（动物学专业论文）不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析.pdf

摘要 我国的鱼类实验动物开发利用研究工作比较滞后，标准化的鱼类 实验动物至今仍是空白。以中国为原产地的金鱼( 国朋船j 船a 姗芒船 ) 可以作为一种鱼类实验动物进行研究与开发。关于金鱼的解剖 性状、蛋白质、同工酶和基因组d n a 的随机多态扩增( r a p d ) 已有一些 研究报道，但是，把金鱼作为实验动物，其系统进化关系和分子遗传 背景尚有一些争议，很有必要进行深入的研究。线粒体d n a 具有自身 独特的遗传系统，是理想的物种鉴定的遗传标记物之一。作为分子标 记己被广泛应用于各物种系统发生的研究。本文通过研究不同品系的 金鱼和鲫鱼的线粒体d n a 控制区及其一侧t r n a 基因部分核苷酸序列及 c y t b 序列的对比，为金鱼的系统进化关系和遗传背景研究提供分子生 物学证据。本研究的主要研究内容如下： 1 、对金鱼的代表品种红龙睛、红帽子、虎头、琉金、墨龙睛、 水泡眼及彭泽鲫的线粒体d n a 控制区及t r n a t h r 和t r n a p h e 基因进 行了测序，将所得序列同g e n b a n k 中日本白鲫、红鲫、鲤鱼的序列进 行比较分析。分析结果说明t r n a t h r 、t r n a p h e 基因序列变化较小， 保守性高，进化慢，不能很好地提供系统发育信息；控制区遗传变异 程度较高，因而可以为金鱼和鲫鱼系统发育研究提供一个好的分子遗 传标记。从线粒体控制区分析证实了金鱼起源于鲫鱼，在演化过程中 其遗传物质发生了较大的变异，各个品种金鱼的遗传物质也形成了一 定的分化。 2 、对金鱼的代表品种红龙睛、红帽子、虎头、琉金、墨龙睛、 水泡眼、珍珠及彭泽鲫的c y t b 基因进行了测序，将所得序列同 g e n b a n k 中日本白鲫、银鲫、红鲫、野鲫和鲤鱼的序列进行比较分析。 从c y tb 基因分析，进一步证实了金鱼起源于鲫鱼。 关键词：金鱼，鲫鱼，线粒体d n a ，控制区，c y t b 基因 a b s t r a c t t h er e s e a r c ho ff is ha sa ne x p e r i m e n t a la n i m a lis1 a gi n c h i n a ， a n dt h es t a n d a r d i z e da n i m a lo fe x p e r i m e n t a lf i s hi s s t i l lb l a n k n e s s g 0 1 d f i s h( ( a ，a s s j ，sa 啪f u s 比射哆，w h i c h o r i g i np r o v e n a n c ei sc h i n a ，c o u l db eae x p e r i m e n ta n i m a lo ff i s h f o rs t u d ya n de x p l o r a ti o n t h ea n a t o m yp r o p e r tie s ， p r o t ei n ， i s o d y n a m i ce n z y m ea n dr a n d o m l ya m p li f i e dp 0 1 y m o r p h i cg e n o m e d n ao ft h e9 0 1 d f is hh a v eb e e ns t u d i e da n dr e p o r t e d h o w e r v e r ， a sa e x p e r i m e n t a la n i m a l ， t h er e l a ti o n s h i po fs y s t e me v o l u t i o n a n dt h ei n h e r i tm 0 1 e c u l a rb a c k g r o u n da r es t i l la r g u a b l y m t d n a i saw i d e l yu s e dm o l e c u l a rm a r k e rt o i n v e s t i g a t e t h e p h y l o g e n e s i so fs p e c i e s i np r e s e n ts t u d y ，m i t o c h o n d r i a l t r n a t h rg e n e ，t r n a p h eg e n ea n dp a r ti a lc o n t r o lr e g i o n ( d 一1 0 0 p ) a n dc y tbo fd i f f e r e n tv a r i e t i e s o f9 0 1 d f i s h e s( 1 么n f s j ，s a “2 一a ，s 训 a n dc r u c i a nc a r p s( c ：a r s s j “sa “，a 芒“曲h a db e e n s e q u e n c e d t h er e l a t i o n s h i po f m t d n am 0 1 e c u l a rg e n e t i cb e t w e e n t h e s ef is h e sa n do t h e rr e l a t e df is h e sw e r ei1l u m i n a t e d t h e m a j o rr e s u l t si nt h i sp a p e rw e r ep r e s e n t e da sf 0 1 1 0 w s ： 1 、m i t o c h o n d r i a lt r n a t h rg e n e ， t r n a p h eg e n ea n dp a r t i a l c o n t r 0 1r e g i o no fr e p r e s e n t a ti v ev a r i e ti e so f 饧，s s j “sa “，a 芒“s i l i y a r ，r e dd r a g o ng o l d f is h ，r e dc a p9 0 1 d f i s h ，t i g e rh e a dg o l d f i s h ， 9 0 1 dp l a t i n gg o l d f i s h ， b l a c kd r a g o n9 0 1 d f i s h ，w a t e rv e s i c l e g o 1d f is ha n dc t a 粥s j “sa “，a 芒队so fp e n gz ew e r es e q u e n c e d t h e m o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ct r e eo ft r n a t h rg e n e ，t r n a p h eg e n ea n d p a r ti a lc o n t r o lr e g i o ns e q u e n c e sa m o n gt h e s eg o l d f is h ， r e d c r u c i a nc a r p，j a p a n e s ec r u c i a nc a r p ， a n dc o m m o nc a r pf r o m g e n b a n kw a sc o n s t r u c t e dw it hd n a s t a rs o f t w a r e t r n a t h rg e n e a n dt r n a p h ei nt h o s ed i f f e r e n t v a r i e t i e s o fg o l d f i s h e sa n d c r u c i a nc a r p sw e r ei d e n t i c a lw h i c hs h o w e dt h e i rc o n s e r v a t i v e t h u st h et r n a t h rg e n ea n dt r n a p h eg e n es e q u e n c e sc o u ld n t b eag o o dm 0 1 e c u l a rm a r k e r t h ec o n t r 0 1r e g i o nh a si m p o r t a n t v a l u ef o ri n v e s t i g a t i n gi n t r a s p e c i f i cg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n b e c a u s eo fi t sh i g hm u t a t i o na c c u m u l a t i o n t h ea n a l y s i so f d l o o ps h o w e dt h a tt h eo r i g i no f9 0 1 d f i s hw a sc r u c i a nc a r pa n d t h eg e n e t i cm a t e r i a lt a k ead i f f e r e n t i a t i o ni nt h el o n g e v 0 1 u t i o n a lp r o c e s s 2 、m i t o c h o n d r i a l c y tbg e n eo fr e p r e s e n t a t i v ev a r i e t i e s o fc 机s j “sa “，a f u sy a n ，r e dd r a g o n9 0 1 d f i s h ，r e dc a p9 0 1 d f i s h ， t i g e rh e a dg o l d f i s h ，9 0 1 dp l a t i n gg o l d f i s h ， b l a c kd r a g o n g o l d f i s h ， w a t e rv e s i c l e9 0 1 d f i s h ， g e n u i n ep e a r lg o l d f i s ha n d ( ：蜀娜s j “sa “，a f “so fp e n gz ew e r es e q u e n c e d t h em o l e c u l a r p h y l o g e n e tict r e eo fc y tbs e q u e n c e sa m o n gt h e s e9 0 1d f is h ， r e d i v c r u c i a nc a r p ，j a p a n e s ec r u c i a nc a r p ，s i l v e rc r u c i a nc a r p ，w i l d c u r c i a nc a r pa n dc o m m o nc a r pf r o m g e n b a n kw a sc o n s t r u c t e dw i t h d n a s t a rs o f t w a r e t h es t u d yp r e s e n t e dt h em o l e c u l a re v i d e n c e t h a tt h eo r i g i no f9 0 1 d f i s hw a sf r o mw il dc r u ci a n k e yw o r d ：g o l d f i s h ： c r u c i a nc a r p ：m i t o c h o n d r i a ld n a ：c o n t r o l r e 9 1 0 n s ：乙y tbg e n e ，、l v 附录3 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：压甚仁么，孵年腔月夕日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：历基红日期：捌年，- 月夕日 刷磁轹邛破醐蒯 硼 “ 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 1 前言与综述 1 1 金鱼起源和系统演化的研究概述 具有中国国鱼之称的金鱼是世界著名的观赏鱼类之一，它以其绚 丽的色彩、优美的体态以及典雅的游姿深受人们的喜爱。金鱼具有千 奇百态的变异性状，体态奇异的金鱼与江河湖泊中的野生鱼类有着极 大的不同，在自然水域找不到其踪影，它是人工饲养的产物。但据史 料记载和近代科学实验，科学家们认为中国是金鱼( 蚀阳鼬j 姻 a 啪芒，s ) 的发源地，金鱼起源于我国普遍食用的野生鲫鱼 ( 饧阳s s j 晒a 黝f 姻) ，由银灰色的野生鲫鱼首先变为红黄色的 金鲫鱼，然后由红黄色的金鲫鱼再经过不同时期的家化，逐渐演化为 各个品种的金鱼。动物学家将金鱼归为鲤科( 叨r f 刀j 幽p ) ，鲤亚科 0 c y p r i n i n a e 、) 。趣饕属( 、c a r a s s i u s 、) 。赚( 、c a r a s s i u s au r a t u s 、) 并作为鲫鱼的变种。 1 1 1 金鱼起源于鲫鱼的历史考证 我国明朝的医学家李时珍( 1 5 9 6 ) 在他的本草纲目中记载：在 晋朝( 公元2 6 5 4 2 0 年问) 桓冲游庐山时，见湖中有赤鳞鱼即金鱼。 金鱼有鲤、鲫、鳅数种，但只有金鲫耐久，并自宋朝以来不断有人饲 养，到明朝已传播到各地，处处有人饲养玩赏。晋朝是现存史料中记 载的发现红色鱼的最早年代，并据金鲫鱼耐久这一记载，科学家们认 为金鱼起源于野生的红色金鲫鱼，且金鱼的起源可追溯到晋朝，至今 已有lo o o 多年的历史。 高校教师在职硕+ 学位论文 从野生鲫鱼到众多的金鱼品种，根据我国著名生物学家、遗传学 家陈祯教授考证，将众多金鱼的品种形成分为4 个演化阶段： 第1 阶段，野生状态的红黄色鲫鱼到半家化状态的红鲫阶段：第 2 阶段，池养时期一一金鱼家化的开始：第3 阶段，盆养时期：第4 阶 段，有意识的人工选择阶段。形成金鱼品种的主要因素有二类：一是 生活条件的改变，二是人工选种。 从野生鲫鱼到众多品种的金鱼，经历了千余年的历史。到1 8 4 8 年姚元之所著竹叶亭杂记所记，金鱼品种己达数十种，并将其分 为草金、纹鱼、龙睛、蛋鱼，共四大类，这是对金鱼正式分类的开始， 并一直沿用下来。金鱼品种越来越多，本世纪7 0 年代末已发展至1 6 0 多个，目前已达2 4 0 个以上，我国主要有1 4 0 多个。按传统分类法将 金鱼分为草金种、文种、龙种、蛋种四大类。 1 1 2 金鱼起源的科学实验研究 陈祯教授记载了金鱼外观形态上的1 0 种变异( 体色、体型、背、 尾、臀鳍、头型、眼型、鳞片、鳃盖、鼻膜) ，金鱼与鲫鱼的差别很 大，但把鲫鱼和金鱼定为同属同种，并在科学上共用同一学名 饧抛s s j 淞a 啪f 姻，除了史料记载，科学家推断金鱼起源于野生卿 鱼外，中外学者从本世纪2 0 年代起，对金鱼和鲫鱼的亲缘关系从不 同水平进行了科学实验研究。 1 1 2 1 杂交实验 我国著名的科学家陈祯教授曾于1 9 2 8 年和1 9 3 4 年在金鱼的杂交 实验中证明：任何一种金鱼都可以与野生鲫鱼进行杂交，并且杂交后 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 代均具有正常的生殖能力。因为一般说来种内杂交产生可育的后代， 而种间杂交由于生殖的不亲和性往往不易杂交成功，或者即使杂交成 功，其杂交后代也常常是不可育的。陈祯教授的实验结果证明：金鱼 和鲫鱼间的亲缘关系极为密切。 1 1 2 2 胚胎发育实验 我国学者李璞瞳1 对野生鲫鱼、红鲫鱼、五花珍珠鳞正常眼金鱼及 透明鳞龙睛鱼的胚胎发育进行了观察，其结果为：第一，金鱼和鲫鱼 从受精卵到幼鱼体形分化并生出鳞片为止，依据显著的形态和生理特 征，其发育期均分为4 4 个期：第二，金鱼和鲫鱼的胚胎发育程序及各 发育期在形态上完全相同，且在同一温度下发育速度也相同：第三， 金鱼和鲫鱼的胚后发育程序相同，金鱼的体形和体色发育首先重复祖 先的一般形态，然后才出现特殊分化。 1 1 2 3 染色体方面的研究 王春元3 3 报道：日本学者o j i m a ( 1 9 7 9 ) 对中国鲫鱼( 沈馏s s j 凇 a 黝手雌d 和金鱼以及日本产的5 个亚种鲫( e 岔c “订啦ca ， s u b s p 。c a 1 a n g s d o r f ii 。c a g r a n d o c u li 器乙c 。a b u e r g e r j 、 进行了染色体组型及c 一带分析，结果表明：中国鲫鱼、日本鲫鱼和金 鱼的染色体组型相同，2n = 1 0 0 ，但c 一带结果为金鱼和中国鲫鱼的 c 一带反应相同，即：早鱼有一对次中部着丝点染色体，短臂深染( c 一 带) ，6 鱼亚中部着丝点的染色体只有一条有c 一带反应，这种具有深 染标记的染色体被认为是x 染色体。而金鱼只和日本鲫的ca s 的印 亚种有上述同样的反应，而其它4 个亚种均无此反应，因此o j i 腑认 为中国鲫鱼是金鱼的祖先，日本产ea s “6 印鲫鱼与中国鲫鱼为同 1 高校教师在职硕+ 学位论文 一系统。在我国对金鱼和鲫鱼染色体组型的分析，首先是王春元n3 的 研究，结果为金鱼和鲫鱼的染色体不仅数目相同，2 n = 1 0 0 ，而且形态 也十分相似，在相同实验条件下，很难找出它们的明显差异。 1 1 2 4 生化方面的研究 陈祯教授n 3 记述日本生物学家石原( i s h i h a r a ) 和y m a t s u i ( 1 9 3 4 ) 研究发现金鱼和鲫鱼的血清沉淀反应相同，证明金鱼和鲫鱼属于同 种。o ji m a ( 1 9 7 9 ) 在对金鱼和鲫鱼染色体分析的同时，对它们的肌肉 蛋白电泳进行了分析，结果发现，金鱼与中国鲫鱼的肌肉蛋白电泳谱 带完全一致，而与日本产的5 个亚种鲫( 包括与金鱼染色体c 一带反应 相同的亚种) 均不相同，o j i m a 的结果再一次证明了金鱼起源于中国 的鲫鱼而不是日本鲫鱼。 罗莉中等畸3 对鲫鱼和红龙睛鱼的8 种组织器官( 心脏、脾脏、眼、 脑、肝、肌肉、肾脏、卵) 进行了乳酸脱氢酶( l d h ) 同工酶分析，结果 表明，鲫鱼和金鱼的l d h 同工酶谱带均有组织特异性，但在同一组织 中，金鱼和鲫鱼的l d h 同工酶谱带基本一致，其不同只在于部分谱带 着色深浅的差异，之后又对西吉彩鲫和红高头金鱼的胚胎及胚后发育 ( 至鳞片形成期) 的不同时期l d h 同工酶进行比较研究响1 ，结果为在同 样的发育阶段金鱼和鲫鱼的同种组织l d h 同工酶谱带基本相同，只是 金鱼谱带稍浅。王春元口3 对鲫鱼和红高头金鱼的7 种组织的酯酶( e s t ) 同工酶进行比较发现，金鱼和鲫鱼的e s t 同工酶也均有组织特异性， 同一组织中e s t 同工酶谱带主带基本一致，但弱带表现出差异。 梁前进哺3 利用3 种不同的电泳技术( 琼脂糖等电聚胶电泳 a g a r o s e i e f ，s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳s d s p a g e 和双向电泳) ， 4 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 对鲫鱼和5 个金鱼代表品种的肌肉蛋白进行了分析，结果表明，鲫鱼 和金鱼各代表品种的大量组分相似，但金鱼也有一些蛋白成分的消失 和产生。之后又检测了鲫鱼和几个金鱼品系的血清抗原反应阳3 ，发现 金鱼和鲫鱼血清蛋白成分及抗原性相似性很大，血清电泳同样是大部 分谱带相似。 上述生化方面的实验，为金鱼由野生鲫鱼演化而来提供了生化指 标上的佐证。 1 1 2 5 分子生物学证据 阐明物种的起源、发生、演化关系，以前的研究多以形态学、胚 胎学、细胞学以及同工酶研究为基础而进行。这些标记是基因表达加 工后的产物，并且这些标记能用简便方法分析者数量有限，且大多数 易受环境和生物发育阶段的影响。随着分子生物学技术的发展和完 善，使研究直接从d n a 水平上来进行，克服了上述缺点，因此使结论 更加可靠。 王晓梅等n 们从d n a 水平，利用d n a 分子标记( r a p d 标记) 技术并 辅以适当的统计分析，研究了金鱼和鲫鱼的亲缘关系，结果表明：金 鱼和鲫鱼的遗传距离小，平均为o 6 1 7 ，而二者间的r a p d 标记共享 度高，为o 8 3 3 。此结果在d n a 。水平上进一步证实了金鱼起源于鲫鱼： 1 1 3 金鱼系统演化的研究 李璞3 、王春元n 2 3 将金鱼的系统演化归纳为野生鲫鱼通过金鲫鱼 发展为草金鱼，然后再由草金鱼向不同的方向分化为文鱼、龙睛和蛋 鱼。梁前进n 3 1 的报道中记述：徐金生( 1 9 8 1 年) 指出草金鱼形成后，向 有背鳍和无背鳍两个方向分化，形成龙种和蛋种两大家族，并各自进 s 高校教师在职硕十学位论文 一步变异为不同的品种，王占海等( 1 9 8 2 ) 则认为草金鱼形成后发展为 文种鱼，之后文种发生较复杂的分化，一支演化为蛋种，另一支演化 为龙种。上述均为对资料的归纳，真正的实验研究始于1 9 9 4 年。 梁前进对鲫鱼和金鱼代表品种肌肉蛋白阳1 电泳结果，经聚类分 析，他对两种电泳技术得出的结果做出两种不同的解释，a g a r o s e i e f 的电泳结果支持草金鱼形成后，演变为文种、龙种和蛋种的推论，而 s d s p a g e 电泳结果又与王占海的观点一致。但对几个金鱼品系血清 抗原性的探讨中呻1 ，不同的实验方法仍得出上述两种结论。 王晓梅利用r a p d 技术探讨金鱼的系统演化n0 i ，应用类平均法聚 类后，得出金鱼的系统演化关系为：草金鱼形成后，首先演化为文种 金鱼，之后由文种鱼演化成龙种和蛋种两个亲缘关系很近的品系。 尽管对鲫鱼和金鱼亲缘关系的研究已有几十年的历史，但对于金 鱼品种的系统演化问题至今仍未取得共识，仍有必要对金鱼的系统演 化关系，从更新的角度、更多的品种进行深入探讨。 1 2 线粒体d n a 在鱼类种类遗传分化研究中的应用概述 线粒体d n a ( m i t o c h o n 砸a ld n a ，m t d n a ) 是一种具有半自主性的细胞 器，是细胞进行呼吸作用、产生能量的重要场所n 制。它具有自身独特 的遗传系统，为严格的母系遗传，是理想的物种鉴定的遗传标记物之 一。作为分子标记己被广泛应用于各物种系统发生的研究。鱼类是脊 椎动物中最原始但在种属数量上又最占优势的类群，其物种繁多，分 布广泛，起源复杂，研究其系统发生历来是令人饶有兴趣的课题。虽 然从形态结构、生理特征及化石资料中可得出许多有关鱼类分类及进 化的有意义的结果，但由于受许多客观条件的限制，如形态特征信息 6 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 量的不足，趋同进化的干扰以及连续性化石标本的缺乏，使得传统的 分类学方法有时并不足以解决分类和系统进化中的一些疑点。近年 来，已有越来越多的研究工作将m t d n a 作为分子标记来探讨各种鱼类 遗传分化，并且获得了许多启发性的结果。 1 2 1 鱼类线粒体d n a 的结构与遗传特性 1 2 1 1 鱼类m t d n a 的结构特点 鱼类m t d n a 同其它脊椎动物的m t d n a 一样，呈共价闭合环状，包 括一条重链，一条轻链，是细胞核外具自主复制、转录和翻译能力的 遗传因子。与核d n a 相比，鱼类m t d n a 具有分子小、结构简单、进化 速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，是一个相对独立的复制 单位。正是由于鱼类m t d n a 具有这些特点，使其成为鱼类进化遗传学、 分子生态学、遗传多样性及其保护生物学等研究的重要标记。随着分 子生物学技术向生物学各研究领域的渗透，以m t d n a 作为分子标记， 已成为鱼类群体遗传结构与系统演化关系研究中的重要工具。当前， 对鱼类m t d n a 研究的热点包括m t d n a 的信息、结构和功能遗传，m t d n a 在系统进化中的应用，m t d n a 在起源进化及群体遗传分化中的应用， 不同生物m t d n a 的进化等。 目前，已测定了1 6 1 种鱼类m t d n a 的全序列，它们的分子量大小 在1 5 5 6 l 1 8 7 0 5b p 之间，除海七鳃鳗、淡水七鳃鳗和溪鳃外，其 余1 5 8 种鱼m t d n a 的结构和基因成分都与其它脊椎动物的类似，它们 均由2 2 个t r n a s 基因、2 个r r n a 基因( 1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a ) 、控 制区( d 一环区) 、轻链复制起始区和1 3 个疏水性蛋白质多肽基因组成。 这些多肽包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的亚单位：细胞色素 7 高校教师在职硕十学位论文 b ( c y t b ) 2 个a t p 酶的亚单位( a t p a s e 8 和a t p a s e 6 ) ，3 个细胞色素 c ( c y t c ) 氧化酶的亚单位( c o i ，i i 和i i i ) ，7 个n a d h 还原酶复合体的 亚单位( n d 一1 ，一2 ，一3 ，一4 ，一4 l ，一5 和6 ) 。鱼类m t d n a 的排列极 为保守，几乎完全一样。 1 2 1 2 鱼类m t d n a 的特征 i ) 分子较小 从已报道的1 6 1 种鱼类m t d n a 的全序列可知，鱼类m t d n a 分子大 小范围在1 5 5 6 l 1 8 7 0 5 b p 之间，重复序列的存在是鱼类m t d n a 分子 大小明显差异的主要原因。 2 ) 编码效率高 在鱼类中，同核d n a 相比，m t d n a 中的基因排列极为紧凑，除了 控制区有非编码区存在外，其余都为基因编码区；在蛋白质编码基因 中无内含子，基因间分隔常少于1 0 b p ：两基因间几乎没有空间，有时 相互交搭，每一个核苷酸都有编码的功能；部分m t d n a 的密码子不同 于核内d n a 缺少终止密码子，仅以u 或u a 结尾。因此鱼类m t d n a 编 码效率较高。 3 ) 拷贝数多 鱼类每个细胞中有1 0 0 0 1 0 0 0 0 个线粒体d n a 拷贝，容易从组 织中分离纯化。 4 ) 进化速度快 鱼类m t d n a 的突变率高于核d n a ，并且修复效率低，即缺乏有效 的d n a 损伤修复机制，有些突变还有累加效应。m t d n a 内不同区域的 进化速率不同，适合不同水平的进化研究。 r 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 5 ) 解码体系简单 鱼类m t d n a 的解码由一个很小的t r n a 体系完成，而不像在核基 因组摆动假说( w o b b l eh y p o t h e s i s ) 中所要求的那样需要在3 2 个t r n a 反密码子上的摆动。 6 ) 核质互作 由原有的m t d n a 为模板进行复制，但它的d n a 功能在很大程度上 受核基因组基因的控制，m t d n a 复制、重组、转录等过程所需的酶都 是由核基因编码的。 7 ) 异质性 细胞中m t d n a 突变会导致一个细胞中同时存在两种类型的m t d n a ， 异质性细胞在连续分裂的过程中会使突变型和野生型比例发生改变。 8 ) 多态性 m t d n a 中存在多态现象，两个无关个体的m t d n a 碱基平均相差3 ， 这些差异大多为中性的，不改变氨基酸排列，多态性集中在d 环，其 它区域则高度保守。 1 2 2 鱼类m t 州a 多态性及其在鱼类系统学中的应用进展 1 2 2 1 鱼类m t d n a 多态性及主要的检测方法 m t d n a 的多态性是指m t d n a 在同种群体内或群体间表现出的变异 现象，这种现象可以通过序列测定和限制性内切酶等方法来分析n 5 1 。 m t d n a 多态性可分为位点多态性和长度多态性两类，长度多态性大部 分来源于串联重复序列，此外还有长度不等的插入和缺失。从目前所 能利用的鱼类m t d n a 数据分析表明鱼类m t d n a 变异的主要特征是以碱 基替换为主，插入和缺失较少，序列进化速率较核d n a 快5 1 0 倍， q 高校教师在职硕十学位论文 几乎无重组现象。碱基替换主要发生在基因间隔区和控制区，且不同 部位替换速率不同。在种内或种间控制区进化速率最快，一般用它来 分析种内种群间的遗传结构，r r n a 基因进化速率最慢，蛋白质和t r n a 基因进化速率居中。碱基替换的型式以转换为主。l e e 等n 刚专门探 讨了硬骨鱼类d l o o p 的结构和进化方式，他们发现：即使在亲缘关系 很近的物种间，也存在高度的长度变异，因此建议在选择适当的区域 来进行种内变异的研究时，必须特别小心。对于探讨一些快速进化的 物种，d 一1 0 0 p 提供的信息可能更有价值。m t d n a 进化速度快的原因分 析起来有以下几种：1 ) 选择压力小。核d n a 承担了绝大部分的选择压 力，而m t d n a 的选择压力相对较小，因而其突变容易固定下来。2 ) 错误的复制和不完善的修复加剧了突变速率。在哺乳动物中m t d n a 是 由 r 聚合酶复制的，这种酶缺乏对新合成d n a 链的编辑整理能力，且 易于形成较高的核苷酸错配率。3 ) m t d n a 的代谢增补时间短，这在 一定程度上增加了单位时间内突变及错误复制的数目，使突变能不断 传递下去。4 ) 线粒体内具有较高浓度的内外源诱变剂，提高了m t d n a 的突变速率，线粒体作为氧化磷酸化和许多代谢反应的场所，自由基 和一些代谢中间物如烷化剂，积累在其中，这些物质都是强诱变剂， 可以使m t d n a 的突变率增高。5 ) 细胞中冗余的线粒体和较小的d n a 长 度增加了对突变的固定速率。 目前用于鱼类m t d n a 多态性检测的方法主要有以下几种：( 1 ) 内切 酶图谱法。一般用双酶消化构建鱼类m t d n a 限制酶图谱。内切酶图谱 法是一种较早的研究方法，此法虽在检测点突变上较为直观，但费时 且须做双酶切，其谱带亦较复杂，若个体出现多态就更难解释。( 2 ) l n 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 限制性内切酶片段长度多态法( r f l p ) 。该法步骤似同图谱分析法，但 无须双酶切。( 3 ) p c r r f l p 法。该法利用p c r 扩增总d n a 的某些片段， 避免了纯化m t d n a 的繁琐工作。( 4 ) 探针法，也称杂交法。该法只能 估算相似性和平均相似值，缺少详细资料，对种内检测不太敏感。用 放射性标志探针与靶m t d n a 进行分子杂交，印迹通过自显影而检测， 在种间标志上较有意义。( 5 ) 直接测序法。该法通过测定m t d n a 全序 列或部分基因片段序列来比较不同物种或个体间相关序列的差异，从 而探讨进化关系。m t d n a 的r f l p 分析与d n a 序列分析相比，不仅简 单、快速、耗费低，而且从理论上讲，只要选择的酶足够多，就可检 测到足够的变异，但它毕竟是一种间接检测d n a 序列变异的方法，因 而，与d n a 序列相比，提供的信息很有限。近年来，随着p c r 技术的 广泛应用，特别是全自动序列分析技术在分子生物学领域的推广，鱼 类m t d n a 多态性的研究主要集中于d n a 的序列分析。 1 2 2 2 鱼类m t d n a 多态性在鱼类系统学中的应用 随着d n a 测序技术和生物信息学的快速发展，分子系统学也日臻 完善。m t d n a 由于具有独特的优点，在鱼类分子系统学研究中得到广 泛的应用。以m t d n a 序列研究物种的进化关系，大致分两大步骤：( 1 ) 根据研究的对象与目的，选择适当的m t d n a 区域，测定目标片段的序 列。对于近缘物种的研究，应选用进化速率较快的区域：对于远缘物 种的研究，应选用相对保守的区域。( 2 ) 通过m t d n a 同源序列的比较， 采用基本的加权规则以及一定的系统重建途径与方法，如简约法、距 离法、似然法等综合分析m t d n a 序列，提取进化信息，构建分子系统 树。在对鱼类的m t d n a 序列分析中，c y t b 基因的结构和功能在m t d n a i l 高校教师在职硕十学位论文 的1 3 个蛋白质编码基因中被了解得最为清楚，且能用一些通用引物 扩增，因而被广泛地用来进行系统进化研究。鱼类c y t b 基因含有1 1 4 0 个碱基，不发生缺失和( 或) 插入，碱基置换多数是沉默的，且很大程 度上倾向于转换( t r a n s i t i o n ) 或颠换( t r a n s v e r s i o n ) ，并且密码子第 3 位点进化最快，而密码子的第2 位点最保守。所以c y t b 基因在不 同的科、属、种的研究中显示出良好的系统关系。近年来，彭作刚等 n 7 3 采用线粒体c y t b 基因序列变异分析了东亚鳍科鱼类的系统发育。 何德奎等n 8 1 采用线粒体c y t b 基因序列分析了特化等级裂腹鱼类3 属 9 种和亚种的分子系统发育，并通过黄河上游与青海湖隔离的地质时 间来校正分子钟，进而探讨了特化等级裂腹鱼类的主要分支发生事件 与青藏高原阶段性隆起的关系，结果表明，特化等级裂腹鱼类并不是 一个单系群。s a n j u r 等n 们利用线粒体c y t b 基因研究了伊比亚半岛的 1 4 种欧洲勋芒c a j j 凇鱼类的遗传结构，揭示了此半岛勋姻- j 船鱼种 群的物种形成及分化的历史和地理原因。w a n g 等瞳叫采用线粒体c y t b 基因序列分析了雅罗鱼亚科( l e u c i s c i n a e ) 东亚群体的系统进化关 系。何舜平等硷采用线粒体c y t b 基因序列分析了东亚鲤科鱼类的系 统发育。 对于不同的类群，即使是相同的区域，进化速率也有一定的差异。 在无背景资料的情况下，选择m t d n a 的哪个区域? 测多长的序列? 来解 决所研究类群的系统进化关系，从某种意义上来讲，带有一定的盲目 性。z a r d o y a 和m e y e r 忱1 考察了脊椎动物m t d n a 上1 3 个蛋白编码基因 包含系统发育信息的情况。不考虑数据处理和加权的方法，可将1 3 个蛋白编码基因分为好、中、差3 组：好的一组含有良好的系统发育 1 ， 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 信息，它们是：n d 4 、n d 5 、n d 2 、c y t b 和c oi ：中等的一组含有一定 的系统发育信息，它们是：c oi i 、c o i i i 、n d l 和n d 6 ：差的一组基因不 能很好地提供系统发育信息，它们是：a t p a s e 6 、n d 3 、a t p a s e 8 和 n d 4 k 在m t d n a 上，控制区的进化速率快。对于探讨一些快速形成的 物种，控制区提供的信息，可能更有价值。在剑尾鱼属肜咖d 阳s 系统关系的研究上，l o c k h a r t 呦1 等认为控制区提供的信息比c y t b 提 供的更为可靠。l i u 等乜钔利用m t d n a 控制区序列变异探讨了鲤科鱼的 系统发育关系。王伟等心朝利用m t d n ad 一1 0 0 p 序列变异探讨了鳅舵亚 科鱼类系统发育。张四明等心6 3 利用m t d n a 控制区序列探讨了达氏鲟、 亚洲和北美洲中吻鲟的分类地位。孙玉华等利用m t d n a 控制区序列 对中国胭脂鱼线粒体控制区遗传多样性进行了分析，结果表明中国胭 脂鱼的线粒体控制区的变异远大于美国胭脂鱼。l u s s e n 等汹3 利用 m t d n a 控制区的部分序列分析了智利m s f j a s ( t e l e o s t e i ： c y p r i n o d o n t i d a e ) 鱼的系统发育，并阐明了伽s 芒如s铆s s j l o r e s t i a s c h u n g a r e n s i s 。 o r e s t i a s p a r i n a c o t e n s i s 。 o r e s t i a s i a u c a e n s i s 。o r e s t i a sa s c o t a n e r t s i s 。o r e s t i a st s c h u d ii 和伽s 才如sj 印j 的单系起源。 在无背景资料的情况下，为了获得较为客观的进化树，近来一般 主张选择m t d n a 不同区域的多组序列数据，再采用“联合”或“一致 的途径：或者选择m t d n a 不同区域和核d n a 相结合的方法：或者选择整 个m t d n a 全序列来进行研究的方法。p o n d e l l a 等幽1 利用线粒体1 6 s r r n a 和1 2 sr r n a 基因序列，探讨了鲈形目的尸a 朋- a 所- a 彳 ( p e r c i f o r m e s ：s e r r a n i d a e ) 及其相关种的系统发生关系：n e a r 等3 0 1 1 1 高校教师在职硕十学位论文 利用线粒体n d 2 和1 6 sr r n a 基因分析了南极i c e f is h e s ( n o t o t h e n i o i d e i ：c h a n n i c h t h y i d a e ) 的系统进化关系：d u n n 等3 1 利 用线粒体1 2 sr r n a 基因、4 个t r n a 基因和两个蛋白质编码基因探讨 了m y l i o b a t i f o 瑚( c h o n d r i c h t h y e s ：m y l i o b a t i f or m e s ) 的分子系统 发生关系：k o n t u l a 等池3 利用线粒体a t p a s e b 一6 基因、c y t b 基因和 m t d n a 控制区共2 8 2 2 b p 序列探讨了聚集在贝家尔湖的c o t t o i d 鱼的 系统发生关系：t h a c k e r 等3 1 利用线粒体n d l ，n d 2 ，和c o i 基因共 3 5 7 3 b p 的序列探讨了虾虎鱼( ( t e l e o s t e i ：p e r c i f o r m e s ：g o b i o i d e i ) 的分子系统发生关系：o b e r m i l l e r 等通过分析3 3 种海鲢总目 ( e l o p o m o r p h ) 鱼的线粒体1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 基因序列探讨了它们 的系统发生关系：c l e m e n t s 等3 5 3 通过分析2 1 种刺尾鱼科 ( a c a n t h u r i d a e ) 鱼的线粒体1 2 sr r n a ，1 6 sr r n a ，t r n a p r 。基因和控 制区序列来研究它们的系统发生关系。k o s k i n e n 等m 1 综合河鳟 ( 炳- - 姻印妫m t d n a 和核d n a 的生物地理学分析，对贝加尔湖的 水文学理论进行了研究：s t r e c k e r 等7 3 综合微卫星d n a 多态位点分析 和线粒体c y t b 基因序列分析，探讨了4 个墨西哥洞穴群体( 尸a 幽 s a b i n o s 。t i n a j a c h i c 亩与& 令表面群体a s t y a n a x ，a s c 如f 妇( c h a r a c i d a e ) 的遗传关系。i s h i g u r o 等3 8 1 利用整个m t d n a 全序列探讨了原棘鳍鱼总目( ( p r o t a c a n t h o p t e r y g i i ) 鱼的系统发生 关系：s a i t o h 等b 钔利用整个m t d n a 全序列探讨了1 4 种d s 芒甜j 印厅”如刀 鱼和9 种非d s 芒甜j p p 疗阼s a 门的硬骨鱼的系统进化关系：m i y a 等n 们利用 整个m t d n a 全序列探讨了硬骨鱼类( t e l e o s t e a n ) 的系统进化关系。 i n o u e 等n 妇利用整个m t d n a 全序列探讨了辐鳍亚纲鱼类 1 4 不同品系金鱼和鲫鱼的线粒体分子标记及其系统发育分析 ( a c t i n o p t e r y g i a n ) 的系统进化关系。 1 3 本研究的目的和内容 鱼类作为实验动物在国外已较普遍，目前国外已有近交2 0 代的 纯系鱼类实验动物，无菌鱼类实验动物也在研究探索之中h 羽。鱼类实 验动物己被广泛应用于胚胎学、遗传学、内分泌学、毒理学、行为科 学、比较病理学、环境保护科学等实验研究领域。鱼类动物具有某些 无可取代的优点和特点，其生物学性状完全可以与人类的相应性状所 类比。与国外相比，我国的鱼类实验动物开发利用研究工作明显滞后， 标准化的鱼类实验