（高分子化学与物理专业论文）聚乙烯撑碳酸酯类高分子酶载体的合成与性能研究.pdf

物载体可作为固定化酶等具有游离胺基的生物活性物质分子。 本文选择制糖工业中重要的酶之一一淀粉糖化酶为研究对象，对固定于乙烯撑碳酸酷均聚物载体上的淀粉糖化酶的性质进行了 研究。同时也对溶液淀粉糖化酶的性质进行了 研究。 通过对比 溶液淀粉糖化酶和固定化淀粉糖化酶的 性质，发现固定化淀粉糖化酶的性质发生了改变:溶液淀粉糖化酶催化淀粉底物反 应的 适宜p h值范围 为4 - 5 ， 而固 定化 酶催化反 应的 适宜p h值向 碱性方向发生偏移;溶液淀粉糖化酶催化淀粉底物反应的最适温度范围为 5 0 - 6 0 c ，固定化酶催化反应的最适温度范围变窄为 5 5 0c ;溶液淀粉糖化酶催化淀粉底物反应时存在底物抑制作用，开始时酶促反应速率随底物浓度增加而增大，但底物浓度过高，酶促反应速率反而下降，固定化酶催化淀粉底物反应时底物抑制作用和外扩散限制效应同时存在， 不仅存在底物浓度过高酶促反应速率反而下降的现象， 而且固定化酶达到最大活力时的底物浓度有所提高。 本文对固定于乙 烯撑碳酸酩一 甲 基丙烯酸一 p 一 经乙 r e 、乙 烯撑碳酸酩一 甲 基丙烯酸一 p 一 轻乙酷一 丙烯酸经丙酷和乙 烯撑碳酸醋一 丙烯酸轻丙0三类共聚物交联载体上的淀粉糖化酶的固定化条件、固定化酶的性质、以及载体性能对固定化酶相对活力的影响进行了 研究。发现淀粉糖化酶固定于乙 烯撑碳酸酷一 甲 基丙烯酸一 p 一 轻乙 酷交联载体上的 最佳浓度为2 8 u / m l ， 最佳 p h值为5 .3 8 ， 最佳的固定化时间为 1 6 h 。当酶固定于乙 烯撑碳酸醋一 甲 基丙烯酸一 p 一 轻乙 酷载体 s 3 5上以后，与溶液酶相比，固定化酶的性质发生了一定程度的变化:固定化酶达到最大相对活力时， 酶促反应时间需要延长，催化淀粉反应时的最佳 p h值向 碱性方向发生偏移，酶促反应最适温度在 5 56 0 范围内 ( 溶液酶催化淀粉反应的最适温度范围为 5 06 0 0c ) ，与溶液酶相比，固定化酶进行酶促反应时存在外扩散效应与内扩散效应，因此达到最大相对活力时的底物浓度有所提高，酶在固定化后的储存稳定性有显著提高， 储存2 6 天后相对活力仍保持原来活力的8 4 %左右。并且酶在反复使用六次后仍能保持较高的活力。当酶固载于乙烯撑碳酸醋一 甲 基丙 烯 酸一 p 一 轻乙 醋 载体 s 3 0 上后， 与 溶液酶 相比， 最 佳p h值范围 没有发生变化:最适温度范围变得更宽;同样，在达到最大相对活力时需要更高的底物浓度。 淀粉糖化酶固 定于乙 烯撑 碳酸 酷 一 甲 基丙 烯酸 一 p 一 轻乙 醋 一 丙 烯酸 经丙m e 交联载体s 5 9 上的最佳 浓度为3 2 u / m l ， 最 佳p h值为6 .0 0 ， 最 佳的固 定化时间为2 4 h 。固 定化酶催化淀粉时的 最佳p h值向 碱性方向 发生偏移:酶促反应最适温度为 5 0 0c ;与溶液酶相比，固定化酶进行酶促反应时达到最大活力时的底物浓度有所提高。淀粉糖化酶固定于乙烯撑碳酸酷一 丙烯酸轻丙酷交联载体 s 4 7上的 最 佳 浓 度为2 4 u / m l ， 最 佳固 定 化时 间 为2 0 h 。 固 定 化 酶 作 用的 最 适 温 度范围变得更宽，并且储存稳定性有显著提高，在储存5 0 天后，相对活力仍能保持原来活力的 9 0 % 左右。对这三类共聚交联载体而言，固定化酶载体的单体配比和致孔剂及其含量对固定化酶的活力也有影响。关 键 词 : 乙 烯 ， 碳 赢 粉淀粉糖化酶，固 定 化 募聚 合 物 载 体 ， 甲 基 丙 烯酸 一 p 一” 沙丙烯酸轻丙酉 旨乙 烯 基 毗 咯 烷 酮 溶 胀 行 为胺解反应。 卜加洲f| 飞从乙如叼 卜城才州 、门沪口r、ab s t r a c t c y c l i c c a r b o n a t e g r o u p s o f p o l y ( v i n y l e n e c a r b o n a t e ) o r p o l y ( v i n y l e n e c a r b 6 n a t e -h y d r o p h i l i c m o n o m e r ) c a n r e a c t e as i l y w i t h a m in o g r o u p s i n b i o m o l e c u l e s u n d e rm i l d c o n d i t i o n s w i t h o u t a c t i v a t i o n . t h u s p o l y m e r s o f v i n y l e n e c a r b o n a t e m a y b e u s e das s u p p o r t s o f b i o m o l e c u l e s w i t h f r e e a m i n o g r o u p s f o r t h i s p u r p o s e , f i r s t ly v i n y l e n e c a r b o n a t e w as s y n t h e s i z e d . t h e n p o l y ( v i n y l e n ec a r b o n a t e ) w as s y n t h e s i z e d b y u s i n g b u l k p o l y m e r i z a t i o n , a n d p o l y m e r s o f v i n y l e n ec a r b o n a t e - h y d r o x y e t h y l e n e m e t h a c ry l a t e , v i n y l e n e c a r b o n a t e - h y d r o p r o p a n e a c ry l a t e ,v i n y l e n e c a r b o n a t e - h y d r o x y e t h y l e n e m e t h a c ry l a t e - h y d r o p r o p a n e a c ry l a t e , a n dv i n y l e n e c a r b o n a t e 小v i n y l - 2 - p y r r o l i d o n e w e r e s y n t h e s i z e d b y a n t i - p h a s e s u s p e n s i o np o ly m e r i z a t io n i n p a r a f f i n o i l , w i t h d i ff e r e n t d i l u e n t a g e n t s s u c h a s e t h a n o l , e t h y l e n eg l y c o l , g l y c e r o l , d i e t h y l e n e g l y c o l a n d 1 , 1 , 1 - t r i m e t h y l o l p r o p a n e . t h e p r o p e r t i e s o fp o l y m e r s w e r e m e as u r e d b y i r s p e c t r a a n d s e m , a n d t h e s w e l l i n g p r o p e r t i e s o fp o l y m e r s i n d i ff e r e n t s o l v e n t s a n d d i s t i l l e d w a t e r w e r e a l s o s t u d i e d . t h e k i n e t i c s o f a m i n o l y s i s r e a c t i o n o f e t h y l e n e c a r b o n a t e a n d p o l y ( v i n y l e n ec a r b o n a t e - h y d r o x y e t h y l e n e m e t h a c ry l a t e ) b y e t h a n o l a m i n e , d i e t h a n o l a m i n e a n db u t y l a m i n e w e r e s t u d i e d . t h e a m i n o l y s i s r e a c t i o n v e l o c it y c o n s t a n t o f e t h y l e n ec a r b o n a t e b y e t h a n o l a m i n e , d i e t h a n o l a m i n e a n d b u t y l a m i n e w e r e o b t a i n e d u n d e rd i ff e r e n t r e a c t i o n c o n d i t i o n s . t h e p r o d u c t s o f a m i n o l y s i s r e a c t i o n b e t w e e n p o ly m e ra n d a m i n e w e r e s t u d i e d b y i r s p e c t r a a n d e l e m e n t a n a l y s i s . t h e p e a k o f c y c l i cc a r b o n a t e g r o u p s d i s a p p e a r e d , a n d t h e r e w e r e n i t r o g e n e l e m e n t i n t h e a m i n o l y s i sp r o d u c t . i t w a s s u g g e s t e d t h a t c y c l i c c a r b o n a t e g r o u p s o n t h e p o l y m e r m a t e r i a l s c o u l de as i l y r e a c t w i t h a m i n o g r o u p s u n d e r m i l d c o n d i t i o n . g l u c o a m y l as e( e c . 3 .2 . 1 .3) i s o n e o f t h e i m p o r ta n t e n z y m e s i n t h e c o u r s e o fr e f i n i n g s u g a r f r o m s t a r c h . t h e p r o p e rt i e s o f n a t i v e g l u c o a m y l as e a n d i m m o b i li z e dg l u c o a m y l a s e o n t h e p o l y m e r o f v i n y l e n e c a r b o n a t e w e r e i n v e s t i g a t e d . c o m p a r e dw i t h n a t i v e g l u c o a m y l a s e , t h e p r o p e rt i e s o f i m m o b i l i z e d g l u c o a m y l as e c h a n g e d . t h eo p t i m u m p h v a l u e o f n a t i v e g l u c o a m y l as e w as 4 - 5 , w h e r e a s i t w a s 5 . 8 0 f o r t h ei m m o b i l i z e d g l u c o a m y l as e . t h e o p t i m u m r e a c t i o no f n a t i v eg lu c o a m y l a s e w a s 5 06 0 0c , w h e r e as it w as 5 5 0c f o r t h e i m m o b i l i z e d g l u c o a m y l a s et h e o p t i m u m s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n w a s 2 % f o r n a t i v e g l u c o a m y l ase , a n d 6 % f o r t h ei m m o b i l i z e d g l u c o a m y l a s e . g l u c o a m y l as e w as a l s o i m m o b i l i z e d o n t o n o v e l p o r o u s p o l y ( v i n y l e n e c a r b o n a t e -h y d r o p h i l i c c o m o n e m e r ) s u p p o rt s . t h e p r o p e rt i e s o f i m m o b i l i z e d g l u c o a m y l as e a n dt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n im m o b i l i z e d e n z y m e a n d p o r o u s p o l y m e r s u p p o rt s w e r ei n v e s t i g a t e d . t h e i m m o b i l i z e d g l u c o a m y l as e h a d w i d e r t e m p e r a t u r e p r o f i l e t h a nn a t i v e e n z y m e , a n d t h e o p t i m u m p h w as c h a n g e d c o m p a r e d w i t h t h e n a t i v e e n z y m e .t h e o p t i m u m s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n f o r i m m o b i l i z e d g l u c o a m y l a s e w a s h i g h e r t h a nt h a t u s e d f o r n a t i v e e n z y m e . f o r g l u c o a m y l a s e i m m o b i l i z e d o n t o s u p p o r t s 3 5 , a ft e rs t o r a g e f o r 2 6 d a y s , i t s t i l l h a d a b o u t 8 4 % o f i t s i n it i a l a c t iv i t y , a n d a ft e r u s e dr e p e a t e d l y f o r 7 t i m e s , t h e i m m o b i l i z e d e n z y m e s t i l l m a in t a i n e d a b o u t 8 5 % o f i t si n i t i a l a c t i v i t y . f o r g l u c o a m y l as e i m m o b i l i z e d o n t o s u p p o rt s 4 7 , a ft e r s t o r a g e f o ra b o u t 5 0 d a y s , i t s t i l l m a i n t a i n e d a b o u t 9 0 % o f it s i n i t ia l a c t i v i t y . f u r th e r m o r e , t h ep r o p e rt i e s o f p o r o u s p o ly m e r s u p p o rt s h a d e ff e c t o n t h e r e l a t i v e a c t i v i t y o f t h ei m m o b i l i z e d g l u c o a m y l a s e .k e y w o r d s : v i n y l e n e c a r b o n a t e , g l u c o a m y l as e , i m m o b i l i z e d g l u c o a m y l a s e , p o r o u sp l y m e r s u p p o rt s , h y d r o x y e t h y l e n e m e t h a c ry l a t e , h y d r o p r o p a n e a c ry l a t e , 1 - v i n y l - 2 -p y r r o l i d o n e , s w e l l i n g b e h a v i o r , a m i n o l y s i s r e a c t i o n1 1南开大学博士学位论文第一章绪论摘要 本章主要介绍固定化酶方面的有关概念并对淀粉酶的固定化进行文献综述。内容主要包括固定化酶及常用的固定化酶载体、 固定化酶的制备方法、 固定化酶的性质和固定化酶的应用以及研究固定化酶的意义等。 对由乙烯撑碳酸酷单体制备含反应性环碳酸酷基的亲水性固定化酶载体的合成方法和应用前景进行了评述， 确定此类含活性功能基的载体具有稳定性好、 适用范围广、 使用方便等特点。在此基础上， 提出了本论文工作的思路为从合成乙烯撑碳酸a el 单体出发， 通过本体聚合法制备乙烯撑碳酸酷均聚物载体， 并选择几种合适的亲水性单体与乙 烯撑碳酸醋进行自由基共聚合， 于反应体系中加入交联剂和不同的致孔剂以制备亲水性的共聚交联载体，并且选择制糖工业中重要的酶之一一淀粉糖化酶为研究对象，对固定于乙烯撑碳酸酷类聚合物载体上的淀粉糖化酶的性质进行系统研究。关键词:固定化酶，聚乙烯撑碳酸酷，载体，反相悬浮聚合盛丑 卫 遭鱼全赳迷区一 1 . 1引言 酶是一类分子量适中的蛋白 质， 存在于所有的活细胞中， 是天然的高分子催化 剂 ， 在 性 质 上 不同 于 合 成的 催 化 剂 川 ， 其 表 现 在 三 个 方 面 : ( 1 ) 催 化 效 率 极 高 ;( 2 ) 对反应物和产物有特异性; ( 3 ) 控制的灵敏性。 尽管酶有这些优点， 但由于它的不稳定性、 价格昂贵以及不能回收和重复使用 而 使 工 业 应 用 受 到 限 制。 为了 克 服 这 些 缺 点 ， 有 两 种 可 行 的 办 法 12 1 . ( 1 ) 利 用 有机化学合成方法合成具有生物活性的 催化剂; ( 2 ) . 将酶固定在载体上， 使之不溶于水， 这种技术为“ 固定化酶技术”。固定化酶的优点在于不但仍然保持着酶的高度专一性和高催化效率， 而且还具有类似于离子交换树脂的 优点3 1 ，即: ( 1 ) . 具有一定的机械强度， 可用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，可使反应过程实现管道化、 连续化和自 动化; ( 2 ) . 固定化酶在使用前可以 充分洗涤，不带进杂质， 在反 应中酶与产物可以自 然地分开， 所以产物容易提纯，收率也较高; ( 3 ) . 反应后固定化酶能够很方便地从反应液中分离出 来， 并可重复使用，比较经济; ( 4 ) 酶在经过固定化以 后， 稳定性大为提高，可较长期地使用和贮藏。 a - 淀粉酶 ( e c .3 .2 . 1 . 1 ) ( a - 1 ,4 - 葡聚糖- 4 - 葡聚糖水解酶) 广泛分布于动物界 ( 唾液、 胰脏) 、 植物界 ( 麦芽、 植物种子) 和微生物界。 它只作用于直链淀粉、支链淀粉和糖元中直链部分的a - 1 ,4 糖昔键， 但对a - 1 ,6 键和支链部分并不具有水解作用4 1 。 所以， 仅有a - 淀粉酶单独作用于淀粉时， 则是会形成由 数个葡萄糖聚合成的寡糖和a 一 极限糊精， 而葡萄糖只有少量形成。 因此， a - 淀粉酶对于淀粉溶液的主要作用是降低其粘度。 一般情况下， 淀粉液经糊化后就成为糊状， 粘度非常大， 但淀粉浓度在2 0 %以上时， 糊化后就不呈溶液的状态而成为固态，此时如以a - 淀粉酶作用， 这种固体就将会被转化为液态， 顾名思义， a - 淀粉酶亦可称之为 液 化酶 15 1 。 大多 数 a 一 淀 粉 酶的 分子 量 在5 0 ,0 0 0 - 5 5 ,0 0 0 之间 。 而 所 有的 a - 淀 粉_南开大学博士学位论文酶都是 c 扩 十 金属酶 6 1 ， 每个单元上 至少 有一 个c 扩 十 离 子。 c 扩 + 离子的 存在活 化了 a一 淀粉酶，同 时也 使酶在 p h 值为 5 .5 - 8 . 0 范围内 保持 稳定。 淀粉糖化酶 ( e c .3 .2 . 1 .3 ) ( a - 1 ,4 - 葡聚糖葡萄糖水解酶) 不同于a 一 淀粉酶，其作用是自 淀粉的非还原性末端， 依次水解a - 1 ,4 糖昔键形成葡萄糖，并可将支链淀粉及糖元中的a - 1 , 6 键断开。淀粉糖化酶的氨基酸组成目 前还不太清楚， 但已经确定其分子量为6 0 , 0 0 0 左右， 包含有8 个自由的胺基， 其中只有1 个位于活性中 心，另外7 个位于表面 7 1 。这种酶以 前主要是由 霉菌所生产， 但现在除霉菌外使用其他微生物也达到工业生产的水平 5 1 。由 于微生物菌株的不同， 对淀粉的 分解限 度也不同， 有些只有7 0 % 左右， 即使是同一淀粉糖化酶， 对a - 1 , 6 键的分解能力也各不相同。 能完全分解淀粉的淀粉糖化酶称为根霉型糖化酶， 其他称为黑曲霉型。淀粉糖化酶的性质见表1 . 1 。t a b l e 1 . 1 t h e p r o p e rt i e s o f g l u c o a m y l asero o t mi l d e ws p e r g i l l u s n i g e ro p t i m u m p hp h ( 3 0 0c , 2 4 h ) s t a b i l i t yh e a t ( p h 5 , 1 5 m i n ) s t a b i l it yi s o e l e c t r i c p o i n t p h4 . 53 . 83 . 5 - 8 刀2 . 2 - 7 . 55 0 - 5 5 c7 . 45 0 -7 0 0 c6 . 5 由于大分子中富含葡萄糖结构单元的淀粉廉价易得、 资源丰富， 所以自1 8 1 0年以 来一 直在科 技和产业界 倍受 重视8 1 淀 粉的 水 解可由 酸、 酶或 两者共同 实 现。由于酶的作用具有明显的专一性， 所以 人们对酶催化的淀粉水解进行了广泛的研究。 淀 粉水 解通 常由 两步 完 成 9 1 ， 即: ( 1 ) a - 淀 粉 酶 对 淀 粉作 用形 成 各 种 低分 子的 麦芽糊 精中间 产物 和少 量葡萄 糖， 为 液化过 程; ( 2 ) .淀粉糖化酶作用于 低分 子的中间产物生成葡萄糖，为糖化过程。 2 0 世纪五十六十年代， 固定化酶技术的兴起对淀粉水解工业产生了巨大的影响。 通过将。 一 淀粉酶和淀粉糖化酶固定于不溶于水的载体上， 可降低生产成本，并可实现连续化操作，能更精确地控制反应， 并能得到高质量的产品， 可使酶催 _ _ 一眨哒堂竺址越送区一一一一一一化技术更加适 应生 产连续 化 和自 动 化的 要 求 1 0 。 目 前， 固 定 化a - 淀粉酶己 有商品出售。固定化淀粉糖化酶正在研究之中。 近年来， 有人又把兴趣投向。 一 淀粉酶和淀粉糖化酶的共固 定化研究中 1 1 , 1 2 1 ， 目 的是为了 把两步反应合二为一， 即 在恒定条 件下 ( 不需调节温度、 p h 值) 完成淀 粉至葡萄 糖的 一步 法直接转化， 能 简化生产工艺，提高生产效率。 但是由 于两种酶作用的最适温度和p h 值不同，至今没有取得令人满意的结果。 综上所述，由于固定化酶的优点十分突出， 且比 游离酶更为稳定， 进而适应于生产的连续化和自 动化， 因此许多科学家对淀粉糖化酶的固定化研究至今尚未间断。1 .2固定化酶载体 作为固定化酶的载体可以是大小、 性状、 密度和孔隙度不同的天然或合成的有机或无机材料，可以是片状、 管状、纤维状或筒状， 最通用的是球状 13 。 但总的对载体的要求为 1 4 1 . ( 1 )载体表面应具有化学活性基团，这些基团可以直接与酶分子偶联，或经过较为温和的化学方法活化后与酶分子偶联， 这是化学偶联制备固定化酶的前提; ( 2 )载体应具有一定的容量，可以偶联足够量的酶分子。 这对于提高实验效率和降低成本都很重要; ( 3 )载体应是惰性的。载体的作用仅是使酶分子固定化，而不应干扰酶分子的功能; ( 4 )载体应具有足够的物理和化学稳定性; ( 5 )用于亲和色谱的载体，还应具有合适的粒度和孔径结构; ( 6 )廉价易得。实际上， 很少有一种载体材料能完全满足上述所有条件。 一般总是根据工作南开大学博士学位论文需要选择比较合适的载体。1 . 2 . 1无机载体材料1 . 2 . 1 . 1硅胶 多孔硅胶 ( p o r o u s s i l i c a )是一类常见的无机材料。人们往往根据不同的需要选择多孔硅胶的 颗粒直径和孔径。 一般颗粒直径在0 . 1 - 0 .5 m m 之间 9 , 1 5 , 1 6 ， 孔径在1 0 - 5 0 0 m n 之间， 但也有使用小颗粒硅胶 ( 颗粒直径为7 - 2 0 u m ) 1 7 ,1 8 的 报导。 硅胶表面的活性基团主要为轻基 ( 硅醇基) ， 其活化方法主要是用含有胺基的有机硅氧烷 ( 如3 - 氨丙基三乙氧基硅烷) 处理载体， 再用戊二醛等双功能基试剂把酶与载体连接起来。1 . 2 . 1 .2可控孔玻璃 可 控孔玻璃c c p g ) 具 有许多 理 想载体的 特性 1 4 1 ， 它 质地坚硬并 且不受 操 作压力 和洗涤剂 组分、 p h 值、 离子强 度的 影响。 其孔径均匀， 具有 确定的 排阻限度， 相当明显的分辨力和卓越的重复性。 可控孔玻璃不受微生物的侵蚀， 并能承受高压灭菌。 因此， 用其作为载体来研究固定化(x - 淀粉酶和淀粉糖化酶的报导很多 1 8 -2 5 1载体使用的形式有两种: 一种为球状，直径在7 4 - 4 0 0 u m 之间，孔径在5 0 - 7 0 n m 之间，也有使用较小 ( 8 n m)和较大孔径 2 9 0 n m)的例子;另一种为玻璃纤维状，直径为2 3 u m ， 孔径为3 0 n m . 可控孔玻璃的活化方法与硅胶类似， 也是先用有机硅氧烷活化， 再用双功能基试剂将载体与酶连接。1 . 2 . 1 . 3其它 用氧化铝作为载体，固定化a 一 淀粉酶和淀粉糖化酶的 研究并不多见。 j e n n ye m n e u s 2 5 用氧化铝作为载体，分别用氨丙基三乙 氧基硅烷和聚乙二胺作为活化 1 3 f 遇 兰鱼丝一一一一一一一剂对载体活化， 而后用戊二醛连接活化后的载体和酶， 并对两者进行比较， 结果发现， 前者优于后者。 此外， 还有报导直接将淀粉糖化酶固定在铂电极上制成酶电 极2 6 。 也有 报导 将淀粉糖化酶固 定 在水合氧 化错制 成的 金 属膜上2 7 11 . 2 . 2天然有机载体材料 1 . 2 .2 . 1纤维素 纤维素是较早用于固定化酶的 载体材料， 其化学本质为p - d - 葡萄糖的1 ,4 一 线型聚合物，没有分叉结构 ( 见图1 . 1 )，链与链之间以氢键结合，但各部分氢键密度不同 14 1 ，密度较大的区域称为“ 结晶区”， 密度较小的区域称为 “ 无定形区”。 纤维素廉价而来源充足， 具有较好的稳定性， 也可以高压灭菌。因此， 许多研究者以 此来作为固定化a - 淀粉酶和淀粉糖化酶的载体8 , 1 1 , 1 2 ,2 8 -3 0 1 。 纤维素上的相关活性基团与酶进行偶联的反应主要发生在 “ 无定形区”，而处于 “ 结晶区”的活性基团则不能被利用， 于是限制了偶联容量的提高， 并且增加了非特异性吸附。 许多研究者在改进纤维素性状方面做了 工作， 如制备纤维素凝胶3 1 ， 纸状纤维素3 2 1 等。、c h2 0 h5 些旦hoo h o i lho hf i g . 1 . 1 t h e f r a m e w o r k u n i t o f c e l l u l o s e1 . 2 . 2 . 2琼脂糖凝胶 琼脂糖是由 琼脂分离制备的 链状多糖， 它的结构单元是d 一 半乳糖和3 , 6 一 脱水- l 一 半乳糖，见图1 .2 。琼脂糖凝胶是一种大网孔型凝胶，其骨架是由许多琼脂糖南开大学博士学位论文链互相盘绕形成的绳状琼脂糖束， 链间主要以 氢键结合在一起。 凝胶具有亲水性和疏松性，因此分子量超过1 0 6 的大分子可以自由进出凝胶颗粒。 琼脂糖凝胶具有良 好的惰性， 不会发生离子交换反应， 对生物大分子的非特异性吸附很低， 可以用c n b r 活化3 3 , 3 4 1 方法共价结合a - 淀粉酶，也可直接用于吸附a - 淀粉酶3 5 1ch2 ohf i g . 1 .2 t h e fr a m e w o r k u n i t o f g e l o s e 1 . 2 . 2 .3葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是一种微网孔凝胶， 其基本骨架为葡聚糖， 糖链间通过醚桥相互交联形成三维空间网 状结构。 可以 用t i c l ; 活 化法固定 淀粉糖化酶3 5 1 。 也有些 研究者在葡聚糖上引入离子型基团，并用c n b r 法活化，以 考察固定化淀粉糖化酶的 微环境效应3 6 ,3 7 1 。 结 果发 现， 将亲水性多 糖类载 体引 入阳 离子或阴 离子 基团 后，其抗菌性能明显提高。 因而可在一定程度上放宽其贮存条件和延长使用寿命。 1 .2 .2 .4海藻酸盐类 近年来， 有人用海藻酸盐 作为载体固定化a 一 淀粉酶和淀粉糖化酶。 如c h i t h r a等人3 s 似海藻酸钠为载体，用氰尿酞氯 ( c 3 n 3 c l 3 ) 活化后固 定化淀粉糖化酶。c h e in - s h y o n g s u 等 人 3 9 )用 海 藻 酸 钙 为 载 体 ， 对 a - 淀 粉 酶 和 淀 粉 糖 化 酶 进 行 吸 附 研究。 另 外， s o m e r s 等 人 4 0 把 海 藻 酸 盐 与 交 联 淀 粉结 合 起 来制 成小 球， 作 为 a 一 淀 粉酶的吸附剂。1 .2 . 2 .5骨类骨质主要由两种成分构成， 即有机质和无机质， 有机质中大部分为胶原， 而 一速鱼叁到玺造巡鱼左一一一一一一无机盐主要为磷酸钙。 基于酶蛋白可能与磷酸钙和胶原蛋白的氨基酸侧链之间存在 着 离 子 相 互 作 用， s c h a fh a u s e r 和 s t o y e y 4 1 ,4 2 1将 淀 粉 糖 化 酶 吸 附 于 鸡 骨 上 进 行 研究。 结果发现酶蛋白与载体之间的结合力较强。 因此推断， 酶蛋白还可能与胶原蛋白 上的其 他侧基发生 疏水相互 作 用。 此外， m u k a t a k a 等4 3 1 还利 用猪骨先吸附 淀粉糖化酶， 后用戊二醛交联， 对淀粉水解进行了研究。 利用此类载体的优势为载体廉价，自 然资源广，当酶的活力耗尽之后， 载体还可以作为动物的食物再行利用。 1 . 2 .2 .6蛋白 质 由于蛋白 质载体可以提供酶固定化的多种基团，以及它特有的物理一 化学性质， 所以近年来， 人们对此类载体产生了兴趣. 如有人将a - 淀粉酶通过化学交联法固 定于照相用明 胶上 4 4 1 。 又 有将一 淀粉酶 通过 糖基化作 用固定 于 食用蛋白( 酪蛋白 ) 上 4 5 1 ， 结 果 发 现当 p h 值 大于 5 时， 载 体蛋白 出 现自 溶 和 老 化 现象。 还 有 r a j u等将淀粉糖 化酶用戊二醛 交联 法固 定于 鸡蛋白 上 【4 6 1 ， 活力 只 有游离 酶的 3 5 % 。 这类载体总的来说无毒、 廉价， 但由 于载体也是蛋白 质， 所以 酶在固定化后对变性剂如尿素等的抵抗力没有增加。1 . 2 . 2 . 7其他 甲 壳质 ( c h it i n ) 是由 2 一 乙 酞氨基一 2 ， 脱氧- d - 葡萄糖通过p - 1 ,4 一 糖昔键组成的聚合物，为链状化合物，不存在分支结构。 f r e i r e 等4 7 以甲 壳质为载体， 用戊二醛和己二胺活化后将淀粉糖化酶固定于载体上， 即可用于水解淀粉。 此外， 农业生产中的玉米渣依次被偏高碘酸钠氧化， 乙二胺活化后， 用戊二醛可将a - 淀粉酶以 共价键形式结 合于载体上1 5 1 。 还有天 然淀粉经过接枝丙 烯腊和丙 烯酞胺的 两亲性高分子化合物后，用于物理吸附淀粉糖化酶4 8 1南开大学博士学位论文 1 .2 .3合成有机载体材料 为适应固定化酶的需要， 化学家们通过乳液聚合、 悬浮聚合以 及辐射聚合等方法， 选用各种单体、 交联剂、引发剂及致孔剂， 制得了一系列优质的固定化酶载体材料。 1 . 2 . 3 . 1丙烯酸衍生物 1 .2 .3 . 1 . 1聚丙烯酞胺凝胶 聚丙烯酞胺凝胶是由 单体丙烯酞胺、 交联剂 n ,n 一 亚甲 基双丙烯酞胺加适量的引发剂如 n ,n ,n ,n ，一 四甲 基乙 二胺及过硫酸按聚合而成， 可将淀粉糖化酶包埋于其中4 9 聚丙烯酞胺凝胶耐微生物侵蚀， 具有较好的化学稳定性， 但由于聚丙烯酞胺凝胶的机械稳定性能较差， 并且由于网孔较小， 因而大分子底物不能自由 进入凝胶颗粒。此外，产物在凝胶颗粒中的扩散尚有待于进一步研究。 1 .2 . 3 . 1 .2丙烯腊一 醋酸乙烯一 二乙烯苯共聚物 丙烯睛一 醋酸乙烯一 二乙 烯苯三元共聚物系由悬浮聚合法制备，在制备过程中加入不同的 惰性溶剂以 研究载体的多孔性能5 0 l 。 载体制备完成后， 用乙 二胺胺解， 在载体上引入乙 胺基， 之后用戊二醛法固定淀粉糖化酶。 这种载体的 特征为亲水性高，孔径大小可由不同的致孔剂进行控制。 1 .2 . 3 . 1 . 3聚甲 基丙 烯 酸一 p 一 轻乙 酷 有人用低 温辐射聚合法直接将+ - 淀粉酶固 定于聚甲 基丙 烯酸一 r - 轻乙 醋载体上5 n ， 可以 尽可能保持酶的活性。 载体呈微孔结构， 其亲水性随所加入的甲 基丙烯酸一 p - t -1 乙 酷单体浓度的 提高 而下降， 并具 有线性关系。 这是由 于随 着单体浓度的增大，会使载体孔洞变小，进而导致亲水性下降所致。 鱼压星迎型遗渔丝这一一一一一一 1 .2 .3 . 1 .4甲 基丙烯酸缩水甘油醋 ( g m a ) 和n 一 异丙基丙烯酞胺 ( n i p a n )共聚物 甲 基丙烯酸缩水甘油醋 ( g m a ) 和n 一 异丙基丙烯酞胺 ( n i p a n )的 共聚物由 过 硫 酸 钱和 硫 酸 氢 钠引 发 聚 合15 2 1 。 淀 粉酶 通 过 g m a 上的 环 氧 基团 与 载体 偶 联。这种载体一 酶的固定化体系于3 2 以 下可溶于水， 而升高 温度至4 4 后， 转而不溶于水， 这样就可以 在水相催化淀粉水解， 反 应完成后升高 温度， 固定化酶就可以从反应介质中分离出来，重复使用。 1 .2 .3 . 1 . 5甲 基丙烯酸一 甲 基丙烯酸甲 醋系共聚物 此 类 载 体 能 根 据 反 应 介 质中 p h 值的 变 化 而 改 变 溶 解 性 (5 3 1酶 在 溶 解 状 态 下与高分子量或不溶性底 物作用。 反 应完成后， 通过稍 微降 低反 应介质的 p h 值，即可使载体一 酶体系不溶于水， 可轻易分离固定化酶体系与反应介质。 1 .2 .3 . 1 .6丙烯酸丁酷一 二甲 基丙烯酸乙 撑酷共聚物 将丙烯酸丁醋一 二甲基丙烯酸乙撑酷共聚物胺解，之后用戊二醛固定化淀粉糖 化酶 17 1 ， 结 果 发 现 胺 基 含 量 较 少的 载 体 更 适 合 淀 粉 糖 化酶 的 固 定。 此 外， 将酶于固定化之前先用少量戊二醛交联可确保其操作稳定性。1 .2 .3 .2苯乙 烯衍生物1 .2 .3 .2 . 1磺酸基苯胺基聚苯乙烯犷丫 s o 3 h夕犷 卜 s 0 3 h少、f i g . 1 . 3 t h e f o r m a t i o n o f p o l y s t y r e n e w i t h a n i l i n e g r o u p s磺酸基苯胺基聚苯乙烯是一种离子型多孔聚苯乙烯微球， 机械强度高， 耐化南开大学博士学位论文学、 生物腐蚀。 系由 磺酸型聚苯乙 烯衍生制得 ( 见图1 .3 ) ， 。 载体 用重氮 化方法活 化后固 定 淀 粉 糖化 酶 15 5 ,5 6 1 。由 于 载体 带 有阴 离 子 基团， 使固 定 化 酶 最 佳 p h值向碱性方向移动了2 个单位。 1 .2 .3 .2 .2三乙醇胺基聚苯乙 烯 三乙醇胺基聚苯乙 烯属于一种阴离子型多孔聚苯乙 烯微球， 机械强度高， 耐化学、生物腐蚀， 载体通过c n b r 活化， 用于固定化淀粉糖化酶 5 4 1 。由于载体于活化后周围形成碱性微环境， 使固定化酶表观最佳p h 值向 酸性方向 移动了 2 个单位。1 .2 .3 .2 .3活化的苯乙 烯一 二乙 烯苯共聚物苯乙 烯 一 二乙 烯苯 共 聚 物与甲 基丙 烯酸 一 2 ,3 一 环 氧丙 醋 接 枝聚 合5 7 1 ， 在载 体 上引入环氧基团，载体被活化 ( 见图1 . 4 )。环氧基团可直接与淀粉糖化酶结合，也可将环氧基团转化为胺基后用戊二醛偶联酶。公 c h = c h 2c h 3 o 11+ c h z = c -c - o - c h z - c h 协h 2 0r.一书卜子 c ic h ， 一 牙 c !=0o - c h 2- c h -c h 2o j n甲c h 2 -h 3c = 0o - c h 2- c 丫h 2cicic!0 一 h一|书| rf i g . 1 .4 t h e g r a f t p o l y m e ri z a t i o n o f p o l y s t y r e n e a n d e p o x y p r o p a n e m e t h a c ry l a t e南开大学博士学位论文 1 . 2 . 3 . 2 .4大孔胺甲 基聚苯乙 烯一 二乙 烯苯聚合物 h o f m a n n 等15 8 以大孔胺甲 基聚苯乙 烯一 二乙 烯苯聚合物为载体， 用戊二醛偶联淀粉糖化酶，研究了有机溶剂对固定化酶的影响。载体稳定，机械强度较高。1 . 2 . 3 . 3聚酷衍生物 1 . 2 . 3 . 3 . 1聚对苯二甲酸乙二醇酷 最早使用聚对苯二甲 酸乙 二醇酷作为固定化酶载体的是w e e t a 1 1 r 1 ，他用了四 步反 应来活化 载体和固 定 化天冬酞 胺酶。 后来， g o o d m a n 6 0 也使用聚 对苯二甲酸乙二醇酷为载体，固定化胰蛋白 酶。而o l i v e i r a 6 1 也使用聚对苯二甲酸乙 二醇醋为固定化淀粉糖化酶的载体， 不过， 其活化载体的方法更加简便， 而且还对载体的物理形态进行了比较。其活化载体并固定化酶的具体过程见图1 . 5 .a . 麟解一 h 2c - h 2c 巾 一 c 一 oii i ooi ic -o -c h z - c h zc h 3 0 h一 h z c - h zc - o - c - q ob . 叠氮化oi iu - 1, 4 1 71 - 1, 4 珑+ h o -c h z c h 2 -一 “ ， c 一 ” ，c 一 0 一 行 - - 02 c - h zc - o - cc11oi ic -nh -nh 2hci +o二一 h ， c 一 h ， c 一 0 一 居 - - 0h 2 c - h 2 c - o - cq11c -n 3一 -南3 f 大学博士学 位论文c 固定化酶一 h 2 c - h 2c - 0 - c -0! c -n3十e nz yme一 h 2 c - h 2 c - o - c11 0一 h 2 c - h 2 c - 0 - c 0一h 2 c - h 2 c - 。 一 行 00i ic-nh- e 0手i ic - s- e 06 卜 i i c - o - ef i g . 1 .5 t h e i m m o b i l i z a t i o n o f e n z y m e o n p o l y m e r s u p p o rt 1 .2 . 3 . 3 .2聚对苯二甲 酸丙二醇酷 r o i g 等用 一系列二 醇如丙 二醇、 新戊二醇 和二酸如: 对苯二甲 酸、 间 苯二甲酸以及己二酸合成了低分子量的聚酷， 并对聚酷进行了不同的修饰， 得到不同的载 体 用于 固 定 化 ix - 淀 粉 酶 6 2 和 淀 粉搪 化 酶 6 3 。 修 饰 方 法 主 要 包 括以 下 几种: a . 用亚硫酞氯 b . 用异氰酸酷 c . 用三甘醇与聚酷中的苯三酸配反应产生一亲水性的空间 “ 手臂”。1 . 2 .3 . 4其他聚乙烯甲基醚是一种水溶性聚合物，用 卜射线辐射后转变为聚合物凝胶。这种凝胶对热比较敏感， 当温度高于3 8 时， 凝胶收缩， 而在这个温度下可以溶胀。 k o k u f u t a 等6 4 1 用此凝胶包埋淀粉糖化酶， 可以 通过升降温度的方法