（分析化学专业论文）电化学生物传感器的研制及应用.pdf

摘要 摘要 本文对电化学生物传感器的类型、制备方法以及在分析化学中的应用作了较 为详细的评述。在此基础上，采用多种电极材料，对生物材料的固定化方法进行 了一系列探索，构筑了多种性能良好的生物传感器，并对其应用进行了研究。各 项研究工作简述如下： 1 葡萄糖氧化酶生物传感器的制备与应用研究 1 1 聚中性红修饰玻碳电极研制葡萄糖生物传感器 以中性红为电子传递介质，电聚合于n a t i o n 修饰玻碳电极表面，以戊二醛作 交联剂固定葡萄糖氧化酶，最后覆盖一层n a t i o n 膜防止酶流失，构建一种新型葡 萄糖生物传感器。详细探讨了传感器的电化学性能及其对葡萄糖的最佳响应条件， 结果表明，3 0 时，传感器在p h7 0 的p b s 中线性响应范围为1 0 x 1 0 5 - 5 0 x 1 0 。 m o l l 。该传感器制作简单、性能优良，有潜在应用前景。 1 2 基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶生物传感器的研究 本文以n a t i o n 聚中性红修饰电极为基底，自组装多壁碳纳米管和壳聚糖之后，再 固定上葡萄糖氧化酶，制成葡萄糖氧化酶生物传感器。实验表明，该传感器在3 0 的 p b s ( p h7 o ) 中对葡萄糖的线性响应范围为5 0 1 0 - 6 2 0 x 1 0 弓m o l l ，线性相关系数 为0 9 9 4 8 ，检出限为1 0 x 1 0 。6m o l l ，达到9 5 稳态电流所用的时间cojj了o 聚中性红修饰玻碳电极研制葡萄糖生物传感器 3 2 实验条件的优化 3 2 1 p h 的选择 在同样的实验条件下，进步讨论了p h 对酶电极的影响。图4 ( 左图) 为p h 从5 2 7 4 的循环伏安图。a 砌的p h 值分别为5 2 ，5 4 7 2 ，7 4 。由图可以 看出，随着p h 值的增大，p l 峰和p 2 峰同时正移，说明电极反应中有旷参与。 图4 ( 右图) 为还原峰电流和p 1 4 的关系。可以看出峰电流在p h 5 2 7 4 范围 内随着p n 的增大而增大，在p h 6 “7 2 附近呈现平台，但考虑p h 对酶活性的影 响，实验选择p h 7 0 的p b s 。 姜 l 8 图4p h 对酶电极峰电流的影响 f i g 4 t h ee f f e c to f t h es e n s o ri n0 1t o o l l p b sw i t hd i f f e r e n tp hv a l u e s d = 1 0 0m v s 3 2 2 温度的影响 由于酶受温度影响较大，亦考察了温度对酶电极的影响。图5 ( 左图) 为不 同温度下的循环伏安图，如图所示，p 2 峰变化不大，p l 峰随温度的变化峰电流发 生了明显的改变，说明在p l 峰的电位下，对葡萄糖的催化效果更强。 图5 ( 右图) 为p l 还原峰电流与温度的关系。由此图可以看到，从2 0 到3 0 。c ， 峰电流随温度的升高而增大，在3 0 时达到最大，此后到6 0 c 峰电流随温度的升 高而逐渐减小。说明在3 0 c 时酶的催化活性最大，实验温度应选择3 0 c 。 2 1 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 氏瞻憧- v 憾 垆g at e m 砷州 图5 温度对酶电极的影响 f i g 5 e f f e c to f t h et e m p e r a t u r eo nt h es e n s o rr e s p o n s ei n0 1t o o l u 1p b s ( p h7 o ) i ) = 1 0 0 1 1 1 v s 3 3 传感器的线性范围 最佳实验条件下，测试酶电极在不同浓度葡萄糖溶液的峰电流值，测得结果 如图6 所示，在1 0 x 1 0 5 5 0 1 0 一m o l l 以之间出现较好的线性关系，线性方程为 f p = 1 1 0 3 7 + 0 1 1 5 4c ( e ( m m o l l 。1 ) ) ，相关系数r = 0 9 9 1 3 。 墨 宅 罢 3 o c o n c e n t r a t i o n m m o l l 图6 浓度与峰电流的关系 f i g 6 l i n e a rr e s p o n s eo f t h es e n s o rt o g l u c o s ef r o m l 0 1 0 巧t o5 0 1 0 。t o o l l 1 i n0 1t o o l l 1p b s ( p h 7 0 1t ) = 1 0 0m v s v，sc磐30 聚中性红修饰玻碳电极研制葡萄糖生物传感器 4 结论 在n a t i o n 修饰玻碳电极上，以中性红为电子传递介质，戊二醛交联固定葡萄 糖氧化酶的方法，研制了一种新型葡萄糖传感器。线性范围为1 0 x 1 0 5 - 5 0 x 1 0 。3 m o l l ，相关性优良。 该电极具有制作简单，响应迅速等特点，并且所需条件近似于人体生理条件， 有应用于人体血糖检测的前景。 参考文献 【l 】 覃柳， 刘仲明，邹小勇电化学生物传感器研究进展阴中国医学物理学杂志， 2 0 0 7 ，2 4 ( 0 1 ) ：6 0 6 3 【2 】曾辉，任力锋，刘昭前医学领域中的新型生物传感器田传感器技术，2 0 0 2 ，2 1 ( 1 0 ) ： 5 9 - 6 4 【3 】李彦文生物传感器及其在环境监测方面的应用明环境保护科学，2 0 0 4 ，3 0 ( 0 1 ) ：3 5 3 8 【4 】毛斌，韩根亮，李工农等生物传感器在食品农药和抗生素残留检测中的应用【j 】甘肃 科学学报，2 0 0 7 ，1 9 ( 2 ) ：7 2 - 7 6 5 】刘洁生，彭志英生物传感器在食品工业中的应用【j 】食品与发酵工业，1 9 9 7 ，2 3 ( 0 4 ) ： 6 1 - 6 6 6 j 冶保献，刘瑛，曾东华等聚甲苯胺蓝修饰碳纤维微柱电极的制备及其电化学性质明郑 州大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 0 ，3 2 ( 0 1 ) ：7 3 7 6 【7 】冶保献，张娟，李风菊等聚亚甲蓝修饰碳纤维微电极的性质及对多巴胺的电催化测定 f j - j 天津师大学报( 自然科学版) ，2 0 0 0 ，2 0 ( 0 4 ) ：1 0 1 4 8 】袁倬斌，张玉忠，赵红聚天青i 玻碳修饰电极对血红蛋白催化还原叨分析化学， 2 0 0 1 。2 9 ( 11 1 ：1 3 3 2 1 3 3 5 【9 】罗济文，李家洲，李家贵等聚灿烂甲酚蓝修饰玻碳电极的制备及电化学性质【刀化学研 究2 0 0 3 1 4 ( 0 1 ) ：18 2 2 【1 0 】刘颜，袁若，柴雅琴等聚中性红和纳米金修饰玻碳电极的葡萄糖生物传感器叨西 南师范大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 5 3 0 ( 0 3 ) ：4 7 8 - 4 8 2 2 3 基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶生物传感器的研究 第二节基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶 生物传感器的研究 1 引言 近年来，静电吸附用作生物分子的固定化方法已逐渐用于各种生物传感器的 制备【1 4 】，以聚电解质阴、阳离子的静电吸附作用以及与生物分子通过多层交替自 组装所制作的各种生物敏化膜【5 ，比传统的共价交联与包埋等固定化方法所构成 的生物膜具有保持生物分子活性好、性能稳定和制作简便等优点。多壁碳纳米管 ( m w n t ) 具有很好的生物相容性、奇特的电学性能、明显的量子效应、大的比 表面积、高稳定性以及强吸附特性。壳聚糖( c s ) 具有很好的吸附性、稳定性和 良好的生物相容性，其丰富的氨基可被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制 备。中性红( n r ) 作为一种吩嗪类染料，能在弱酸性溶液中于玻碳( g c ) 电极表面 电氧化聚合成膜，该膜具有附着力好、紧密均匀、制备方法简单等特点，对生物 分子有较强的电催化作用，且工作电位低，可以消除一些电活性物质的干扰。利 用m w n t s i 和c s t 9 1 0 1 固定葡萄糖氧化酶( g o d ) 制备葡萄糖传感器的研究已有报 道，但大多是利用c s 包埋的方法固定酶，而利用m w n t 和c s 的静电吸附作用固定 酶的方法还很少有报道。 本研究利用m w c n t s 的比表面积大和c s 生物兼容性好的特点，并利用聚中性 红( p n r ) 与m w n t 、m w n t 与c s 的静电相互作用将其固定在p n 刚觚。怕c 电 极表面进而吸附g o d ，研制成功一种新型的葡萄糖生物传感器。与己报道的m w n t 或c s 修饰的葡萄糖氧化酶传感器相比，该传感器具有灵敏度高、线性范围宽、检 出限低、稳定性好等特点。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 c h l 6 5 0 电化学工作站( 美国c h i 公司) ；三电极系统：g c 电极( d = - 3m m ) 或化学 2 4 基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶生物传感器的研究 修饰g c 电极为工作电极，a g a g c l ( 饱和k c l ) 电极为参比电极，旋状铂丝电极 为对电极；p h s - 2 9 a 型数字酸度计( 上海大中分析仪器厂) 。 m w n t 1 1 】( 使用前经过浓硝酸回流处理，长度在微米极，直径1 0 一5 0n i n ， 德国马尔堡大学化学系材料科学中心提供) ，壳聚糖( c s ，脱乙酰度 9 2 ，上海 华硕精细化学品有限公司) ，n a t i o n ( 5 的乙醇溶液，f l u k a 公司) ，中性红( n r ， 上海试剂厂) ，葡萄糖氧化酶( g o d ，2 9 8 u m g ，s i g m a ) ，k h 2 p 0 4 一k 2 h p 0 4 缓冲溶 液( p b s ) ，葡萄糖溶液( 使用前放置过夜) ，5 0 葡萄糖注射液( 漯河市方汇药业 有限公司) 。其它试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。 2 2 葡萄糖氧化酶电极的制备 将g c 电极依次用1 o 、o 3 和0 0 5g r n 的a 1 2 0 3 粉在抛光布上抛光至镜面之后， 分别用无水乙醇、1 ：l 硝酸和水各超声清洗3r a i n 。吸取3 o 此0 1 n a t i o n 乙醇溶 液滴加于g c 电极表面，自然晾干，制成n a f i o n g c 修饰电极。其中n a t i o n 膜既 可以增强n r 在电极上的聚合又可阻挡一些阴离子干扰物。然后在0 0 2 5m o l l p b s ( p h5 5 m 5m o l ln a n 0 3 + 1 0 x 1 0 4m o l ln r 溶液中于1 o 1 4v 电位下引发 数圈，再于0 8 - 0 8v 电位下聚合，制成n 源，n 撕o i l g c 修饰电极，其膜的厚度 可由聚合过程中的扫描圈数来控制。由循环伏安( c v ) 图1 可知，聚合时n r 有 两对氧化还原峰，峰电流均随扫描圈数增加而增大，说明p n r 膜有良好的导电性。 3 0m gm w n t 于1 01 1 1 l 无水乙醇中，超声分散得到o 3m g m l 黑色悬浮液， 经过处理的m w n t 带有c o o h ，荷负电。将上述带正电的p n r 修饰电极浸入 m w n t 悬浮液3 0r a i n ，通过静电吸附得到m w n t 厂p n 刚n 瓶o n g c 修饰电极。再 将上述电极浸入1 0 的c s 溶液中，静电吸附3 0m i n ，得到 c s m w n t p n r n a i l o r g g c 修饰电极。最后将所得修饰电极浸入5 0m g m lg o d 溶液( p h7 0 的p b s ) 中，于4 。c 条件下静电吸附3 0m i n 得到 g o d c s m w n t p n r n a i l o n g c 修饰电极，即制得g o d 生物传感器。 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 图1中性红电聚合的循环伏安图 f i g 1 t h ec vc u r v e sf o rp o l y m e r i z a t i o no f n e u t r a lr e d 1 = 5 0m w s 2 3 测试方法 采用三电极系统，以g c 或修饰g c 电极为工作电极，铂丝电极为对电极， a g a g c l ( 饱和k c l ) 电极为参比电极，扫描速率为1 0 0m v s ，在0 1m o l l p h7 0 的p b s 底液和浓度为2 0 x 1 0 。3m o l l 的葡萄糖溶液中进行c v 测定。实验前先向溶 液中通氮气除氧，并在整个实验过程中保持氮气气氛。 3 结果与讨论 3 1 修饰电极的电化学行为 图2 中曲线a ， b ，c 分别为空白g c 、g o d ，p n r ，n a 矗o g c 、 g o d c s m w n t 倒n r ，n 瓶o n g c 电极在葡萄糖溶液中的c v 图。其他条件相同的情 况下，三支电极在葡萄糖溶液中的c v 曲线有明显不同。曲线c 的氧化还原峰电流要 比没有吸附m w n t 和c s 时大，这说明m w n t 和c s 的加入，提高了酶电极的催化活 性。 图3 为葡萄糖传感器对葡萄糖的催化行为曲线。其中a 为没有葡萄糖的p h7 0 p b s 溶液，b 为有葡萄糖的p h 7 0p b s 溶液。c v 图中出现两对氧化还原峰，分别 2 6 ：二2i；u 基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖同定葡萄糖氧化酶生物传感器的研究 标识为p l 和p 2 峰，在p l 峰处曲线b 比曲线a 的氧化电流明显降低，还原电流明显 升高，表明g o d 对葡萄糖存在显著的催化作用。 图2g c 电极( a ) 、g o d 倒n r ，n a f i o n g c 修饰 电极( b ) 、 g o d c s m w n t 研啄，n 娟o n g c 修饰电极( c ) 在2 0m m o l l 葡萄糖的0 1m o v l p h 7 0p b s 溶液中的c v 图 f i g 2 c vc u r v e s o f g c ( a ) 、 g o d ，i 卟限仆i a f i o n g c ( b ) 、 g o d c s m n t p n r ，n a f i o i l g c ( c ) e l e c t r o d e s i n2 0m m o l lg l u c o s eo f0 1m o f lp h7 0p b s r e s n e c t i v e l v 1 ：10 0m v s 图3g o d 修饰电极在加入葡萄糖前后 的c v 图 a ：0 1m o l lp b s ( p h7 0 ) ： b ：2 0m m o l l 葡萄糖的o 1m o l lp b s ( p h7 0 ) ； 扫速：1 0 0m v s f i g 3c vc u r v e so ft h eb i o s e n s o r a b ：i nt h ea b s e n c ea n dp r e s e n c eo f2 0 m m o l lg l u c o s ei n0 1m o l lp b s ( p h 7 0 1r e s p e c t i v e l y 1 = 10 0m v s 3 2 p h 和温度对传感器的影响 随着溶液p h 值的增大，阳极峰电位和阴极峰电位均向正移，可能是由于氧化 还原反应中有旷的参与。p h 值在5 6 , - - 一7 0 范围内电流值变化不大，且当p h 值为7 0 时峰电流最大( 图4 ) ，考虑到葡萄糖氧化酶的生理活性，选p b s 的p h7 0 为宜。 温度是影响酶催化反应的另一个重要因素。实验表明( 图4 ) 在2 0 3 0 范围 内酶电极的催化电流随温度的升高变化不大但稍有增加，当超过3 0 时响应值呈 下降趋势，这可能是由于温度过高而导致部分酶失活，所以实验温度均选择为 3 0 。 2 7 n，葛p皇，u 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 图4 温度与p h 对峰电流的影响 f i g 4 e f f e c to f t h et e m p e r a t u r ea n dp ho nt h es e n s o rr e s p o n s ei nt h ep r e s e n c eo f 2 0m m o l lg l u c o s ei n0 1m o l lp b s ( p h7 o ) t ) = 1 0 0m v s 1 ：p h 的影响( e f f e c to f t h ep h ) 2 ：温度的影响( e f f e c to f t h et e m p e r a t u r e ) 3 3 峰电流和扫速的关系 为进一步探讨传感器的电化学性质，在1 0 - 2 5 0m v s 扫速范围测得c v 图。 以氧化峰为例，峰电流与扫速之间呈现良好的线性关系，线性方程为：i p = o 1 7 9 7 + 0 0 1 3 3d 耽，相关系数，= 0 9 9 9 5 ( 如图3 5 ) ，表明该电极过程受表面吸附 控制。 3 4 响应时间 在恒电位0 4v 条件下，分别对2 0m m o l l 和1 0m m o l l 葡萄糖进行i t 曲线 测定( 图5 ) 。实验表明，达到9 5 稳态电流所用的时间少于1 0s 。 基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶生物传感器的研究 v ，m v s 图3 5 峰电流与扫速的关系 f i g3 5 t h ec y c l i cv o i t a m m o g r a m so fg o dm o d i f i e de l e c t r o d ea td i f f e r e n ts c a nr a t e s d ：1 0 ，2 0 ，3 0 2 4 0 ，2 5 0m v s t i m e s 图5 传感器对不同浓度葡萄糖溶液的电流时间曲线 f i g 5 c u r r e n t - t i m ee t l r v eo ft h es e l l s o r a ：2 0m m o l lb ：1 0m m o i l r1：c2i；u 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 3 5 传感器的稳定性 该葡萄糖传感器在0 1m o l lp b s ( p h7 o ) 中连续循环扫描5 0 圈，电流值几乎 不变。且在5 0 x 1 0 4m o f l 葡萄糖溶液平行测定5 次，得到相对标准偏差为4 8 。电 极保存于4 环境3 0d 后，其催化电流值约为原来的8 4 3 。表明该葡萄糖传感器 具有较好的连续稳定性和长期稳定性。 3 6 传感器的线性范围及其检出限 于上述最佳条件下，葡萄糖溶液的浓度在5 o 1 0 西 - 2 0 x 1 0 。3m o l l 之间与p l 氧 化峰催化电流呈现较好的线性关系，线性方程为i p ( 衅) = 1 2 4 6 5 + 0 0 4 8 6 4 c ，相 关系数r - 0 9 9 4 8 ，检出限为1 o x l o 。6m o l l 。 c o n c e n t r a t eo f g l u e o s e m m 0 1 l 。1 图3 2 浓度与峰电流的关系 f i g 3 2l i n e a rr e s p o n s eo f t h es e n s o rt og l u c o s ef r o m 5 0 x 1 0 击t o2 0 x 1 0 。m o l l i n0 1m o l lp b s ( p h 7 0 ) d = 1 0 0m v s 3 7 样品分析 用标准加入法对样品( 葡萄糖注射液) 进行分析。结果列于表1 ，其回收率在 9 4 7 1 0 6 1 之间。 3 0 基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶生物传感器的研究 表1g o d 生物传感器用于样品中葡萄糖的测定 t a b l e1d e t e c t i o no fg l u c o s ei nt h es a m p l e sw i t hg o db i o s e n s o r 3 8 干扰物质的影响 在实际血样中，干扰葡萄糖测定的物质主要有抗坏血酸和尿酸，因此本文着 重考察了正常生理条件时1 2 1 3 1 两种物质对葡萄糖测定的干扰。当葡萄糖的浓度为 5 0 x1 0 5m o l l 时，2 0 x10 。5m o l l 抗坏血酸和2 0 10 5m o l l 尿酸的存在对响应电流 基本没有影响。这是因为在生理p h 值下，尿酸、抗坏血酸为阴离子，被n a f i o n l j 日 离子交换膜挡在传感器外，且所采用的电子媒介体的氧化电位低，亦可消除这些 活性物质的干扰。 4 结论 在p n r n 蚯o n g c 修饰电极上用m w n t 和c s 静电吸附固定g o d ，研制成功一 种新型的g o d 生物传感器。该制备方法不仅提高了酶电极的催化活性，还提高了 电极的灵敏度，同时可利用m w n t 的催化性能提高电子传递的速度，缩短响应时 间。该传感器具有较宽的线性范围和较低的检测限，而且性能稳定，抗干扰能力 强，是测定葡萄糖的一种可行的手段，有潜在的应用价值。 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 参考文献 【1 】c o n s t a n t i n eca ，m e l l osv ，d u p o n ta ，c a oxh ，s a n t o sdj ，o l i v e i r ao n j ，s t r i x i n oft ， p e r e i r aec ，c h e n gtc ，d e f r a n kjj ，l e b l a n c erm 【j a m c h e m s o c ，2 0 0 3 ，12 5 ： 1 8 0 5 - 18 0 9 【2 】f o r z a n ies ，s o l i svm ，c a l v oe 【j a n a l c h e m ，2 0 0 0 ，7 2 ( 2 1 ) ：5 3 0 0 5 3 0 7 【3 】王存嫦，王桦，吴朝阳，曾光明，沈国励，俞汝勤一种新的压电免疫传感器中生物分子 固定化方法的研究【j 】化学学报，2 0 0 2 ，6 0 ( 7 ) ：1 2 8 4 1 2 9 0 【4 】4n i g e lf ，e i t h n ed ，t i m o t h ymc 【j 】e l e c t r o a n a l c h e m ，2 0 0 5 ，5 7 4 ：3 5 9 - 3 6 6 【5 】h o d a kj ，e t c h e n i q u erc a l v oej ，s i n g h a lk ，b a r t l e t tpn l a y e r - b y l a y e rs e l f - a s s e m b l yo f g l u c o s eo x i d a s ew i t hap o l y ( a l l y l a m i n e ) f e l l r o c e n er e d o xm e d i a t o r j l a n g m u i r , 1 9 9 7 ，13 ( 10 ) ： 2 7 0 8 - 2 7 1 6 【6 】w a n gcc ，w a n gh ，w uzy ，s h e ng l ，y urq ap i e z o e l e c t r i ci m m u n o a s s a yb a s e do n s e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r so fc y s t a m i n ea n dp o l y s t y r e n es u l f o n a t e f o rd e t e r m i n a t i o no f s c h i s t o s o m a j a p o n i c u ma n t i b o d i e s j a n a l b i o a n a l c h e m ，2 0 0 2 ，3 7 3 ( 8 ) ：8 0 3 8 0 9 【7 】t o m o n o f ih ，h i d e k a z us ，s a c h i ek ，c h i k a k ot ，c h e nq ，a n z a ij 刀a n a lc h e m ，2 0 0 1 ， 7 3 ( 2 1 ) ：5 3 1 0 一5 3 1 5 【8 】 尹峰，赵紫霞，吴宝艳，王新胜，王艳艳，陈强基于多壁碳纳米管和聚丙烯胺层层自 组装的葡萄糖生物传感器忉分析化学，2 0 0 7 ，3 5 ( 7 ) ：1 0 2 1 1 0 2 4 【9 】9k a n gxh ，m a izb ，z o uxy ，c a ipx ，m ojy t a l a n t a ，2 0 0 8 ，7 4 ( 4 ) ：8 7 9 - 8 8 6 【10 m i a oy ，c h i als ，g o hnk ，t a nsn a m p e r o m e t r i cg l u c o s eb i o s e n s o rb a s e d o n i m m o b i l i z a t i o no f p e r o x i d a s ei nc h i t o s a nm a t r i xc r o s s l i n k e dw i t hg l u t a r a d e h y d e j e l e c t r o a n a l y s i s ，2 0 0 1 ，3 ( 4 ) ：3 4 7 - 3 4 9 【1 1 】王淑敏，李照山，屈建莹多壁碳纳米管修饰玻碳电极伏安法测定氯霉素 j 】化学研究， 2 0 0 7 ，18 ( 3 ) ：8 3 8 6 12 】z h e n gh ，x u ehg ，z h a n gyf ，e ta 1 ag l u c o s eb i o s e n s o rb a s e d o l l m i c r o p o r o u s p o l y a c r y l o n i t r i l es y n t h e s i z e db ys i n g l er a r e e a r t hc a t a l y s t j b i o s e n s o r sa n db i o e l e c t r o n i c s ， 3 2 基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶生物传感器的研究 2 0 0 2 ，1 7 ( 6 7 ) ：5 4 1 - 5 4 5 13 】t a n gh ，c h e l ajh ，y a osz ，e ta 1 a m p e r o m e t r i cg l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do na d s o r p t i o no f g l u c o s eo x i d a s ea tp l a t i n u mn a n o p a r t i c l e m o d i f i e dc a r b o nn a n o t u b ee l e c t r o d e 阴a n a l y t i c a l b i o c h e m 妇t r y ，2 0 0 4 ，3 3 1 ( 1 ) ：8 9 - 9 7 3 3 辣根过氧化物酶生物传感器的制各及应用研究 第三章辣根过氧化物酶生物传感器的制备及应用研究 第一节明胶固定辣根过氧化物酶制备h 2 0 2 传感器 1 引言 在生物传感器的研究中，酶的固定化是一个重要的条件，它决定生物传感器 的制作及响应性能。包埋法一般不需要与生物物质的残基进行键合反应，很少改 变生物活性物质的高级结构，因而生物活性损失很少，且不易泄漏【lj ，从而得到广 泛的应用。 另一方面，传感器的制作材料及电子媒介体的选择也发挥着至关重要的作用。 我们考虑到多壁碳纳米管( m w n t ) 具有很好的生物相容性、奇特的电学性能、 明显的量子效应、大的比表面积、高稳定性以及强吸附特性口卅等优点；明胶作为 一种天然高分子材料，是由胶原热变性或者经物理、化学降解得到的，具有良好 的生物相容性和生物可降解性、溶胶凝胶的可逆转换性、极好的成膜性【7 卅；所以 选择m w n t 和明胶作为修饰材料。同时考虑到以染料分子为电子媒介体的传感器 具有选择性高、灵敏度高、稳定性好和电流响应快等优点【9 q 0 1 ，我们选择茜素红 ( a r ) 作为电子媒介体，它是一种羟基葸醌类染料，由于其结构中含有大的共轭 芳香环，通过i - - a t 键作用可使其在碳纳米管侧壁有一定程度的物理吸附1 9 】。已有研 究表明，利用明胶固定辣根过氧化物酶制备生物传感器可以保持酶良好的生物活 性【1 1 1 3 】、不易泄漏，并且性能优越。 本实验首次以m w n t 吸附a r 为基底，利用明胶固定辣根过氧化物酶( h r p ) 于 a r m w n t g c 电极表面，并结合明胶工艺，用戊二醛对其交联改性，提高了膜的 机械强度，从而研制出性能优良的生物传感器。并探讨了该传感器对h 2 0 2 响应的 最佳测试条件，实验表明，该方法提高了测定的线性范围，降低了检出限，且具 有良好的灵敏度、重现性、稳定性和较长的使用寿命，具有潜在的应用价值。 明胶固定辣根过氧化物酶制各h 2 0 2 传感器 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 c h l 6 5 0 电化学工作站( 美国c h i 公司) ；三电极系统：g c 电极( d = 3m m ) 或化 学修饰g c 电极为工作电极，a g a g c l ( 饱和k c l ) 电极为参比电极，旋状铂丝电 极为对电极；p h s 2 9 a 型数字酸度计( 上海大中分析仪器厂) 。 m w n t 1 4 】：( 使用前经过浓硝酸回流处理，长度在微米极，直径1 0 。5 0r l l l l ， 德国马尔堡大学化学系材料科学中心提供) ，明胶( 上海化学试剂厂) ，茜素红 ( a r ，天津市化学试剂三厂) ，辣根过氧化物酶( h r p ，1 0 m g ，s i g m a ) ， k h 2 p 0 4 - k 2 h p 0 4 缓冲溶液( p b s ) ，3 0 h 2 0 2 ( 天津市德恩化学试剂有限公司) 。其 它试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。 2 2 辣根过氧化物酶传感器的制备 2 2 1 玻碳电极的预处理 首先将玻碳电极依次用1 o 、0 3 和o 0 5 岫的a 1 2 0 3 粉浆在抛光布上抛光至镜 面，然后分别用无水乙醇、1 ：1 硝酸和二次蒸馏水各超声清洗1m i n ，洗净的电极 用二次蒸馏水冲洗，自然晾干，备用。 2 2 2 a r m w n t g c 修饰电极的制备 3 0m gm w n t 于1 0 n 正无水乙醇中，超声分散得到0 3r a g m e 黑色悬浮液， 经过处理的m w n t 带有c o o h 。吸取6g lm w n t 悬浊液于洁净的g c 电极表 面，自然晾干成膜。然后放在1 0 x 1 0 4m o l la r 于3 0 水浴中吸附1 0 0m i n ，得 到a r j m w n t g c 修饰电极，二次水清洗，自然晾干，备用。 2 2 3 辣根过氧化物酶的固定 采用明胶包埋的方法固定h r p 。用p b s ( p h7 0 ) 配置3 的明胶，吸5 0p l5 m g lh r p ( 用p h7 o 的p b s 配制) 与1 5 0 皿3 明胶混合均匀，然后吸取7 “l 混合 酶液于删w n t g c 修饰电极上，于4 放置l o 小时然后浸入3 g a 中1 0m i n ， 制成h r p m w n t g c 传感器，4 环境下保存，备用。 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 2 3 测试方法 采用三电极系统，扫描速率为1 0 0m v s ，在0 1m o l lp h 7 0 的p b s 底液和浓 度为5 0 x 1 0 4m o l l 的h 2 0 2 溶液中于一定电位范围内进行电化学测定，实验前先 向溶液中通氮气除氧，并在整个实验过程中保持氮气气氛。 3 结果与讨论 3 1 实验条件的优化 3 1 1 明胶浓度的选择 以相同的酶量( 5r a g m e 的h r p5 0p l ) 分别采用1 5 0 此浓度( 质量分数) 为 1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 的明胶包埋，测定固定化酶对h 2 0 2 的催化电流。 如图1 所示，随着明胶浓度的增加，h r p 的催化作用逐渐降低，在1 4 之间降低 缓慢，在4 7 之间降低明显。由于明胶浓度过低，酶容易泄漏；明胶浓度过高， 膜层较厚，阻碍电子转移，不利于与底物反应；考虑到明胶膜的强度和h r p 的活 性及稳定性，本实验选择3 的明胶。 图1 明胶的浓度对催化电流的影响 f i g 1e f f e c to f t h ec o n c e n t r a t i o no fg e l a t i no nt h es e n s o rr e s p o n s ei nt h ep r e s e n c eo f 0 5m m o i lh 2 0 2i no 1m o l lp b s ( p h7 o ) t ，= 1 0 0m v s 3 6 明胶固定辣根过氧化物酶制各h 2 0 2 传感器 3 1 2 戊二醛浓度及交联时间的影响 明胶是种蛋白质，它的空间结构受它所在溶液的p h 和离子强度的影响而会 发生胀缩。为防止酶膜的胀缩，本实验除了制膜时所用的制膜液和洗膜液保持相 同p h 和相同离子强度外，还使用戊二醛( g a ) 对其交联改性。 分别用浓度( 体积分数) 为0 2 5 、0 5 、1 、2 、3 、4 和5 的g a 溶液 交联硬化一定时间，测定其对h 2 0 2 的催化电流( 图2 ) ，并对交联时间的影响进行 了研究( 图2 ) 。从图中可以看出，g a 为3 时，催化电流最大，且随交联时间的 延长，催化电流逐渐减小，可能是由于交联时间较长，酶的活性中心构造受到影 响，而使h r p 失活。综合考虑明胶膜的坚固度和h r p 酶的活性，实验选择3 的 g a ，交联时间为1 0m i n 。 图2 戊二醛的浓度及交联时间的影响 f i g 2e f f e c to f t h ec o n c e n t r a t i o na n dc r o s s l i n k i n gt i m eo fg ao nt h es e n s o rr e s p o n s ei nt h ep r e s e n c e o f 0 5m m o l lh 2 0 2i no 1m o l lp b s ( p h7 o ) i ) ；1 0 0m v s 1 ：e f f e c to f t h ec o n c e n t r a t i o n2 ：e f f e c to f t h ec r o s s l i n k i n gt i m e 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 3 1 3 p h 对传感器的影响 在最佳实验条件下，考察h 2 0 2 传感器在p h 4 0 范围内对0 5m m o l lh 2 0 2 的 响应( 图3 a ) 。实验发现，随着溶液p h 值的增大，阴极峰电位逐渐负移，这是由于 电极反应中有质子参与。在p h4 6 9 0 之间，e p 与p h 成线性关系：耳= 0 3 2 5 6 + 0 0 2 9 9 p h ( 图3 b ) ，表明茜素红在发生两电子转移的同时【l5 1 ，还伴有质子的转移。 在中性条件( p h7 o ) 下，h r p 能保持较高的催化反应活性，这与水溶液中的辣根过 氧化物酶的催化性能一致【1 “1 7 1 。因此，本实验选p h7 o 的p b s 为底液。 3 1 4 温度对传感器的影响 酶的催化反应活性会随着温度的升高而增加，但高温会使酶蛋白变性而失活。 本实验考察了在1 5 - 4 5 0 范围内，该传感器对h 2 0 2 的电流响应与温度之间的关系 ( 图4 ) 。结果表明，2 5 前催化电流随温度的升高而增大，2 0 3 0 间催化电流变 化不大，当温度超过3 0 后，响应值呈下降趋势，这可能是因为温度过高而导致 部分的酶失活。考虑到酶的生理活性和电极灵敏度，实验温度选择2 5 。 图3 ap h 对峰电流的影响 f i g 3 at h ec vc u r v e so f t h es e n s o ri n 0 1m o l lp b sw i t hd i f f e r e n tp hv a l u e s 抄= 1 0 0 m v s u 。0 面 啪 图3 b 不同p h 的p b s 中印。与p h 值的关系 f i g 3 bt h ep l o to f e p ov e r s u sp hi np b sa t d i f f e r e n tp hv a l u e s d = 1 0 0 m v s 明胶固定辣根过氧化物酶制备h 2 0 2 传感器 刀 图4 温度对峰电流的影响 f i g 4e f f e c to f t h et e m p e r a t u r e0 1 1t h e $ a r l s o rr e s p o n s ei nt h ep r e s e n c e o f0 5m m o l lh 2 0 2i n0 1m o l lp b s ( p h7 o ) d = 1 0 0m v s 3 2 传感器的电化学特征 3 2 1 修饰电极的电化学行为 图5 中1 ，2 ，3 ，4 ，5 分别为g c 、a r g c 、m w n t g c 、删w n t g c 及 h 】冲a r 舢w n t g c 电极在h 2 0 2 溶液中的c v 图，l 是g c 电极在p b s ( p h 7 0 ) 中的c v 图。a r g c 、a r m w n t g c 及h r p a r m w n t g c 电极在p b s ( p h 7 o ) 中c v 扫描均 于0 5v 左右出现一对可逆的氧化还原峰，且峰电流依次增大，在其他条件相同 的情况下，五支电极在h 2 0 2 溶液中的c v 曲线有明显不同。其中g c 、a r g c 电极 对h 2 0 2 几乎没有催化作用，m w n t g c 、a r m w n t g c 修饰电极对h 2 0 2 有一定的 催化作用，h i 冲删w n t g c 修饰电极对h 2 0 2 的催化还原电流明显比前几支电极 大，说明h i 冲被成功固定到电极上。 3 9 河南大学分析化学专业2 0 0 7 级硕士学位论文陈文静 e vv s a g a g c l 图5g c ( 1 ) 、a r g c ( 2 ) 、m w n t g c ( 3 ) 、a r m w n t g c ( 4 ) 、h r p a r m w n t g c ( 5 ) 电极 在0 5m m o l lh 2 0 2 + o 1m o l i _ , p b s ( p h 7 0 ) 中的循环伏安图 g c e ( i ) 在0 1m o l l p b s ( p h 7 0 ) 中的循环伏安图扫速：1 0 0m v s f i g 5 t h e c v c u r v e s o fg c ( 1 ) 、a r g c ( 2 ) 、m w n t g c ( 3 ) 、a r m w n t g c ( 4 ) 、 h r p a r m w n t g c ( 5 ) e l e c t r o d e si n0 5m m o l lh 2 0 2o f o 1m o l lp b s ( p h 7 0 ) r e s p e c t i v e l y t h ec vc u r v eo f g c e ( 1 ) i n0 1m o l l p b s ( p h 7 0 ) t ) = 1 0 0m v s 3 2 2h l 冲a r 删r 、t g c 修饰电极的电催化性质