（动物学专业论文）蛋白酶体活性抑制对小鼠空间认知能力的影响及其机制.pdf

硕士学位论文 i f a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名 日期：加，年莎月日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者蓉名求持声 日期：t 1 r r - 6 月日 导师签名：陆书惦 日期：如if 年钥f 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。园壶途塞握童卮溢卮! 旦坐生；旦= 生；旦三生筮查! 储糨符秘。 日期：| l 牟月j 日 导师签名：醉以切 日期：山1 1 年钥，日 摘要 泛素蛋白酶体系统( u b i q u i t i n - p r o t e a s o m es y s t e m ，u p s ) 是细胞内蛋白质降解的 主要体系之一，主要由泛素活化酶e 1 、泛素结合酶e 2 、泛素连接酶e 3 、去泛素化 酶和蛋白酶体等组成。泛素蛋白酶体系统在突触的可塑性、轴突的生长、突触数量 和大小以及树突棘的形成过程中都发挥着重要的作用，并且泛素蛋白酶体系统异常 与帕金森氏症和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发病相关。本实验在小鼠脑神经瘤 细胞系( n e r o 2 a , n 2 a ) 和昆明小鼠( m u sm u s c u l u s , k m ) 水平探究了抑制蛋白酶 体活性对神经元形态和小鼠的空间认知能力的影响及其相关机制。第一部分：不同 浓度梯度的蛋白酶体抑制剂m g l 3 2 处理n 2 a 细胞2 4 小时后，分别用相差显微镜和 免疫荧光技术观察细胞基本形态和突起长度的变化，用免疫印迹技术检测细胞内与 突触形成和突触可塑性有关的转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白 ( c a m p r e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n 。c r e b ) 含量和活性以及突触后致密区蛋白 9 5 ( p o s t s y n a p t i cd e n s i t y 9 5 。p s d 9 5 ) 含量的变化，而后用免疫印迹技术检测微管相 关蛋白t a u 的磷酸化修饰和微管结合功能的变化。结果发现：( 1 ) 蛋白酶体抑制剂 m g l 3 2 处理n 2 a 细胞2 4 小时后，细胞突起长度缩短，突起数量减少；( 2 ) m g l 3 2 处理细胞2 4 小时后c r e b 、磷酸化的c r e b ( p c r e b ) 和p s d 9 5 含量降低；( 3 ) m g l 3 2 抑制蛋白酶体活性导致t a u 蛋白总量增加，t a u s e r 3 9 6 、s e r 2 6 2 、s e r l 9 5 1 9 8 1 9 9 2 0 2 、t h r 2 3 l 和t h r 2 0 5 等位点过度磷酸化修饰，且t a u 蛋白微管结合功能下降。 第二部分：鉴于以上细胞水平的研究结果，我们进一步以成年昆明小鼠为研究对象， 侧脑室定位注射m g l 3 2 抑制脑内蛋白酶体活性2 4 小时后，利用水迷宫检测小鼠的 空间认知能力，高尔基染色检测神经元突起的长度，免疫印迹检测神经细胞内c r e b 活性和p s d 9 5 含量以及t a u 蛋白磷酸化修饰的变化。结果发现：( 1 ) 2 5i x m 和5 0 州 的m g l 3 2 导致小鼠的逃避潜伏期和搜索路径明显延长，在平台所在象限的停留时 间显著缩短。表明抑制蛋白酶体活性损伤了小鼠的空间认知能力；( 2 ) 抑制蛋白酶 体活性导致脑内神经元突起数量减少和长度变短，同时神经细胞内c r e b 活性和 p s d 9 5 含量降低；( 3 ) 蛋白酶体活性抑制并未影响脑内总体t a u 蛋白的含量，但是 导致了t a u - s e r 3 9 6 、s e r 2 6 2 、s e r l 9 5 1 9 8 1 9 9 2 0 2 、t h r 2 3 1 和t h r 2 0 5 位点的异常过度 磷酸化修饰。以上结果表明蛋白酶体活性抑制将导致小鼠空间认知功能障碍，而蛋 白酶体活性抑制引起的神经元突起缩短、c r e b 活性下降、p s d - 9 5 含量降低和t a u 蛋白的异常过度磷酸化修饰可能是其空间认知功能障碍的原因。 关键词：蛋白酶体；突起形态；认知能力；t a u 蛋白 a b s t r a c t u b i q u i t i n - p r o t e a s o m es y s t e m ( u p s ) ，w h i c h i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts y s t e mo f i n t r a c e l l u l a rp r o t e i nd e g r a d a t i o n u p sm a i n l yc o n t a i n su b i q u i t i na c t i v a t i n ge n z y m ee 1 ， u b i q u i t i nc o n j u g a t i n ge n z y m ee 2 ，u b i q u i t i nl i g a s ee 3 ，d e u b i q u i t i n a t i n ge n z y m e sa n d p r o t e a s o m ea n ds oo n i tp l a y sc r i t i c a lr o l e si nm a n yp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e ss u c h 嬲 s y r m p t i cp l a s t i c i t y , a x o n a lg r o w t ha n dd e n d r i t i cs p i n ef o r m a t i o n u p si m p a i r m e n th a s b e e nr e p o r t e di n v o l v e di ns e v e r a l sn e r v o u ss y s t e md i s e a s e ，s u c ha sp a r k i n s o n sd i s e a s e a n da l z h e i m e r sd i s e a s e i n0 1 1 1 7r e s e a r c h ，w es t u d i e dt h ee f f e c to fp r o t e a s o m ei n h i b i t i o n o nt h ec o g n i t i v ea b i l i t yo f m i c ea n de x p l o r e dt h em e c h a n i s m si nn 2 ac e l l sa n dm u s m u s c u l u sm i c e f i r s t , w et r e a t e dn 2 an e u r o m ac e l ll i n ew i t h0 5 州，1 0p , ma n d2 0p m m g l 3 2 ( as p e c i f i ci n h i b i t o ro fp r o t e a s o m e ) f o r2 4k t h e nd e t e c t e dt h ec h a n g eo fc e l l u l a r m o r p h o l o g y , t h ea c t i v i t i e so fc 黼一r e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ( c r e b ) ，ak e y t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o ri n v o l v e di nt h ef o r m a t i o no fs y n a p s ea n ds y n a p t i cp l a s t i c i t y , a n d c o n t e n to fp o s t s y n a p t i cd e n s i 妒9 5 s d - 9 5 ) w ea l s o i n v e s t i g a t e d t h ee f f e c to f p r o t e a s o m ei n h i b i t i o no nt h ep h o s p h o r y l a t e dt a ua n dt h eb i o l o g i c a lo f t a uo fb i n d i n gt o t h em i c r o t u b u l e sb yw e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s ：( 1 ) i nn 2 ac e l l s ，m g l 3 2t r e a t m e n t r e s u l t e di nd e c r e a s eo ft h el e n g t ha n dn u m b e ro fn e u r i t e s ( 2 ) m g13 2t r e a t m e n t d e c r e a s e dt h ec o n t e n t so fc r e b ，p c r e ba n dp s d 9 5 ( 3 ) m g13 2t r e a t m e n ti n c r e a s e d t h el e v e lo ft o t a lt a ua n dp h o s p h o r y l a t e dt a ua ts e r 3 9 6 ，s e r 2 6 2 ，s e r l9 5 1 9 8 19 9 2 0 2 ， 耻3 1a n d 咖0 5s i t e s ，a n dd e c r e a s e di t sb i n d i n ga b i l i t yt om i c r o t u b u l e s e c o n d ，w e u s e dm g l3 2s t e r e o t a x i ci n j e c t i n gi nl a t e r a lv e n t r i c l eo f m i c ef o r2 4ha n dt h e nd e t e c t e d t h ea l t e r a t i o no fs p a t i a lc o g n i t i v ea b i l i t yo f m i c eb yw a t e rm a z e ，w ea l s oo b s e r v e dt h e c h a n g eo fn e u r i t i s ，c r e ba c t i v i t y , p s d - 9 5c o n t e n ta n dp h o s p h o r y l a t i o no ft a np r o t e i n r e s u l t s ：( 1 ) m g l 3 2t r e a t m e n ti m p a i r e ds p a t i a lc o g n i t i o no fm i c e ( 2 ) m g l 3 2t r e a t m e n t r e d u c e dt h el e n g t ha n dt h en u m b e ro fn e u r i t i s ，t h ea c t i v i t yo fc r e ba n dt h ec o n t e n to f p s d 9 5 ( 3 ) m g l 3 2t r e a t m e n ti n c r e a s e dt a u - s e r 3 9 6 ，s e r 2 6 2 ，s c r l 9 5 1 9 8 1 9 9 2 0 2 ， 眦31a n d 眦0 5s i t e sp h o s p h o r y a t i o n i nc o n c l u s i o n , o u rr e s u l t sm a n i f e s t e dt h a t p r o t e a s o m ei n h i b i t i o ni m p a i r e ds p a t i a lc o g n i t i o n o fm i c e 1 1 1 ea t r o p h yo fn e u r i t i s ， d e c r e a s eo fc r e ba c t i v i t ya n dr e d u c t i o no fp s d 一9 5c o n t e n t , a n da b n o r m a l p h o s p h o r y l a t i o no f t a up r o t e i nm i g h ti n v o l v ei nt h em e c h a n i s m s k e yw o r d ：p r o t e a s o m e ；n e u r i t e sm o r p h o l o g y ；s p a t i a lc o g n i t i o n ；t a n n 硕士学位论文 m a s t e r 8t h e s i s 目录 摘要i a b s t r a c t 第一章引言 1 1 1 泛素蛋白酶体系统。1 1 2 神经系统疾病与泛素蛋白酶体系统2 1 3 泛素蛋白酶体系统与神经元形态功能的关系3 1 4 泛素蛋白酶体系统与认知功能的关系4 1 5c r e b 和p s d 9 5 在认知过程中的作用。5 1 6t a u 蛋白与突起形态和认知功能的关系6 1 7 本研究的目的及意义6 第二章蛋白酶体活性抑制对n 2 a 细胞神经突起和记忆相关蛋白的影响7 2 1 弓i 言7 2 2 材料和方法7 2 2 1 主要试剂7 2 2 2 主要仪器8 2 2 3 细胞培养8 2 2 4 药物处理n 2 a 细胞抑制蛋白酶体活性8 2 2 5 检测c r e b 活性、，p s d 9 5 含量以及t a u 蛋白的磷酸化样品的收集：9 2 2 6 检测t a u 蛋白微管结合功能时样品的收集9 2 2 7b c a 法检测样品蛋白质的浓度。1 0 2 2 8 免疫印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) 1 0 2 2 9 细胞免疫荧光技术1 2 2 2 1 0 统计学分析1 2 2 3 结果1 2 2 3 1 蛋白酶体活性抑制对n 2 a 细胞基本形态的影响1 2 2 3 2 蛋白酶体活性抑制对神经细胞突起长度的影响1 3 2 3 3 蛋白酶体活性抑制对n 2 a 细胞内c r e b 和p s d 9 5 的影响。1 4 2 3 4 蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白磷酸化修饰的影响1 5 2 3 5 蛋白酶体活性抑制对t a u 蛋白的微管结合功能的影响1 7 2 4 讨论1 8 2 4 1 蛋白酶体与神经细胞形态。1 8 2 4 2 蛋白酶体与c r e b 和p s d 9 5 的关系1 8 2 4 3 蛋白酶体与t a u 蛋白1 9 第三章蛋白酶体活性抑制对小鼠空间认知功能的影响及相关机制研究2 l 3 1 弓l 言2 1 3 2 材料和方法2 1 3 2 1 主要试剂和仪器2 1 3 2 2 侧脑室立体定位注射2 1 3 2 3a n y m a z e 水迷宫2 2 3 2 4 高尔基染色2 2 3 2 5 免疫印迹检测海马中c r e b 活性、p s d 9 5 含量和t a u 蛋白的磷酸化2 3 3 3 结果2 3 3 3 1 蛋白酶体活性抑制对小鼠的空间认知能力的影响2 3 3 3 2 抑制蛋白酶体活性对小鼠脑内神经元突起的影响2 5 3 3 3 蛋白酶体活性抑制对海马中c r e b 和p s d 9 5 的影响2 6 3 3 4 蛋白酶体活性抑制对海马内t a u 蛋白磷酸化的影响2 7 3 4 讨论2 9 3 4 1 泛素蛋白酶体系统与空间认知能力2 9 3 4 2 神经细胞形态、c r e b 和p s d 9 5 与认知功能2 9 3 4 3t a u 蛋白与突起变化和认知功能3 0 第四章结论。 参考文献 附录 致谢。 3 2 3 3 4 0 4 1 第一章引言 1 1 泛素蛋白酶体系统 泛素蛋白酶体系统( u b i q u i t i n - p r o t e a s o m es y s t e m ，u p s ) 是细胞内广泛存在的蛋 白降解体系之一，它在清除细胞内异常折叠的蛋白和维持胞内蛋白的更新中起重要 作用。u p s 主要由泛素活化酶e 1 、泛素结合酶e 2 、泛素连接酶e 3 、去泛素化酶和 蛋白酶体等组成。蛋白酶体是一个巨型蛋白质复合物，最普遍的蛋白酶体形式是一 个2 6 s 蛋白酶体，包含一个2 0 s 核心亚单位和两个1 9 s 调节亚单位，核心亚单位为 中空的桶状结构，其环状内侧有多个蛋白酶活性位点，能将目标蛋白最终降解 为氨基酸残基。核心亚单位的两端分别连接着一个1 9 s 的调节亚单位，每个调节 亚单位都含有泛素结合位点和多个三磷酸腺苷( a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ，a t p ) 酶 活性位点，可以识别多泛素化的目标蛋白质，并将它们传送到核心亚单位u j 。目 标蛋白质经u p s 的降解过程：首先在a t p 的参与下，泛素活化酶e l 的半胱氨 酸的巯基位点与泛素的c 末端生成高能硫酯键，使泛素活化；活化后的泛素与 泛素结合酶e 2 相结合；而后在泛素连接酶e 3 的作用下将泛素连接到底物蛋白上； 被泛素化标记后的底物蛋白在2 6 s 蛋白酶体中被降解，泛素可被去泛素化酶从 底物上水解下来重新利用1 2 j 。 泛素蛋白酶体系统不仅可以降解异常或损坏蛋白质，而且还参与调节细胞凋 亡、细胞周期进程、细胞应激反应、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、肿瘤发 生、细胞的增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程【3 】。此外泛素蛋白酶体系 统还与神经系统的各种生理和病理过程有着密切的关系。研究表明泛素- 蛋白酶体系 统直接或间接的影响轴突的生长和形成、突触的数量、突触前后膜的结构和功能、 突触的可塑性、长时程增强和认知功能等神经过程【3 】。进一步的研究还表明泛素一 蛋白酶体系统在帕金森氏症( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 1 4 】、阿尔茨海默病 ( a l z h e i m e r s sd i s e a s e , a d ) 【5 】、亨廷顿氏病( h u n t i n g t o n sd i s e a s e s ，h d ) 垆j 和精神 分裂症【7 】等神经系统疾病的病变过程中发挥重要作用。这也使泛素蛋白酶体系 统成为预防和治疗以上神经系统疾病的可能靶标之一。 1 2 神经系统疾病与泛素蛋白酶体系统 泛素蛋白酶体系统与阿尔茨海默病、帕金森氏症和亨廷顿氏病等神经系统 疾病有着密切的关系。蛋白质降解异常被认为是这些神经系统退行性疾病的主 要发病原因之一。有研究显示蛋白酶体抑制剂能导致与帕金森氏症相似的病理 特征的出现。在帕金森氏症患者外周血液单核细胞中的蛋白酶体活性降低是帕 金森氏症快速方便诊断的指标之一【引。同时蛋白酶体功能异常被认为是阿尔茨海 默病的重要发病机制之一。阿尔茨海默病是一种年龄相关的神经退行性疾病，临床 上主要表现为渐进性的认知功能障碍，主要的神经病理学特征是细胞内的神经原纤 维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g j e s ，n f t s ) 和细胞外的老年斑( s e n i l ep l a q u e s ，s p s ) 沉积。 淀粉样蛋白( a m y l o i db e t a , a p ) 的异常聚集是形成老年斑的直接原因，而神经原 纤维缠结则以异常过度磷酸化的微管相关蛋白t a u 为主要成分【9 j 。蛋白酶体系统 作为体内最重要的异常蛋白降解途径，其功能异常被认为是导致以上蛋白异常聚集 的重要原因之一。a d 患者的大脑皮层和脑脊液中蛋白质被泛素化的程度显著提高 i o , 1 1 】。进一步的研究发现，脑样中存在大量泛素和泛素化蛋白的聚集，同时微管 相关蛋白t a u 不仅异常磷酸化而且存在过度泛素化修饰，在海马等脑区的蛋白酶体 活性显著降低，并且是由于翻译后的化学修饰所致，这些研究成果都预示着在a d 中泛素蛋白酶体系统存在异常【1 2 1 。泛素化的蛋白大量聚集的直接原因主要有两 种：( 1 ) 蛋白质的泛素化过程出现异常，导致目标蛋白不能被2 6 s 蛋白酶体降解。 此异常过程与泛素活化酶e 1 、泛素结合酶e 2 、泛素连接酶e 3 和去泛素化酶有关。 ( 2 ) 2 0 s 蛋白酶体功能损伤，导致泛素化后的目标蛋白质不能被正常降解l i 引。泛 素c 末端转移酶( u b i q u i t i nc t e r m i n a lh y d r o l a s el i ，u c h l i ) 是大脑最主要的去泛 素化酶，在a d 患者脑内以及大量的细胞和动物模型中的研究证明u c h l i 的活性 降低是导致异常蛋白不能正常降解进而聚集的重要原因之一i l4 1 。此外，大量的a d 病人的脑样检测发现蛋白酶体的活性明显受到损伤【l5 1 。在稳定转染人t a u 4 4 1 异构 体的人肾母细胞株( h u m a ne m b r ) ，o m ck i d n e y2 9 3c e i l s ，h e k 2 9 3 t a u 4 4 1 ) 和果蝇中， 用蛋白酶体抑制剂l a c t a c y s t i n 抑制蛋白酶体的活性不仅阻碍了t a u 蛋白的降解，而 且进一步加剧了t a u 蛋白异常过度磷酸化和t a u 蛋白的异常聚集【l6 ，1 。导致t a u 蛋白 的异常过度磷酸化的主要原因之是蛋白激酶活性的升高，在果蝇中蛋白酶体活性 抑制提高了糖原合成酶激酶3p ( g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s c3 p ，g s k 一3 p ) 活性，表明蛋 白酶体活性抑制可通过上调蛋白激酶的活性进一步诱导t a u 蛋白的异常过度磷酸化 修饰【1 7 】。同时t a u 蛋白的磷酸化也能调控蛋白酶体的活性，适度稳定的磷酸化t a u 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 蛋白能够促进蛋白酶体活性而过度磷酸化修饰的t a u 蛋白则损伤了蛋白酶体的功能 【1 8 】。蛋白酶体活性降低的原因有多种，在a d 中随着年龄的增加和神经系统病变 的发生，细胞内错误折叠的蛋白含量逐渐增多，超过了蛋白酶体的降解负荷， 进而导致蛋白酶体活性受损【1 3 1 。淀粉样前体蛋白( a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n , a p p ) 基因、早老素l ( p r e s e n i l i nl ，p s l ) 基因和t a u 基因的三重转基因的a d 模型小 鼠( 3 x t g a d ) 中的研究表明，a $ 低聚物能够抑制蛋白酶体活性，而蛋白酶体 活性抑制进一步促进了a p 和t a u 蛋白的聚集【1 9 1 。s o n g 等研究显示泛素结合酶e 2 ( e 2 2 5 k h i p 2 ) 介导了a b l 吨的神经毒性和a p l - 4 2 对蛋白酶体活性的抑制过程1 2 w 。 在a d 模型小鼠中，增强泛素蛋白酶系统活性能够修复树突棘的病理变化，进一步 证明了蛋白酶体系统在a d 中的作用【2 。泛素蛋白酶体系统的异常是导致a d 脑 内一些病理变化和行为上认知损伤的重要原因之一。 1 3 泛素蛋白酶体系统与神经元形态功能的关系 泛素蛋白酶体系统在突触的可塑性、轴突的生长、突触数量和大小以及树突棘 的形成过程中有着重要的作用【1 3 】。在神经元中，泛素和蛋白酶体不均匀的大量分布 于树突、相近的突触以及突触后致密区，这预示着蛋白酶体可能在突触的形成和功 能维持过程中发挥一定的作用【2 2 , 2 3 , 2 4 】。u p a d h y a 等研究表明神经元突触端的蛋白酶 体含量明显高于胞体，此外突触前后膜的蛋白酶体浓度也存在差异【2 5 1 。同时泛素- 蛋白酶体系统在调节突触可塑性过程中有着重要的作用，最早在海兔的长时程易化 ( 1 0 n g - t e r mf a c i l i t a t i o n ，l 1 f ) 中研究了泛素蛋白酶体系统在突触可塑性中的作用， 长时程易化需要稳定的蛋白激酶a ( c a m p - d e p e n d e mp r o t e i nk i n a s e ，p k a ) 活性， h e g d e 等研究表明泛素蛋白酶体系统能够降解p k a 的调节亚基，从而使其催化亚 基发挥活性，进而促进l t f 【1 3 , 2 6 1 。蛋白酶体系统对突触可塑性影响的另一种机制是 调控转录过程。突触可塑性以及长期记忆的形成和保持过程需要新蛋白质的合成， 转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白( c a m p r e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n , c r e b ) 是细胞内重要的转录调控因子，其能够调节许多记忆形成相关基因的表达 f 2 7 1 。另有研究显示c r e b 是蛋白酶体的下游底物，因此蛋白酶体能够通过调控c r e b 进而影响突触可塑性和记忆的形成【3 】。突触后膜上谷氨酸受体( a - a m i n o - 3 - h y d r o x y - 5 - m e t h y - 4 一i s o x a - z o l e p - p r o p i o n a t er e c e p t o r , a m p a r 和n m e t h y ld - a s p a r t a t er e c e p t o r , n m d a r ) 是神经递质传递的重要受体，在突触刺激下其存在胞吞作用，p a t r i c k 等 研究发现在刺激前3 分钟抑制蛋白酶体活性，将阻止胞吞作用，该结果表明蛋白酶 3 体是谷氨酸受体转运的调节靶位【2 2 1 。在脊椎动物中，相关研究表明蛋白质降解作用 在轴突的生长过程中有着重要的意义，深入的研究发现多种能够促进轴突生长和在 轴突生长过程中发挥重要作用的蛋白如微管蛋白等都是泛素连接酶e 3 的底物，e 3 连接酶对这些蛋白的调控作用直接影响着轴突的生长【2 8 , 2 9 】。编码泛素结合酶u b c d l ( u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y m e ) 的基因变异会导致树突的变形和再生过程受阻，进 一步的研究发现u b c d l 对细胞凋亡蛋白l ( a p o p t o s i sp r o t e i n1 ，d i a p l 可抑制细胞凋 亡) 的降解作用是其重要的分子机制【3 们。另有研究显示泛素蛋白酶体系统直接或 间接的调节突触后致密区蛋白9 5 ( p o s t s y n a p t i cd e n s i t y 一9 5 ，p s d 一9 5 ) 的含量，p s d 一9 5 能够促进突触的形成和稳定以及神经递质的传递【2 】，而c o l l e d g e 的研究显示泛素一 蛋白酶体系统能够降解磷酸化的s p a r ( s p i n e - a s s o c i a t e dr a pg t p a s ea c t i v a t i n g p r o t e i n , s p a r ) ，s p a r 的降解能导致突起数量的减少和p s d 9 5 蛋白含量的降低p 。 在a d 中，蛋白酶体活性抑制促进了a p 的形成和聚集，有研究表明在a p p 突变的 神经细胞中，a b 聚集能够减少突触中p s d 9 5 和g l u r l 的含量【j 引。 1 4 泛素蛋白酶体系统与认知功能的关系 泛素蛋白酶体系统在动物认知功能的形成过程中有着重要的作用，其参与调控 突触的可塑性、长时程易化( 1 0 n g - t e r mf a c i l i t a t i o n , l t f ) 以及长期记忆形成等过程 3 , 3 3 l 。早期在海兔神经元的长时程易化研究中首次证明了泛素蛋白酶体系统在l r f 中的作用，长时程易化需要稳定的蛋白激酶a 活性，而p i c a 是由调节亚基和活性 亚基组成，只有当两个亚基分开时p k a 才能发挥其活性，进一步的研究发现p k a 的调节亚基能够被泛素化并且被蛋白酶体降解【2 引。此外，去泛素化酶a p - u c h ( a p l y s i a u b i q u i t i nc - t e r m i n a lh y d r o l a s e ) 也参与调控l t f 的诱导过型2 2 j 。去泛素化酶u c h l l 的活性是突触和认知功能形成所必须的，同时在c 5 7 b l 6 的小鼠海马脑片中的研究 显示u c h l l 能够修复由a p 引起的突触功能的降低和陈述性记忆的损伤【3 4 1 。w o o d 等研究显示u c h l 3 在空间记忆中有着关键的作用，u c h l 3 突变的小鼠在m o m s 水迷宫和八臂迷宫实验中的成绩明显降低【3 5 1 。在c h a s m a g n a t h u s 中研究显示蛋白酶 体与记忆的形成有关，抑制蛋白酶体活性损伤了长期记忆的形成1 3 6 】。以往许多的研 究预示蛋白酶体在认知功能形成过程中有着重要的作用，而在哺乳动物中抑制蛋白 酶体活性对认知功能的影响尚无明确的报道。 4 1 5c r e b 和p s d 9 5 在认知过程中的作用 环腺苷酸应答元件结合蛋白( c a m pr e s p o n s ce l e m e n tb m d m gp r o t e i n , c r e b ) 是 分布于真核生物细胞核内的转录因子，由3 4 1 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质。 c r e b 的主要功能是调节细胞核内特定基因的转录和表达，其转录的功能活性受到 自身磷酸化水平的调节，磷酸化的c r e b 是其主要的活性形式【37 ，弼j 。c r e b 在神经 系统的发育、学习记忆和昼夜节律等生命活动中有着重要的作用【3 9 4 0 。学习记忆的 形成需要大量新的蛋白质的合成，而c r e b 是调控一些记忆相关蛋白合成的主要调 控因子h 1 , 4 2 】。早期在果蝇的研究中利用热冲击技术诱导一个能够抑制c r e b 活性的 蛋白表达，则阻碍了长时程记忆的形成，相反诱导一个激活c r e b 的蛋白表达，则 促进长时程记忆的形成【4 3 舢】。另有研究显示c r e b 缺失的突变型小鼠的长时程记 忆形成过程受阻【4 5 】。长时程增强( 1 0 n g - t e r mp o t e n t i a t i o n ，l t p ) 是在突触水平研究和 解释学习记忆神经机制的模型，c r e b 在l t p 的形成过程中有着重要的作用，在海 马中诱导l t p 后能够提高c r e b 磷酸化水平，而且在l t p 维持期间也需要高磷酸 化的c r e b 4 6 1 。w h i t e 等研究显示c r e b 通过增加神经营养因子的活性进而促进神 经突起的生长，此过程也有利于学习记忆的形成【4 7 】。近来有研究显示，蛋白酶体参 与调控了c r e b 的活性和含量，进而对学习记忆过程产生影响【j j 。 突触后致密区( p o s t s y n a p t i cd e n s i t y , p s d ) 是突触后膜上的神经递质受体以及 与受体相关的信号传导蛋白的主要集中区，而突触后致密区蛋白9 5 ( p o s t s y n a p t i c d e n s i t y 9 5 ，p s d 9 5 ) 是p s d 区含量最丰富的蛋白之一【4 引。p s d 9 5 在神经突触上发 挥着重要的功能，它能够通过抑制蛋白的侧向扩散和细胞内吞作用，稳定突触后膜 上蛋白间的相互作用，调节蛋白在突触中的定位【4 9 1 。同时，p s d - 9 5 在稳定突触连 接和调节离子型谷氨酸受体通路过程中有着重要的作用【5 0 】。p s d - 9 5 还能够影响甘 氨酸、乙酰胆碱等神经递质在突触间的传递【5 。长期记忆形成中需要神经元间构成 大量稳定的突触连接，而p s d 9 5 在此过程中有着关键的功能。另有研究显示泛素 蛋白酶体系统直接或间接的调节突触后致密区蛋白9 5 的含量，蛋白酶体能够降解 磷酸化的s p a r ( s p i n e a s s o c i a t e dr a pg t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n ) ，s p a r 的降解能导 致突起数量的减少和p s d 9 5 蛋白含量的降低【3 l 】。因此，泛素一蛋白酶体系统对 p s d 。9 5 的作用可能会影响突触间的连接甚至记忆的形成。 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 6 r a u 蛋白与突起形态和认知功能的关系 t a u 蛋白是神经元内主要的微管相关蛋白之一，其在促进微管的组装和稳定微 管的结构中有着重要的作用。微管是神经元细胞骨架的主要成分之一，微管的稳定 性直接影响神经元的突起形态，因此，t a u 蛋白的微管结合功能影响着突起形态的 变化。t a u 蛋白的功能主要受磷酸化等翻译后修饰的调控。t a u 蛋白的异常过度磷 酸化修饰会降低其微管结合功能，并且在细胞内聚集形成n e t s ，进而影响神经元 的突起形态f 5 2 , 5 3 】。在a d 中，t a u 蛋白的异常过度磷酸化和聚集形成n f t s 是a d 的 重要病理特征之一，也是导致脑内神经元形态变化和认知功能下降的原因t g , s 4 】。同 时，在动物水平的研究也表明t a u 蛋白的异常过度磷酸化修饰会导致动物学习记忆 能力的下降【5 5 】。t a u 蛋白的磷酸化主要受蛋白激酶和磷酸酯酶的调控，蛋白激酶促 进t a u 蛋白的磷酸化，而磷酸酯酶降低t a u 蛋白的磷酸化。但最近的研究发现泛素 蛋白酶体系统也参与调控t a u 蛋白的磷酸化过程，过度磷酸化的t a u 蛋白形成了双 股螺旋丝结构( p a i r e dh e l i c a lf i l a m e n t s ，p h f ) ，其中p h f - t a u 不仅被磷酸化还被泛素 化，同时体外的研究也证明抑制蛋白酶体活性会导致t a u 蛋白的磷酸化程度升高 【1 6 5 5 1 。 1 7 本研究的目的及意义 鉴于蛋白酶体系统对神经元突起形态，c r e b 活性，p s d 9 5 含量和t a u 蛋白磷 酸化的影响以及这些形态和蛋白质在认知功能中的作用。因此，本实验初步探究了 抑制蛋白酶体活性对小鼠空间认知能力的影响，以及海马区神经元突起形态，c r e b 活性，p s d 9 5 含量和t a u 蛋白磷酸化等的变化。为了便于研究的开展和机制的深入 探究，本研究首先在n 2 a 细胞中研究了抑制蛋白酶体活性对神经元突起形态，c r e b 活性，p s d 9 5 含量和t a u 蛋白磷酸化的影响。继而以昆明小鼠( m u s m u s c u l u s ，k m ) 小鼠为模型，研究抑制蛋白酶体活性对认知功能的影响以及神经元突起形态，c r e b 活性，p s d 9 5 含量和t a u 蛋白磷酸化的变化。通过以上的研究期望对蛋白酶体在动 物认知过程中的作用及其可能机制进行初步探讨，为进一步研究蛋白酶体的功能提 供了一定的实验依据。 6 第二章蛋白酶体活性抑制对n 2 a 细胞神经突起和记忆相关蛋 白的影响 2 1 引言 神经元的突起数量及长度在认知功能的形成过程中发挥重要的作用。神经元突 起数量的增多，突起长度的延长以及突起上树突棘的增加都会促进记忆的形成。神 经元突起的形态变化过程中存在大量蛋白质降解过程，而蛋白酶体活性则影响蛋白 的降解进而影响突起形态【1 3 】。此外c r e b ，p s d 9 5 和t a u 蛋白作为记忆相关蛋白都 会影响记忆的形成。c r e b 能够促进记忆形成所需要的特定蛋白的表达畔】，而 p s d 9 5 能够稳定突触连接和促进神经递质的传递【4 9 】。t a u 蛋白在促进轴突的延伸和 稳定突起的形态过程中有着重要作用。同时大量的研究显示泛素蛋白酶体系统参与 调控c r e b 活性、p s d 9 5 的含量以及t a u 蛋白的正常功能1 3 4 加】。本实验中在n 2 a 细胞水平上探究了抑制蛋白酶体活性对神经元突起的影响以及c r e b 活性、p s d 一9 5 含量和t a u 蛋白的磷酸化水平的变化。 2 2 材料和方法 2 2 1 主要试剂 过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e , a p ) ，苯甲基磺酰氟( p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e p m s f ) ，脱氧胆酸钠( d e o x y c h o l i ca a c i ds o d i u n ls a l t ，d o c ) ，牛血清白蛋 白( a l b u m i nb o v i n evb s a ) ，甘氨酸( g l y c i n e ) 均购于b l o s h a r p 公司。t r i t o nx 1 0 0 ， 溴酚蓝( b r o n p h e n o lb l u e ) ，脏p e s ，b 巯基乙醇( 1 3 - m e r e a p t o e t h a n 0 1 ) ，t w e e n - 2 0 均购于a m l s c