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利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 摘要 董棕为棕榈科鱼尾葵属常绿乔木，它是我国稀有大型棕榈植物，自然资源少， 主要生于海拔3 7 0 - - 2 0 0 0 m 处的山坡和沟谷中，是国家二级保护濒危种。本文通 过i s s r 分析了董棕的遗传多样性并借助对叶绿体t r n k 基因的内含子m a t k 序列 分析，初步研究了中国原生鱼尾葵属4 种属间的系统发生。 从董棕新鲜叶片中采用c t a b 法摸索和提取董棕叶片基因组d n a ，找出最 合适的提取条件和药剂用量。在此基础上，对董棕i s s r - p c r 进行扩增，从1 0 0 条i s s r 引物中筛选出可以扩增出清晰、重复性好的1 5 条带的引物，1 5 条引物 对1 0 9 份材料共扩增出1 6 3 条带，扩增条带分子量大小在0 1 2 k b 之间，其中1 5 6 条带具有多态性，其多态性百分率为9 5 7 。各引物扩增条带数在5 一1 7 条不等， 平均为l l 条。董棕的遗传多样性及分化系数由p o p g e n e 软件获得。董棕物种 水平的遗传多样性( i - i t ) 为0 2 8 4 6 ，种群内遗传多样性( h s ) 是0 1 4 4 1 。董棕的( g s t ) 值为0 4 9 3 7 ，即4 9 3 7 的变异存在于种群间，5 0 6 3 的变异存在于种群内，说 明董棕的遗传变异存在于种群内与种群间。n e i s 遗传多样性指数h 为0 2 8 6 6 ， s h a n n o n s 信息指数i 为0 4 3 7 0 。 由u p g m a 法获得的基于n e i s 的无加权计算遗传距离董棕各种群的聚类图。 各种群的遗传距离在o 0 1 7 8 一o 3 6 6 4 之间。其中蒙自种群与田心种群间的遗传距 离最小，那坡种群与龙树冲种群间的遗传距离最大。说明种群间的分化程度较高。 种群的u p g m a 聚类的结果表明：董棕1 3 个种群聚成可以分成三大类群： 第一类群包括友谊关、水口镇、新联和弄达，其中友谊关和水口镇的亲缘关 系较近，聚为一小类，新联和弄达聚成一小类。 第二类群包括广西植物园、安德镇、那坡、上长湾、田心、蒙自园林局和马 关。此类群分类复杂，又细分两个分支。一个分支包括广西植物园、安德镇和那 坡，另一个包括上长湾、田心、蒙自园林局和马关。 第三个分支比较小，仅仅包括兴街和龙树冲两个种群。 董棕种群内存在巨大的遗传变异，适应力强。丰富的遗传多样性为董棕提供 了变异的源泉。董棕分布广，栽培历史悠久，但野生种群都比较小，多呈岛屿状 1 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 分布格局，提出了董棕的保护策略。 测定了4 种中国原生鱼尾葵属植物m a t k 序列。结果显示，鱼尾葵属的m a t k 序列存在一定的信息位点，但是较为保守；通过对其m a t k 序列的聚类分析表明 系统树有两个分支，一支为鱼尾葵，另一支为董棕、单穗鱼尾葵和短穗鱼尾葵， 其中董棕与单穗鱼尾葵亲缘关系最近。这种分类与形态学的分类有些差别。 关键词：董棕；i s s r ；m a t k 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 a b s t r a c t c a r y o t au r e n sl i n n i so f t e ng r e e nt h et r e e ，i ti so h l c o u n t r yr a r el a r g e - s c a l ep a l m p l a n t ，t h en a t u r a lr e s o u r c ea r ef e 、mm a i n l yh a db e e nb o r ni nt h ee l e v a t i o n3 7 0 2 0 0 0 m p l a c eh i l l s i d ea n dt h er u n - o 行d i t c h i ti st h en a t i o n a lt w ol e v e l so fp r o t e c t i o n si si n i m m i n e n td a n g e r p l a n t s s e q u e n c e r e s e a r c hp r e l i m i n a r y a n a l y s i s c h i n ap r i m a r y c a r y o t ah a sb e e n4k i n d st h r o u g hc h l o r o p l a s tt m kt h eg e n ec o n t e n td u r i n gm a t kt o b en l ep h y l o g e n ya n dh a sa n a l y z e dt h ec a r y o t au r e n sl i m a h e r e d i t ym u l t i p l i c i t y t h r o u g hi s s r u s e st h ec t a bm e t h o df r o mt h ec a r y o t au r e n sl i m a f r e s hl e a f t ot r yt of i n do u t a n dw i t h d r a wc a r y o t au r e n sl i n n d n a ，d i s c o v e r st h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o na n d t h em e d i c a m e n ta m o u n tu s e d i nt h i sf o u n d a t i o n ，c a r r i e do nt oc a r y o t au r e n sl i n n i s s r - p c re x p a n d si n c r e a s e s ，s e l e c t e d15p r i m e r sf r o m10 0i s s rp r i m e r s ，w h i c h m a ye x p a n dc l e a r l y , d u p l i c a t ew e l l 15p r i m e r sa m p l i f i e d10 9m a t e r i a l st oi n c r e a s e 16 3b a n d i n g s ，t h ea m p l i f i e db a n d i n g sm o l e c u l a rw e i g h ts i z eb e t w e e no 1 2 k b ，15 6 b a n d i n g sh a dt h ep o l y m o r p h i s m ，i t sp o l y m o r p h i s mp e r c e n t a g ew a s9 5 7 a m p l i f i e d b a n d sn u m b e rw a sf r o m5t o17 ，w a se q u a l l y1 1 t h ec a r y o t au r e n $ l i n n h e r e d i t y m u l t i p l i c i t ya n dd i f f e r e n t i a t i o nc o e f f i c i e n to b t a i n e db yt h ep o p g e n es o t t w a r e c a r y o t au r e n sl i n n 。s p e c i e sl e v e lh e r e d i t ym u l t i p l e ( h t ) w e r e0 2 8 4 6 ，o c c u p i e di n t h eg r o u pt oi n h e r i tm u l t i p l e ( h s ) i s0 14 41 。t h ec a r y o t au r e n sl i m a ( g s t ) v a l u ew a s 0 4 9 3 7 ，n a m e l y4 9 3 7 v a r i a t i o n se x i s t e di no c c u p yt h eg r o u p ，5 0 6 3 v a r i a t i o n e x i s t e di no c c u p y i n gi nt h eg r o u p ，e x p l a i n e dc a r y o t au r e n sl i l l r lt h eh e r e d i t a r y c h a n g ee x i s t e di no c c u p y i n gi nt h eg r o u p 、析t l lt oo c c u p yt h eg r o u p n e i sh e r e d i t y m u l t i p l ei n d e xhw a s0 2 8 6 6 ，t h es h a n n o n si n f o r m a t i o ni n d e x1w a s0 4 3 7 0 o b t a i n e db yt h eu p g m a o c c u p i e st h eg r o u pb a s e do nt h en e i sn o n w e i g h t i n g c o m p u t a t i o nh e r e d i t yf r o md i f f e r e n tc a r y o t au r e n sl i m tp o p u l m i o n v a r i o u s c o m m u n i t i e s h e r e d i t yw a sa w a yf r o mb e t w e e n0 017 8 - - - 0 3 6 6 4 h e r e d i t yb e t w e e nm z a n dt h et sc o m m u n i t y sw a sa w a yf r o ms l i g h t l y , h e r e d i t yb e t w e e nt h en pca n dl s c o m m u n i t y sw a sa w a yf r o mi nab i gw a y e x p l a i n e dt h es p l i tu pd e g r e eb e t w e e nt h e 3 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 c o m m u n i t yw a sh i g h o c c u p i e dt h eg r o u pt h eu p g m a c l u s t e rr e s u l tt oi n d i c a t et h a t , c a r y o t au r e n sl i m a 1 3c l u s t e r sm a yd i v i d ei n t ot h r e eb i gc l a s sg r o u p s ： t h ef i r s tc l a s sg r o u pi n c l u d i n gy o u y i g u a n ，s h u i k o u z h e n ，x i n l i a na n dn o n g d a ， i nw h i c hy o u y i g u a na n ds h u i k o u z h e n sr e l a t i o n s h i pr e l a t i o n sw a sn e a r , g a t h e r sw a s o n es m a l lt i r e d ，t h en e wa s s o c i a t i o ns t i r sr e a c h e sg a t h e r e dam i n o rs o r t s e c o n dc l a s sg r o u pi n c l u d i n gg u a n g x ib o t a n i c a lg a r d e n , a n d e z h e n ，n a p o ， s h a n g c h a g n w a n ，t i a n x i n ，m e n g z il a n d s c a p eb u r e a ua n dm a g u a n t h i sc l a s sg r o u p c l a s s i f i c a t i o nw a sc o m p l e x ，a l s os u b d i v i d e dt w ob r a n c h e s ab r a n c hw a si n c l u d i n g g u a n g x i b o t a n i c a lg a r d e n ，a n d e z h e na n dn a p o ，a n o t h e ri n c l u d i n go ns h a n g c h a g n w a n , t i a n x i n ，m e n g z il a n d s c a p eb u r e a ua n dm a g u a n t h et 1 1 i r db r a n c hw a sq u i t es m a l l ，i n c l u d e dm e r e l yx i n g i i ea n dl o n g s h u c h o n g t w oo c c u p i e si nt h eg r o u p c a r y o t au r e n sl i l l i l i nt h eg r o u ph a st h eh u g eh e r e d i t a r yc h a n g e ，a d a p t i v e f a c u l t y t h er i c hh e r e d i t ym u l t i p l i c i t yh a dp r o v i d e dt h ev a r i a t i o nf o u n t a i n h e a df o r c a r y o t au r e n sl i n n t h ec a r y o t au r e n sl i m a d i s t r i b u t i o nw a sb r o a d ，t h ec u l t i v a t i o n h i s t o r yw a sg l o r i o u s ，b u to c c u p i e st h eg r o u pq u i t et ob ea l ls m a l lw i l d l y , a s s u m e st h e i s l a n d ss h a p ed i s t r i b u t i o np a t t e r n , p r o p o s e dt h ec a r y o t au r e n sl i n n p r o t e c t i o n s t r a t e g y d e t e r m i n e d4k i n d so fc h i n e s ep r i m a r yc a r y o t am a t ks e q u e n c e t h er e s u l t s h o w e d ，c a r y o t a sm a t ks e q u e n c ee x i s t e n c ec e r t a i ni n f o r m a t i o nb i ts p o t ，b u tm o r e c o n s e r v a t i v e ；t h r o u g hi t sm a t ks e q u e n c ec l u s t e ra n a l y s i si n d i c a t e dt h eg e n e a l o g i c a l t r e eh a st w ob r a n c h e s ，f o rt h ec a r y o t a ，a n o t h e rf o rc a r y o t au r e n sl i n n ，c a r y o t am i t i s b e c ca n dc a r y o t am o n o s t a c h y ab e c c ，i nw h i c hc a r y o t au r e n sl i n n a n dc a r y o t a m o n o s t a c h y ab e c cb l o o dr e l a t i o n s h i pr e l a t i o n si sr e c e n t t h i sk i n do fc l a s s i f i e da n d m o r p h o l o g yc l a s s i f i e dh a v es o m ed i f f e r e n c e s k e yw o r d s ：c a r y o t au r e n 8l i n n ； i s s r ；m a t k 4 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导f ，独立完成的研究成果。本人 在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当 方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 噬南够畅分 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 求务蕊勇 ) 课题( 组) 经费或实验室的资助， 在( 楠整臀 ) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课题或课题组 负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。) 声明人( 签名) ：龋 妒6 月日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等 规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文( 包 括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查 阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共 建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、 缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于 年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 夕2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文应是 已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审 定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论 文，均适用上述授权。) 璐吞 ) r 名， 湓 月人6 明 年 声 y 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 1 前言 1 1 遗传多样性研究背景和意义 生物多样性保护已成为当今世界的热门话题和研究的重要领域，生物多样性 是人类赖以生存和发展的基础，越来越成为研究的焦点。然而遗传多样性又是 生物多样性的核心和基础，广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传 信息的总和。通常被认为是种内不同种群之间或一个种群不同个体之间的遗传变 异的总和。 遗传多样性的系统研究始于达尔文的物种起源。随着生物科学、数学、 物理化学、计算机等学科的发展，对遗传多样性的研究也逐步深入提高，检测遗 传多样性的方法经历了形态学水平、细胞学( 染色体) 水平、酶水平直至目前的分 子水平【2 1 。分子水平的研究，可直接检测d n a 本身的序列变化，这种方法可以 避免表型性来推断基因型产生的各种问题。因此，d n a 分析方法成为目前最有 效的遗传多样性分析方法【3 1 。 遗传多样性的研究具有重要的理论和实际意义 4 1 。首先，物种或种群的遗传 多样性是长期进化的结果，是其生存( 适应) 和发展( 进化) 的前提。一个物种或种 群的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于物种内遗传变异的程度，也有赖于 遗传变异的种群结构。遗传多样性越高，对环境变化的适应能力就越强，越容易 扩展其分布范围和开拓新的领域。理论推导和大量实验证据表明，遗传变异的程 度与种群的进化速率成j 下比，因此对遗传多样性的研究可以揭示物种或种群的进 化历史( 起源的时间、地点、方式) ，也能为进一步分析其进化潜力和未来的命运 提供重要资料，尤其有助于物种濒危原因及过程的探讨。其次，遗传多样性是保 护生物学研究的核心之一。只有了解种内遗传变异的程度、时空分布及其与环境 条件的关系，才有办法采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源( 基 因) ，来挽救濒于绝灭的物种，保护受威胁的物种【5 i 。对珍稀濒危物种保护方针和 措施的制订，都有赖于我们对物种遗传多样性的认识。再次，对遗传多样性的认 识是生物各分支学科重要的背景资料【6 j 。对遗传品种遗传变异的程度和遗传结构 进行分析研究无疑有助于人们更清楚地认识生物多样性的起源和进化，尤其能加 5 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 深人们对微观进化的认识，为植物的分类、进化研究提供有利的证据，进而为动 植物育种和遗传改良奠定基础【7 1 。 1 2 影响遗传多样性的因素 自然选择是造成遗传多样性的主要原因：1 ) 杂合体的选择优势；( 2 ) 定向选择； ( 3 ) 中性学说( n e u t r a lm u t a t i o nh y p o t h e s i s ) 。木春资生等人提出“分子进化中性理论” 对进化现象有了新的解释，“中性学说 认为生物在分子水平上大多数的进化变 异并不是由自然选择，而是由选择中性或近中性的突变的随机漂变造成的嘲。而 综合进化学说认为进化是在种群中实现的，突变、选择和隔离是进化的三个基本 环节。 自然界的种群往往不是处于理想状态下的，其种群遗传结构受到多种生物 学、生态学过程的影响 9 1 。植物种群遗传结构在很大程度上依赖于生存环境在空 间上的异质( 差异) 性，同时，植物的生长和发育是开放式的，具有多种多样的 生殖方式和交配系统以及极强的发育和环境可塑性【1 0 1 。影响种群遗传结构的主要 因素有：选择、突变、基因流、遗传漂变和交配系统等。这些因素对种群遗传结 构的影响，是种群遗传学研究的重要内容。 1 2 1 选择 选择的实质是一种环境压力，既包括物理因素( 光照、土壤、温度和湿度等) ， 也包括生物因素( 种问竞争、传粉媒介和病虫害侵袭等) 。植物种群具有各种特 定的空间结构，除了植物迁移扩散的方式不同以及偶尔发生的一些随机事件外， 主要原因就在于植物种群生存环境有差异】。选择对植物种群变异和遗传结构的 影响，主要来自两个方面的证据：一方面来自对直接受选择作用的表型性状的观 察和实验，这些表型性状包括形态、生理、种子萌发和休眠、个体大小和生长速 率以及生殖分配等生活史特性；另一方面的证据则来自不受选择直接作用的同工 酶位点的研究f 1 2 】。 选择是导致种群发生遗传分化的重要因素，不仅可以出现在很大的地理范围 内( 如几百千米) ，也可以出现在很小的距离内( 如几米) ，因此种群遗传分化的 大小并不取决于距离的大小，而是取决于选择、突变、交配系统和基因流等因素 的共同作用。即使种群之问存在不断的基因流，但强有力的选择也能使彼此相距 6 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 很近的种群保持遗传上的差别【1 3 】。酶电泳技术揭示了生物种群中存在大量遗传变 异，使选择是否影响种群的遗传变异一直存在争谢j 。在对一些自交植物的研究 中，发现酶位点上一些特定的基因组合( 多位点基因型) 和特定的生态小环境相联 系【1 4 l 。另外，遗传变异与生态或地理适应相关的情况在分布范围较广的物种中更 为常见，因为分布范围大意味着面临各种环境，受不同环境选择的机会也会增加。 1 2 2 基因流 基因流( g e n ef l o 们就是基因在种群之内和种群之间的运动1 1 5 】。如果将自然选 择定为导致种群分化最主要的进化力量，那么基因流则是对抗选择作用的重要因 素。2 0 世纪中期，综合进化理论认为，物种是进化的基本单位，这一基本单位 的整体性是靠基因流来维持的。可是，以后的一些学者对这一观点提出了挑战， 认为基因流在自然界十分有限，因此决定种群遗传分化以至在进化上的意义很 小，而选择才是决定性的力量【1 6 1 7 1 。越来越多的证据表明，基因流强弱对种群遗 传分化具有重要影响，在进化上的重要意义是毋庸置疑的，只是基因流在不同的 物种、同一物种的不同种群甚至同一种群不同的时间都会都会存在差异【1 3 1 们。 植物种群问的基因流是借助于花粉、种子、抱子、植株个体以及其他携带遗 传物质的物体为媒介进行的，其中花粉和种子的扩散是自然植物种群最主要的基 因流【2 0 1 。尽管对花粉运动这种基因流形式做了较多研究【2 1 i ，但关于天然种群中花 粉基因流强弱的直接证据还很少，这有几个方面的原因。首先，花粉基因流和植 物的传粉模式有很大关系。风媒植物花粉数量多、表面光滑、体积小，能借助于 风力将花粉传播到很远的地方，故一些风媒针叶树基因流的强度不亚于活动能力 很强的动物f 2 1 1 ；而虫媒植物花粉扩散的能力则有很大差异，取决于昆虫等传粉者 的生物学特性和行为特点。其次，花粉基因流的强弱还和植物的交配系统有很大 关系。异交率越高的植物其基因流强度越大，专性自交植物的花粉基因流为零。 此外，花粉基因流的大小还和种群空间结构、大小和密度甚至群落特征等因素有 关。种子扩散是植物基因流的另一个主要途径。靠重力和果实破裂方式扩散种子 的植物，其基因流是很有限的，往往形成一定的家系结构，使种群出现亚分化： 而靠风力传播种子或果实的物种，基因流的强弱则取决于种子或果实的重量、结 构和种子成熟时风力的强弱等。迄今为止，对种子扩散这种基因流形式的研究还 很少【1 9 】。 1 2 3 遗传漂变 7 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 在有性生殖的种群中，世代的基因库是对上一个世代基因库的随机抽样和复 制。在世代交替过程中，不同的等位基因遗传到下一代的偶然性对种群遗传结构 可能会产生显著影响。w r i g h t 把这种由于配子产生及结合过程中的随机性导致的 基因频率的波动称为遗传漂变( g e n e t i c 哟，也称随机漂变、遗传偏离或w r i g h t 效应【2 3 1 。 抽样过程中，样本数目的大小，与其方差成反比。因此，种群越大，后代越 容易保持原有的基因频率，不发生偏离；而种群越小，则越可能发生显著的漂变。 对同样大小的种群而言，下降种群比上升种群中发生遗传漂变的效应更明显。例 如，在一个种群中，若某一基因的频率为2 ，则在一个5 0 万个个体的种群中， 有这一基因的个体就有1 0 0 0 0 个；然而，如果这一种群只有5 0 个个体，则只有 一个个体有这种基因，而这一个体由于偶然的机会死亡或没有成功交配，从而导 致其基因在后代中消失的可能【2 4 1 。如果种群很小，相对于遗传漂变来讲，自然选 择的作用很小，这时有利的基因会被淘汰，而有害的基因保留或扩散。野生生物 有时会受到气候的变动、传染病的侵袭等因素的影响，从而使个体数量的显著减 少或者种群斑块化，因此，遗传漂变的作用非常重要。在一个大种群被分割为多 个小种群后，遗传漂变的后果，将使小种群内遗传多样性降低，小种群间遗传分 化增大。 1 2 4 交配系统 植物的交配系统不仅决定了种群未来世代的基因型频率，而且还影响到植物 种群的有效大小、基因流和选择等其他进化因素【l i 】，是影响种群遗传结构最关键 的生物学因素之一。 近交( i n b r e e d i n g ) ，会增加结合配子之间的一致性，并降低重组，从而导致配 子阶段的不平衡，其结果会使种群内的个体基因型趋向均一，而种群间出现遗传 分化。与此相反，远交( o u t c r o s s i n g ) 会降低结合配子之间的一致性，并提高其重 组率，加上远交能促进花粉的运动和远距离的基因流，从而避免种群出现分化。 但植物中绝对远交( 自交不亲和) 和绝对自交的类群极少，大多数物种都是以自交 为主或以异交为主以及两者兼而有之的混合型交配模式。由于植物种群中只要有 少数的异花传粉就能阻止种群出现分化，故进行混合交配的物种其遗传结构与以 异花传粉为主的植物类群近似。从某种意义上来说，在其他条件基本一致的情况 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 下，植物种群具有什么样的遗传结构将取决于种群中自交或近交所占的比重。 1 3 常见的种群遗传结果模式 由于种群内存在近亲繁殖、选择和基因流迁移等现象，在物种的种群很少的 情况下，不会形成一个单一的大繁殖种群，而是形成许多分离的不同的小繁殖种 群，进而形成新的种群结构 2 5 1 。为了进一步研究种群间的相互关系、种群结构 的遗传进化规律，一些学者提出了多种模式，比较通用的模式有以下几种。 1 3 1 陆岛模式( c o n t i n e n t i s l a n dm o d e l ) 迁移发生在很大的陆地与很小的岛屿之间，而且基因流方向主要是从陆地到 岛屿。由于陆地种群相对岛屿来说足够大，从岛屿到陆地的基因流不足以影响陆 地的等位基因频率，因而可以忽略不计。一般认为迁移现象只发生在陆地到岛屿， 岛屿上等位基因频率的变化则由岛屿和陆地间等位基因频率差异的大小和迁移 个体的数量决定。这是一种最简单的迁移模式。 1 3 2 海岛模式( i s l a n dm o d e l ) 彻底不连续分布的种群结构模式叫做海岛模式。该模式中的每个种群彼此孤 立，共同构成一个大种群。它的特点是迁移发生在随机的同类群之间，而且在地 理距离上可不相邻，可无亲缘关系。各子种群间基因频率变化呈现跳跃式而不具 有连续性。这种种群结构中所有子种群间发生迁移的概率相等，而且由于子种群 间基因频率不具有连续性，其间的差异较大，所以迁移对基因频率的影响大，阻 止了种群间散布作用的效果，明显导致地理距离上的邻近关系。它不仅可表示彼 此由水分离着的岛屿种群，而且可表示占据一系列湖泊或池塘或泥坑或沼泽或被 大草原环绕的小片森林或被树林环抱的小片草原上的种群海岛模型。适合于对一 个物种有利的生境区域及其类似区域被不利生境分隔开的任何情况。 1 3 3 阶石模式( s t e p p i n g - s t o n em o d e l ) 与海岛模式相似，但迁移总是从一种种群向另一种种群按线性移动。它的特 点是迁移只发生在邻近种群间，导致邻近种群间有更大遗传相似性。 1 3 4 距离隔离模式( i s o l a t i o n b y d i s t a n c em o d e l ) 种群内子种群间彼此连接，形成许多相互接壤的邻里，每个邻里就相当于一 个子种群，这种种群原本是个均匀分布的大种群，由于个体从出生到性成熟整个 期间内所能移动的距离有限，所以，根据个体间随机交配范围的限制，将种群自 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 然地划分为许多邻里。每个邻里就是其中个体能够有效的随机交配的区域，由于 邻里间彼此是连接的，所以，邻近的邻里间迁移的可能性要比相距较远的邻里间 大得多，而且由于基因频率在邻里间呈现连续变化，邻里间的基因频率差异小， 导致种群间在地理位置和遗传距离之间有关系。据有关研究表明邻里内有效种群 大小n e 约为2 0 左右时，由于子种群很小，邻里间分化将很明显；如果子种群内 有效数目为2 0 0 左右，邻里间只能发生适度分化，而当n e = 1 0 0 0 左右时子种群 间分化将可以被忽略。距离隔离模式也可称为邻里模式( n e i g h b o r h o o dm o d e l ) 。 1 3 5 层次模式( h i e r a r c h i c a lm o d e l ) 迁移只发生在子种群内部，子种群之间无迁移现象。就像支流水系，同源头 支流之间能发生迁移，不同源头支流的种群是彼此隔离的。目前对层次模式基础 上的基因流的研究还很少。 1 4 分子系统学的发展 分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i e s ) 是近3 0 年发展起来的- 1 综合性前沿学 科【2 6 】，它在分子水平上对生物进行遗传多样性、分类、系统发育和进化等方面的 研究，其研究结果对于保护生物多样性( 尤其是遗传多样性) ，揭示生物进化历程 及机理具有十分重要的意义。 系统学的发展经历了两个阶段：生物系统学和分子系统学【2 7 1 。过去，人们主 要利用形态特征研究生物的多样性、品种分类、类群之间的亲缘关系、遗传变异 以及进化发育的状况，该研究方法在实践中受到了一定的限制，不能解决科研和 生产的实际问题。随着生物科学、数学、物理化学、计算机等学科的发展，分子 系统学的研究也逐步深入，尤其是在二十世纪五六十年代，随着电泳技术的出现， 使分子系统学的研究达到蛋白质水平。到了七十年代，系统学的研究进入核酸水 平。八十年代，随着各种分子标记技术的相继出现，使系统学的研究达到了最高 阶段分子水平阶段，即分子系统学。它是指利用分子生物学和系统学的理论知识， 研究生物的系统发育、分类、进化规律的一门学科。它是以分子生物学、系统学、 遗传学、分类学、生物化学等学科为基础，利用这些学科发展的最新理论和技术， 研究生物的进化、遗传、发育的一门科学。生命系统从分子、细胞、组织、器官、 个体、种群、群落和生态系统的不同层次表现出多样性，同时每个层次的多样性 1 0 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 又有其自身的发展规律。其中，分子层次的多样性构成分子系统学的研究领域， 具有最基本的意义。分子系统学广泛用于植物、动物、微生物系统学的研究，解 决了传统系统学遇到的一些棘手问题，如同名异物、同物异名。它为生物多样性、 系统进化的研究提供了有利的依据。 1 5 分子系统学d n a 水平的分子标记与检测 8 0 年代以来，随着分子遗传学技术的发展，人们将目光投向直接基于d n a 的分子标记【2 8 1 。d n a 分子标记一般指在d n a 水平上、以个体间的遗传物质内核 苷酸序列变异为基础的遗传标记，是d n a 水平遗传变异的直接反映。d n a 分子 标记方法是在基因组上寻找多态位点，以揭示个体间或种群间的遗传变异及其亲 缘关系等【2 9 】。与传统遗传标记相比，分子标记具有诸多优越性：直接以d n a 的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节环境限制， 不存在是否表达的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，自然存在 着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；表现为中性，即不影响目标 性状的表达，也与不良性状无必然的连锁；有许多分子标记表现为共显性，能 够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，因而现已逐渐形成了 许多新的分子标记系统。 1 5 1 核酸序列测定 通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间相关性的方 法即为核酸序列分析法。以前常用的d n a 测序技术是双脱氧链( d d n t p ) 终止法， 由于用到放射自显影涉及到安全问题，现在多采用荧光标记的自动测序仪，而且 有供序列对比的软件。 近年来，随着人类基因组计划的开展，在d n a 的序列测定上发生了一系列 重大的改进，国际上最新的测序方法有杂交法、质谱法和流动式单分子荧光检测 法等。 直接测定d n a 序列可以测出所有的d n a 变异。从而获得最为准确的遗传 信息，但是这一技术耗资大，目前d n a 样品制备技术和d n a 序列图象的获得 及数据分析方法都不理想，序列数据本身存在的多重替换问题、协同进化问题和 序列进化速率的变异等问题以及数据分析中的序列对准方法的不足都使得目前 1 1 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 的应用受到一定的影响。 在分子系统学研究中，用来进行序列测定的靶d n a 序列主要是一些进化上 的高变区。如m t d n a 的细胞色素b 区，李明等( 1 9 9 9 ) 通过测定其序列对4 种鹿 ( c e r v u ) 的系统进化关系进行了研列3 0 l ，王义权等( 1 9 9 9 ) 对l 种游蛇( n a t h o ) 的演化 关系进行了分析【3 1 1 。另外，m t d n a 的其它一些序列区段【3 2 3 3 j 以及核d n a 的某些 片段【3 4 1 在系统进化研究上也得到了较广泛的应用。目前植物c p d n a 的m a t k 基 因和r b c l 基因序列及n r d n a 的i t s 区序列已作为重要的分子模版被广泛用于不 同分类阶元上的植物分子进化与系统发生研究【3 5 。3 饥。 1 5 1 1 叶绿体d n a ( e p d n a ) 的特点 叶绿体d n a 为双链环状分子，一般周长约4 0 1 t m 4 5 1 a m ，分子量约为9 0 m d a 。 叶绿体d n a 大小约为7 1 k b 一2 1 7 k b ，但绝大部分在1 2 0 k b 1 6 0 k b 之间。叶绿体 d n a 平均浮力密度为1 6 9 4 9 c m 3 1 6 8 9 9 c m 3 ，g c 含量2 5 3 8 1 3 引。 大多数叶绿体d n a 有两个反向重复序列，称为倒位重复( i n v e r t e dr e p e a t ，i r ) 。 裸子植物叶绿体d n a 缺少倒位重复序列，但对黑松的研究发现，黑松叶绿体基 因组中有残余的倒位重复序列，裸子植物的这种缺少倒位重复序列或仅有残余重 复序列的现象被科学家认为是次生形成的。两个反向重复序列将叶绿体环状分子 分隔成两个大小不同的单拷贝区，大单拷贝区( 1 a r g es i n g l ec o p y ，l s c ) 长度在 7 8 5 k b 一1 0 0 k b ，小单拷贝区( s m a l ls i n g l ec o p y ，s s c ) 长度在1 2 k b 7 6 k b 。其中， 叶绿体所有r r n a 基因( 4 5 s ，5 s ，1 6 s ，2 3 s ) 及部分t r n a 基因位于反向重复序列 内，大部分t r n a 和光合机构中的基因分布在l s c 区。 大多数叶绿体基因组为多顺反子转录单位，如操纵子p s b b p s b h p e t b p e t d 编码光系统i i 和细胞色素b 6 f 蛋白复合体；操纵子r p s 2 一a t p i - a t p u - a t p f - a t p a 为一 个编码核糖体蛋白s 2 和a t p 合酶亚基的结构复杂的操纵子。一般来说，叶绿体 的这种多顺反子的单位可以使用较少数目的转录起始位点。 大多数学者认为叶绿体中存在两种甚至两种以上具有不同功能的r n a 聚合 酶，其中一种在叶绿体d n a 制备过程中紧密的与d n a 缔合，形成d n a 一蛋白 质复合物，称之为结合的r n a 聚合酶；另一种是可溶的r n a 聚合酶，由多个 亚基( 7 1 4 种多肽) 组成。但叶绿体r n a 聚合酶到底是由核基因编码还是由叶绿 体基因编码，还是一个具有争议的问题。 利用i s s r 分析中国原生董棕植物遗传多样性 叶绿体基因组的基因分为两大部分，一是遗传系统的基因如：r r n 基因和t r n 基因；二是光系统的基因，其基因产物参与光合作用，如r b c l 基因和n d h 基因。 叶绿体基因的表达调控与核基因相似，有转录水平的调节，转录后调节和修饰， 翻译的调节以及翻译后修饰等。 叶绿体在不同植物中的遗传方式各异，大多数的被子植物为母系遗传，约 2 0 为双亲遗传，如月见草属、天竺葵属、苜蓿属；母系遗传的被子植物仅在猕 猴桃属的植物中有过报道：针叶树的叶绿体是父系遗传。叶绿体的单亲遗传有效 防止了不同来源的基因组之间的相互作用，而松科植物的父系叶绿体，在从传粉 到受精的将近1 3 个月的时间里为雄配子的发育提供了营养f 3 9 1 。 1 5 1 2m a t k 基因及在植物系统发育分析中的应用 m a r k 基因位于叶绿体t r e k 基因的内含子中，长约1 5 0 0 b p ，为单拷贝基因， 编码一种成熟酶( m a t u e a s e ) ，这种成熟酶参与r n a 转录体中i i 型内含子的剪切 1 4 0 1 。是现知被子植物中进化速率较快的基因，多用于科下属间系统发育关系的研 究【4 1 1 。 h i l u ( 1 9 9 9 ) 等在探讨禾本科植物的m a t k 基因的核苷酸插入删除的进化含 义时指出：m a t k 基因的3 端的插入删除和核苷酸的替换在鉴别草本植物的某些 主要进化中有重要作用。l b p 的缺失引起了开放阅读框的转换，在禾本科的两个 最基本的进化支s t r e p t o c h a e t a 和a n o m o c h l o a 的位置被一个关键的突变所支持。 另外，l b p 的缺失造成开放阅读框的提早终止是e h t h a r t a 所独有的。1 个6 b p 的 插入导致了p a n i c o i d e a e ，a r u n d i n o i d e a e ，c e n t o t h e c o i d e a e 和c h l o r i d o i d e a e ( p a c c ) 4 个亚科的单系发生。这个标记在区分p a c c 支与察看p a c c 支和它的姐妹群关 系时有重要作用。来自苔鲜植物，裸子植物和种子植物的氨基酸序列对准表明这 个