r eg r e e na n dm g a t e ，a n dw e i g h to fa h u n d r e do fs e e d si s3 0 4 9g r a m t h ec o n t e n to fe a c ho ff o u rp h y t o h o r m o n e st h a ti n c l u d e di a a ，g a 3 ，i p aa n da b aw a sm e a s u r e di n f l o w e r sa n dl e a v e so ft h em a l es t e r i l ea n df e r t i l ep l a n t so fs u g a rp e aa td i f f e r e n td e v e l o p i n gs t a g e sb yt h e m e a n so fe l i s a ( e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b a n t a s s a y s ) t h ec h a n g e o ft h ec o n t e n to fe v e r y p h y t o h o r m o n ei nf l o w e r sa n dl e a v e so ft h es t e r i l ew a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tf r o mt h a to ft h ef e r t i l e t h e c o n t e n to f1 a aa n dt h a to fi p ai nf l o w e rb u d so fs t e r i l ep l a n t sw e r el o w e rt h a nt h a to ff e r t i l eo n e sa t e a r l yd e v e l o p i n gs t a g e ，a n dt h ec o n t e n to fg a 3a n dt h a to fa b aw e r eh i g h e ra te v e r yd e v e l o p i n gs t a g e t h ee v e r yc h a n g eo f p h y t o h o r r n o n a lc o n t e n ti nl e a v e sw a ss i m i l a rt ot h a ti nb u d s b ym e a n so fp a g e ( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ，f o u rk i n d so fi s o e n z y m e s ，w h i c h i n c l u d e dp e r o x i d a s e ( p o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) , e s t e r a s ef e s a 3a n ds u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) w e r e a n a l y z e di nt h es t a m e n ，p i s t i l ，p e t a l ，c a l y xa n dl e a v e so ft h em a l es t e r i l ea n df e r t i l ep l a n t so fs u g a rp e a m o r ec a ti s o e n z y m eb a n d s ，a n dl e s se s ti s o e n z y m eb a n d sa n dl o w e ra c t i v i t y , a n dh i g h e rp o da n d s o da c t i v i t yw e r eo b s e r v e di nt h es t a m e n ，p i s t i l ，p e t a la n dc a l y xo ft h em a l es t e r i l ep l a n t st h a nt h a to f t h ef e r t i l eo n e s ，e s p e c i a l l yi ns t a m c n t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h el e a v e so ft h em a l e s t e r i l ep l a n t sa n dt h o s eo ft h er e v i l eo b c si nt h ei s o a n z y m o g r a m so ff o u re n z y m e s k e yw o r d s ：s u g a rp e a 但s a t i v u r alv a r m a c r o c a r p o n & ) ，m a l es t e r i l i t y , l a wo fh e r e d i t y , p h y t o h o r m o n e s ，l s o e n z y m e s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 彳u 易、? 之 时间：一“j - 年，月，8 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： u易、，志： 时问：一州年j 月，$ 1 3 导师签名： 时间：年月日 1 1 雄性不育的概述 第一章文献综述 雄性不育是指植物在有性繁殖过程中不自e 产生正常的花药、花粉或雄配子的一种遗传现象。 雄性不育与雄性可育构成了雄性育性的一对相对性状。 早在1 7 6 3 年，k o l r e u t e r 就观察到了雄性不育现象。1 8 7 6 年c o l e m a n 酋先引入“植物雄性不 育”这一概念。雄性不育现象在植物界中十分普遍，据k a u l ( 1 9 8 8 ) 报道，已在4 3 个科、1 6 2 个属、3 2 0 种植物中发现了6 1 7 例雄性不育。 s e a r s ( 1 9 4 7 ) 将可遗传的雄性不育划分为3 类，即细胞质不育型、细胞核不育型和质核互作 不育型，即“三型学说”。后来，e d w a r d s o n ( 1 9 5 6 ) 将“三型学说”修改为“二型学说”，即核 不育型和质核互作不育型两类。核不育型是指雄性不育性由细施核不育基困控铋，不受细胞质影 响。质核互作不育型是指雄性不育性由细胞核不育基因和细胞质不育基因相互作用产生的。为了 与细胞核雄性不育( g e n i cm a l es t e r i l i t y , g m s ) 相对应，质核互作不育又称为细胞质雄性不育 ( c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y , c m s ) 。 利用杂种优势可以提高作物产量，优化作物品质，但大多数植物为雌雄同株或白花受粉，若 要利用杂种优势，需先去除雄蕊。雄性不育的存在，可以免去杂交制种中人工去雄的麻烦，而且 可以提高杂交种的纯度。此外，雄性不育还既是作物进行轮回选择和群体改良的重要工具，又是 研究花粉发育、细胞质遗传和质核互作的重要材料。 1 2 雄性不育的细胞学基础 1 2 1 花粉发育过程 孢原细胞期花药横切面的晟外面是一层表皮，表皮以内有几个较大的细胞，即孢原细胞。 孢原细胞经平周分裂外侧形成初生壁细胞，内侧形成初生造孢细胞。 小孢子母细胞期初生壁细胞经过平周和垂周分裂形成两个次生壁细胞，内层的次生壁细胞 分化成为绒毡层而外层的再经过一次垂周分裂，分化成为药室内壁和中层，与此同时，初生造 孢细胞分化成为小孢子母细胞，随后小孢子母细胞表面因沉积胼胝质而彼此分离。 减数分裂期小孢子母细胞开始减数分裂，此时小孢子母细胞体积较大，绒毡层可以看见二 核。 四分体期小孢子母细胞减数分裂形成的四个小孢子累在一起，每个四分体小孢子有一个染 色深且体积较大的核。 小孢子释放期刚从四分体分离出来的小孢子呈现圆形，细胞核较大。 小孢子液泡化期这个时期的小孢子具有一个较大的液泡，小孢子呈现不规则形状。 小孢予成熟期由于小孢子体积增长和液泡化细胞核由中央移到另一侧，整个小孢予染色 深，三沟萌发孔明显，绒毡层解体。 花粉粒成熟期小孢子经有丝分裂形成两个子核，其中一个形成生殖细胞，另一个形成营养 细胞，三沟萌发孔消失，染色变浅，形成成熟花粉。此时绒毡层完全解体，只剩下表皮和纤维 层，相邻两个孢予囊的隔壁解体破裂，为花粉的散开打开通道。 1 2 2 雄性败育的主要时期 g o r m a n 和m c c o r m i c k ( 1 9 9 7 ) 研究表明，番茄各个时期败育的n m s 突变体比例大体相等。 p a l m e r ( 1 9 9 2 ) 对2 6 个玉米n m s 突变体进行细胞学研究，结果显示从造孢细胞至二核花粉阶段 各时期均可发生败育。l a s e r 和l e r s t e n ( 1 9 7 2 ) 对1 3 个科3 8 种植物的6 2 例c m s 类型花粉败育 时期进行统计，结果表明四分体时期以后败育的比例达7 0 。g o t t a s c h a l k 和k a u l ( 1 9 7 4 ) 对1 2 个科4 8 种植物的9 9 例n m s 类型花粉败育时期进行统计，结果表明四分体时期以后败育的比例 达到8 5 。 1 2 3 雄性败育的过程 孢原细胞退化据冯纯大等( 1 9 9 8 ) 观察，在棉花某些突变体中，发育早期孢原细胞尚未成 熟就己发生解体，只能偶尔形成少数花粉母细胞，有些能形成正常的孢原细胞，但孢原细胞不能 发育形成正常的花粉母细胞，或者是形成的花粉母细胞发生粘连，细胞液泡化，核结构破坏，核 仁、染色体与胞质凝结成团。刘金兰等( 1 9 9 4 ) 观察发现，棉花洞a 核雄性不育株花粉发育的整 个过程中都会发生败育，最早出现在现蕾后第五天的花粉母细胞。 减数分裂异常据杨光圣等( 1 9 9 9 ) 报道，甘蓝型油菜宜3 a 在减数分裂期部分花粉母细胞并 不分裂，或分裂但出现染色体桥，三极或多极纺缍体，染色体结成团块不均等地集中在各个极中， 不能形成或形成不规则的二分体或四分体，或形成鲍二分体或四分体互相之间发生粘连，无观显 细胞壁，导致细胞壁形成不完整。a a r t s 等( 1 9 9 3 ) 研究发现，大白菜不育系的绒毡层细胞异常 伸长，向内挤压小孢子母细胞，使减数分裂不能进行或能进行但不能形成正常的四分小孢子。 小孢予败育汤泽生等( 1 9 8 1 ) 在棉花洞a 中发现小孢子细胞质发育缓慢，不饱满或停滞， 多数核不能再分裂。季良越等( 1 9 9 7 ) 在玉米核雄性不育小孢子败育的细胞学研究中发现，m s 2 突交体的小孢子在幼小孢子期至中小孢子期敢育，小孢子从四分体释放后细胞器基本正常，绒毡 层异常，小孢子外壁上始终没有孢粉素沉积，不能形成外壁结构。 1 2 4 绒毡层与雄性不育 绒毡层是花药壁的最内层，它包围着花粉母细胞或小孢子。在花粉形成和发育中起着很重要 的作用。在雄性不育花药的细胞学研究中常常发现绒毡层发育和行为的异常( k a u l ，1 9 9 8 ) 。据 w a r m k e 等( 1 9 9 8 ) 观察，玉米可育系花粉绒毯层细胞中线粒体数目从前胼胝质期开始显著增加， 最终达到其体细胞的4 0 倍，在t - c m s 系未见增加，而是自单核期开始不育系绒毡层线粒体膨大 解体。季良越等( 1 9 9 7 ) 在对玉米不育系的研究中发现，绒毡层从花粉母细胞减数分裂开始就出 现异常，至幼小孢子期表现出质体、线粒体退化，内质网细而少，看不到高尔基体，细胞质内出 现大量有脂类沉积的囊泡结构。m a r i a n i 等( 1 9 9 0 ) 将核酸酶基因与从烟草中分离的只在绒毡层 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 细胞中专一表达的1 5 k b t a 2 9 基因启动子构建嵌合基因，导入烟草和油菜，得到雄性不育转基因 植株，雄性不育转基因植株出除了花药皱缩变褐，绒毡层和花粉囊解体，没有可见的小孢子外， 其他组织与未转化植株相同，这表明在花药发育过程中有选择地破坏绒毡层，会阻碍花粉的发育。 由此可见，绒毡层发育和行为的正常是花粉正常发育所必需的。 1 3 雄性不育的遗传学基础 1 3 1 雄性不育的经典遗传学研究 显性不育和隐性不育根据不育基因与对应的可育基因之间的显隐性关系，细胞核雄性不育 可分为隐性核不育和显性核不育。1 9 2 1 年e y s t e r 在玉米中发现了隐性核不育，其与任何可育材料 的杂交一代( r ) 均是正常可育的，因此，任何育性正常材料都是其恢复系，但找不到相应的保 持系，它只能从f ，的自交后代中分离得到不育株，或通过f l 与不育株回交得到。由于隐性核不 育难以保持，生产上应用较少。植物显性核不育是1 9 1 0 年s a l a m a n 在马铃薯中首先发现的。到 1 9 9 1 年，已在小麦、水稻、棉花等2 0 个种中发现或人工诱变产生了3 5 个显性核不育突变体( 孟 金陵，1 9 9 7 ) 。由于难于找到恢复系，显性核不育在生产上应用得也很少。据k a u l ( 1 9 8 8 ) 统计， 在已发现的核不育现象，隐性核不育占8 8 ，显性核不育仅占1 0 。对于一对基因控制的不育性 状，隐性核不育的遗传特点是：1 ) 不育株自交不结实；2 ) 与正常可育株杂交。后代全部可育； 3 ) 杂合体自交育性分离，可育株与不育栋的分离比率为3 ：1 ( 汤泽生等，1 9 8 1 ) 。显性核不育的 遗传特点是：1 ) 不育株自交不结实；2 ) 与可育株杂交，后代育性分离，可育株与不育株的分离 比率为1 ：1 ；3 ) 可育株自交后代育性没有分离；4 ) 育性没有中间类型；5 ) 多代回交不能改变上 述情况( 邴景扬等，1 9 8 2 ) 。 孢子体不育和配子体不育根据杂交一代( f j ) 的表现，细胞质雄性不育可分为孢于体不育 和配子体不育两种类型( 李泽炳，1 9 8 0 ) 。孢子体不育的主要特征是：在与恢复系杂交时，f ，的 花粉全部可育，其不育性是受母体即孢子体的基因型控制，花粉正常发育所需的物质一一蛋白质 由孢子体产生，经绒毡层营养细胞提供给花粉生长发育所用。由于r 的遗传中有可育因子f ，所 以它能产生提供花粉进行生长发育的物质，遗传型为s ( f ) 及s ( f ) 的花粉都能正常的生长发 育，而不产生育性分离。f 2 产生遗传型为s ( ff ) 的孢子体，其花粉表现不育，产生育性分离现 象，可育株与不育株的分离比例为3 ：1 ，所以此类不育系的f 2 难于在生产上应用。配子体不育的 主要特征是：在与恢复系杂交时，f 1 的可弯花粉率为5 0 ，自交结实率在8 0 9 o 以上，f 2 中全可育 花粉的植株及半可育花粉的植株约各占半，自交结实也正常未出现不育株，这种类型的不育 性是由配子本身的遗传型所控制，不受孢子体控制。不育性的表现孢子体虽有可育因子f ，但质 核双方都不能为基因型为s ( f ) 的花粉合成其发育所必需的某种或某些酶，致使花粉不能正常发 育，因此不育花粉在f 。就分离出来。不具育性的花粉在f l 被淘汰，故f 2 不出现育性分离，可班 在生产上应用。水稻野败型( w ) 属孢子体不育，红莲型( h l ) 和包台型( b t ) 属配子体不育。 单基因不育和多基因不育王山荭和刘秉华( 1 9 9 8 ) 提出了对于隐性核不育材料可根据姊妹 交后代的育性表现来计算控制育性基因的数目。即： 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 可育株：不育株= 2 ”：1 ( n = 1 ) 可育株：不育株= c 。( 卜2 1 ) ( 2 一1 ) ”1 ：c 。2 ”( 2 “- 1 _ 1 ) ( n 2 ) m 表示不育基因对数：n 表示姊妹交次数 但在实际工作中，确定涉及的核育性基因数目时并不这样简单。水稻野败型细胞质雄性不育性， 不同的研究者，其研究结果不尽相同。多数研究者认为由2 对隐性基因控制，在恢复系中有相应 的恢复基因( 傅爱军等，1 9 8 8 ) 。有的学者认为是由1 对隐性基因控制，还有一些学者认为是数 量性状的遗传( 刘俊等，1 9 9 8 ) 。分析其中的原因，至少与下列三方面的因素有关：1 ) 雄性育 性的表达受生境条件影响，生长环境不适合可能模糊可育与不育之间的界线，产生部分可育、部 分不育的植株，使分类困难( t r a c y 等1 9 9 1 ) ：2 ) 育性指标的选择和育性标准的划分问题，不 育与可育有一个“度”的问题，“度”不同，结论可能迥然不同( 傅爱军等，1 9 8 8 ) ：3 ) 核遗传 背景问题，遗传背景的差异可能造成育性恢复修饰基因如温度敏感基因及育性增强基因的差异 ( 王学德等，1 9 9 7 ) 。 1 3 2 雄性不育的分子遗传学研究 细胞核雄性不育的分子机制有关细胞核雄性不育的分子机制的研究，上个世纪9 0 年代以前 国内外报导都很少。直到1 9 9 2 年，b e d i n g e r 等才对核不育基因进行研究，随着r f l p 和以p r c 为基础的分子标记技术的出现，细胞核雄性不育基因的定位和克隆工作取得了较大的进展。在不 育基因的定位上，z h a n g 等( 1 9 9 4 ) 利用r f l p 技术，将水稻籼型不育缰台 3 2 0 0 1 s 明恢6 3 ) 的2 个光敏不育基因分别定位于第3 和第7 染色体上。王风平等( 1 9 9 6 ) 利用r a p d 技术进一步 证实3 2 0 0 1 s 等第7 染色体上存在不育基因且来自农垦5 8 s 。a l b e r t s e n 等( 1 9 9 3 ) 利用r f l p 技 术把玉米的核不育基因m s 3 0 定位于4 l 染色体上。t r i m e l l 等( 1 9 9 8 ) 也用r f l p 技术将m s 3 0 和 m s 3 1 两个不育基因定位于2 l 染色体上。在不育基因克隆上，拟南芥的m s 2 基因是第一个运用转 座子标签法克隆的雄性不育基因( a a r t s 等，1 9 9 3 ) 并用该法克隆了玉米的m s 4 5 雄性不育基因 ( a l b e r t s e n 等，1 9 9 3 ) 。 细胞质雄性不育的分子机制关于细胞质雄性不育发生机制的研究绝大多数集中在细胞质基 因组载体一一线粒体( m t ) 和叶绿体( c p ) 上。大量研究表明，线粒体基因缀与细胞质雄性不育 关系密切，而与叶绿体基因组关系不大( 刘俊等，1 9 9 8 ) 。l e v i n g s 和p r i n g ( 1 9 7 6 ) 首次利用多 种限制性内切酶消化玉米正常胞质和t 型的m t d n a ，发现两者的酶切图谱存在明显差异，因而提 出线粒体与细胞质雄性不育有关的观点。t - c m s 玉米的线粒体基因t - u r f l 3 编码着一条1 3k d 的 多肽u r f l 3 ，u r f l 3 蛋白质直接或间接地增加了玉米对真菌的敏感性并且影响花粉的发育 ( d e w a y 等t1 9 8 6 ) 。对向且葵可育与c m s 花药m t d n a 的组成与表达进行比较研究发现，其 m t d n a 的差异在于编码f l 的a t p 酶n 一亚基( a t p a ) 的3 端。序列分析表明，不育花药m t d n a 的a p t a 编码区下游发生了包括倒位与插入的重摊。这种重排产生了一个新的开放可读框( o f f ) ， 这个可读框可与a t p a 共转录，产生一种1 5k d 蛋白质。这表明雄性不育性与a t p a 基因重排所产 生的新o f f 以及其编码1 5k d 蛋白质存在密切关系( l a v e r 等，1 9 9 1 ) 。j o h n s 等( 1 9 9 2 ) 发现菜豆 的c m s 与线粒体上被称为p v s 的3 k b 特异序列有关。p v s 序列至少存在两个o f f , 分别编码1 0 9 k d 和2 6 7k d 的蛋白质。j o h n s 等对含p v s 序列的区域作了d n a 的限制性图谱和d n a 测序， 4 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 但文章中未指出p v s 序列影响c m s 的机理。在矮牵牛的m t d n a 中p c f 序列和其c m s 紧密相关， 花药中p c f 的转录频率是叶中4 _ 5 倍( y o n g 等，1 9 8 7 ) 。许仁林等( 1 9 9 5 ) 应用a p - p c r 技术从 水稻w a 型雄性不育系的m t d n a 中得到一个特异的扩增片段r 2 6 3 0 w a ，并证明了r 2 6 3 0 w a 的确与雄性不育系密切相关。对r 2 6 3 0 w a 片段的序列分析发现，该序列中含有一个由2 0 个氨 基酸残基组成的短肽的编码区域，此序列中含有一个长1 0b p 的小反向重复序列 5 - a c c a t a t g g t - 3 ，这个反向重复序列可能是水稻m t d n a 发生分子内或分子问重组的一个热 点部位。至于其功能如何，有待于进一步研究。 1 4 雄性不育与植物激素 生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、脱落酸和乙烯等五种内源激素在植物组织内普遍存在， 它们既是代谢反应的产物，又参与了植物生长发育中几乎所有生理过程的调节。植物激素对雄性 育性也同样起着重要的调节作用。 1 4 1 生长素与雄性不育 促进植物维譬束发育是生长素的重要生理作用之一，植物体中的生长素类物质以吲哚乙酸 ( i a a ) 最为普遍。i a a 含量高的组织和器官是营养物质输入的“库”，花药中i a a 严重亏缺， 就会使得营养物质输入不足，引起小孢子发育异常和败育，导致雄性不育( 黄厚哲等，1 9 8 4 ) 。 玉米( 夏涛等，1 9 9 4 ) 、水稻( 黄少白等，1 9 9 4 ) 、小麦( 李英贤等，1 9 9 6 ) 以及光敏核不育水 稻( 徐盂亮等1 9 9 0 ) 的不育系花药中1 a a 含量远远低于可育系花药。山靛雄性不育株中的1 a a 含量低于部分雄性不育株和可育株( h a m d i 等，1 9 8 8 ) ，其i a a 水平降低可能是i a a 氧化酶活性 升高的结果( l m i s 等，1 9 9 0 ) 。此外，在辣椒( 高夕全等，2 0 0 1 ) 、大豆( s k o l u p s k a 等，1 9 9 4 ) 中的研究结果也都表明雄性不育的发生与生长素的亏缺有关。但在不同的不育系中，也存在相反 的情况，番茄雄性不育突变体s 1 2 ( s i n g h 等，1 9 9 2 ) 以及g m s 油菜( s h u k l a 等，1 9 9 3 ) 的不育 株雄蕊中生长素的含量高于相应可育系。 1 4 2 细胞分裂素与雄性不育 作物种类不同，其雄性育性与细胞分裂紊含量的关系不一样。在番茄( s k l 曲等，1 9 9 2 ) 、g m s 油菜( s h u m a 等，1 9 9 2 ) 雄性不育株中细胞分裂素含量低于可育株，而c m s 玉米( 夏涛等， 1 9 9 4 ) 、辣椒( 高夕全等，2 0 0 1 ) 以及k 、t 型c m s 小麦( 李英贤等，1 9 9 6 ) 的不育系花药组织 或者花蕾与可育系相比，却表现为内源细胞分裂素类物质的积累。不同种类的细胞分裂紊在性别 分化过程中所起的作用不同，g m s 油菜中二氢玉米素转化为二氢玉米素核苷的代谢较弱，核苷 型细胞分裂索合成减少被认为是导致g m s 油菜花药中小孢子发生中断的部分原因( s h u k l a 等， 1 9 9 3 ) 。番茄s 1 2 雄性不育株与可育株中细胞分裂素食量的差异也主要是玉米素核苷和二氢玉米索 核苷的含量降低( s 远h s 等，1 9 9 2 ) 。此外，在拟南芥a p r t 缺失型雄性不育突变体中，a p t i 基 因突变导致隙瞟岭磷酸核糖转移酶活性降低，使得细胞分裂素的代谢削弱，形成的核苷酸减少 5 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 ( g a l l i a r d 等，1 9 9 8 ) ，由此可以见，核苷型细胞分裂素可能是雄蕊正常发育的重要因子。 1 4 3 赤霉素和乙烯与雄性不育 赤霉素类( g a s ) 和乙烯分别具有促进雄性和雌性发育的重要生理作用。早期的研究就已证 明黄瓜雄性株系中g a s 的含量高于雌性系，乙烯含量则低于雌性系。拟南芥中编码内根贝壳杉烯 合成酶a ( 赤霉素合成过程中的关键酶) 的g a l 基因发生突变后赤霉素的合成受阻，突变体表 现出雄性不育( s u n 等，1 9 9 4 ) 。c m s 水稻不育系中g a l + 4 含量低于其保持系( 黄少白等，1 9 9 4 ) ， 而幼穗乙烯的释放速率显著高于保持系( t i a n 等，1 9 9 9 ) 。在g m s 水稻中也表现为g a s 亏缺， 其g a l 和g a 4 的含量大约只有育系的1 ，6 ( n a k a j i m a 等，1 9 9 1 ) 。雄性不育突变体番茄s 1 2 的升和 花中，内源g a s 的水平都低于正常可育系，特别是在雄蕊中，g a l 、g a 4 + 9 和g a 2 0 仅为可育系的 1 c 卜1 ，3 ( s i g h s 等，1 9 9 2 ) 。c m s 玉米在小孢予败育前的减数分裂期中，花药的乙烯释放量显著 高于可育系( 夏涛等，1 9 9 6 ) 。这些结果显示了内源赤霉素亏缺和乙烯过量产生都与雄性不育的 发生有密切的关系。 1 4 4 脱落酸与雄性不育 脱落酸作为赤霉素的一种拮抗物，其在雄性不育植物中的含量与赤霉素相反，表现为不育系 高于可育系。例如，番茄雄性不育突变体s 1 2 的雄蕊中内源a b a 为可育株雄蕊的6 倍( s i g h s 等， 1 9 9 2 ) rg m s 和c m s 油菜( s h u l d a 等，1 9 9 4 ) 以及k 、t 型c m s 小麦( 李英贤等，1 9 9 6 ) 中的 情况也都与此相似。但也有研究认为内源a b a 含量的剧减是农垦5 8 5 雄性败育的原因之一( 赵 玉锦等，1 9 9 6 ) 。 1 5 雄性不育与同工酶 李叉华等( 2 0 0 3 ) 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法对青花菜雄性不育系及保持系花蕾的雄 蕊、雌蕊、花萼和花瓣进行了过氧化物酶( p o d ) 、过氧化物歧化酶( s o d ) 、多酚氧化酶( p p o ) 和儿茶酚氧化酶( c a o ) 同工酶分析，结果表明，4 种同工酶谱不仅在不育系与保持系之间有明 显差异，而且在不育系或保持系花蕾的不同部位之间也有明显差异，表现为花蕾的p o d 、c a o 同工酶在不育系谱带数多而在保持系谱带数少，p p o 、s o d 同工酶则正好相反。4 种同工酶在不 育系与保持系之间的差异主要表现在雄蕊上。胡美华等( 2 0 0 0 ) 研究发现，榨菜胞质雄性不育系 及其保持系在个体发育过程中过氧化物酶( p o d ) 和酯酶( e s t ) 同工酶的表达均具有特异性， 在营养生长期不育系的p o d 酶谱与保持系相同，但在生殖生长期花蕾中酶的活性显著高于保持 系，其酶谱中出现两条在保持系中不表达、迁移率分别为o 1 2 和0 1 9 的特异带。榨菜的e s t 同 工酶表达丰富，特异性强不育系的e s t 同工酶在营养生长期与保持系有所不同，在生殖生长期 差异显著，活性显著低于保持系，且花蕾的酶谱中缺少在保持系中表达的迁移率分别为o 3 8 和 0 4 0 的两条特异谱带。邓代信等( 2 0 0 4 ) 采用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳法对开花期萝 细胞质雄 性不育系及其相应保持系的叶片和花蕾中几种同工酶进行了酶谱分析，结果表明，花蕾中p o d 、 6 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 c o d 、e s t 及a 淀粉酶同工酶种类和活性与不育性有关，而s o d 同工酶在不育系与保持系间无 明显差异。叶片中不育系与保持系问均无明显差异，这说明与雄性不育性有关的同工酶可能仅在 花蕾中表达。许忠民等( 2 0 0 4 ) 以育成稳定多代的甘蓝胞质雄性不育系及其保持系为试材，以盛 花期的根、叶、花蕾和花以及9d 和1 3d 幼苗的叶和根为试样，采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 技术分析了p o d 同工酶的谱带差异，结果表明，不育系和保持系p o d 同工酶存在谱带增减，活 性强弱和器官特异表达等差异，不育系和保持系问p o d 同工酶差异以花、大营和小蕾最大，叶 和根问差异不明显。张鲁刚等( 1 9 9 9 ) 研究发现，大白菜不育系过氧化物酶同工酶活性变异要比 酶带数目变异更重要，生殖器官中不育系p o d 酶活性弱于保持系，叶片中不育系的酶活性则强 于保持系根和茎中两系问无差异。 1 6 基因表达与雄性不育 彭永康等( 1 9 9 5 ) 对粳稻3 4 1 a 与3 4 1 b 不同发育时期的器官进行同工酶比较，共检测出9 种p o d 同工酶谱带，其中p o d 5 、p o d 6 在1 0 个器官中都存在，因此可以认为是粳稻3 4 1 a 、3 4 1 b 的基本谱带，p o d 8 、p o d 9 谱带仅在少数器官中存在，具有一定的器官专一性。在花粉粒发育的 两个关键时期，不育系的p o d 同工酶谱带均多于保持系，这可能是由于不育质基因对核基因表 达的调控作用所致。沈银柱等( 1 9 9 4 ) 用等电聚焦电泳分析的方法，测定小麦3 种不育类型( a 型、e 型、t 型) 的细胞质雄性系及其相应保持系的萌动胚及幼芽可溶性蛋白时发现，保持系等 电点( p i ) 为4 9 0 的蛋白质合成数量高于相应的不育系，p i 为6 8 5 的蛋白质可能是t 型细胞质 基因表达的结果，d l 为7 6 的蛋白质可能为律丰a 不育系特有的区带。这表明细胞质来源不同的 不育类型，其萌动胚及幼芽可溶性蛋白等电聚焦电泳图谱差异明显，有可能成为鉴别它们的依据。 滕晓月等( 1 9 9 6 ) 以小麦t 型雄性不育系及其保持系种子为材料，用双向电泳结合高灵敏度银染 技术对其胚乳醇溶蛋白进行分析发现两系之间有明显差异。不育系1 4 a 有两个特异蛋白，分子 量分别为3 6 k d 和4 6 k d ，而缺少4 5 k d 的多肽，不育系1 1 a 有2 4 k d 的特异蛋白，且3 0 k d 及2 8k d 的两种多肽，其浓度较保持系明显增加。又用s d s - p a g e 法比较了不同发育时期可溶 性蛋白的组分，发现两系之间在种子和花药中有明显差异，而在苗期叶片来发现显著差异，表明 t 型细胞质雄性不育基因的表达具有时空性。曹家树等( 2 0 0 1 ) 用m r n a 差别显示技术对自菜核 雄性不育两用系中不育株群与可育株群花蕾的总r n a 进行了比较分析，在6 种反转录模板和2 0 种差异随机引物共1 2 0 种组合的选择扩增中拭回收了1 8 个e d n a 差异片段，对其中6 个c d n a 差异片段进行n o r t h e r n 验证，获得了一个在可育株群花蕾中特异表达的阳性差异片段，简称为 b 0 3 0 2 - 4 。n o r t h e r n 验证结果表明。它在不育栋中的表达受到了明显鲍抑割，其长度为4 6 3b p 。 经g e n b a n kb l a s t 查询，它与拟南芥第一条染色体上编码细胞色素p 4 的基因c y p s o c 4 核昔 酸序列有8 4 3 的同源性。侯磊等( 2 0 0 2 ) 应用c d n a - a f l p 技术，分析了棉花洞a 雄性不育 和可育材料在花药发育过程中花粉发育相关基因表达的差异，结果表明，在花药发育的相同时期， 不育和可育花粉e d n a - a f l p 谨带在单核期的差异大于减数分裂觏，这说踢在花粉发育过程中， 与花粉发育相关基因的表达具有时空特异性，共回收了6 4 条差异c d n a 片段，随机选择3 个片 段标记为探针，r n a 斑点杂变分析表明，g h a 2 7 具有花器富组织特异性，仅在花器宫中袤达， g h a 2 8 、g h a 4 7 则具有花药组织特异性，仅在可育花药中表达序列相似性比较表明，g k a 2 7 7 中国农业大学硬士学位论文 第一章文献综述 与植物a d p - r i b o s y l a t i o nf a c t o r ( a r f ) 基因有较高的相似性，而g h a 2 8 、g h a 4 7 与已知序列的 相似性很低。王学德等( 1 9 9 8 ) 用m r n a 差别显示对水稻细胞质雄性不育系、保持系和f l 杂种 的花药m r n a 和叶片m r n a 进行了比较和分析，以研究雄性不育花药在花粉败育时期的基因表 达方式。花药在不育与可育间显示的e d n a 差别带数多于叶片，这表明育性基因的表达在花药中 比在叶片中活跃和充分。不同类型花药的基因转录方式既与花药育性程度有关又与花药败育早晚 有关，不育花药所显示c d n a 差别带数多于可育花药，晚期败育的花药所显示c d n a 差别带数多 于早期败育的花药。在回收的1 2 个e d n a 差别片段中，有2 个可能与雄性不育相关，a b 小5 片 段只在不育花药中专一表达，另一片段a 】b b 2 含有与线粒体基因c o x i i 同源的序列，在不育花药 中的表达受到部分抑制。刘秀珍等( 2 0 0 3 ) 采用d d r t - p c r 技术对太谷核不育小麦的一对近等基 因系进行了差别表达分析，以找出与太谷核不育基因t a l 表达有关的基因并研究其引起雄性不育 的机制。共用3 0 对随机引物进行差异显示，从展示的近1 0 0 0 条e d n a 片段中找出3 0 条特异表 达的c d n a 片段，其中包括可育特异和不育特异，这些片段可能与t a l 基因的表达有关。钱晓茵 等( 1 9 9 8 ) 运用差异展示( d d r t - p c r ) 方法对野败型细胞质雄性不育系珍汕9 7 a 及其保持系珍 汕9 7 b 的基因产物进行比较分析，发现这两个核基因组完全相同的品系问约有1 0 的基因差异表 达。选取一个差异表达明显的c d n a 成员b 1 3 2 进行n o r t h e r n 杂交发现，该基因在保持系中正常 表达，在不育系中表达受到明显抑制。 1 7 豌豆雄性不育的研究现状 目前，国外己在豌豆中发现了3 9 个雄性不育突变体，除一个自然突变体外，其余是由理化 诱变产生的，这些突变体均属核不育类型，由核内隐性单基因控制，大多数基因的等位性尚不清 楚( k a u l ，1 9 8 8 ：s i a g h 等，1 9 9 5 ) 。 1 7 1 结构性雄性不育 用2 k r y 射线诱变产生的突变体r u s k 9 ，其花粉囊发育不良，没有分化出造孢组织，雌性育性 正靠。这种异常现象是由隐性单基因( r a s k g ) 控制的。用5 嫁1 射线处理豌豆种子，在m ：分离 出一个与r u s k 9 类似的突变体，其花药矮小，有造孢组织分化，但产生的花粉母细胞畸形，不能 发生减数分裂，雌性育性正常，该不育性是由隐性单基因( m