（无机化学专业论文）钌配合物抗肿瘤活性及其诱导肿瘤细胞凋亡的研究.pdf

2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文刘江琴 摘要 自从1 9 6 9 年顺铂被发现具有抗肿瘤活性以来，铂类配合物以及其它非铂 类金属配合物抗肿瘤活性研究非常广泛。许多配合物被合成，并且测试了它们 的抗肿瘤活性。钌配合物被认为是最有前途的。因为钌配合物无论在固态还是 在溶液中都很稳定，具有预期的结构，并且低毒。到臣前为止，许多钉配合物 被合成并且测试了它们的抗肿瘤活性和机理。 为此，我们设计合成并分离了系列钉配合物，对它们的抗肿瘤活性及抗 肿瘤机理进行了初步研究。方法和结果如下： 1 采用m t t 法测定了十五个配合物对人体正常肝细胞l 0 2 作用4 8 小时 后的生长抑制。结果表明：配合物a 3 的细胞毒性最强。当浓度为1 0 0 9 9 r o _ l 时，抑制率达到8 5 9 。 2 采用m t t 法测定了十五个配合物对肿瘤细胞b e l - 7 4 0 2 、a 5 4 9 、 c n e 一2 z 作用4 8 小时或7 2 小时后的细胞毒性实验。结果表明：所有配合物均 表现出抑制作用，其中c 3 对b e l 7 4 0 2 的活性最大，其i c 5 0 为1 0 6 p m l 。 3 采用台盼蓝拒染计数法测定了十二个配合物对k 一5 6 2 细胞作用4 8 小时 和7 2 小时的细胞毒性实验。结果表明：配合物对i - 5 6 2 细胞的抑制率高于对 其他三个肿瘤细胞的抑制率。其中c 3 的活性最大，i c 如分别为1 0 1 l a g m l 和 7 4 1 l a g m l 。 4 用h o e c h e s t 3 3 2 5 8 p i 荧光染色法观察配合物c 3 处理b e l 7 4 0 2 细胞 4 8 小时后是否有凋亡细胞。结果表明：在荧光镜下观察出现典型的细胞凋亡 形态。并且随着浓度的增加凋亡越明显。 5 用流式细胞术检测c 3 处理b e l 7 4 0 2 细胞4 8 小时后的凋亡率。结果 表明：当c 3 浓度为4 0 9 9 m l 时，凋亡率为2 0 7 。 关键词：钉配合物抗肿瘤活性凋亡抗肿瘤机理 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文 刘江琴 s t u d i e so na n t i t u m o ra c t i v i t i e so fr u t h e n i u m c o m p l e x e sa n d t h e i ri n d u c t i o no f a p o p t o s i so f t u m o rc e l l s m a j o r ：i n o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：l i uj i a n g - q i n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f l i uj i e a b s t r a c t t h ea c c i d e n t a ld i s c o v e r yo ft h ec y t o s t a t i cp r o p e r t i e so fc i s p l a t i ni n1 9 6 9 s p a r k e d o f fa n e x t e n s i v es e a r c hf o ro t h e rp l a t i n u ma n dn o n - p l a t i n u m m e t a l s a n t i t u m o ra g e n t s n u m e r o u sc o m p l e x e sw e r es y n t h e s i z e da n dt e s t e df o ra n t i t u m o r e f f e c t s r u t h e n i u mc o m p l e x e sa r er e g a r d e da s p r o m i s i n ga l t e r n a t i v e st op l a t i n u m c o m p l e x e ss i n c et h ec h e m i s t r yi sw e l lu n d e r s t o o da n do f f e r sm a n ya p p r o a c h e st o i n n o v a t i v em e t a l l o p h a r m a c e m i c a l s ；t h ec o m p l e x e sa r ek n o w nt ob es t a b l ea n dt o h a v ep r e d i c t a b l es t r u c t u r e sb o t hi nt h es o l i ds t a t ea n di i ls o l u t i o n ；a c c o m p a n i e db ya s t e a d i l yi n c r e a s i n gk n o w l e d g eo f t h eb i o l o g i c a le f f e c t so f r u t h e n i u mc o m p l e x e s u p t on o w , al a r g en u m b e ro f r u t h e n i u mc o m p l e x e sh a sb e e ns y n t h e s i z e da n dt e s t e df o r t h ea n t i t u m o ra c t i v i t y w e d e s i g e da n ds y n t h e s i z e das e r i e so f r u t h e n i u mc o m p l e x e sa n du s e dt h e mt o s t u d yt h ec y t o t o x i ca c t i v i t ya n da n t i t u m o rm e c h a n i s m s t h er e s u l t sa r o 1 t h eg r o w t hi n h i b i t o r ya c t i v i t i e so ff i f t e e nr u t h e n i u mc o m p l e x e sw e i c e v a l u a t e di n 王广0 2n o r m a lh u m a nl i v e rc e l l s w i t hm t t a s s a y 瓶e l 4 8ho f t r e a t m e n t 1 1 1 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文刘江琴 c o m p l e xa 3s h o w e dt i ms t r o n g e s tc y t o t o x i ca c t i v i t y , a n dt h ei n h i b i t i o nr a t ew a g 8 5 9 b yt r e a t m e n tw i t h1 0 0 肛g m l 2 n 站g r o w t hi n h i b i t o r ya c t i v i t i e so ff i f t e e nr u t h e n i u mc o m p l e x e sw e 地 e v a h i a t 铷li nb e l - 7 4 0 2 ，a - 5 4 9 , c n i 2 z c e l l s ，w r hm t t a s s a ya i t c r4 9 h o r7 2 ho f t r e a t m e n t a l lc o m p l e x ss h o w e dt h ei n h m i t i o na c t i v i t y , a n dc 3w a f tt h em o s ta c t i v e j i lb e l r 7 4 0 2 w h o s ei c s 0w a s1 0 6 p g m l 3 t h eg r o w t hi n h i b i t o r ya c t i v i t i e so ft w e l v er u t h e n i u mc o m p l e x e sw e r e e v a l u a t e di nk - 5 6 2c e l l s , w i t ht r y p a nb h me x c l u s i o nt e s ta f t e r4 8 ho r7 2 ho f t r e a t m e n t c o m p l e x ss h o w e dm o r eh i g h e r 虹山m i t i o nr a t ei nk - 5 6 2c e l l s c 3w a st h e m o s ta c t i v e , w h o s ei c 5 0w e r el o 1 t t g m l ，7 4 1p g m l r e s p e c t i v e l y 4 p la n dh o e c h s t3 3 2 5 8w e r eu s e dt os t a i nb e l 7 4 0 2c e l l st r e a t c dw i t h c o m p l e xc 3 ，o b s e r v a t i o na n dp h o t o g r a p h yw b - t em a d e u l d e rf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e t y p i c a la p o p t o t i cb o d i e sw e r es e e ni nt h eb e l - 7 4 0 2c e i l st r e a t e dw i t h c 3 5 n 撼i n d u c t i o no fa p o p t o s i so fb e l - 7 4 0 2c e l l st r e a t e dw i t hc 3w e r e s t u d i e db yf l o wc y t o m e t r ya n a t , t h ea p o p t o s i sr a t eo fb e l - 7 4 0 2c e l l st r e a t e d w i t h4 0 p e d m lo f c 3w a s2 0 7 k e y w o r d s ：r u t h e n i u mc o m p l e x e s ；a n t i t u m o ra c t i v i t y ；a p o p t o s i s ；a n t i t u m o r m e c h a n i s m s 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文刘江琴 1 1 引言 第1 章前言 癌症是全球一个主要死亡原因。世界卫生组织预测，恶性肿瘤是本世纪人 类健康最大的威胁。目前全世界恶性肿瘤的发病率不断上升，每年新增恶性肿 瘤病人近1 0 0 0 万。据估计，2 0 0 5 年有7 6 0 万人死于癌症，并且如果不采取行 动，在今后l o 年将有8 4 0 0 万人死亡根据目前癌症的发病趋势，2 0 2 0 年全 世界癌症发病率将比现在增加5 0 ，全球每年新增癌症患者人数将达到1 5 0 0 万人由此。世界卫生组织( w h o ) 己提出一项全球耳标，从2 0 0 6 年至2 0 1 5 年每年将慢性病死亡率降低2 。实现这项目标可在今后l o 年内避免预测由癌 症造成的8 4 0 0 万死亡中的8 0 0 多万。w h o 正在加强其应对以实现这项目标 因此，各国政府、研究机构及制药公司长期以来一直对肿瘤研究和抗肿瘤药物 予以高度重视，在抗肿瘤药物的研究上，目前已取得了重大进展。近年来，分 子肿瘤学、分子药理学的发展使肿瘤本质正在逐步阐明；大规模快速筛选、组 合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程；抗肿瘤药物 的研究与开发已进入一个崭新的时代。 金属抗癌配合物的研究一直是无机药物研究的重点。特别是顺铂( d d p ) 的 临床应用，使抗癌配合物的设计合成和筛选成为热门课题，人们合成了大量的 具有抗肿瘤活性的配合物，为寻找广谱、高选择性和低毒性的抗肿瘤药物做 出不懈的努力。 1 2 金属配合物抗肿瘤活性 1 2 1金属铂配合物抗肿瘤活性 金属配合物抗肿瘤作用的研究是从发现顺铂开始的。2 0 世纪6 0 年代， 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文 刘江琴 r o s e n b e r g 在研究电流对微生物的效应时，偶然发现在n h 4 c 1 的存在下，铂电 极周围的含微量铂电解产物培养液可抑制大肠杆菌的繁殖，r o s e n b e r g 合成并 试验了一系列铂类化合物，发现顺铂( 顺式二氨二氯铂，1 ) 对s 1 8 0 及l 1 2 0 1 等小鼠移植性肿瘤具有强大的抗肿瘤作用【l 】。随后证明了二氨= 氯铂( 顺式) 对多种恶性肿瘤有显著的疗效，并且新一代的铂类药物不断问世，相继合成出 几千个类似的铂配合物，其中包括后来已经走向临床应用的如卡铂f 顺式二氨 基( 1 ，1 - 环丁烷二羧酸) 合铂，2 】、奥沙利铂“l r ，2 r ) - i ，2 - - 氨基环己烷草酸 根合铂，3 】等。今天，顺铂已成为临床上治疗睾丸癌、卵巢癌、头颈肿瘤和膀 胱癌等最广泛使用的药物之一【2 l 。但它的毒副作用也是十分明显的，如肾毒性、 骨髓毒性、耳毒性、外周神经毒性、催吐性及长期使用产生的耐药性等i 引，而 且有不少肿瘤铂类药物并不起作用，使其应用受到限制。这促使一部分研究者 的眼光转向开发非铂类金属抗癌药物 4 , 5 1 。 o 胃，nc l p t h ，ncj l 葛i 暑 o 豳1 - 1 顺铂，卡铂奥沙利铂的结构 1 2 2 非铂类金属配合物抗肿瘤活性 抗癌的会属配合物【6 1 药物的合成涉及到的会属元素基本集中于过渡会属 中的i b 族的c u 、a g 、a u ：v b 族的v 、n b 、t a ；v i b 的m d 、w ；v i i i 族中 的f e 、c o 、n i 、r u 、r h 、p d 、i r 、p t 和一些主族金属配合物，如i v a 族的s n 、 g e 等。 2 p 】 ， h h o d 土 ：y 入 h 一 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文 刘江琴 抗癌有机锡配合物在8 0 年代多设计合成为铂类类似物，特别引人注目的 是烃基类有机锡，其中有些配合物的抗癌活性比顺铂高出数百倍由于吡啶、 吡唑、咪唑、噻唑等的衍生物结构中有多个配位点，人们合成了六配位的具有 双氮螯合配体的有机锡配合物，并对它们的结构进行了表征，考察了它们对多 种癌细胞的抑制作用，探讨了构效关系【刀，结果表明这些配合物的活性结构构 效与铂类不同。有机锡配合物的突出缺点是抗癌谱狭窄，仅对少数肿瘤有明显 的抑制作用。尽管在探讨细胞与分子问相互作用上有一定的研究，但到目前为 此，实际作用机理仍未明确。 稀土配合物对细胞生长有胞浆毒性，稀土金属在生命过程中的重要作用己 引起医疗界的重视，而且作为药物早有报道。孔德源【3 】等合成了碱配体 l ( g i h l 2 0 4 n k e 2 0 ) 及其稀土配合物( l ) 2 l n o n h 2 0 ( l n = s m ，e u ，n o ；l n = y ， n d ，n = l ；l n = y b ，n = 2 ) 。该类配体是以酚氧原子、s c h i f f 碱的氮原子以及氨 基酸的羧基氧原子单落配位，形成了六配位的配合物。初步的药理实验表明该 类配合物在体外对肿瘤细胞株h l - 6 0 和b e l - 7 4 0 4 的生长有一定的抑制作用； 同时，又合成了一类新的s c h i f f 碱配体l ( c 1 7 h 1 6 0 4 n ) k ，同时在水相中合 成6 种新的稀土配合物。其化学式为( l ) 2 l n c i n h 2 0 ( l n = n d ，i f 4 ；l n = p r ， y b ，n = 2 ；l n = s m ，e u ，d y ，舻1 ) ；该类配体是以酚氧原子，亚氨基的氮原子、 桥联的羧基氧原子以及氯原子同稀土离子配位。形成了九配位的双核配合物。 稀土配合物能提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，从而在放、化疗修饰剂的无机合 成物提供了新的研究方向。 金属铜广泛存在于生命体系中，具有特殊的生物活性。苯乙酮缩氨基硫脲 与金属铜( 1 1 ) 形成二齿配合物，赵喜荣【9 l 采用小鼠移植性肿瘤模型对化合物的 抗s 1 8 0 腹水癌细胞的活性进行实验，发现作用良好。f e r r a r i 合成了新的5 - 甲 酰尿嘧啶缩氨基硫脲配合物，并对它进行抗肿瘤研究。结果发现：该配合物对 人白血病k - 5 6 2 、c e m 细胞的抑制活性很高，在较低浓度下抑制率超过5 0 ， 但它并不诱导细胞凋亡【i o l 。 金属金作为有潜力的抗肿瘤试剂，在上世纪多集中予一价配合物上。由于 a u ( 1 1 1 ) 离子与p t ( i i ) # f 层电子类似，而且都形成平面四方几何结构，a u ( 1 1 1 ) 配 合物有一定的细胞毒性和抗肿瘤性质【l l ，1 2 l ，但是迄今为止，由于他们的生理稳 定性差而发展缓慢。 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文刘江琴 金属银配合物在对第二代铂类抗癌药卡铂的空间结构类似物的合成上，丙 二酸银( i ) 的化合物被合成，并评价了它们对几种人类肿瘤细胞株的体外细胞 毒性。所合成的化合物对实验用的几种肿瘤细胞株有强烈的毒性作用，而对正 常人肝细胞的毒性作用则较弱，但其作用机理还不清楚。这一方面的研究提示 银的化合物也可能成为有希望的抗癌药物先导物。 有关铁( ) 配合物也有报道【1 3 1 4 】；赵元弟等人对铁( m ) 的s c h i f f 碱配合物 的电化学性质进行过研究。 在对金属配合物抗肿瘤研究中，钌配合物被认为是最有前途的。因为化学 家对它有充分的了解，可以提供许多途径去合成这些化合物。这些配合物稳定， 具有预期的结构，可以调节配体的亲和力，取代速度，以及氧化还原电势。还 有对钌配合物生物效应方面知识的增长，因而显示出了诱人的前裂1 5 m ，有些 化合物已经进入一期临床应用【4 引 1 3 钌配合物的合成及其抗肿瘤活性研究 由于钉配合物具有独特的物理和化学性质，人们已经合成了各种各样的钌 配合物，并对其相应的性质作了研究。八面体钌( 1 i ) 联吡啶配合物及其衍生物 由于具有独特的d n a 的键合能力、良好的电化学发光、氧化还原及激发态活 性等性能，可用于d n a 结构识别、电化学发光探针、太阳能材料及光催化等。 目前已合成出几百种该配合物或其配体【1 7 嘲。钉扑啉是通过扑啉环上的配位基 团与多吡啶钉配位而得到的一类具有丰富的光谱和化学活性的大分子配合物。 对钉扑啉的研究大都集中在其氧化还原、电化学以及催化氧化反应活性和超分 子自组装等方面【2 0 】。钉配合物的抗肿瘤活性按照其配体的种类分为以下几类 2 1 l 。 1 3 1 氨、胺、亚胺类配体的钌配合物 以氮、胺、亚胺为配体的钉配合物已经得到了很好的发展。c l a r k e 等在研 究它们与一些生物小分子作用的同时，最早对这类配合物进彳亍系统的抗肿瘤活 性评价之5 l ( 应用于p 3 8 8 淋巴细胞自血病体系) 。 4 2 0 0 7 届中山大学顽 学位毕业论文刘江琴 上世纪8 0 年代中后期，k c p p l c r 等 2 6 1 着手设计并合成了一大批通式为 h b r u b 2 c h i 和( h b ) 2 r u b c l 5 ( b 为含n 杂环小分子) 且有较好水溶性的钉配合 物，并用于体内抗肿瘤活性试验脚q ”，取得了令人惊喜的结果。其中数 h b r u b z c l 4 型【b ：咪唑( i i i i ，i c r ，4 ) ，b = 吲哚0 r i d 。5 ) 】的配合物，它们不仅对 p 3 8 8 体系的最佳t c 值分别为2 0 0 和1 6 0 ( 顺铂为l g o ，5 - 氟尿嘧啶为1 5 0 ) ，而 且4 还对w a l k e r 2 5 6 肉瘤，5 对s t o c k h o l m 腹水癌的最佳t c 值达到2 5 0 1 2 l i 。 另外，某些一元羧酸的钌配合物如： c h 3 c h 2 c 0 2 0 q h 3 ) 5 r u ( c 1 0 4 ) 具有抗 肿瘤活性。还有以氯为配体的配合物如：c s 0 2 0 q h 3 ) 4 r u c i ，如 0 3 ( n h 3 ) 3 r u 和( h i m ) 打乜p 【c 1 4 ( i m h 】也显示出很好的抗肿瘤活性1 3 2 1 。增加氯原子的 个数可以增加化合物的水溶性，从而增加其抗肿瘤活性。有实验证明 t r a s - ( l h ) c 1 4 l 2 r u ( l = 眯哗或吲唑) ，对许多系列瘤株显示出活性，特别对直肠 瘤活性更明显l 驯。 计亮年课题组研究一类钌的三双齿多毗啶配合物( r u ( b i p y ) 2 6 ( c 1 0 4 b ， r u ( p h c n ) 2 6 ( c 1 0 4 b ， r u ( p h e n h 7 ( c 1 0 4 b ，【r u ( 7 ) 2 ( b i p y ) ( c 1 0 4 b ，并对它们 进行了h l - 6 0 人白血病、b d 7 4 0 2 人肝癌、k b 人鼻咽癌、h e l a 人宫颈癌等 瘤株的体外活性筛选，结果发现除 r u ( p h e n ) 2 7 ( c 1 0 4 ) 3 和 r u ( p h e n ) 2 6 ( c 1 0 4 ) 3 对这4 个瘤株不表现出活性外，其余都表现出不同程度的活性，有的甚至与顺 铂相当【2 1 1 m i s h r a 等对含有配体8 的多吡啶配合物进行了体外活性筛选，发 现有几个配合物具有很好的活性【圳 矗 7 n 圈i - 2 配体6 ，7 ，8 ，9 的结构 ， 2 0 0 7 届中山大学硕 学位毕业论文刘江琴 最近有报道显示r u ( i i ) 配合物显示出很好的活性。特别是 e i s - c 1 2 ( a z p y ) 2 r u ( a 聊心h e n y l a z 0 ) p y r i d i n c ) 的a 异构体( 图l - 3 ) 与它的p 异 构体和t 异构体的细胞毒性不同i 蛳。可能是由于它有c 2 对称轴，因此与d n a 作用方式不同，所以a 异构体表现出比d 异构体和y 异构体更高的抗肿瘤活性。 幽i - 3c s - c 1 2 ( a z p y ) 2 r u 】o t 异社i 体 1 3 2e d t a 配体的钌配合物 钉与聚氨基，聚羧基整合配体的配合物是一类相对较新的抗肿瘤化合物l 抱 3 7 1 。研究发现：配合物 r u ( h 3 e d t a ) c 1 2 4 h 2 0 中两个氯原子处于顺式，与顺 铂类似，表现出很强的抗肿瘤活性嗍。环己二胺四乙酸( h 4 c d t a ) ( 9 ，钉为 十4 价) 1 3 7 1 及l ，2 一丙二胺四乙酸( p d t a ) 的钉配合物对p 3 8 8 体系表现出明 显的活性，还对e h r l i c h 腹水癌、人乳腺癌等表现出很强的活性化合物 ( h 2 0 x e d t a ) r u ( i i ) 1 2 不仅与5 - g m p 的n 7 ( 3 0 ) 而且与n 3 ( 7 0 ) 部位配位， 但r u ( 1 1 1 ) 仅仅只是在n 7 配位。多羧酸盐钉( m ) 配合物显示出活性出于被转铁 蛋白t f 传送，化合物c i s - c 1 2 ( p d t a ) r u ( i i i ) ( p d t a = l ，2 - p r o p l e n d i a m i n 咄t r a - a e r a t e ) 也显示出很好的抗肿瘤活性，可能是由于d n a 上的g t m s 交联的结果 这些化合物最大的特点是有很好的水溶性，在空气中稳定。【c 1 2 ( p d t a ) r u ( 1 1 1 ) 】 晶体结构表明它与两个氮和两个羟酸盐配位。在溶液中，c i 离解产生活性 r u ( 1 1 1 ) 配合物迅速与白蛋白结合，转铁蛋白( p d t a ) r u ( i i i ) 可能在蛋白表面与 组氨酸键合例。c i s - c 1 2 ( p d t a ) r u ( i i i ) 损伤细胞核的d n a ，抑制d n a 的识别 和消散，改变d n a 的构造1 3 9 1 从而表现出抗肿瘤活性。 6 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文刘江琴 1 3 3 r e s o 类配体的钌配合物 1 9 8 4 意大利化学家g i o v a n n im 髂x r o n i 和他的合作者首次发现c s - 和 t r a s - 【c h ( m e ：z s o ) 4 r u 对几种鼠类转移性肿瘤具有抗赘瘤生长的作用，从而 开发了一类新型抗肿瘤药物。它们具有良好的水溶性，低毒性。实验表明，c i s 和t r a s c h ( m e 2 s o ) 4 r u 不仅具有抗赘瘤生长的性质，而且具有对某些耐顺铂 的p 3 8 8 淋巴白血病表现出很好的活性。同样条件下反式比顺式更有效。 为了探讨它们的抗肿瘤机理，通过实验证实，c s c h ( me ：z s o ) 4 r u 在水溶 液中的行为如下： 当顺式异构体溶于水后，立即释放出一个氧配位的二甲基亚砜分子，紧接 着是一个c l 。离子的缓慢解离，给出一个阳离子物种【4 。反式反式异构体在水 溶液中表现出颇不相同的行为： n m r 研究表明，反式异构体一旦溶解，立即释放出两个二甲基亚砜分子， 接着缓慢释放出一个c r 离子。与顺式异构体相似，在相应于细胞外c i 离子浓 度的条件下，c r 离子的离解被完全抑制【4 2 1 。 利用二环基硫氧化物的类似物为配体，可以增加配合物的水溶性。配合 物船- c 1 2 ( m e = 2 s o ) 4 r u ，【c h ( m e ：2 s o ) 2 8 r u l ( b = i m i d a z o l e o r i n d a z o l e ) 及n a r i 9 5 o h ( r e s o h r u 】( r - - m e t h y lo r t c f f a m c t h y l c n e ) 均具有良好的水溶性。 7 。kb 孚、 。k_ k l 萋咿 m妇k 寺 nkin 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文 刘江琴 1 3 4抗肿瘤配合物n a m i - a ，k p l o t 9 进一步的研究促使了化合物( h 2 i m ) w a n s - r u c h ( f i i m ) ( d m s o ) 】( n a m i a , h i m = i m i d a z o 妫和k p l 0 1 9 ( o r f f c l 4 a ) 作为钌配合物抗肿瘤药物进x h 临床 试验。在临床试验阶段，n a m i 似寸抗转移有很好的作用，k p l 0 1 9 对直肠癌以 及其他原发性肿瘤有很好的抑制作用地3 1 k p l 0 1 9 是从r u c h h 2 0 - 与乙醇 和h c l 回流，然后用过量吲唑处理回流液，得到棕红色的缸舔构型的r u ( u 1 ) 配合物。 由于k p l 0 1 9 的水溶性中等，因此溶解度更大的钠盐( k p l 3 3 9 ，f f c l 4 图 l - 4 ) 被用在临床试验中。它f 由g p l 0 1 9 通过氨盐的交换反应制得。 黔髀 骅 图l - 4k p l 0 1 9 ，n a m i a ，k p l 3 3 9 和k p 4 1 8 的结构 它们的分子结构如图1 - 5 ，证实了两个吲唑基处于反式鲫。 图卜5 ( p k t p ) 【t r a n s r u c k ( h i l l d ) 2 】的分子结构 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文刘江琴 k p l 0 1 9 对直肠癌具有很好的抑制作用，而这些肿瘤对标准的化疗药物有 抗药性资料表明，对5 0 种原发性直肠肿瘤有效率为8 0 0 o 4 3 。k p 1 0 1 9 被用 于原发性鼠类直肠癌，被证实有很高的活性，而顺铂被证实对这种类型的肿瘤 中完全没有作用1 4 4 s 1 目前，孓f u 在直肠癌中被认为是最有效的，可以使肿 瘤体积减少到4 0 0 ( 与对照组比较) 而k i 1 0 1 9 作用更有效，使肿瘤体积减 少到8 ( 图1 6 ) ，而且毒性最b t 4 r l 。k p l 0 1 9 可根除大约l 3 的肿瘤，可促进 传统化疗药物在常发性肿瘤中的作用。实验证明，它们在更宽的肿瘤谱有活性， 其中包括对铂类药物有耐受作用的肿瘤。在治疗的剂量中，k p l 0 1 9 在体内有 很好的耐受性，只有轻微的副作用，在i 期临床试验中来发现严重的副作用【船】。 由于它们的低毒性，使它们的临床应用前景非常乐观。 图1 6k p l 0 1 9 ，顺铂和5 f u 对原发性鼠直肠癌的活性 1 4 钌配合物抗肿瘤机理 1 4 1 还原活化机理 钉配合物与铂类抗肿瘤试剂有两个重要的不同：第一，p t 配合物为平面正 方形，而钉配合物为八面体构型。第二，r u “r u 易发生电子传递，而v t ( v i ) 还原到p t ( i i ) ，既涉及到配位数的改变又涉及到原子间键的距离变化。由于这 些不同，钌配合物抗肿瘤机理模型被假设与铂类化合物不同【4 9 1 ，机理的不同 9 2 0 0 7 届中山大学硬士学位毕业论文刘江琴 可能是k p l 0 1 9 显示出对铂类有耐药性的肿瘤有效的重要原因。在钉配合物的 研究过程中，对钌( ) 配合物的抗癌活性提出了一个重要的假设【4 4 5 l 还原 活化，即钌( ) 配合物可能只是前体药物，在体内通过还原活化后与生物分 子发生作用。这在肿瘤内较低的0 2 浓度和p h 值情况下，对提高相应的药物 选择性是有利的。g s h 和大量的还原蛋白可在体内还原r u ( m ) 配合物，而r u ( i i ) 到r u ( i i i ) 的氧化可以通过分子氧、细胞色素氧化酶以及其他氧化剂发生， 但是这个过程在低氧环境的肿瘤细胞中却相对很少发生。对k p l 0 1 9 及其类似 配体的抗肿瘤活性研究证实了还原活化假设。在这些配合物对直肠癌系 s w 4 8 0 的抗肿瘤活性研究中，发现r u ( i i i ) 的氧化还原电势越高，i c s o 越小【鳓 捌( 表1 - 1 ) 表明配合物的活性与氧化还原电势有关。 表l l 钌配合物的还原电势与对s w 4 8 0 肿瘤细胞的i c 5 0 c o m p o u &e m ( r u 驯) ( v )i c 5 0 ( 1 tm ) a ：n a t r a n s r u c h ( h i n d ) z 】 1 4 2 转铁运输 转铁蛋白( t ) 是一种分子量为8 0 k d a 的单肽链糖蛋白，由两个叶组成，可 调控对几种金属离子的特异性吸收【5 3 1 。在血液中，大多数键合是由白蛋白和转 铁蛋白负责的i 弭5 5 1 ，并且转铁蛋白的出现更有利于进入细胞( 拍1 。然而，无论 是动力学上还是钉的吸收与释放主要由配合物本身来决定。例如钉氨和亚氨配 合物、【( h 2 0 ) ( n h 3 ) s r u ( i i ) 】2 + 、 c i ( n h 3 ) s r u 2 + 、t r a n s - o m 1 2 c 1 4 r u 一和t r a n s - 【( i r a ) 5 ( d m s o ) c 1 4 r u 一会迅速与蛋白质的组酰氨咪唑氮结合。 抗癌药物l r a n s - 【c h ( i m ) 2 r u 一与转铁蛋白结合几小时中，吸收只需要几分 钟【5 7 1 ，与血液中自蛋白组酰氨咪唑氮结合，类似于n a m i 。晶体结构表明， t r a n s - c l , ( 1 m ) 2 r u 】一与一个组氨酸在铁结合位点结合。( 碳酸盐可起到帮助作 用，精确的晶体结构表明没有碳酸盐结合的迹象) 与转铁蛋白的结合比钉配 0 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文刘江琴 合物单独存在时更有效地抑制肿瘤细胞的生长【5 。】。无论是c 厶- c h f n h 3 ) 4 r u c l ， 还是( i m h ) t r a n s - ( i m h c h r u 一增加与t f 的结合会抑制肿瘤细胞的增长，由于它 们优先被肿瘤细胞吸收，r u - t f 结合物可能提供一系列新的更低毒高效的抗肿 瘤试剂。 1 4 3 与d n a 的键合 r u 配合物与d n a 结合和细胞毒性存在一定的关联。很多ru 配合物展现下 列活性：抑制d n a 的复制；致突变活性以及诱导s o s 修复系统；减少与d n a 的 结合和d n a 合成。这些都会严重影响肿瘤细胞的快速增殖，造成一定的细胞毒 性洄1 。c l a r k e 等认为钉配合物作用的主要靶标为d n a 。他们将不同类型的配 合物c i s - r u ( n h 3 ) 4 c h c l 和h i m t r a n s - r u ( i m ) 2 c 1 4 在不同浓度下与h e l a 细胞作 用，然后提取其d n a ，发现钉配合物到达了细胞核并与d n a 结合嗍。b r a b e c 等进一步研究了配合物与d n a 的作用方式，发现钉优先共价键合鸟嘌呤残基， 并形成链问交联【2 l 】。1 9 8 7 年c a u i c 对c i s - 【c 1 2 ( m e 2 s o ) 4 r u 与d n a 的作用进行 了详细研究，确定了配合物与d n a 存在作用。发现配合物不仅没有显著改变 d n a 的b 型构象，而且对d n a 构象起了稳定的作用。他认为最恰当的解释 是由于钉配离子的电j 下性以及与邻近基团形成氢键的可能，配合物倾向处于 d n a 大沟的位置【6 ”。1 9 8 9 年a l e s s i o 对t r a s - 【c h ( m e 2 s o ) 4 r u 与5 d g m p 反 应发现它们的结合位点为n 7 和磷酸氧【6 2 l 。另有资料显示：e d t a 配体的r u ( m ) 和r u ( i v ) 配合物显示出抗肿瘤活性，显然是通过与d n a 键合 6 3 , 6 4 。 总之，到目前为此，许多钉配合物被合成并且发现具有临床应用潜力。正 在研究它们的作用机理及构效关系。包括研究它们的水解、氧化还原、与蛋白 质和d n a 的结合，以及在体内和体外的生物学活性。 1 5 研究展望与选题意义 相对铂类抗肿瘤药物，钉配合物的低毒性，使它们具有很好的临床应用前 景。对抗肿瘤药物的体外活性筛选是整个抗肿瘤药物研发过程中的重要环节。 一般认为，当药物通过体外活性试验后，才可以进行动物体内试验。为此，我 2 0 0 7 届中山大学硕士学位毕业论文 刘江琴 们设计合成了一系列多吡啶配体及其配合物，并将它们用于对b e l 7 4 0 2 人肝 癌、a - 5 4 9 人肺癌、k - 5 6 2 人白血病、人体鼻咽癌c n e - 2 z 等瘤株进行体外抗 肿瘤活性筛选。 在抗肿瘤的体外筛选中，最常用的方法是台盼蓝拒染法、m t t 法。和s r b 法。本实验采用前两种方法，分别对1 5 个化合物进行体外活性筛选。该方法 由以下步骤组成：( 1 ) 肿瘤细胞株的体外培养；( 2 ) 肿瘤细胞株形态学观察； c 3 ) m t t 法测定受测试样品对肿瘤细胞株的抑制率，计算出l c 如。 目前，对钌配合物抗肿瘤机理的研究也是热点之一因此，我们对初步筛 选后的两个化合物作了抗肿瘤机理的初步探索。具体方法是：( 1 ) 用h o e c b s t 3 3 2 5 5 p i 染色，在荧光显微下观察细胞形态，观察是否有细胞凋亡。( 2 ) 采用 流式细胞术定量检测细胞的凋亡率。 2 2 0 0 7 届中山人学顿 学位毕业论文 刘江琴 参考文献 【l 】r o s e n b e r gb v a nc a m pl ，t r o s k oje ，m a n s o u rvh n a t u r e ，1 9 6 9 ，2 2 2 ： 3 8 5 3 8 6 【2 jw o n ge ，g i a n d o m e n i c ocm c h e m r e v 1 9 9 9 ，9 9 ：2 4 5 1 - 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