（分析化学专业论文）离子色谱法和高效液相色谱法测定奶粉中胆碱含量的研究.pdf

摘要 胆碱( c h o l i n e ) 是强有机碱性化合物，以游离态胆碱、乙酰胆碱和复合磷脂的形式 广泛存在于生物机体中。它是动物生长过程中不可缺少的一种水溶性维生素。【l j 研究表 明，1 2 3 l 它在脑发育和开发认知、记忆与学习能力方面有很重要的作用。对于脑发育关 键时期的婴儿，在婴儿配方及奶粉中添加胆碱是十分必要的。m 】它的另一个主要作用 是促进肝脏机能。如果缺乏胆碱，特别是老年人可能引起脂肪肝、肝硬化、动脉硬化， 也可能引起老年痴呆症。1 6 j 以往测定胆碱的方法有高氯酸非水滴定法1 7 1 、雷氏盐比色法删和雷氏盐重量法。1 1 0 l 现行的国家标准1 1 1 l g b 厂r5 4 1 3 2 0 1 9 9 7 采用的是酶反应显色分光光度计法检测胆碱含 量。这些传统方法操作繁琐，选择性差，干扰因素多，无法鉴别掺入的廉价无机氯化物 和胺类等物质。【1 2 1 近些年可参见的文献中有高效液相色谱一电化学检测法、【1 1 】化学发光 法、【1 3 l 离子色谱一电导检测法【5 1 1 1 5 d 7 】等，但尚未见高效液相色谱一蒸发光散射检测法 及高效液相色谱一质谱法对胆碱含量检测的报道。 本论文建立了离子色谱法、高效液相色谱一蒸发光散射检测法及高效液相色谱一质 谱法三种方法对奶粉中胆碱含量的测定，并将此三种方法进行对比讨论。通过正交试验 设计法b ( 3 3 ) ，固定奶粉质量5 0 0 9 ，盐酸体积3 0 i i l l ，设计盐酸浓度( 0 5 m o l l 、0 8 m o l l 、 1 o m o l l 三水平) ，反应温度( 6 0 、7 0 、8 0 三水平) ，反应时间( 3 h 、4 h 、5 h 三水 平) ，寻找到奶粉前处理的最佳酸水解条件是1 m o l i 。盐酸7 0 下反应3 小时。最后还 对离子色谱测定奶粉中胆碱含量的方法做出不确定度的分析和评定。 三种方法对胆碱含量测定的最低检测限分别为0 1 m g l 、o 2 m g l 和o 0 1 m g l ，相 对标准偏差分别为1 1 3 、2 6 7 和3 8 6 ，添加回收率分别为9 8 7 8 1 0 0 7 2 、 9 6 7 2 1 0 2 0 3 和9 1 6 7 1 0 0 0 2 。方法操作简单，灵敏度高，选择性强，能克服 传统方法中繁琐，准确度低等缺陷和不足。本论文丰富了奶粉中胆碱的含量测定的方法 同时对其他同类产品中胆碱含量的测定提供了参考。 关键词：胆碱；劬粉；离子色谱法；高效液相色谱法 a b s t r a c t c h o l i n ei sas t r o n go 玛姐i ca l k a l i n ec 0 m p o u n d sw h i c hw i d e s p 陀a di nt h el i v i n g o 喀a n i s m si nt h ef 0 加o f 丘c ec h o l i n e ，a c e t y l c h o l i n e a n dp h o s p h o l i p i dc o m p l e x i ti sa n i n d i s p e n s a _ b l ew a t e r s o l d b l ev i t 锄i nf 研g 玲w t ho fa l l i m a l r e s e 缸c hs h o w st h a ti tp l a y sav e r y i m p o n a n tr o l ei nb r a i n 鲈o w c ha n dt h cd c v e l o p m e n to fc o 伊i t i v e ，m e m o r ya n di e a n i i n ga b i l i t y n s 柚o t h e rm a i nr o l et 0p r o m o t el i v e rf u n c t i o n t h el a c ko fc h o l i n em a yc a u s ef a t t yl i v e f ， c i 玎h o s i s0 ft h el i v e ra n d a n e r i o s c l e r o s i se s p e c i a n yf o rt h ee l d e d y ，孤di t 啪a l s oc a u s e d z h e i m e r t sd i s e a i ti sv e 巧n e c e s s a r yt h a ta d d i n gc h o l i i i li n f a n tf b 珊u l a 柚dd r yi i l i l k 1 如e rc o u n t r yh a sp r 0 v i s i o n0 fa d d i n gc o n t e n t0 fc h o l i n e t h ep r e v i o u sm e t h o d s0 fd e t e c t i n gc h o l i n ea r ep e r c h l o r a t en o n a q u e 伽st i t r a t i o nm e t h o d ， l e i s h is a l tc o l o r i m e t 巧a n dk i s h is a l tw e i g l l tm e t h o d n ec l l 玎c n tn a t i o n a ls t 柚d 砌g b 厂r 5 4 1 3 2 0 1 9 9 7u s e st h e 锄聊n er c a c t i o nc o l o rs p e c 的p h o t o m e t e it om e a 驰r et h ec o n t e n to f c h o l i n e t h e s et r a d i t i o n a lm e t h o d sa r cc 0 m p l e x ，b a ds c l e c t i v i t y ，h a v i n gm 锄yi n t e f f e r i n g f a c t o r s ，a n dt h e y 啪n o ti d e n t i f yi n c 0 叩。均t i o no fc h e a pi i 帕r g a n i cc h l o r i d e 锄d 锄i n e h l r e c ：e n ty e a 心l i t e r a t u r c sw ec a i lf i n ds o m en e wm e t l l o d ss u c h 嬲t h eh i g hp e 向姗柚c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y e l e c 瞅h e m i c a ld e t e c t i o nm e t h o d ，t h ec h e m i l u m i n e s c c n c em e t h o d ，t h ei c h r o m a t o 伊a p h y c o n d u c t i v i t yd e t e c t i 彻m e t h o de t c b u tt h e 坨i sn o t 锄yr e p o r t a b o u t h p l c e l s dm e t h o d 趾dh p l c m s dm e t l l o dt od e t e c tt l 圮c o n t e n to fc h o l i n e 1 m i s p a p e r e s t a b l i s h c si d n c h r o m a t o 铲a p h y( i c ) ，h i g l l - p c r f 0 咖柚c el i q u i d c h r o m a t 0 黟a p h y c v a p o r a t i v el i 曲ts c a t t c 血gd c t e c t i o n ( h p 【c e l s d ) 锄dh i 曲- p e 哟册锄c c l i q u i dc h r o m a t o 鲫h y - m 舔ss p i t r o m e t r y ( h p l c m s d ) t h r e em e t h o d st od e t e c tt h ec o n t e n t o fc h o l i n ei nd r ym i l l 【，a n dd i s c u s s e st h ec o m p a r i s o no ft l i e s et l i r e em e t h o d s b yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n td e s i 铲b ( 3 ) ，f i ) 【d r ym i l kq u a l i t yo f5 0 0 9 卸dh y d r 0 c h l o r i ca c i dv o l u m eo f 3 0 l n ld e s i 伊t h ec o n c c n t r a t i o no f h y d 眦h l o r i ca c i d ( 0 5 m o 儿0 8 m o l 几1 0 l i l o l lt h r e e l e v e l s ) ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r c ( 6 0 ，7 0 ，8 0 t h r c el c v e l s ) ，t h er e a c t i o nt i m e ( 3 h ，4 h ，5 h t h r e el c v e l s ) ，蛆dg e tt h eb e s tp r c t r e a t m e n tc 锄d i t i o ni s1 m o l lh c la t7 0 r p o n s i n gt l l r e e h o u 塔f i n a l l y i 酉v et l i eu n c c n a i n t ye v a l u a t i 衄o fm ed e t e 姗i n a t i o no fc h o l i n ei nd 巧m i l kb y i cm e t h o d t h em i n i m u md e t e c t i o nl i m i t so ft h r c em e t h o d so fd e t e c t i n gc h o l i n ea r e0 1 m g 几 0 2 m g l 觚d0 0 1 m g ln er c l a t i v es t a l l d a r dd e v i a t i o n s 撒1 1 3 ，2 6 7 姐d3 8 6 n e a d dr e c 0 v e r ya r c9 8 7 8 1 0 0 7 2 ，9 6 7 2 1 0 2 0 3 觚d9 1 6 7 1 0 0 0 2 1 n h em e t h o d i ss i m p l e ，h i g hs e n s i t i v i t y g d o ds e l e c t i v i t yw h i l et 豫d i t i o n a lm e t h o d sc a nn o t t h i sp a p e ra d d s m e t h o d so fd e l e l m i 船t i o no fc h o l i n ei nd r ym i l l 【，蠲da l s 0 西v e sar c f c r e n c ea _ b o u t d e t e r m i n a t i o n0 fe i l o l i n eo n0 t h e rs i n l i l a rp r o d u c t s k e yw o r d s ：c h o l i n e ；d r ym i l l 【；i i 嘶c h 舢a t o g r a p h y ；h i g l lp e r f o 姗柚c cl i q u i d 幽m a t o g r a p h y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：盘! 堕日期：独芝：立：堑 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日 期：x 壁越堪 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： r 币签翥；睽诣日期：型芝：【、硝 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 胆碱的研究概况 1 1 1 胆碱的结构与基本性质 胆碱( c h o l i n e ) 即b 羟乙基一三甲基胺的羟化合物( b h y d r o x y e t h y l 仃佃e t l l y l 锄m o n i u mh y d r o x i d e ；c h o l i n eh y d r o x i d c ) ，是一种含氮的有机强碱性化合物， 在水溶液中可以完全电离，碱性强度与n a o h 相似。胆碱为无色粘稠液体，分子量为 1 2 1 1 3 。胆碱的发现已有1 6 0 多年，1 8 4 4 年g o b l e y 从蛋黄中分离出一种卵磷脂( 1 e c i t h i l l ) ； 1 8 4 9 年，s t r e k e r 从猪胆汁中分离出一种化合物，1 8 6 2 年命名为“胆碱”，b u y e r 和w u r t z 确定了该物为季胺化合物( q u a n 锄a 巧a m m 仰i u mc o m p o u n d ) 并首次合成了胆碱。但在 相当长的时期内胆碱的研究并不受重视。直到1 9 3 2 年，b e s t 首次报道，给大鼠喂高脂 肪饲料时，胆碱可防止脂肪肝的发生，并证明胆碱是卵磷脂的活性组分，之后对胆碱的 研究逐渐增多。1 1 j 胆碱及其相关化合物的结构式如图1 1 所示。 p m 矧伽b 、；矧c ， 胆碱( c h o l i n e )氯化胆碱( c h o l i n ec h l o r i d e ) 叫j k 啦删一： l l r 一c o 叩 o c l l 2 一。一 一。一c h ：吼n 一( c h 办 东北师范大学硕士学位论文 在营养学中，胆碱被归为b 族维生素，有人把它称为维生素b 4 。但它却并不符合 维生素的经典定义。其一，从在动物体内代谢及生理功能来看，胆碱不是作为辅酶在酶 促反应中起作用，而是作为细胞结构物质发挥其生理功能；其二，动物对胆碱的需求量 远远高于其它维生素，己超出痕量范畴；其三，各种成年动物体内均可合成胆碱，虽然 在许多情况下其合成速度或数量不能满足机体对胆碱的需要。【捧”j 胆碱被生物体吸收后，首先在肠粘膜蓄积，然后在肝脏蓄积，之后进入血液循环、 被输送到大脑一类组织器官。磷脂酰胆碱被吸收后，也在肝中蓄积，然后一部分以血浆 脂蛋白的形式分泌到血液中。i 孙z 1 j 氯化胆碱( c h o i i n ec h l o r i d e ) 是胆碱的盐酸盐，呈无色透明的结晶状，具有吸湿性， 分子量为1 3 9 6 3 。虽然奶粉中都存在复合磷脂形式的胆碱，但其数量不足以满足正处于 大脑发育关键期的婴儿的需要，所以需要在婴儿配方和奶粉中添加胆碱。氯化胆碱已成 为最直接和最经济的补充胆碱的方式。 1 1 2 胆碱的功能及生理作用 胆碱在生物体内具有不可替代的基本功能，主要体现在3 个方面：【l1 2 、嬲l ( 1 ) 是细胞膜的组成成分之。构成磷脂酰胆碱或卵磷脂、神经鞘磷脂和缩醛磷 脂( 构成体内磷脂的7 0 踮) ，参与形成细胞膜和脂蛋白，为维持细胞膜结构和正 常功能，保证软骨基质的正常成熟所必需。磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和神经鞘磷脂的 变化，影响细胞膜通透性和完整性，最终影响整个细胞的新陈代谢。 ( 2 ) 能促进脂肪的分解，同时又是生物的甲基供体，保证肝脏脂肪正常代谢。它 与脂肪酸和磷酸可在肝中形成卵磷脂，从而促进肝脏机能。预防脂肪肝、肝硬化、动脉 硬化等，还可帮助调节肝和胆囊的功能，预防胆结石。 ( 3 ) 作为合成神经脉冲传递物质一乙酰胆碱的前体。与中枢神经系统和副交感神 经系统的作用密切相关，从而影响机体的记忆、肌肉运动等多种功能，可以促进脑发育， 开发认知、记忆与学习能力，预防心血管疾病，老年痴呆等症。 胆碱的主要生理作用有： 促进脑发育和提高记忆能力；保证信息传递；调控细胞凋亡；构成生物膜 的重要组成成分；促进脂肪代谢；促进体内甲基代谢：降低血清胆固醇。 1 1 3 胆碱来源及添加情况 胆碱是卵磷脂中鞘磷脂的重要组成部分，卵磷脂即是磷脂酰胆碱，广泛存在于动植 物中。与其他维生素不同，各种动物体内均可合成胆碱，在肝脏中，磷脂酰乙醇胺经甲 基化作用合成胆碱。【1 9 l 富含胆碱的食物有蛋类、动物的脑、动物心脏与肝脏、绿叶蔬菜、 啤酒酵母、麦芽、花生、大豆卵磷脂等。胆碱耐热，在加工和烹调过程中的损失很少， 干燥环境下，即使很长时间储存食物中胆碱含量也几乎没有变化。 由于胆碱在自然界中的广泛存在，加上人体自身也能合成胆碱，所以不易造成缺乏 症。目前需要添加胆碱的产品主要是婴儿配方及奶粉和动物饲料。主要是以氯化胆碱的 形式添加。1 1 】氯化胆碱可由三甲胺和环氧乙烷缩合而成。i o j 东北师范大学硕士学位论文 1 1 4 胆碱含量检测方法的介绍 因为胆碱作为动物饲料添加剂研究较早，且研究动物饲料配方相对容易，饲料一般 成固体，前处理较为简单。关于动物饲料中胆碱含量的研究已经比较成熟，从含量检测 到掺假鉴别都已见文献报道。当前与动物和饲料有关的文章主要集中胆碱在提高动物免 疫方面的作用，如和免疫反应性细胞的转化、胸腺细胞形成、巨噬细胞趋向性、t 一淋 巴细胞的关系等。以及在氯化胆碱质量检测、天然胆碱的生物有效性和不同动物、不同 年龄的最佳添加量等科学使用的问题上。还有一些是天然植物中提取胆碱的报道。 而奶粉溶与水形成乳浊液，加上奶粉自身也有键合形式的胆碱存在，研究起来相对 不易。目前国内关于奶粉中胆碱含量检测的报道不多见。对胆碱含量的检测主要传统方 法有高氯酸非水滴定法、雷氏盐比色法、雷氏盐重量法等。随着仪器的进步和方法的多 样化发展，现代胆碱含量的检测方法有离子色谱法、高效液相色谱一电化学检测法、化 学发光法等。 1 1 4 1 高氯酸非水滴定法 氯化胆碱与乙酸汞反应，氯化胆碱转化为乙酸盐和难电离的氯化汞，在乙酸介质中 以高氯酸对生成的乙酸盐进行滴定，从而测得胆碱的含量。 称取在( 1 0 5 2 ) 下干燥2 h 的样品约( 0 6 0 7 ) g ，精确至o 0 0 0 2 9 ，置于2 5 0 m l 具塞锥形瓶中，加4 0 m l 甲醇，充分摇动3 0 m i i l ，用干燥的漏斗和脱脂棉( 或滤纸) 过滤， 用甲醇洗涤滤渣，洗涤时应采用少量多次反复淋洗的方法，将滤液和洗液合并，总体积 不得少于9 0 m l ，在水浴上蒸发至干，加2 0 n l l 冰乙酸，加热溶解残渣后，加2 m l 乙酸酐， 1 0 m l 乙酸汞溶液和2 滴结晶紫指示液，摇匀，用高氯酸标准溶液滴定至溶液呈纯蓝色， 同时作空白试验。 此方法操作步骤简单，但选择性不好，不能就掺入的三甲胺类物质鉴别出。 1 1 4 2 雷氏盐比色法i 列 利用在低温下生成氯化胆碱雷氏盐晶体的丙酮溶液在可见区有吸收的原理进行测 定胆碱含量。 精确称取试样约5 9 于具塞锥形瓶中，精确移入甲醇一三氯甲烷混合液1 0 0 0 0 m l ，加 塞，在振荡器上振荡3 0 m i n 后，用慢速滤纸过滤，得试样提取液。精确吸取上述提取液 5 o o 。1 0 0 0m l 于1 0 0 m l 高形烧杯中，在5 0 水浴上蒸发至干，加水4 0 m l 使残渣溶解， 再在冰浴中冷却到5 以下，加3 m l 雷氏盐溶液( 二氨基四硫代氰酸铬铵的4 0 叽甲醇溶 液) ，间断搅拌反应3 0m i n ，得到胆碱雷氏盐的结晶。将生成的结晶转入坩埚式过滤器 中真空抽滤，烧杯用水洗净，洗液一并抽滤。滤毕，结晶用3 5 m l 水洗，再用5 1 m l 甲 醇洗，抽干，向过滤器中加入丙酮，使结晶溶解，转入5 0 i i l 镕量瓶中，用丙酮洗净过 滤器，洗液一并转入5 0 n l l 容量瓶中，加丙酮至刻度，混匀，得试样溶液。吸取5 0 n l l 所 得试样液于1 0 l l l l 离心管中，离心5 m i n ，转速为3 0 0 0 r m i n ，取上层清液，以丙酮作参比， 用1 0 锄比色皿在5 2 5 n m 波长下，用分光光度计测定吸光度，在工作曲线上查得试样中氯 化胆碱的含量。 此方法操作步骤多，分析时间长，前处理过程损失较大。 。 3 东北师范大学硕士学位论文 1 1 4 3 酶反应显色分光光度计法 应用胆碱在胆碱氧化酶与过氧化酶的作用下产物在可见区有吸收的原理进行测定 胆碱含量。 称取5 9 混合均匀的样品于2 5 0 m l 平底磨口烧瓶中，加入3 0 i i l l 盐酸，搅拌。将装有 样品的容器与回流冷凝器连接，在7 0 水浴中加热5 h ，同时磁力搅拌。冷却。用氢氧化 钠溶液调p h 至3 4 3 6 。若必要的话再次冷却，并转入5 0 m l 容量瓶中，用蒸馏水稀释至 刻度。过滤水解液，滤液应是澄清的，如果不澄清，通过0 4 耻m 的滤膜再次过滤。取0 1 m l 过滤后的溶液，加入3 m l 薜反应发色剂( 1 6 m 舢碱氧化酶、o 2 7 m g l 过氧化酶和 1 5 m g l 4 氨基安替比林的o 0 5 m o l l s 溶液) ，密封于3 7 水浴中保温反应1 0 l n i n 。以 蒸馏水作空白，用分光光度计在5 0 5 姗波长处进行检测。 此方法选择性较好，但操作步骤多，分析时间长，背景干扰因素较多。 1 1 4 4 雷氏盐重量法 热稳定性好是重量法成立的前提条件，胆碱雷氏盐沉淀物的热稳定性是建立重量法 的关键。雷氏盐重量法化学反应如下： n h 4 c r ( n h 4 ) 2 ( s c n ) 4 + 【( c h 3 ) 3 n c h 2 c h 2 0 h 】。 【( c h 3 ) 3 n c h 2 c h 2 0 h 】c n h 4 ) 2 ( s c n ) 4l + n h 4 t 称取经1 0 5 干燥至恒重的试样l g ，置于1 0 0 m l 容量瓶中，加水7 0 n l l 混匀。在约8 0 水浴上加热1 5 m i n ，取出稍冷后在电动振荡器振荡2 0 m i n ，用水定容至1 0 0 m l 。过滤，分 取1 0 i n l 滤液至1 0 0 m l 高角烧杯中，在冰浴上冷却到5 以下加2 0 m l 雷氏盐溶液雷【二氨基 四硫代氰酸铬铵的甲醇溶液2 ( m v ) 】，间断搅拌反应3 0 m i i l 得到胆碱雷氏盐沉淀。将生 成的沉淀转入事先在1 0 5 烘至恒重的坩埚式过滤器中真空抽滤，烧杯用水洗净，洗液 一并抽滤，沉淀再用每次1 0 m l 水洗4 次。将装有沉淀的坩埚放入烘箱1 0 5 烘2 h ，称重， 计算含量。 此方法选择性较好，但操作用时较长，检验人员因素影响较大较多。 1 1 4 5 离子色谱法 胆碱是一种含氮的有机碱性化合物，在水溶液中可以完全电离，碱性强度与氢氧化 钠相似。所以可以应用离子色谱法，采用阳离子交换柱测定胆碱的含量。目前饲料级氯 化胆碱的有行业标准【6 l h g 厂r 2 9 4 1 2 0 0 4 ，就是用离子色谱法作为仲裁法的，方法较为成 熟。 称取约1 9 经1 0 5 干燥2 h 的实验室样品，精确至o 0 0 0 2 9 ，于2 5 0 m l 容量瓶中， 加约2 0 a l i i l l 水，摇匀，在( 7 0 士3 ) 恒温水浴上加热1 5 m i n ，在电动振荡器上振荡 1 0 m i n ，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀后，用干燥的滤纸和漏斗过滤。移取滤液 1 0 0 l i n l ，置于1 0 0 m 1 容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀得试验溶液。取适量试验溶液上 机测定，用带抑制器的电导检测器检测，外标法定量。连续重复进样，直至所测氯化胆 碱峰面积平行，取平行测定的算术平均值为峰面积测定结果。 此方法选择性较好，灵敏度高，是国内外多数专家推荐的测定胆碱的方法。 东北师范大学硕士学位论文 1 1 4 6 其他检测方法 随着科技的日益进步，近些年可参见的文献中有高效液相色谱一电化学检测法、【为l 化学发光法等，相信随着科技的日益发展，仪器设备的日益进步，研究方法也会越来越 多，越来越简单，越来越精确。 1 2 离子色谱法简介 离子色谱法( i c ) ，是2 0 世纪7 0 年代中期发展起来的一项新的液相色谱技术，主 要用于离子型化合物的分析，目前已成为分析化学领域中发展最快的分析方法之一。 1 2 1 离子色谱法原理【孤2 9 】 在离子色谱法中，各种离子是根据对交换树脂的相对亲和力通过离子交换而分离开 的。阴离子在阴离子交换树脂柱( 分离柱) 上得以分离后，再流过一个阳离子交换树脂 柱( 抑制柱) 时，阴离子就转变成其相应的高电导酸；阳离子在阳离子交换树脂柱( 分 离柱) 上得以分离后，再经过一个阴离子交换树脂柱( 抑制柱) 时，阳离子就转变成氢 氧化物，而阴离子则转变成为低电导率的组分。 测定阴、阳离子所用分离柱、抑制柱、流动相都不同，测定不同离子应正确更换， 以免造成仪器故障。 ( 1 ) 阴离子色谱分析。流动相通过泵不断送入阴离子分离柱、阳离子抑制柱和电 导池。经电导率仪检测后排掉，在未进样前，阴离子分离柱的树脂为r h c o 型，流动相 不与它作用，迸到抑制柱( 含r h 树脂) 时，发生下述反应：r h + n a h c 0 3 _ r n a + h 2 c 0 3 。即作为流动相的强电解质n a h c 0 3 和n a 2 c 0 3 经抑制柱后转化为弱电解质h 2 c 0 3 ， 电导率仪对它显示低的电导率( 本底) 。基线平稳后，用注射器通过进样阀注入试样， 试样中的阴离子进入分离柱中被固定相( 分离树脂) 和流动相进行无数次交换，洗脱， 再交换，再洗脱过程，使阴离子得到有效的分离。分离后的物质进到阳离子抑制柱，柱 中的树脂又将阳离子进行交换，产生与阴离子相应的酸。这样试样中与阴离子相对应的 盐经过抑制后，就转化为阴离子对应的酸，由此看出，抑制柱同时起到了抑制背景电导 和增强被测组分信号电导的双重作用。 ( 2 ) 阳离子色谱分析。流动相通过泵不断送入阳离子分离柱、阴离子抑制柱和电 导池，经检测后排掉。未进样之前，阳离子分离柱的树脂为r h 型。流动相不与它反应， 进到抑制柱时则与r o h 反应：r o h + h c i r a + h 2 0 。由于水是微弱电离的物质， 电导率仪对它显示很低的电导率，基线平稳后，和阴离子测定原理一样。 1 2 2 离子色谱仪 离子色谱仪由流动相传送部分、分离柱、检测器和数据处理系统4 个部分组成。流 动相通过的管道、阀门、泵、柱子及接头等不仅要求耐高压，而且还要求耐酸碱腐蚀。 分离柱是离子色谱仪的关键部件之一，是惰性材料，一般均在室温下使用。抑制器是抑 制型电导检测器的关键部位，能自动连续工作，不用复杂和有害的化学试剂是现代抑制 器的主要特点。检测器分为电化学检测器和光学检测器两大类。电化学检测器包括电导、 直流安培、脉冲安培和积分安培等检测器；光学检测器包括紫外一可见和荧光检测器。 5 东北师范大学硕士学位论文 其中，电导检测器是离子色谱仪的主要检测器。数据处理系统的色谱工作站不仅能处理 数据，还能控制仪器，半智能地帮助使用者选择和优化色谱条件。【3 0 1 随着技术的发展，离子色谱仪也得到飞速的发展。在色谱柱方面有多维柱技术、羟 基选择性接枝型离子色谱固定柱、静电离子色谱和仿生离子色谱、可变交换容量的固定 相、涂覆型高效离子色谱固定相、整体式离子色谱固定相和芯片式离子色谱固定相等新 技术。【3 1 】 瑞士万通( m e t r o h i l l ) 公司设计的离子色谱仪自动进样系统，采用被动渗析的原理， 即物质在膜两侧浓度差的推动力作用下，有选择性地从一种溶液( 原溶液和样品溶液) 迁移到另一种溶液( 接受液) ，从而完成仪器的自动进样。这种设计可大大简化前处理 的过程，实现了仪器全自动化，提高了工作效率。本论文的工作就是应用此项技术完成 的。 1 2 3 离子色谱法的应用 离子色谱的优点是选择性好、灵敏度高、快速简便，可同时测定难以用其他仪器和 方法分析的多组分。他既能分析简单无机阴、阳离子，还能分析有机酸、碱。随着新固 定相的合成和梯度洗脱等新色谱技术的出现，现在离子色谱不仅可分析各种类型的离子 型化合物，还可以分析各种各样极性有机物，甚至可同时分离极性、离子型和中性化合 物以及色谱性能相差极大的化合物，有力地扩大了离子色谱解决问题的能力。离子色谱 自问世以来，其应用范围已涉及到环境、食品、农业、生物医学、制药、化工、工业、 材料科学等方面，测定范围包括无机阴离子、无机阳离子和有机化合物三大类共2 0 0 多 种。 ( 1 ) 溴酸盐的检测1 3 2 】 饮用水中的溴酸盐是用臭氧对其进行消毒时产生的消毒副产物，具有致癌作用。研 究表明，如果人们终身饮用溴酸盐含量为5 陬g 儿或o 靴g 皿的饮用水，其致癌机率分别 为1 0 r 4 和1 0 一。目前，离子色谱法测定饮用水中溴酸盐的方法主要采用三种不同的检测器： 抑制型电导检测、柱后衍生光度检测和质谱检测。自1 9 4 1 年以来，溴酸钾一直被用作面 粉增筋剂，在面团发酵、醒发和烘焙过程中作为慢性氧化剂影响面团的结构和流变性， 显著改善面制品的烘焙效果。直到1 9 9 2 年，w h o 发表了溴酸钾的使用安全审查报告， 确认溴酸根是一种氧化性致癌物。基于饮用水中溴酸盐的分析方法，几个有关单位已合 作建立了用离子色谱法测定面粉中溴酸盐的方法，方法正在审批中。 ( 2 ) 高氯酸盐的检测【3 2 。3 3 1 多年来，高氯酸盐被广泛应用于火箭、导弹和焰火等的固体推进剂中的氧化剂，也 作为添加剂较多地被应用于润滑油、织物固定剂、电镀液、皮革鞣剂、橡胶制品、染料 涂料、冶炼铝和镁电池等产品的生产中。另外农业生产中使用的以智利硝石为原料的化 肥中也含有一定浓度的高氯酸盐，这些高氯酸盐来自于天然环境过程，在整体环境中高 氯酸盐所占比例很少。然而，较低浓度的高氯酸盐就可以干扰人体甲状腺的正常功能， 最终影响人体发育。2 0 0 2 年，美国e p a 规定儿童和成人饮用的饮用水中高氯酸盐的含量 分别不得高于0 舡娜凇g 几。然而，我国只有北京的少数自来水厂可检测出较低浓度 6 东北9 币范大学硕士学位论文 的高氯酸根。高氯酸盐的分析方法主要是离子色谱法。自1 9 9 7 开始，分析工作者们相继 使用i o n p a c a s 5 、1 0 n p a c a s l l 和i o n p a c a s l 6 色谱柱对高氯酸进行了分离，电导法检测。 美国e p a 关于饮用水测定的3 1 4 0 号标准方法采用了1 0 n p a ca s l 6 色谱柱。 ( 3 ) 在食品添加剂检测中的应用【3 5 3 6 j 近年来，随着食品工业的迅猛发展和人民生活水平的提高，人们对食品添加剂痕量 成分的检测提出了更高的要求，离子色谱技术因上述的优点逐渐受到人们的重视。如用 离子色谱法对亚硝酸盐与硝酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、苯甲酸和山梨酸、人工合成甜 味剂和柠檬酸等在食品添加剂的测定均有许多研究。 1 3 高效液相色谱法简介 1 3 1h 眦e l s d 原理及应用 1 3 1 1h p i c e l s d 的原理 目前，高效液相色谱仪日益普及，所分析的样品范围也越来越广。检测器作为高效 液相色谱仪的重要组成部分，其发展在某种意义上决定着h p l c 技术的进步。高效液相 色谱检测器中除了最常用的紫外检测器之外，还有二极管阵列检测器，荧光检测器，示 差折光检测器，蒸发光散射检测器，化学荧光检测器，质谱检测器，电化学检测器，拉 曼光谱检测器，核磁共振检测器等。检测器的研究其共同方向均朝着灵敏度高，重现性 好，响应快，线形范围宽，适用范围广，对流动相流量和温度波动不敏感，死体积小等 方面发展。1 3 7 j 1 3 1 1 1h p l c 分析原理【碉 高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次 交换的过程，他借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作 用的差别使不同溶质得以分离。液相色谱柱的分离度用下列公式表示： r 岩孚( 帮) ( 南) 式中：r 一液相色谱柱分离度；n 一柱效率，用理论塔板数来表示；a 一溶剂效率， 是固定相对某两个混合物分离能力的表征；k 一容量因子，是在平衡状态下组分在固定 相与流动相中质量之比。 从上面公式可见，要提高分离度，共有三条途径： ( 1 ) 增加n 。在其他条件相同的情况下，增加n 可以使色谱峰变狭。这点可以通过 增加柱长来实现，但增加柱长分离时间也会增加，但如果采用高效能的填充剂，不仅可 提高分离度，而且能使峰形变狭从而提高检出的灵敏度。 ( 2 ) 增加a 。使后一组分相对于前一组分的保留时间增加来提高分离度。这可通过 改变流动相或固定相的组成来达到。最有效的方法就是改变流动相的极性，这就是高效 液相色谱中通常采用连续改变流动相极性的梯度淋洗法。 ( 3 ) 增加k 。对液相色谱来讲，流动相极性增大，k 减小，色谱峰向前移，分离度 降低；流动相极性减小，k 增加，色谱峰的流出时间增加，同时峰形变宽，分离度提高。 东北师范大学硕士学位论文 但若k 过大，不但分离时间拖得很长，而且峰形变平坦，影响分辨率和检出灵敏度，k 的 有效范围以a = 掣( 1 3 ) 0 n 当测量结果取n 次算术平均值时，x 所对应的a 类不确定度为式1 4 ： 拉( i ) 霉i 互掣( 1 4 ) ，n 测量次数n 充分多，才能使a 类不确定度的评定可靠，一般认为n 应大于5 。但也要视 实际情况而定，当a 类不确定度分量对合成不确定度的贡献较大时，n 不宜太小；反之， 当a 类不确定度分量对合成不确定度的贡献较小时，n 可以小一些。 1 4 4 2b 类不确定度的评定 b 类不确定度的评定，主要立足于分析以前的观测数据、前人的经验、权威机构的 证书、报告或文件等，一般是判断被测量的分布区间并假设测量值的概率分布，由要求 的置信概率估计包含因子，通过计算求得标准不确定度。 1 5 东北师范大学硕士学位论文 如果已知信息表明，被测量之值x i 分散区间的半宽度为a ，且x i 落于x i a 至x i + a 区间的 概率p 为1 0 0 ，即全部落在此范围中，通过对其分布的估计，可以得出b 类标准不确定 度u b ( x i ) = a c ，a 值一般是在制造商随产品出示的合格证书中给出的。在证书中，通常给 出无法定量的限值，我们称之为置信区间。c 为置信系数，与分布状态有关。常见分布 与c 、u ( x i ) 的关系见表1 1 ： 表1 1 常见分布与c 、u 的关系 分青类擞p l c ( 1 l 正巷 9 9 7 33 衫 l 矗 _ l $ 棒形且= 0 7 l i 2 a ，z 奄黟i 均匀i i 万 畸 反正穰 l 酒q 器 蕊点 i id 注：表中b 为梯形上底与下底的比值 在缺乏其它信息的情况下，一般估计为矩形分布。 1 4 4 3 合成不确定度的评定 合成标准不确定度一般用i i c 表示。不确定度一般有不止一个来源。对于每一个来源 产生的不确定度，可能是a 类也可能是b 类或两者都有。一般的原则是将两种类别的不 确定度平方加和再开方就得到合成标准不确定度，见式1 5 ： ( 1 5 ) 当各分量不相关时，p = o ，得和方根u t = v 3 + 。b 2 ；当各分量完全正相 关时，p = 1 ，得线性和比c = 2 口 + 五h i 。 1 4 4 4 扩展不确定度的确定 扩展不确定度分为两种，即u 与u p 。前者为标准偏差的倍数，后者为具有概率p 的置 信区间的半宽。扩展不确定度由合成标准不确定度u c 乘以包含因子k 得到。即：u = l c l l c 。 对于任一给定的置信水平p ，扩展不确定度u p = l 【p i l c 。有时，为了测量和表达的需要，也 可以用相对不确定度来表示。 由于测定数据概率分布近似正态分布，且l l c 的有效自由度较大，在l l c 确定后，乘以 一个包含因子k 得到u 。k 的取值随置信概率的不同而不同。置信概率一般采取6 8 3 、 9 5 、9 9 三种。当置信概率为6 8 - 3 时，k 为1 ；当置信概率为9 5 时，k 为2 ；当置信 概率为9 9 时，k 为3 。目前国际上通用的置信概率为9 5 ，因此在扩展不确定度中的 k 一般取2 。当直接选取包含因子k 时，一般不给出置信水平p ，若要给出p ，就应给出自 由度v 。 1 4 4 5 测量结果及其不确定度的报告 完整的测量结果含有两个基本量，一个是被测量的最佳估计值，一般由测量列的算 1 6 东北师范大学硕士学位论文 术平均值给出；另一个是描述该测量结果分散性的量，即测量不确定度。报告不确定度 有两种方式，一种是直接用合成标准不确定度，另一种是使用扩展不确定度u 或u p 。带 有不确定度的测定结果：y = y l l c ( k = 2 ) 或y = y u ( k = 2 ) 。 1 5 研究内容及意义 现行测定奶粉中的胆碱含量的国家标准【1 1 l g b 厂r5 4 1 3 2 0 1 9 9 7 采用的是酶反应显色 分光光度计法。该方法选择性较好，但操作步骤多，分析时间长，背景干扰因素多，有 待进一步研究改进。国内关于奶粉中胆碱含量测定的报道不多见，国外已有用离子色谱 一电导检测法测定婴儿配方及奶粉中胆碱含量的报道和标准。但尚未见高效液相色谱一 蒸发光散射检测法及高效液相色谱一质谱法对胆碱含量测定的报道。 本论文建立了离子色谱法、高效液相色谱一蒸发光散射检测法及高效液相色谱一质 谱法三种方法对奶粉中胆碱含量的测定。并将此三种方法进行对比讨论。通过正交试验 设计法b ( 3 3 ) ，固定奶粉质量5 0 0 9 ，盐酸体积3 0 m l ，设计盐酸浓度( 0 5 m o l 压、0 8 m o l l 、 l m o l l 三水平) ，反应温度( 6 0 、7 0 、8 0 三水平) ，反应时间( 3 h 、4 h 、5 h 三水 平) ，寻找到奶粉前处理的