（植物学专业论文）镁离子转运基因atmgt7的功能研究.pdf

摘要 镁离子是植物细胞中最丰富的二价阳离子，其吸收、转运和同化 受到严格的调控。迄今为止，镁离子的转运机制在细菌中得到了较详 尽阐释。然而，在分子水平上，对植物中镁离子的吸收和转运了解不 是很多。2 0 0 1 年，“等在拟南芥中鉴定了一个可能具镁离子转运功 能的a t m g t 基因家族。通过序列分析，该家族编码蛋白与细菌c o r a 及酵母m r s 2 镁离子转运蛋白有一定同源性。本研究采用r t - p c r 方 法，克隆到a t m g t 家族中的一个基因4 矶佑基因。该基因具 有两种可变剪接转录体，分别命名为a t m g t 7 a 和a f 惦r 殆。其中， a t m g t 7 a 的开放阅读框含有l15 8 b p ，编码3 8 6 个氨基酸；a t m g t 7 b 的开放阅读框则只含有1 11 3 b p ，编码3 7 1 个氨基酸。 a t m g t 7 a 和a t m g t 7 b 在拟南芥的表达模式也有差异。a t m g t 7 a 基因在植物的各个组织都表达，而a t m g t 7 b 仅在植物的根与花组织 中表达。基因的亚细胞定位研究也显示，a t m g t 7 a 基因主要定位在 细胞质膜上，a t m g t 7 b 基因定位在亚细胞器膜上或质膜上。 通过功能互补研究，a t m g t 7 a 能互补缺失m 9 2 + 转运活性m m 2 8 1 细菌突变株，a t m g t 7 b 则不能。进一步以同位素6 3 n i 2 + 为示踪物， 对a t m g t 7 a 和a t m g t 7 b 蛋白的离子转运特性进行分析，a t m g t 7 a 为一类低亲和性m 9 2 十转运蛋白，而a t m g t 7 b 不具m 9 2 + 转运功能， 可能与c u 2 + 或c d 2 + 转运有关。 膜片钳试验结果显示，在外液镁离子浓度为5 0 m m 条件，表达 a t m g t 7 a 蛋白的h e k 2 9 3 细胞平均膜电流达到2 8 6 _ 4 6 p a ，是表达 a t m g t 7 b 蛋白的h e k 2 9 3 细胞和对照系h e k 2 9 3 细胞平均膜电流的 近6 倍。表明a t m g t 7 a 蛋白在转h e k 2 9 3 细胞中起着镁离子转运通 道作用。 对t - d n a 插入突变体植株的表型观察，在缺镁离子条件， a t m g t 7 基因突变体植株叶片颜色比野生型的略浅。进一步测定野生 型与突变体植株的叶绿素和镁离子含量，野生型叶绿素和镁离子含量 明显高于突变体植株。表明a t m g t 7 基因编码蛋白与植物中的镁离子 吸收和转运有关。 综上所述，本研究首次在高等植物中鉴定出一个低亲和性镁离子 转运蛋白a t m g t 7 a ，与已鉴定的a t m g t l 等高亲和性镁离子转 运蛋白比较，显示了植物中镁离子吸收和转运的多样性。而在转基因 h e k 2 9 3 细胞中测得的大量镁离子依赖膜电流，则暗示a t m g t 7 a 蛋 白在植物中很可能起着镁离子通道作用。 关键词：a t m g t 基因，功能互补，镁离子转运，低亲和性，膜片钳 i i a b s t r a c t m a g n e s i u m ( m 9 2 + ) i sl h em o s ta b u n d a n td i v a l e n tc a t i o ni np l a n t c e l l sa n dp l a y sac r i t i c a lr o l e i nm a n yp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s t h e a b s o r p t i o n ，t r a n s p o r t a t i o na n da s s i m i l a t i o n o fm a g n e s i u ma r es t r i c t l y c o n t r o l l e di nt h et i s s u e sa n dc e l l s s of a r , t h et r a n s p o r tm e c h a n i s mo f m a g n e s i u mi sw e l lk n o w ni nt h eb a c t e r i a b u ti ti sl e s su n d e r s t o o da b o u t t h e a b s o r p t i o n a n d t r a n s p o r t a t i o n o fm a g n e s i u mi n p l a n t f r o mt h e m o l e c u l a rl e v e l s i n2 0 01 ，l ie ta li d e n t i f i e dap u t a t i v em 9 2 + t r a n s p o r t g e n ef a m i l y ( a t m g t ) w h i c hw a sal i t t l eh o m o l o g yt ot h ec o r ao fb a c t e r i a a n dm r s 2o f y e a s tb ys e q u e n c ea n a l y s i s i no u rr e s e a r c h ，w eh a v ec l o n e d aat m g t 7g e n eb yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i n ( r t - p c r ) i n t e r e s t i n g l y , t h i sg e n ee n c o d e st w om r n a st r a n s c r i p t sr e s u l t e df r o m a l t e r n a t i v e s p l i c i n gv a r i a n t s ，d e s i g n a t e da t m g t 7 aa n da t m g t 7 b a t m g t 7 ac o n t a i n s115 8b a s e p a i r s o fn u c l e o t i d e si nt h e o p e n - r e a d i n g f l a m e ( o r e ) ，e n c o d i n gap u t a t i v ep r o t e i no f38 6a m i n o a c i dr e s i d u e s ，w h e r e a sa t m g t 7 bc o n t a i n s11 13n u c l e o t i d e so fo r f , e n c o d i n gap u t a t i v et r u n c a t e dp r o t e i no f 3 7 1a m i n oa c i dr e s i d u e s g e n ee x p r e s s i o na n a l y s i sd i s c l o s e dt h a tt h et w om r n av a r i a n t s w e r ee x p r e s s e dw i t hd i f f e r e n tp a t t e r n s a t m g t 7 am r n aw a sw i d e l y e x p r e s s e di na l lo r g a n s ，b u ta t m g t 7 bw a sa p p e a r e do n l yi nr o o ta n d f l o w e rt i s s u e s f u r t h e r m o r e ，w el o c a l i z e da t m g t 7 at ot h ep l a s m a m e m b r a n e ，w h e r e a sa t m g t 7 bc o u l dl o c a l i z ep l a s m am e m b r a n eo r i i i f u n c t i o n a l c o m p l e m e n t a t i o n i n d i c a t e st h a ta t m g t 7 ac o u l d c o m p l e m e n tab a c t e r i a lm u t a n ts t r a i n d e f i c i e n ti nm 9 2 + u p t a k e ，w h i l e a t m g t 7 bd i dn o t f u r t h e r m o r e ，t h e6 3 n i 2 + t r a c e ra n a l y s i si nt h eb a c t e r i a l m o d e ls h o w e dt h a ta t m g t 7 am e d i a t e sl o w a f f i n i t yt r a n s p o r t e ro fm 9 2 + ， w h e r e a sa t m g t 7 bm a yb ei n v o l v e di nt h et r a n s p o r tc u 2 + o rc d ” t h ep a t c h c l a m p t e c h n i q u ew a su s e dt om e a s u r ew h o l e c e l l i o n c u r r e n t si nt h eh e k 2 9 3c e l l ，t h eh e k 2 9 3c e l lo v e r e x p r e s s i n gat m g t 7 a a n da t m g t 7 b w i t h5 0 m mm 9 2 + b a t h i n gs u l u t i o n ，t h ec u r r e n ti n h e k 2 9 3 + a t m g t 7 ac e l l a v e r a g e d 一28 6 + 4 6 p a t h e c u r r e n t si nt h e h e k 2 9 3 + a t m g t 7 bc e l la n dh e k 2 9 3i sm o r et h a ns i x f o l ds m a l l e r w ，e c o n c l u d et h a ta t m g t 7 am a yf u n c t i o n a sam a g n e s i u mi o nc h a n n e li nh e k c e l l c o m p a r e dt ow i l dt y p e ，t h ec o l o ro ft h el e a fi nt h e m u t a n to f a t m g t 7i sp h e n o t y p i c a l l yl i g h t e ru n d e rt h em 9 2 + _ d i f i c i e n c yc o n d i t i o n w ef u r t h e re x a m i n e dt h ec o n t e n to fc h l o r o p h y l la n dm a g n e s i u m t h e c o n t e n to fc h l o r o p h y l la n dm a g n e s i u mi n t h em u t a n ta r eo b v i o u s l y l o w e rt h a nt h ew i l dt y p e i n s h o r t ，t h i ss t u d yh a s i d e n t i f i e df r o mah i g h e rp l a n tt h ef i r s t l o w a f f i n i t ym a g n e s i u mt r a n s p o r t e r e n c o d e d b y at m g t 7 g e n e c o n n e c t e dw i t ht h e h i g h a f f i n i t ym a g n e s i u mt r a n s p o r t e r , s u c h a s a t m g t 1 ，i tp r e s e n t e db i o l o g i c a ld i v e r s i t yo fm a g n e s i u mt r a n s p o r t e r a d d i t i o n a l l y , t h el a g em a g n i t u d e o ft h em 9 2 + _ d e p e d e n tc u r r e n t si n i v h e k 2 9 3c e l ls u g g e s t st h a ta t m g t 7 ac o u l df u n c t i o na sa ni o nc h a n n e li n p l a n t k e yw o r d s ：a t m g tg e n e ，f u n c t i o n a lc o m p l e m e n t a t i o n ，m a g n e s i u m t r a n s p o r t ，l o w a f f i n i t ym a g n e s i u m 仃a n s p o r t e r p a t c hc l a m p v 缩写词表 缩写词英文名中文名 a aa m i n oa c i d氨基酸 拟南芥基因研究 a g i a r a b i d o p s i sg e n o m ei n i t i a t i v e 中心 a r a b i d o p s i st h a l i a n am a g n e s i u m 拟南芥镁离子转 a t m g t t r a n s p o r tg e n e 还基l 刭 a m pa m p i c i l l i n氨苄青霉素 b p b a s ep a i r s 碱基对 c h l c h l o r o m y c e t i n 氯霉素 d e p c d i e t h y p y r o c a r b o n a t e焦炭酸二乙酯 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e c o l ie s c h e r i c h i ac o l i大肠杆菌 e d t a e t h y l e n ed i a m l n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸钠 g f pg r e ef l u o r e s c e n tp r o t e i n绿色荧光蛋白 h e k 2 9 3h u m a ne m b r y o nk i d n e yc e l l 人胚胎肾细胞 v i 异苯基1 3 一d 硫 i p t g l s o p r o p y l 一1 3 一d - r h in o 代半乳糖苷 k a n k a n a m y c i n卡那霉素 l bl u f i a b e r t a n im e d i al b 培养基 美国生物技术信 n c b i n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g y 息中心 o d 6 0 0o p t i c a ld e n s i t ya t6 0 0n m吸光度 o i 心 o p e nr e a d i n gf r a m i n g 开放阅读框 。 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n 反转录聚合酶链 r r - r c r r e a c t i o n 式反应 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e超氧化物歧化酶 t mt r a n s m e m b r a n e跨膜区 嘶s 乙二胺四乙 t e研se d 秘 酸 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l1 3 5 溴4 氯3 吲哚 x g a l d - g a l a c t o s i d e半乳糖苷 v i i 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：刁豆肠夕时年i 月 3 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产杈单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 日期：z , - 4 年，月3 日 日期：朋年t o 月j 日 1 1 9 镁离：f 转运基冈a t m g t 7 的功能研究 第一章文献综述弟一早义陬琢尬 1 1 模式植物拟南芥的研究概况 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 是十字花科植物，由于具有独 特的生物学及遗传学性质，目前己成为植物发育生物学与分子生物学 的重要模式植物，被誉为植物中的果蝇。拟南芥的基因组全序列在 2 0 0 0 年底已完全测定并公开发表n 1 ，这是第一个己完全测序的显花植 物，为拟南芥的基因克隆、结构与功能分析创造了良好的平台。有人 预测，到2 0 1 0 年拟南芥的2 9 0 0 0 多个基因的功能都会得到阐明瞳1 ， 这必将对人类认识自然、改造自然产生深远的影响。 1 1 1 拟南芥植物的普通生物学特性 拟南芥为二年生植物，体型小，成熟植株一般高1 5 2 0 c m ，莲座 状基生叶长度不超过5 c m 。植株的生长条件要求不是很严格，只要有 充足的水源与光照，就可以迅速的生长。拟南芥生长周期短，从发芽、 莲座叶的长成到第一粒种子的成熟可在6 周内完成，而全株成熟只需 要2 个月时间，这大大加速了它的世代繁殖，缩短了遗传分析的时间。 在较好的生长环境条件，一株拟南芥可产生上百个荚果，结上万粒种 子，便于遗传分析和扩增种子库。拟南芥的花器官为两性花，在温室 和人工气候室内几乎达到1 0 0 的白花授粉，且在实验室也可以完成 人工杂交授粉，便于开展植物隐性、致死突变体及多突变体遗传操作。 1 1 2 拟南芥植物的遗传学特性 拟南芥一般为二倍体生物，有5 对染色体，比其它模式植物如玉 博十学位论文 米、小麦更容易进行有效的染色体的连锁分析。拟南芥基因组为1 0 1 0 8 b p ，是被子植物中最小的，只有大肠杆菌( c o l i ) 的1 5 倍， 啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的8 倍3 。其它植物如水稻、 烟草：豌豆分别是拟南芥的4 5 倍、1 6 倍和4 5 倍h _ 1 。在整个拟南 芥基因组中，科学家曾预测有2 94 5 4 个基因，测序结果表明只有少 于1 50 0 0 个不同的基因存在，这个数字只比果蝇的1 36 0 1 个基因数 目略大，而小于线虫的1 84 2 4 个基因随一1 。由于基因组小，拟南芥 d n a 中的重复序列较低，几乎没有间隙序列，即使有重复序列，通常 相距很远，有利于进行植物基因组文库的构建、筛选等 拟南芥的另一个重要的遗传特性是比其它植物更易进行遗传转 化睁1 。拟南芥可以通过农杆菌介导法转化植株的花、根、叶及悬浮细 胞，也可以通过p e g 融合、基因枪法转化原生质体与叶片等。因此， 可以很方便地进行基因功能方面的详细研究。 拟南芥的其它遗传特性包括该植物较易通过诱变处理，产生种类 繁多的突变体。加之，拟南芥形态特征简单，易于鉴定突变体及分离 到突变基因。因此，诱变与突变体筛选己成为研究拟南芥植物基因功 能的重要途径n 引。诱变方法包括物理、化学方法，t - d n a 插入诱变和 转座子插入诱变。进几年来，广泛采用的诱变方法是插入诱变法 ( i n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i s ) ，亦称基因标签法( g e n e t a g g i n g ) ， 它是基于在基因中插入己知的d n a 片段，而使基因失去或获得功能， 从而产生突变。由于一般是特定d n a 片段插入到基因中，故产生的突 变往往是失去功能的( 1 0 s sf u n c t i o n ) ，而获得基因功能( g a i no f 2 镁离子转运基冈a t m g t 7 的功能研究 f u n c t i o n ) 的突变体较少。k a y o k oy a m a d a , j u n j 毋j o s e p h 彪等 已完成了2 2 5 0 0 0 次农杆菌转化拟南芥d n a ( t - d n a 插入转化) 实验， 获得了8 80 0 0 多个t - d n a 准确插入位点，并鉴定出2 17 0 0 个拟南芥 基因突变株，占到了整个预测基因的7 4 ，这些突变株的获得为研究 植物基因功能与进行遗传分析提供了良好的材料3 。 综上所述，人们在利用拟南芥作为模式植物研究植物的基因功能 方面取得了重要进展，从拟南芥中克隆与鉴定了一大批功能基因，涉 及到植物发育、性别分化、生理代谢、激素调节、以及对环境胁迫的 应答反应等个方面n 2 i 。 1 1 3 影响拟南芥生长的主要因素 ( 1 ) p h 值：拟南芥最适宜生长的p h 值为5 5 5 8 ，p h 值高于 5 8 ，则种子发芽率低，对于储藏时间长于1 年的种子尤为明显。 ( 2 ) 培养基质：拟南芥适宜于通气状况良好的基质如蛭石中生 长，粘质土壤易导致烂根，造成根系活力降低，影响植物开花与结果。 ( 3 ) 温度：2 2 温室培养的植株生长较快，4 5 周即开花，果 实一周左右成熟。自然温度下( 9 月1 1 月期间，日均温度为1 0 - - 3 0 。c ) 培养的植株生长慢，但比较健壮，6 周左右开花，果实成熟时 间约2 周。当培养室的温度高于2 2 ，植株的开花与结实均受到影 响，花形态发育不正常，花苞易于干枯而败育，有的花可形成果实， 但多内空或种子小，不饱满。 ( 4 ) 空气相对湿度：在拟南芥培养中，湿度是一个十分值得注 意的因素。根据我们的经验，若培养温度高于2 2 。c ，相对湿度低于 博十学位论文 5 0 ，则植株小，结实少或不结实。反之，若相对湿度高于8 0 ，即 使温度高于2 2 c ，植株仍然生长旺盛，结实正常。 ( 5 ) 水分：拟南芥不太抗旱，应注意及时浇水，但不应每天浇 水，可4 一- 5 天浇次，每次浇透，以保持土壤中通气状况良好。浇 水方式不宜直接在培养皿上洒水，可浇灌在培养皿底部，通过渗透方 式保持土壤湿润。 ( 6 ) 光照：在人工气候条件下，长光照( 1 6 小时) 下培养的植 株生长周期短；短光照( 8 小时) 培养，植株的生长周期长。另外， 光照强度对植株的生长也有影响。 总之，在拟南芥培养过程中，我们可以根据不同的培养目的，选 用不同的培养条件。如繁殖种子，要求营养生长期短，结实多，我们 可选用高温( 2 2 2 8 ) 、高湿( 7 0 9 5 ) 条件；观察营养生长或 某一形态发生过程，则要求生长速度较慢，我们可选用低温( 2 0 - 2 2 ) 、中湿( 5 0 8 0 ) 条件。 1 2 镁离子的化学特性及其在植物中的生理作用研究 1 2 1 镁离子概述 镁离子( m 9 2 + ) 是细胞中最丰富的二价阳离子n 3 ，川，存在各种组 织与细胞中。但细胞中镁离子的浓度不是静态的，而是处于一种动态 平衡。研究表明，在动物体内，每种类型细胞的镁离子浓度不相同n 5 i ， 在植物中，不同细胞的镁离子含量也处于不同水平n 6 ，1 7 1 。这暗示，镁 离子的吸收与转运在不同的细胞中有不同的调控方式，以维持细胞镁 离子的平衡和细胞功能正常发挥n8 | 。此外，最近在植物中，人们还发 4 镁离子转运基冈a t m g t 7 的功能研究 现镁离子是一种重要的调控信号，调控生物体内的很多生化反应，例 如镁离子可调控叶绿体中碳固定的关键酶活性乜0 | 。 由于镁离子在组织细胞中起重要作用，镁离子的缺乏，会引起 组织缺失镁离子的各种症状。在单细胞生物，镁离子缺失表型很容易 观察到。像细菌、酵母细胞的镁离子缺失，会导致生长速率显著下降。 如果这些细胞的镁离子吸收系统发生突变时，则只有细胞外液中的镁 离子浓度较高，才能维持细胞的正常生长乜1 2 2 j 。在酵母细胞，亚细胞 结构的镁离子缺失，像线粒体，也会导致典型的p e t 表型瞳引。在植物 中，镁离子的缺乏，首先表现为植物光合速率的变化，这或许是由于 镁离子与叶绿素的合成有密切关系心4 | 。 同样明显的是，镁离子的过多积累也会对细胞产生毒害作用。 在单细胞生物中，镁离子毒害的表型很难观察到。在植物中，镁离子 的毒害往往与干旱胁迫相联系乜5 j 。 尽管镁离子在组织细胞内的平衡非常重要，但过去人们对镁离子 的吸收与转运研究比较少、也不系统，对离子转运的研究主要集中在 c a 2 + 、k + 、n a + 等离子转运系统方面。1 8 0 0 年，j u s t u sv 0 1 7l i e b i g 等认 识到镁离子是植物生长发育的重要元素，2 0 世纪早期，人们才发现镁 离子对动物( 包括人) 也具有重要作用，而以试验手段证明镁离子转 入酵母细胞和细菌细胞分别是在2 0 世纪4 0 年代和6 0 年代。更令人惊奇 的是，人们从发现细菌中镁离子转运系统到克隆第一个与镁离子转运 相关的基因，花费了近1 7 年时间。在真核生物，关于镁离子转运的研 究直到最近才取得重要进展哺刚( 见1 2 3 i $ 述) 。 博十学传论文 1 2 2 镁离子的独特化学特性 m 9 2 + 与其它金属离子比较，有其独特的化学特性。m 9 2 + 缺乏d 电子 参与键间作用，其键角的灵活性不如其它阳离子，在溶液和生物环境 下，与水分子或别的分子结合形成近9 0 。的键角，成规则的几何形状； m 9 2 + 的六个配位键的键距和键角也较为固定，易与中性含氮基团，如 氨基酸和咪唑，以及酸性基团中的氧结合形成共价键，不易与氮和硫 形成共价键眩刨，故m 9 2 + 与蛋白质和其他分子的结合力较弱，较难接 近蛋白质中较深部位的结合位点。有意思的是，m 9 2 + 在脱水状态，是 二价阳离子中半径最小的：与水分子结合的时候，体积则增加近4 0 0 倍，水合离子半径又是最大的。加之，m 9 2 + 与水分子的亲和力比c a 2 + 、 n a + 和k + 大得多，因此，有人推测镁离子是通过与水分子的空间结合 在酶的活性调控中起作用心7 l 。 镁离子上述特征，使人们相信镁离子具有独特的转运系统。在 细菌、酵母中，镁离子的转运研究支持这一假说。 1 2 3 镁离子在植物中的生理作用 m 9 2 + 是植物生长发育的必须元素，在植物酶活化、光合作用、氮 代谢和活性氧代谢等方面具有重要生理作用娩9 3 0 1 。 ( 1 ) 酶活化 几乎所有的磷酸化酶和激酶都需要m 9 2 + 来活化，删姒认为，a t p 酶的活化是通过m 9 2 + 的桥接作用实现的，臣 j m 9 2 + 在a t p 或a d p 的焦磷酸 盐结构和酶分子之间形成一座桥梁。m 9 2 + 能促进a t p 或a d p 的水解并 释放出磷酸和能量，也能活化a t p 酶，促进磷酸化作用，合成更多 镁离- f 转运基冈a t m g t 7 的功能研究 a t p 引。m 9 2 + 作用的机制在于改变a t p 酶的构象，使埋藏在酶内部的结 合态核苷酸更容易暴露出来，以接近底物，从而增加处于活化状态 的酶数量3 34 i 。光合作用、糖酵解作用、三羧酸循环和呼吸作用等能 量转移的基本过程都需要m 9 2 + 。不过，对于磷酸激酶、磷酸转移酶的 活化，m 9 2 + 的作用是专一性的，而对糖酵解作用的烯醇酶、三羧酸循 环中的脱氢酶的活化作用，m 9 2 + 的活化作用可e h m n 代替口引。 m 9 2 + 也是叶绿体基质果糖1 ，6 一二磷酸酯酶和景天庚酮糖一1 ，7 一二 磷酸酯酶的活化剂。光照使叶绿体基质中p h 值及m 9 2 + 浓度提高，相应 地促进了果糖l ，6 一二磷酸酯酶和景天庚酮糖一1 ，7 一二磷酸酯酶的活 化，这2 种酶的活化促进光合作用，使光合链中形成的磷酸丙糖，通 过叶绿体被膜的p i 运转器而转移到胞质溶胶，再逐步转化为蔗糖m 6 i 。 缺m 9 2 + 则导致叶绿体中淀粉的累积，碳水化合物运转受阻口引。缺m 9 2 + 使叶绿体淀粉累积的原因尚不完全清楚，f i s c h n e r t x 为，其原因可能 是光合同化物向库的运转受阻或光合同化物的利用率下降，也可能 是二者共同作用的结果8 | 。 ( 2 ) 光合作用 m 9 2 + 是叶绿素的重要组成成分，占了叶绿素分子量的2 7 ，m 9 2 + 也是叶绿体正常结构所必需的9 | 。但植物叶绿素含量的降低是否是由 于合成叶绿素的m 9 2 + 不足呢? 目前尚无定论。ma r s c h n e r 等认为，植物 叶绿素含量的降低不是由于叶绿素分子合成所需的m 9 2 + 不足，而是蛋 白质合成受阻所致侧。近年来的研究则认为，缺m 9 2 + 胁迫下的活性氧 伤害是叶绿素含量降低和叶片黄化的主要原吲4 1 3 。 博士学位论文 除了参与叶绿素的合成外，m 9 2 + 对光合膜垛叠、激发能在2 个光系 统之间的分配、光合电子传递速率、叶绿素荧光、p s e 活性和原初光 能转化效率以及光合碳代谢等一系列重要的生理生化过程都有明显 的影响3 9 4 0 1 。 ( 3 ) n 代谢 硝酸还原酶( n r ) 是n 素代谢的限速酶，该酶可直接调节n 0 。一 还原，从而调节n 代谢。m 9 2 + 可提高硝酸还原酶的活性水平，还能稳定 蛋白质合成所必需的核糖体构型，缺m 9 2 + 导致核蛋白体解离成小的核 蛋白体亚单位h2 i 。因此，一旦镁离子缺乏，则蛋白质合成受阻。 ( 4 ) 活性氧代谢 m a r s c h n e 噎研究光强对缺素( 缺z n 、缺k 、缺mg ) 菜豆叶片失绿 和坏死的影响时发现，强光使缺m 9 2 + 菜豆叶片叶绿素含量明显降低， 失绿症加重，但对叶片m 9 2 + 含量无明显影响，并推测强光加重的缺m 9 2 + 症状与活性氧累积及生物膜过氧化作用有关h3 l 。之后的研究证实，缺 m 9 2 + 时菜豆叶片自由基清除系统的酶( s o d 、g r ) 活性提高，过氧化保护 物质( a s a 、s h 化合物) 含量增加。不同种类外源活性氧清除剂的实验 结果表明，缺m 9 2 + 胁迫菜豆所累积的活性氧主要是0 。2 和o hm 引。 1 3 镁离子转运蛋白的研究 由于生物膜对镁离子不具渗透性，镁离子吸收和转运都由复杂的 膜蛋白系统来完成。 1 3 1 原核生物中的o o r a 镁离子转运蛋白 镁离子转运基冈a t m g t 7 的功能研究 在所有组织中，c o r a 基因及其蛋白是研究最深入的一种镁离子 转运系统。大部分关于c o r a 基因的研究文章来自于彪叵, ! l a g u i r e 。 直到最近，尼一s c h w e y e n 对镁离子的转运研究取得重要突破并产 生重要影响。 19 6 9 年，s i m o ns i lv e r 首先发现e s c h e r i c h i ac o l i 中具有一 类镁离子转运体系h 引。但直到1 9 8 6 年，t 物i e l & p 才第一次从原核 生物s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 克隆到这一编码镁离子转运蛋白的基 因一仍卅基因h6 l 。研究表明，c o r a 基因广泛分布于原核生物中，含 有一个9 4 8 核苷酸的开放阅读框，编码3 1 6 个氨基酸残基。c o r a 蛋 白在原核生物中是高度保守的，序列相似性达到9 8 n 引，但在亲缘关 系较远的物种之阎，相似性仅为1 5 2 0 h 7 1 。在亲缘关系更远的物种 间，蛋白序列同源性仅仅为c 一末端的2 个t m 跨膜区和高度保守的 m p e l 与y g m n f 基序h 引。g m n 序列在c o r a 基因家族中被认为是蛋白结 构与功能的基本单元。突变分析表明，g m n 中的任一氨基酸发生突变， 都会使c o r a 蛋白丧失m 9 2 + 的转运能力n 9 5 0 i 。 最近，c o r a 蛋白的晶体结构得到了阐明瞄1 5 2 5 3 3 。研究显示：c o r a 蛋白是由同源五聚体组成的一个具t m l 和t m 2 两个螺旋跨膜区的烟窗 式结构( 图卜1a ) ，t m l 组成内腔，外面由单体形成呈指环状的t m 2 包围着，上有m 9 2 + 、c 0 2 + 、c a 2 + 二价金属离子的结合位点( 图卜1 b 、c ) 。 在t m l 和t m 2 环状结合位点，则由保守的m p e l 与y g m n f 基序组成， 这种带负电荷的羰基化结构被认为是更加有利于二价金属离子转入 m 1 ( 图卜l d ) 。 9 博士学住论文 芦曝 圈ic o r a 蛋白晶体拓扑结构 f i g u r e 1 t h e t o p o l o g ys t r t m t u r e o f t h e a m ，+ c h a n n e l 132 原核生物中 i g t a 及m g t b 镁离子转运蛋白 m g t h 和m g t b 是置t y p h i m u r i u m 中发现的另外两个具镁离子转运 活性的蛋白，为复合跨膜蛋白，属于p 型a t p a s e 家族4 “。m g t a 蛋 白由m t g a 基因唯一的o r f 框编码，分子量大约为9 1 k 1 ) a ；而m g t b 基 因则是一个操纵子( o p e r o n ) ，其中的一部分编码m g t b 蛋白，另一部 分编码m g t c 蛋白，m g t c 蛋白与 l g t b 的分子量分别为2 2 1 5k d a 、1 0 2 k d a “。m g t h 与m g t b 基因的转录通过镁离子结合到p h o q 膜感受器 上进行调控，在低镁离子逆境胁迫诱导下表达“6 。”。与c o r a 基因的 - i m 、“ 蕊 镁离：f 转运基冈a t m g t 7 的功能研究 转录和蛋白表达不受m 矿影响不同，当胞外镁离子含量正常时，镁离 子结合到p h o o 上并且抑制基因的转录当胞外镁离子浓度降低时， 基因转录增加。在转运能力方面，c o r a 与m g t 基因一样都受到p h 值 的影响，当p h 为5 0 时，组成型的c o r a 镁离子转运蛋白的转运能力 比在p h 为7 0 时强，但m g t a 、m g t b 的转运能力恰恰相反。因此， 推测c o r a 与m g t 转运体可能相互补充，在不同条件下表达瞄8 5 9 6 0 | 。此 外，c o r a 和m g t a m g t b 系统除了可以转运m 9 2 + ，还能转运其它的二价 金属离子如：n i 2 + 和c 0 2 + ，但从l ( 1 i l 值及离子浓度分析来看，这些基因 的生理功能主要是作为镁离子的转运系统哺1 6 2 j 。 m g t e 是在革兰氏阳性细菌坚强芽胞杆菌( b c i h u sl i t m u s 饼劲 中克隆到的另一类可能的镁离子转运蛋白引。蛋白序列及拓扑结构分 析表明，该蛋白与c r o a 蛋白或其它任何目前已知的转运蛋白的同源性 小，从目前的数据来看，尚不能确定m g t e 是否是一种新的镁离子转 运蛋白。然而，m g t e 可以调节镁的吸收，在细菌中存在较为广泛。推 测，m g t e 的功能与镁离子或其它阳离子的吸收相关，可能是一种新的 镁离子转运蛋白m 4 | 。 1 3 3 酵母抗铝毒性a l r i 和a l r 2 镁离子转运蛋白 在酵母中，有人发现了两个抗铝离子毒性的蛋白阳引，其结构与 c o r a 有一定同源性，都有一个高电荷的n 端d o m a i n ，c 端有两个疏 水d o m a i n ，在靠近第一个疏水区域的末端有一保守的g m n 基序，且 在低镁离子浓度条件下，a l r l 与a l r 2 基因缺失酵母突变体( c m 6 6 ) 生长很弱，暗示a l r 具有镁离子转运的功能哺6 | 。进一步分析表明，a l r l 博十学位论文 基因位于酵母细胞的质膜上，基因的表达受到镁离子浓度的控制，并 且a l r l 酵母突变体经过一段时间镁离子饥饿后，在恢复镁离子浓度 的情况下，不会导致细胞内的m 9 2 + 浓度增加哺7 f 。d o n a j d 丘m a r t i n 等 利用膜片钳技术雎刖，比较a l r l 与a l r 2 基因缺失酵母突变体( c m 6 6 ) 与转基因的c m 6 6 + a l r l 酵母菌株的电生理特征，测得c m 6 6 的内流电 流平均为一5 1 2 6 p a ，而转a l r l 基因的c m 6 6 菌株平均内流电流达到 2 6 4 4 8 p a ，显示a l r l 可能具有离子通道蛋白功能。 1 3 4 酵母线粒体膜上m r s 2 镁离子转运蛋白 与彳躔因一样，脚毽瑾因首先不是作为镁离子转运基因被鉴定 和测序的，而是作为线粒体中r n a 剪接缺失抑制因子发现的引。2 0 0 1 年，a r e g a r 游在研究m r s 2 突变体功能时，发现该蛋白能改变酵母线粒 体的镁离子浓度。进一步研究证实，m r s 2 蛋白位于线粒体内膜上，m r s 2 突变，镁离子不能转运进入线粒体中，而只能以缓慢的“渗透 的方 式进入，过表达m r s 2 ，则可以使线粒体镁离子浓度迅速增加 7 0 , 7 1 , 7 2 。 序列分析表明，m r s 2 与细菌c o r a 转运蛋白类似，而且与酵母的 a l r l p 及a l r 2 p 蛋白有较近关系，都有两个位于羧基端的跨膜区域， 且被短的多肽相隔，第一个跨膜区域的末端有一个短的6 m n 序列基序， 这个保守基序的残基对镁离子的转运是必需的口3 | 。另外，m r s 2 蛋白的 一个较长的氨基端及一个较短的羧基端朝向基质一边的空间，为亲水 性末端，在靠近第二个跨膜区域的羧基端序列中带有正电荷，推测这 可能为蛋白朝向基质空间的定位提供一个拓扑基因信号h 圳。 1 3 5 植物中m 9 2 + 转运蛋白 1 2 镁离子转运基冈a t m g t 7 的功能研究 迄今为止，在高等植物中已克隆到两类具m 9 2 + 转运活性的转运蛋 白，一类是m 9 2 + h + 反向转运蛋白，另一类是c o r a li k e 镁离子转运蛋 白。 ( 1 ) m 9 2 + h + 转运蛋白 1 9 9 3 年，p f e i f f e r r 寸巴蜀黍根的液泡进行生理和分子研究中， 发现了一个m 9 2 + h + 反向转运蛋白口5 j ，该蛋白在液泡膜上介导m 9 2 + 向液 泡内的转运。1 9 9 9 年，s h a u l 等在拟南芥中第一次克隆到编码该蛋白 的基因一at m h x 畸训。氨基酸序列分析表明，a t l x 与哺乳动物质膜上的 n a + c a 2 + 反向转运蛋白n c x l 有3 6 同源性，蛋白结构也相似，都含有 11 个跨膜区域，而且在跨膜区5 和6 之间，两个蛋白都有一个长的胞质 环( n o n m e m b r a n a ll o o p ) 。在n c x l 中，胞质环有5 0 0 个氨基酸长，对转 运功能不是必需的，但起到调控作用。在a t m h x 中，此环较短，仅有1 0 0 个氨基酸长口6 i 。 n o r t h e r nb l o t 分析显示，a t m h x 的m r n a 在拟南芥根、茎和花朵中