（草业科学专业论文）多年生黑麦草再生体系的建立及农杆菌介导AVP1基因的导入.pdf

甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 摘要 多年生黑麦草( l o l i u mp e r e n n el ) 是国内外广泛应用的重要冷季型禾草之 一。利用基因工程进行遗传改良的研究一直备受人们关注。本研究以多年生黑麦 草( l o l i u m p e r e n n el ) 的三个品种：里加( r e g a l ) 、贝尔勒( b e l l e ) 、马拉松( m a r a t h o n ) 为研究对象，建立了高效的遗传转化体系，研究结果表明： ( 1 ) 建立了多年生黑麦草的再生体系。以多年生黑麦草的芽尖、根尖、下胚 轴、成熟种子为外植体进行了愈伤组织诱导和分化的研究，通过不同处理结果的 比较表明，不同划割处理的成熟种子的愈伤组织诱导率不同，不同外植体的愈伤 组织诱导率也不同，芽尖、根尖愈伤组织的诱导效果较差，纵向划割的成熟种子 的愈伤组织的诱导率及分化能力均优于下胚轴；2 , 4 d 浓度在5 7m g l ，6 - b a 浓 度为0 0 5 0 1m g l 时有利于成熟种子和下胚轴诱导产生愈伤组织；在分化培养 基中添加0 5 1 0 m g l 6 b a 对愈伤组织的分化效果较好；继代培养时间对愈伤组 织的分化率有很大影响，成熟种子和下胚轴在继代培养基上继代培养6 0 d 和8 0 d 时分化率最高，继代天数过长不利于愈伤组织的生长。 ( 2 ) 农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化体系的建立与优化。通过对实验现 象的观察和数据的统计分析表明，将预培养4 d 的黑麦草的胚性愈伤组织经o d e o o = 0 6 左右的农杆菌菌液在负压下浸染6 m i n ，共培养3 d ，用2 5 0 m g l 的羧苄青 霉素( c a r b ) 来脱菌，附加1 5 0 i _ t m o l l 的乙酰丁香酮( a s ) ，然后转接到含7 5 m g l 的潮霉素的筛选培养基上进行筛选培养的转化体系效果最佳。 ( 3 ) 目的基因a v p l 的转化及对转基因植株的初步鉴定。将所得抗性愈伤组织 转接到含2 5 0 m g l 的羧苄青霉素和7 5 m g l 的潮霉素的分化培养基上进行诱导分 化，然后在1 2 m s 的生根培养基上使其再生成苗。最后，对转基因植株进行a v p l 基因中间片段及全长的p c r 检测，结果显示黑麦草三个品种均没有获得转基因 植株。表明目的基因没有整合到多年生黑麦草基因组中。 关键词：多年生黑麦草，再生体系，a v p l 基因，农杆菌，遗传转化 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 s u m m a r y p e r e n n i a lr y e 伊a s s 犯o l i u mp e r e n n e 三) i so n eo ft h em a j o rc o o l s e a s o nt u r f g r a s s w i d e l yu t i l i z e db o t ha th o m ea n da b r o a d f o ral o n gt i m e ，b i o t e c h n o l o g yh a sb e e n w i d e l ya p p l i e dt oi m p r o v ei t sc h a r a c t e r i s t i c s w ec h o o s et h r e ev a r i e t i e sf o rt h i s r e s e r c h ，w h i c ha r er e g a l ，b e l l ea n dm a r a t h o n a n dw e v ee s t a b l i s h e da ne f f i c i e n t g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) e s t a b l i s h m e n t o fh i g l l f i e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e m o f p e r e n n i a l 巧e g r a s s d i f f e r e n te x p l a n t so fp e r e n n i a l 巧e g r a s s ( l o l i u mp e r e n n e ) w e r eu s e df o r c a l l u si n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no nm sb a s i cm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t l ld i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no f2 , 4 一da n d6 - b a t h er e s u l t ss h o w e dt h a td i f f e r e n te x p l a n t sh a v e d i f f e r e n ti n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n e f f i c i e n c y s h o o tt i p a n dr o o t t i pw e r e i n e f f e c t i v ei nc a l l u si n d u c t i o n 1 1 1 ec a l l u si n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nd e r i v e df r o m m a t u r es e e d sw e r es u p e r i o rt oh y p o c o t y l w h e ns u p p l e m e n t e d 、析t 1 15 - 7 m g lo f2 , 4 一d a n do 0 5 - 0 1m g lo f6 一b aw e r ep r o p i t i o u st oc a l l u si n d u c t i o n m a t u r es e e d sa n d h y p o c o t y l a n dd i f f e r e n t i a t i o nm e d i u ms u p p l e m e n t e d 埘廿10 5 1 0m 班o f6 - b aw a s t h eb e s t t h em a t u r es e e d sa n dh y p o c o t y lw e r es u b c u l t u r e df o r6 0a n d8 0 d a y s , r e s p e c t i v e l y , c a ng e tt h eh i g h e s td i f f e r e n t i a t i o ne f f i c i e n c y ( 2 ) e s t a b l i s h m e n ta n do p t i m i z a t i o no fp e r e n n i a lr ) r e 粤镯sg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n s y s t e mb ya g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dm e t h o d t h eo p t i m i z e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n p r o c e d u r ew a s c a l l u so b t a i n e da f t e ra b o u t4d a y sc u l t u r e dw e l eu s e d 嬲r e c i p i e n t m a t e r i a lf o rt r a n s f o r m a t i o n，t h ec o n c e n t r a t i o no fa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s s u s p e n s i o nw a so d 6 0 0 = 0 6a d d e d 谢t 1 1a so f15 0 1 a m o l l , t r e a t e dw i t h n e g a t i v e p r e s s u r e ，t h e nt h ei n f e c t e dc a l l iw e r ei n c u b a t e da t2 4 0 ci nt h ed a r kf o r3d a y s a f t e r t h a tc u l t i v a t e di nt h em e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h7 5 m g lh y g r o m y e i na n d 2 5 0 m g l c a r b ( 3 ) t h et r a n s f o r m a t i o n o fav p lg e n ea n dt h e p r e l i m i n a r y i d e n t i f i c a t i o no f t r a n s g e n i cp l a n t s t h er e s i s t a n tc a l l u sw e r et r a n s f e r r e dt ot h ed i f f e r e n t i a t i o nm e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h7 5 m g lh y g r o m y e i na n d 2 5 0 m g lc a r bf i r s t ，a n dt h e nt r a n s f e r r e d t ot h er e g e n e r a t i o nm e d i u mf o rf u r t h e rr o o td e v e l o p m e n ta n df i n a l l yg r e e np l a n t s a t l a s t ，p e r f o r m e dp c ra m p l i f i c a t i o n ，b u tn oo n ep o s i t i v es a m p l ew a sf o u n d t h a tm e a n s t h eaf p lg e n ew a sn o ti n t e g r a t e dt ot h eg e n o m i cd n ao fp e r e n n i a lr y e g r a s s k e yw o r d s ：p e r e n n i a lr y e g r a s s ；r e g e n e r a t i o ns y s t e m ；a v p l g e n e ：a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 2- 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 英文缩写 2 ，4 一d k t l 蛆 k a n c a r b c e f r i f o d r p m p c r d d h 2 0 m s l b b e d l a h y g e b t e 主要英文缩略表 英文全称 2 , 4 一d i c h l o r o p h e x o x y a c e t i ca c i d k i n e t i n i n d o l e 3 a c i d k a n a m y e i n c a r b e n c i l l i n c e f o t a x i m e r i f a m p i c i n o p f i c a ld e n s i t y r o u n d sp e rm i n u t e p o l y m e r a s ee h a i nr e a c t i o n d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r m u r a s h i g e - s k o o gm e d i a l u r i a - b e r t a n ic u l t u r em e d i u m y e a s te x t r a c ta n db e e fe c t r a c tm e d i u m e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e e t h i d i u mb r o m i d e i r i s e d t ab u f f e r d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s ( u s u a l l y a m i xo fd a t p d t t p d c t p d g t p ) b a s ep a i r k i l o b a s ep a i r s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e c o m p l o n e n t a r yd n a t r a n s f e r r e dd n a d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e d a y c e n t i m e t e r h o u r m i n u t e s e c o n d t u m o r - i n d u c i n gp l a s m i d 6 中文名称 2 ，4 二氯苯氧乙酸 激动素 吲哚乙酸 卡那霉素 羧苄青霉素 头孢霉素 利福平 光密度 每分钟转速 聚合酶链式反应 双蒸水 m s 培养基 l b 细菌培养基 y e b 培养基 乙二胺四乙酸， 潮霉素 溴化乙锭 嘶s e d t a 缓冲液 脱氧腺苷三磷酸 (也蛔t d t l l p d c t p d g t p 的混 合物) 碱基对 千碱基对 十二烷基磺酸钠 互补d n a 转移d n a 焦碳酸二乙脂 聚合酶链式反应 三羟甲基氨基甲烷 天 厘米 小时 分钟 秒 致瘤质粒 a 心c 坤勋慧=署d p口s n 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：彳切弓玄 关于论文使用授权的声明 本人完全了解甘肃农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：中甘肃农 业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意甘肃农业大学可以用不同 方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：4 匆兢 导师签名： 时间：b 口年 6 月幻日 时间：三么为萨 6 月z 旬日 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 第一章文献综述 1 多年生黑麦草概述 多年生黑麦草( l o l i u mp e r e n n el ) 又名宿根黑麦草，禾本科( g r a m i n e a e ) ，黑 麦草属( ( l o l i u ml ) 。是一种疏散至稠密的丛生型多年生植物，株高1 0 - - 9 0 c m ， 须根极密，秆丛生，叶片数量多而茎少；具有一定的耐热、耐寒和抗旱性；适宜 于粘重、肥沃的土壤上生长；具较强的发芽力和幼苗生长势，在部分遮荫条件下 也能较好生长，还能够抗二氧化硫等有害气体。原产于南欧、北非和亚洲西南部， 是欧洲、新西兰、澳大利亚、北美的优良草种。我国早年从英国引入，现己广泛 栽培，是我国南北方广泛应用且适应性较强的草坪草种【l 】。因为建植速度快，抗 病虫害能力强，分蘖能力强，在城市绿化和运动场建设中具有重要作用。黑麦草 ( l o l i u m ) 是冷季型草坪草中最重要的一种，由于它可以越冬且生长快，具有根系 发达、分蘖多、耐践踏、繁殖力强等优点，常伴一些生长较慢的品种快速成坪 2 】。 适宜在我国东北平原中南部、西北较湿润地区、华北以及北方沿海城市生长。在 一般管理条件下，也能形成颜色亮绿，叶片细腻的优质草坪。但是，黑麦草只适 宜在冬无严寒、无酷暑的地区生长，在水分缺乏的干旱、半干旱地区却生长缓慢 或无法生长，存在耗水量大、不能忍受冷、热、干旱这些气候的极端值，以及萌 发和苗期对水分需求较大等缺蝌1 1 。 由于黑麦草对干旱、高热和严寒的耐受力较弱，而且对土壤盐碱性耐受能力 中等，因而限制了它的栽培和利用【3 】。并且黑麦草为异花风媒传粉禾本科植物， 高度自交不亲和，优良基因难以纯合稳定下来，这使其遗传改良困难而复刹4 1 。 因此，作为最常用的草坪草，人们应用生物技术方法结合传统育种，从而扩大多 年生黑麦草新的种质资源和农艺性状育种手段已十分普遍。在国内，关于多年生 黑麦草组织培养和遗传转化的研究报道较少，而国外多年来一直致力于通过组织 培养及遗传转化技术对多年生黑麦草进行改良，并获得了转基因植株。 2 转基因技术在黑麦草育种上的应用 为了提高草坪草抗盐碱、抗病、耐践踏等特性，并使其获得更加优良的农艺 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 性状，育种家们一般采用品种选育、种间杂交等传统方法对草坪草进行改良，取 得了一定的成绩并培育出一系列优良品种。但是由于多年生黑麦草自交高度不 育，用传统的方法进行育种，耗时费力，困难大，难以取得突破性进展。组织培 养和遗传转化技术的发展为作物品种的遗传改良开辟了更加广阔的天地，使不同 物种的基因交流和基因的定向转移成为可能，也为黑麦草的遗传育种提供了新的 手段 5 1 。 2 1 黑麦草的组织培养 组织培养是进行植物包括遗传转化操作的基础。一个高效遗传转化体系必须 首先是一个好的组培体系，建立一个高频组织培养再生体系取决于基因型、培养 基组成及合适的外植体。v 酏i 1 也指出建立一个可分化的细胞培养体系应做到以 下3 点：1 ) 外植体应选择一些分生组织、未分化细胞，如未成熟胚和种子、叶基 部或幼嫩的花序；2 ) 培养基上添加高浓度的2 ，4 d 或其它强生长素以诱导胚性愈 伤组织：3 ) 尽量用悬浮胚性愈伤组织分离原生质体【6 】。 目前，用于黑麦草遗传转化的受体主要有胚性愈伤组织r 7 1 、悬浮培养细胞 8 - 1 2 】、原生质体【”，1 叼等。受体体系的选择制约着转化效率的高低，其有效性和简 单性也决定着这种转化体系的应用前景。目前，黑麦草愈伤组织诱导率低，在继 代培养过程中胚性容易丧失，再生植株易发生体细胞无性系变异等问题，成为黑 麦草转基因育种的制约环节。因此，探索新的离体培养再生体系是非常必要的。 2 1 1 愈伤组织的培养 愈伤组织培养的方法与步骤相对较简单，都需经过外植体( 种子、根尖、茎 尖或未成熟的花序) 一愈伤组织诱导一愈伤组织的分化一绿色小苗再生一生根培 养一再生成完整植株等几个过程。 胚性愈伤组织是目前草坪草遗传转化广泛应用的起始材料。在草坪草中，常 用成熟种子或成熟胚作为外植体诱导胚性愈伤组织，叶片基部的切片用于多花黑 麦草胚性愈伤组织的诱导。1 9 7 5 年a h l o o w a l i a 等【1 5 】以黑麦草的未成熟种子为外 植体，建立了多年生黑麦草的愈伤组织培养和悬浮细胞培养再生体系，观察到来 2 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 源于种子的愈伤组织是由胚芽产生的，此外还分析了2 ，4 d 、l 气a 、椰子乳在愈 伤组织诱导、分化、植株再生过程中所起的作用，探讨了由愈伤组织再生的植株 在细胞水平上的稳定性。1 9 7 7 年，d a l e 以多年生黑麦草的根尖分生组织为外植 体，建立了再生体系 1 6 】；1 9 8 0 年，d a l e 用一年生黑麦草未成熟胚建立了黑麦草 的植株再生体系 1 7 1 ；1 9 8 8 年g r e e m e r s 掣1 8 1 以未成熟的花序为外植体，获得了多 年生黑麦草和一年生黑麦草( z o 疗u mm u l a f l o r u ml ) 的再生植株；1 9 9 3 年， p e r e z v i e e n t e 等建立了多年生黑麦草的体细胞培养体系，使从营养器官分生组织 分离的可育植株再生【1 9 ；1 9 9 4 年陈文品等【2 0 1 报道了用多花黑麦草幼穗培养可以 直接成苗，而且成苗率较高，分别达4 8 和7 5 ；2 0 0 5 年姜素云等 5 】用以多年 生黑麦草和一年生黑麦草无菌种子苗的茎尖生长点部分为外植体，建立起高效的 黑麦草丛生芽离体培养体系；2 0 0 3 年张万军等【2 l 】用改良的m s 培养基诱导黑麦 草种子的愈伤组织，愈伤组织的分化率约为7 0 ；2 0 0 4 年刘文真等 2 2 】以多年生 黑麦草成熟种子为外植体进行了愈伤组织诱导和分化的研究，结果表明：d i c a m b a 替代2 , 4 d 可以显著提高愈伤组织诱导率和植株再生率；2 0 0 6 易自立等【2 3 】也用 多年生黑麦草的成熟种子获得了再生植株。 2 1 2 悬浮细胞培养 由于悬浮细胞是获得全能性细胞的唯一途径，研究者们开始了胚性细胞的悬 浮培养，胚性悬浮培养物是禾本科植物具全能性原生质体的主要来源，同时又可 用作遗传转化的直接目标受体。胚性悬浮培养物培养过程如下：外植体( 种子、 茎尖或根尖卜一愈伤组织一愈伤组织的液体悬浮培养一滤膜过滤胚性悬浮细胞 在固体培养基中的植株再生。目前，通过悬浮细胞培养已经获得黑麦草再生植株 的报道有：1 9 8 8 年，d a l t o n 从悬浮培养多年生黑麦草的原生质体中获得了再生 植株【矧；2 0 0 0 年，a l t p e t e 等【2 5 】进行了多年生黑麦草悬浮细胞培养的研究，用灭 菌的未成熟胚和未成熟花序作为外植体诱导愈伤组织，进而建立悬浮细胞系，发 现用麦芽糖替代蔗糖作为碳源可显著提高悬浮细胞的再生率。 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 2 1 3 原生质体培养 原生质体是除去了细胞壁的细胞，尽管原生质体培养过程非常繁琐，植株再 生频率低、再生过程所需时间长，但是原生质体为完全分散的单细胞群体，易于 直接基因导入，所以在转基因研究初期曾被广泛应用。1 9 8 8 年d a l t o n 等【2 6 通过 培养3 0 个多年生黑麦草种子的成熟胚诱导细胞悬浮物质，在包含高浓度2 , 4 d ( 1 0 0m g l ) 的液体培养基中培养，所有源于原生质体克隆的品种都获得了白化苗 和绿苗。1 9 8 9 年c r e e m e r sm o l e n a a r 等【2 7 以多年生和一年生黑麦草为材料，进行 原生质体分离、培养，并成功再生植株。然而原生质体培养较为复杂，目前应用 逐渐减少。 2 1 4 花药培养 花药培养是以花药或花粉为材料通过雄性单性生殖获得单倍体或者加倍单 倍体植株的组织培养技术。由于突变大多是隐性的，在显性等位基因存在时，它 们不能表现。而单倍体植株只有一套基因，隐性突变的作用不会受到显性等位基 因的影响，所以在单倍体中隐性突变很容易表现出来。由于大多数草坪草为异花 授粉，花药培养获得的单倍体植株及经染色体加倍获得的纯合的二倍体植株产生 新的基因型和表现型概率较大。不同基因型的二倍体杂交可选育出具有双亲优良 性状的杂交后代。通过花药培养获得单倍体植株和纯合二倍体植株已成为现代育 种的一种重要手段。 在黑麦草中有关花药培养的报道不少，如m a d s e n 通过花药培养获得单倍体， 加倍后获得自交可育的多年生黑麦草，并对其遗传特性进行了分析 2 8 ，2 9 1 。然而， 花药培养技术在草坪草中尚处于初级阶段，一些草种及品种通过花药培养获得单 倍体植株仍然相当困难，获得再生植株的效率仍然很低。因此进一步优化花药培 养中的培养基成分和技术以提高单倍体植株的再生率是十分必要的。 2 1 5 茎尖分生组织培养 茎尖是由顶端分生组织及其下方的1 3 个幼叶原基一起构成，通过茎尖分生 4 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 组织培养可获得无病毒植株。关于草坪草茎尖分生组织培养的报道并不多见， d a l e 报道了多花黑麦草和多年生黑麦草茎尖分生组织培养，并获得了可育的再 生植株【3 0 1 。 2 2 遗传转化方法 植物遗传转化技术又称为植物转基因技术，是应用d n a 重组技术将外源基 因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表 达的植物遗传改良的一门技术，它是植物基因工程和分子生物学研究中的一个重 要环节，是生物科研工作者了解某个基因功能的重要方法，也是现代遗传育种的 一种重要手段。 草坪草遗传转化研究是在农作物遗传转化研究不断深入的基础上发展起来 的，1 9 8 8 年h o m 【3 l 】等利用原生质体d n a 直接吸入法获得了转基因鸭茅，这是 转基因草坪草的最早报道。随后草坪草遗传转化技术迅速发展，目前用于遗传转 化的转基因方法有4 种：原生质体d n a 吸收( d n au p t a k eb yp r o t o p l a s t ) 、微粒子 轰炸( p a r t i c l eb o m b a r d m e n t ，b i o l i s t i c ) 、碳化硅介导的d n a 发送( s i l i c o nc a r b i d e f i b e r - m e d i a t e dd n ad e l i v e r y ) 和农杆菌介导转化法( a g r o b a e t e r l u m - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ) ( 见表1 ) 。 2 2 1 原生质体d n a 直接吸入法 原生质体d n a 直接吸入法可分为p e g 介导转化法和电击转化法，是草坪草 成功转化的主要方法之一。其原理为：当植物细胞除去细胞壁后，通过在培养基 中加p e g 或利用电击技术促进原生质体吸收外源d n a ，外源d n a 随机整合到 草坪草基因组中，导致草坪草原生质体的转化，最后原生质体生长、分化为转基 因植株。这个方法是以草坪草原生质体培养高频再生植株为基础的。其优越性主 要表现在操作简便，无宿主限制，具有较高的转化频率等方面且由于原生质体为 完全分散的单细胞群体，转化后有可能获得单细胞来源的再生植株。自从h o r n 等利用原生质体d n a 直接吸入法获得了转基因鸭茅【3 l 】以后，很多实验室相继用 此方法获得了转基因草坪草植株，原生质体转化技术才开始发展到日程上来。然 5 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 而，这种方法仍存在着多处缺陷，如难于培养、受基因型限制、转基因易发生重 排、外源基因多拷贝插入与重组，以及常出现体细胞无性系变异及白化苗、不育 苗掣3 2 ，3 3 1 ，转化效率较低，通常只有1 0 一1 0 4 【3 4 】。 2 - 2 - 2 基因枪法 基因枪法又称为微粒子轰炸法或生物弹法，其基本原理为：将包含目的基因 的载体包被于微小的钨粒或金粒的表面( 直径从零点几p m 至几上，通过高压 动力驱动加速颗粒穿透植物细胞壁，导入受体组织细胞内，然后通过组织培养再 生出完整植株。基因枪法的出现晚于原生质体直接吸入法和农杆菌介导法。基因 枪法具有操作简单快速、转化效率高、易控制和受体广泛的优点，它不仅可以原 生质体、悬浮细胞为靶受体，亦可以种子胚、幼穗、幼胚、愈伤组织和花粉细胞 等几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞作受体【3 5 1 。但它也有其自身的缺点， 如拷贝数多，插入随机性大，价格昂贵等。 自从1 9 9 3 年首次利用基因枪法获得转基因草坪草匍匐翦股颖植株以来，利 用此法获得的转基因草坪草和牧草植株的报道不断增加。一些草坪草转基因的报 道以胚性悬浮细胞 3 6 期、未定形悬浮细膨3 8 删、愈伤组纠4 1 1 、合子胚 4 2 】、分生 组织、幼苗3 8 】为粒子轰击的受体，获得转化细胞，并通过外源基因瞬时表达 分析以优化基因枪转化的技术参数及测试构建的载体。然而在已用受体中仅仅胚 性悬浮细胞和愈伤组织产生了转基因植株。 2 2 3 碳化硅纤维介导转化法 碳化硅纤维介导转化法是将悬浮细胞培养物与质粒d n a 及针状的碳化硅纤 维混合，然后进行搅动，纤维与细胞的摩擦使细胞出现损伤，外源d n a 就会进 入细胞中，实现植物细胞的转化】。该法的实验操作和需要的设备简单，而且能 较好的控制转化的d n a 的数量。但此法具获得的转化细胞容易突变、易形成白 化苗、再生能力弱等问题。目前在植物上采用碳化硅纤维介导的基因转化的报道 还很少，a s a n o 4 5 】等首先用碳化硅纤维法得到了转基因小糠草。d a l t o n 【删等利用 此法获得了多花黑麦草、高羊茅、多年生黑麦草和细弱剪股颖的转基因植株，但 6 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 转化效率并不高。 表1 通过各种遗传转化方法转化的黑麦草 2 2 4 农杆菌介导转化法 2 2 4 1 农杆菌介导法植物遗传转化的机制 农杆菌是一种革兰氏阴性的土壤杆菌。土壤杆菌属有4 种类型，与植物基因 7 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 转化有关的有两种类型：即根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 和发根农杆菌 ( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) ，它们侵染植物后分别导致冠瘦瘤和发状根的发生。 目前，在草坪草遗传转化中应用的主要是根癌农杆菌，其介导的转化过程主 要包括：( 1 ) 细菌在植物敏感细胞上吸附；( 2 ) 农杆菌中的t i 质粒上的v i r 区基因 被激活；( 3 ) t - d n a 切割和t - d n a 复合物形成；( 4 ) t - d n a 复合物由农杆菌进入 植物细胞；( 5 ) t - d n a 以单或多拷贝随机整合到植物染色体上并且进行表达 4 刀。 1 9 0 7 年人类首次发现根癌农杆菌，并证明根癌农杆菌是根癌病的致病菌。植物 受伤后根癌农杆菌侵染植株，并在伤口处产生冠瘦瘤，冠瘦瘤细胞可产生正常细 胞所不能产生的冠瘦碱，被农杆菌作为碳源和氮源利用。1 9 7 4 年人们在根癌农 杆菌中发现一种环形的t i 质粒，该质粒含有若干个重要区域：复制起点区、，i r 区、td n a 区和农杆碱分解代谢区。对植物基因工程来说，最重要的是v i r 区和 t d n a 区，它们是t - d n a 转移和整合植物细胞所必不可少的。研究发现，( 1 ) v i r 区大约3 5 k b ，位于td n a 区左侧，在植物基因转化中不整合进植物基因组中， 但却是t d n a 转移时所必需有的，v i r 基因的表达对t d n a 的转移是先决条件。 v t r 区有7 个操纵子，分别是v i r a 、v t r b 、x r t r c 、v t r d 、r e 、v i r f 和w t r h ，一 共2 4 个基因，共同调控着t - d n a 的加工和转移。( 2 ) t d n a 两端边界处各有一 个2 5 b p 的正向重复序列，整合过程中左右边界序列之间的d n a 序列可转移并 整合到植物基因组中，边界是必需的，而边界之间的部分并不影响其转移，因而 这部分序列可被外源基因取代。由于t i 质粒本身能插入外源基因大到5 0 k b 的 d n a ，因此利用这种转化载体，将t i 质粒进行改造，把致瘤的有害基因切除代 之外源基因，侵染植物时，位于t d n a 两端序列之间的外源基因片断转移到植 物细胞的染色体基因组中。随后利用植物细胞的全能性，经过细胞或组织培养， 由一个转化细胞可获得转基因植株 4 8 】。 2 2 4 2 农杆菌介导法的优点 与上述方法相比，农杆菌介导的转化方法具有明显的优点： ( 1 ) 该转化系统是利用天然的转化载体系统，转化频率高，且转化效果好。 ( 2 ) 在所有的转化系统中，农杆菌t i 质粒转化系统机理研究的最清楚，方法 最成熟、应用也最广泛。 ( 3 ) t i 质粒的t - d n a 区可以容纳相当大的d n a 片段插入，目前己把长达 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 5 0 k b 的异源d n a 序列通过t - d n a 完整地转移到植物细胞中。 ( 4 ) t - d n a 上含有引导d n a 转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞 转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入到t - d n a 区的外源基因能够随 同t - d n a 一道在植物细胞中表达。 ( 5 ) 农杆菌t i 质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好， 且多数符合盂德尔遗传规律。 ( 6 ) 农杆菌介导的转化方式和筛选具有明显的简易性，费用相对低廉，操作程 序也不复杂【4 9 1 。 2 2 4 3 影响农杆菌介导法转化草坪草的因素 随着对农杆菌转化机理的深入研究，目前知道有很多因素影响着农杆菌介导 的基因转化。首先，基因型是影响农杆菌转化的重要因素，不同草坪草体外离体 培养的难易程度有着明显差别，研究和建立多种草坪草组织培养再生体系、优化 培养条件、克服基因型的限制是植物遗传转化的首要问题；其次，由于单子叶植 物不是农杆菌的天然寄主，因此利用农杆菌介导法转化单子叶植物的工作滞后于 双子叶植物的转化。而且不同的生物对农杆菌的敏感程度不一样，这也是长期以 来农杆菌转化法所面临的困难。 不同来源、不同部位、不同发育状态的受体都会对农杆菌的侵染产生很大的 影响。保持旺盛分生状态的细胞是农杆菌侵染所必需的。一般认为，胚性愈伤是 获得转基因植株的最好受体。c h a i o o , 5 1 1 等用愈伤组织作为受体材料获得了转基因 结缕草和匍匐翦股颖。b e t m y t 5 2 】等用悬浮细胞为受体材料获得了转基因高羊茅 和多花黑麦草。从其它单子叶植物的转化经验来看，选择处于活跃生长、分裂状 态、结构疏松、易脆、呈整齐排列、大小均匀、色泽淡黄的胚性愈伤组织有利于 农杆菌的转化。 目前，农杆菌介导法在草坪草遗传转化中应用不多，r o s s e t 等人最早报道多 年生黑麦草和多花黑麦草被成功转化，标志着农杆菌介导转化法在草坪草遗传转 化上的突破。随后，农杆菌介导转化法在匍匐翦股颖、细弱剪股颖、鸭茅和结缕 草上也获得成功。因此，农杆菌介导法在草坪草遗传转化方面将发挥越来越重要 的作用。 2 2 4 4 农杆菌介导的植物遗传转化存在的问题 9 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 植物外源基因导入对于研究植物的发育调控及农作物的遗传改良具有重要 的意义，因而在短短的十余年间取得了重大的进展。转基因植物的数量与日俱增， 农杆菌介导的植物基因转化方法也己有很大发展。农杆菌介导的植物遗传转化虽 然己成为当今植物遗传转化的主流，但仍需对一些问题做进一步研究：( 1 ) 基因 型的依赖性，转化频率与植物的基因型具有很大的关系，即使在转化频率比较高 的植物中( 如马铃薯、烟草、拟南芥等) 也有很大的基因型依赖性；( 2 ) 宿主范围的 限制对单子叶植物尤其是禾谷类作物的转化仍受到限制；( 3 ) 农杆菌与受感染植 物之间相互作用产生的过敏反应导致感染部位褐化或坏死，从而影响转化效率， 如芸苔属作物；( 4 ) 可再生细胞部位与转化感受态细胞部位不一致，导致假转化 体的出现和转化效率降低 5 3 1 。 3a v p l 基因与植物抗逆性研究 植物对环境刺激或逆境的适应是植物以细胞为单位感受并传递各种环境刺 激( 如干旱、高盐、养分缺乏等) ，进而做出适当反应以维持其生存。从环境刺 激到植物对逆境做出反应是一系列复杂的信号传导过程，它包括以下三个环节： 一是细胞对环境信号的感知转导，产生胞间信使；二是胞间信使在细胞或组织间 传递，并最终到达受体细胞的作用位点；三是受体细胞对胞间信使的接受转导和 反应，导致受体组织中生理生化和功能的最优化组合，最终体现为植物对环境刺 激或逆境的适应或抗性【5 4 1 。 3 1a v p l 基因概述 a v p l 是编码拟南芥液泡中质子焦磷酸酶( 旷p p a s c ) 的基因。旷p p a s c 是磷 酸酶( p y r o p h o s p h a t a s e ，p p a s e ) 的一种，它广泛地存在于自然界，参与合成糖类、 核酸和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸的水解。p p a s e 通常分为两类： 一类是存在于细胞浆和细胞器基质中的可溶性酶类，即无机焦磷酸( i n o r g a n i c p y r o p h o s p h a t a s e ) ；另一类是与液泡膜、叶绿体膜等结合的不可溶性酶类，即膜 结合焦磷酸酶( v p p a s e ) ，又称为质子焦磷酸酶( 旷p p a s e ) 。2 0 世纪5 0 年代， k u n i t z 首次从酵母中纯化得到无机焦磷酸酶【5 5 】；2 0 世纪7 0 年代中期，k a r l s s o n 从甜菜根的膜制剂中首次分离到钾激活的v - p p a s e t 5 6 1 。v - p p a s e 水解无机焦磷酸 1 0 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 为2 个无机磷( p i ) 的同时，还能将h 十从细胞质经过液泡膜泵入膜内，从而起到 质子泵的作用。 植物细胞体内有三种质子泵：p a t p a s e 、v - a t p a s 和矿p p a s e 。主泵是 p a t p a s e ，为单亚基蛋白质，能够泵出质子，产生质子梯度，从而趋动小分子进 出细胞，运输养分。v - a t p a s e 是多亚基复合物，至少由2 6 个基因编码。矿p p a s e 是单亚基蛋白质，由单个基因编码。v - a t p a s e 和矿p p a s e 维持细胞液泡的酸度 及细胞形态 5 7 , 5 8 】 i r p p a s e 初级结构最早发现于拟南芥中【5 9 1 。拟南芥矿p p a s e 的基因是彳阡， 在基因组中有三个同源基因似印j 卅唧) 。其中，a v p i 近来受到各国研究者诸多 关注，因为该基因除了保持液胞中p h 值，还控制着植物生长激素的运输，可以 使植物更加高产、抗旱耐盐并且能够抗土壤瘠薄硎。 3 2a v p l 编码的h + - p p a s e 结构 关于 i + p p a s e 多肽结构组成成分的相关报道很多，它由一条多肽链组成， 以二聚体形式存在。但在其酶蛋白相对分子质量( m r ) 上有较大的出入。m i s h i m a 和y o s h i d a 从黄化的绿豆苗的下胚轴中纯化到m r 为7 3 k d 的酶蛋f ir 6 1 1 ；b r i t t e n 在甜菜的贮藏根中纯化到一个h 缸为6 4 5 k d 的酶蛋白 6 2 】；c h a n s o n 和p i l e t 及 f r a i c h a r d 等分别从玉米根和欧亚槭中提取到为3 7 4 5 k d 的多肽 6 3 , 6 4 】。1 9 8 9 年s a r a f i a n 等利用传统的去污剂裂解的方法，经过s d s 聚丙稀酰胺凝胶电泳检 测表明其为6 7 0 k d 6 5 】。 2 ：h e n 等的研究表明6 3 4 位c y s 残基在多种已知植物的i f p p a s e 中保守，推 断此c y s 残基是酶的催化位点 6 6 】。k i m 等将拟南芥矿p p a s e c d n a 克隆中9 个保 守的c y s 残基突变成s e r 或a l a ，其中由8 个突变并不影响酶的催化活性及酶对 n e m 的敏感性，只有6 3 4 位的c y s 突变使酶对n e m 不敏感，但突变后的矿p p a s e 仍具有p p i 水解和矿转运活性【6 7 】。这一实验表明该酶的催化位点仍需进一步研 究。 i f - p p a s e 是一个受m g + 激活的水解酶，底物以m 9 2 + p p i 形式和酶的催化位 点结合，在水解p p i 的同时，通过液泡膜将一个旷从细胞质运送到液泡膜内， 调节细胞质中的酸碱度，使细胞达到稳态 6 8 1 。m 孑+ 对该酶不仅有激活作用，还 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 有保护作用，使其在较高温度下不易失洱6 1 1 。此外，矿p p a s e 还受到k + 和n h 4 + 等阳离子的激活，但是激活效果远远不如m 9 2 + t 6 9 1 。 3 3h + - p p a s e 的生理功能 ( 1 ) 质子泵功能 植物在r n a 、蛋白质、糖类等物质的生物合成过程中产生会产生焦磷酸 ( p p i ) ，p p i 积累到一定程度，若不及时