（病原生物学专业论文）重组鸭ifnγ基因的克隆表达及在细胞与动物体内的功能研究.pdf

捕蛙 博。l 学位论文中文摘要 重组鸭i f n y 基因的克隆表达及在细胞与动物体内的 功能研究 乙型川炎瘸薄( t t e p a t i t i sbv i r u s ，h b v j 魁引起人类厶，艘刖炎的稠坂体。个 球约仃4 0 0 ，0 0 0 ，0 0 0 的h b v 携带者，j n j 持续性感染导敛的病毒性肝炎1 i 肝硬化、 盯缃胞肝痛的发乍卡j 密切的关系。t 苦卜感染h b v 并建。旁持续性感染，除与7 爵l ： r t 、堆i i 璎等遗传因素相关外，还j 宿et 抗奈农达和应答异常、淋巴细胞功 能紊乱等晰切桐天。研究表明，抗原特锌3 降的c t 。和：杀伤病毒感染细胞，埘消 除h b v 的感染起着重爱作用。最j 驻在转鏊闪鼠模獭的研究中，还证f 鲥存n i 种 菲细胞杀伤性的1 细胞灭活病海丰凡制，这。ji f n y 和t n f t i 表达水半歼高自天。 觚h b v 患者中分离晌肝细胞写外阁斑荦个核细胞( p b m c ) 共培养的体外模型 骈究也证实，p b m c 被抗探或p i i a 辅激厉，分泌的i f n 。yf q + 以抑制肝绑胞r f ； h b vd n a 的转求。由 ：i f n yl 玎灞强c t 的杀伤力，还f 日促进 f 细施杀 j j 惟 的病毒灭活，潲商讲究i f n ，￥在h b v 缮染和治疗过程中的侔弼冉匿爱意义。 矗 + 拨鬣肝炎病毒w o o d c h u c k t e p a t i t i sv i r u s ，w h v ) 感粢 ：拨鬣潦代肝缩 擞的模型研究t 。发巍，塔管i f n y ，j 以l ：溺m t f cl 等分子的表达，位并小熊撺 制病毒复铡中阔体洳形戏帮r n a 的转慕。蕊s c h u l t z 等谯鹳乙帮劳 炎瘸毒( d u c k h e p a t i t i sbv i r u s ：d h b v ) 感染鹦原 翳纲萎毂熬模型s 沁涯 l 舅重缀鹳i f n 一￥ d u l f n 一￥) l 巧以麴割d h b v 的复划。i f n + y 对蠖翳d n a 病毒羚锑：剐务夺嗣模 掣的艇究e l t 掰到静结果并不毁。 。鸭乙型骶炎炳毒鲍蘩必缌绒梭、复制捌期h b v 分糍似，为氍跨宠l i b v 感染捌病毒溃除姻良好动物模型。报道表列，i f n 一￥蛙燃为饯荆司以挺进俄1 t - ：) b 嗣m 尊个核细胞增雅、免疫应昝类型向1 h 1 转变、增强臻 二c “f l 成铃，弦睦列 幼龄动物的影响比成年动物明鼹。由1 ：盒今尚元以d h b v ，为模型，研究i f n 一￥ 埘d h b v 作用的报道，闪曲本沦文利 id h b v 模型，谯探讨体外缈胞培养r z ， f n v 对i ) h b v 作用的基础匕，进步存动物体内以i f n + y 表达质粒为免疫饯 利，和表达d h b vp r e s s 的d n a 疫苗共免疫，研究i f n 一、7 綮因佐刹在预防_ j 【| 瀹 4 ，d i t b v 感染的作用。f 日前在d h b v 感染鸭模型研究中，d h b vp r e s s d n a 艘前足甭能诱导抗病毒免疫应答尚有争议：t f i y a t n i 等以表达d h b vp r e s s 的 d n a 疫茼免疫鸭，发现能诱导商效价的抗体，皿足产， i 的抗体小能中捌瘸舀 曲卜浮f t 论文 磷笙 织哥抗体的效价j 抗瘸毒作羽誉毁。西r o l t i e r 等的实验捌表明，d l i b p r c s s i ) n a 免疫鸭诱7 三灼抗体 ：汉效价趣，还以中和病毒。d h b p r e s sd n a 烧 | i 能 对d h b v 感染备预防鞠治疗性的效果逐蒜贯进+ 步的研究。 烈究曦美 d u l f n ￥盘体外对d i t b v 的f l ：_ l f 和d u l f n y 龋堋柞! 动物体内作 为免疫佐荆的功熊，将进步驯确在 然感染模型l i ，i f n - y 再。抗病站和诱吁的 贸_ 受心答刈噱埘d n a 瘸毒的俘删。d h b vp r e s s - d n a 疫菹列d h b v 感染- i a 2 保护性，n ：研究d u i f n y 作为壤i 大i 佐利的h 时，也得到j ，进步的确认。卜述 i 作为将来深入研究i f n 。y 。jh b v 的桕恒作1 j ，探讨宿i i 感染i t b v 利清除嫡 t 睡f i j 分f 帆制以及研制新，魁d n a 疫崎提供依拆：。 篇章鸭1 f n y 基因的克隆表达与活性分析 木p 从p h a 莉激的鸭外周血荦个核细胞抽提r n a ，通过r t w p c r 的力法， 获f l j 许兜降，鸭i f n y 的c d n a ，岸对d u l f n ，￥j 列迸行r 分静n e 较。丰【 挤； d u l f n ￥能仃效保护鸭成纤维细胞 i 裰v s v 感染，乔 _ 现细胞瘸变效j 、i ( c y t o p a t h i ce f f e c t s ，c p e l 的特性，d u l f n y 蕾嚣 质 i 转粢c o s 一7 细胞衙，糟c p e 观察法测定了r 细臌t 清液噜f 霞维d u l f n v 栩对j j 抑制v s v ( v e s i c u l a rs t o m a t i t i s v i r u s ) 攻 祷滴艘。另外，还糟m7 f t 泣对茕缉d u l f n ￥栩对 蟊l 制v s v 攻r ；鹋 滴度进 ，r 测定。结采基本豉，为l 。42 r 靠。并醛i f l j j 萋缀d u l f n 一￥盼这种 抗病毒活性；，f 被特并性抗+ d u i f n ，y 抗体群l | 】和。 ：涤嘎维d u l f n y 翮入熊释放d h b v 耨毒赣粒f 鼋l m h d 2 纲艟正，结聚l & 求 d u l f n ￥ 曩以辫j 翱d h b v 复 嬲。 除此之井，还在夫强搴1 麓中表达鄹纯化厂d u t f n ￥融会量一溪，分一l ， 最为 4 2 7k d a ，这；扶核瞢酸序列雄测的分于澄基零孛| 明。 第一：章鹦终周盘单个核缨胞i f n ym r n a 转录水乎的测定 奎謦，庄l 三宠成d u l f n 。y 耩因测序的照础 ：，以i 呜d a c t i n 基因为厅家基 太i ， 通过构建竞争性内参照，建：了捻测d u l f n vm r n a 转录水3 f 的、# 定皎竞争。h ： 彤r p c r 方法，鉴j 二鸭p b m c 是产，卜d u l f n ，y 的i - 要细胞，测定结聚町基本反 映i f n y 在体内的转录情况，利用这一力法观察了p t t a 体外刺激鸭外周m l l 寸个 核细胞d u l f n ym r n a 转录的动态变化，结果农f ”jp t t a 刺激2 4 3 6 h ，i ) u l f n y 转求最最高，随后宵所降低，似仍然维持确：一定的水、f 。 摘 第：章重组鸭i f n y 基因在动物体内的功能研究 为研究t e 组鸭i f n y 丛闪存动物1 奉内的功能，奉交以d u l f n - y 酉纰质粒( 以 卜陶称d u l f n yi ) n a ) 作为免疫优刑，研究d u l f n y 基闪为住剂诱7 t - v , j 免疫j 娅 答n + 预防和f 治，d f t b v 感染中的作，目。 以d u l f n yd n a 作为免疫佐剂，朋表达d h b vp r e s s 蛋r j 质的重组质粒( 以 卜简称d h b p r e s s i ) n a ) 免疫1 w 龄鸭，结果显尔以d u l f n yd n a 和d h b p r e s s d n aj i 免疫纰，鸭p b m c 表达d u l f n ，y 的水ti 岛rd t t b p r e s sd n a 簟独免疫 纰，绐免疫加强后，鸭p b m c 表达d u i f n y 的水一t 十i j 蓐更大。i 叮d h b p r c s s d n a 咀独免疫纽诱导的抗体滴度岛j 二以质耗d i f b p r e s s d n a 和d u i f n yd n a i 免 疫 i l 。hj 商剂量d h b v 攻i k 免疫鸭的实验 i 示，d u i f n yd n a ! j d 1 1 b p r e s s d n a 免疫组在短期内，能够比d i t b p r e s s d n a 荦独免疫细和刈 照纠更快地降低1 0 1 液循环中病毒滴度。肝组织t id n a 的检 偿 果也 - 2 _ ，以 d u l f n y d n a 和d t t b p r e s sd n a t 免疫的鸭，d h b vc c c d n a 及总d n an 勺 b 低：以d h b p r e s sd n a 单独免疫组和对照纠c 。 n ：确定i ) u l f n y 鉴凶为佐剂町以增盟i t ：常鸭p b m cd u l f n ym r n a 表达， 增强d i i b vp r e s s d n a 疫【诃的保护作f h 的慕础卜，进步 jd u l f n yd n a 1 为免疫伪：刹，刖d h b p r e s s d n a 免疫治疗已经建妒d i - i b v 感染的1 w 龄鸭，结 粜显_ d h b p r e s s d n a 与d u l f n 一 d n a 共免疫封i ，初次免嫒后，鸭p b m c d u l l ? n - y 的表达水乎较单用d h b p r e s s d n a 免疫组高，化皿【强后这种芹距更 人，这结果f jd n a 免疫l f 常鸭的结果螭小敛。听核酸斑点杂交卡：j = 测m l 消痫 毒滴度结粜表i ，d h b vp r e s s d n a1 id u l f n y d n a 共免疫组、i ) 1 i b v p r e s s d n a 单独免疫组和对照组的病毒滴度都允明显下降，对照2 l i 、d t i b v p r e s s d n a 弘独免疫组和d h b vp r e s s d n a 与d u l f n y 。d n aj 饱疫组之间 俩t 孥滴度卜l 降并无明显区别( p 00 5 ) 。，第一次实验免疫质粒的用f 抟乃人后，z 刘1 j 前【n 】旌本斗【j 似的结果。 d u l f n yd n a 作为免疫住剂i 叮短暂地提高鸭抗d i b v 感染能力，f 【_ i 对已 经建：d i j b v 感染的鸭，却f ；能清除病毒达剑游，的f j 的，这f 叮能，瘸毒的感 染和复制情况、d n a 免疫的剂筻、免疫的方案有天。f f j j ：d u l f n y 抑制d i i b v 复制的分于机制以及作为免疫佐剂增烈免疫应答的机理并小清楚，也仃r ，r 能足 种细胞测r 同时促进了其它细胞因f 的表达，多种细胞凶r - ，讣日作用的结果，矧 此要达到清除病t 莓和治疗的h 的，町能仅片ji f n y 一种细胞wr 用j 治疗还小 够，还需要考虑1 ；同的免疫方案、用多种细胞蚓r 协同作用进j j 综合治j ，。1 关键词：鸭j f n y ，克隆和表达，竞争性r ，1 1 p c r ，鸭乙型肝炎瘸毒，d n a 篼疫 摘唑 t h e s i sa b s t r a c tf o ra p p l i c a t i o nf o rp h d c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fd u c ki f n yg e n ea n d f u n c t i o n a l s t u d y o fr e c o m b i n a n td u c ki f n yg e n e nv i v oa sa na d j u v a n t a ne s t i m a t e d4 0 0m i l l i o np e o p l ew e r ec h r o n i c a l l yi n f e c t e dw i t ht h eh e p a t i t i sb 、7 i r u s ( h b v ) h b vi sam a j o rp a t h o g e no fa c u t ea n dc h r o n i ch e p a t i t i s c h r o n i cv i r a l h e p a t i t i s j n f e c t i o nu s u a l l yj e a d st os e r i o u ss e q u e l a es u c ha sj i v e rc i r r h o s i sa n d h c p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a i na d d i t i o nt ot h eg e n o t y p e ，t h eg e n d e ra n dh o r m o n a lt h c t o r i nh o s t ，t h er e a s o n st h a tc e r t a i ni n d i v i d u a l sd e v e l o pc h r o n i ci n f e c t i o n r a t h e rt h a na t r a n s i e n ta c u t ei n f e c t i o n ，m a yb er e l a t e dt ot h ed e f i c i e n tp r o d u c t i o no l i n t e r f e r o n ( 1 f n ) d e f i c i e n tr e s p o n s et oi i ：na n da b n o r m a l i t i e so fl y m p h o c y t et u n c t i o n i t w a sa r g u c d t h a te y t o t o x i e7 f - l y m p h o c y t e s ( c t l ) p l a y sac r i t i c a lr o l ei nc l e a r a n c eo fv i r u sf r o m 1i b vp a t i e n t sb yl y s i so fv i r u s i n f e c t e dh e p a t o c y t e s r e c e n t l y i f n ya n di n i ? - “ h a v eb e e ns h o w nt oa b o l i s h f b vg e n ee x p r e s s i o na n dr e p l i c a t i o ni nf l b vt r a n s g e n i c m i c ew i t h o u td e s t r o y i n gi n f e c t e dh e p a t o c y t e s a ni nv i t r om o d e lo f ll y m p h o c y t e sf r o m tt b s a gp o s i t i v ep a t i e n t sc o c u l t u r e dw i t hh b vr e p l i c a t i n gh e p a t o c y t e ss h o w e dt h a t s e c r e t i o no fi f n yf r o ml y m p h o c y t e si n h i b i t e dt h ch b vr e p l i c a t i o n 1i ? n yc a n a c t i v a t ec t i 。a n dm e d i a t et h en o n c y t o l y t i ci n h i b i t i o no fh e p a t i t i sbv i r u sr e p l i c a t i o n w h i c hm a k e si t i m p o r t a n tt oi n v e s t i g a t et h er o l eo fi f n yi nt h ep r o c e s so fh b v i n f e c t i o na n dr e c o v e r yf r o mv i r u si n f e c t i o n r e c o m b i n a n tw o o d c h u c ki f n y u pr e g u l a t e dm h cit r a n s c r i p t i o nb u tw a s u n a b l et oi n h i b i to rc l e a rw o o d c h u c kh e p a t i t i sv i r u sr e p l i c a t i n gi n t e r m e d i a t e sa n d r n a si np e r s i s t e n t l yi n f e c t e dw o o d c h u c kp r i m a r yh e p a t o c y t e s ，t t o w e v e r , t r e a t m e n to f p r i m a r yd u c kh e p a t o c y l e sw i t hr e c o m b i n a n td u c k1 f n yi n h i b i t e dd u c kh e p a t i t i sb v i r u s ( d t t b v ) r e p l i c a t i o ni nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e rd i f f e r e n ti nv i t r om o d e l sg a v e ac o n t r o v e r s i a li m p l i c a t i o no ft h er o l eo fi f n 、i nh e d a d n a v i r u s e si n f e c t i o n d h b va n dh b vs h a r ec o i t l m o ng e n o m i ca n ds t r u c t u r a 】f e a t u r e si n c l u d i n g s i m i l a rv i r i o ns i z ea n du l t r a s t r u c t u r e ，w i t ha n e n v e l o p es u r r o u n d i n gas p h e r i c a l n u c l e o c a p s i dt h a tc o n t a i n sas i m i l a rv i r a ld n ag e n o m ei nt e r m so fs i z e s t r u c t u r e a n d o r g a n i z a t i o n t h e r e t b r e ，d h b v i n f e c t e dd u c ki sag e n e r a l l yu s e da n i m a lm o d e lt o i n v e s t i g a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fh o s td e f e n s ea g a i n s th b vi n f e c t i o n a n i m a l s 4 捕蛭 w h i c hc o i m m u n i z e dw i t h a n t i g e n a n d i f n y e x p r e s s i n g d n ad e v e l o p e d 1 1 11 b i a s e di m m u n er e s p o n s e s c o i n o c u l a t i o no fi i ? 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转旌l 矧黼校 掣的研究巾，还酞明存谯车巾”黔细胞杀伤。降的t 细胞火活病毒静l 制，这ji t ? n 一 ￥, t i i f n f 一衷达水、f 升高有爻l 。从h b v 患荷t p 分离的盯细胞与辩弼缸瞥个 核细胞兵墙莠的体外模型研究也证实，p b m ci f n y 的r 岛表达町以抑制肝细腱； t h b vd n a 灼转录【8 | 。 ：i f n yi 玎增强c f 1 的杀伤力，还i t j 促进斧细胞杀伤 性：的蛹毒火活，冈丽研究i f n 。v 往h b v 感染和治j ，过程中的f l # t j 备最爱意义。 鸭乙犁黯丁炎病毒( d u c kh e p a t i t i sbv i r u s ，d h b v ) j 人乙撄月 炎瘸毒( h b v ) 嗣属嗜月fd n a 病毒曩其结构与l t b v , t i l 似，复制删艄也il t b v 榭列。d h b v f f 然感染的宿 ：动物一鸭来源多，易饲养，；