（高分子化学与物理专业论文）树脂法分离氨基酸.pdf

。纠7 摘要 本文由七章组成。第一章介绍了氨基酸的基本性质，制备分离的方式及分析 方法，重点介绍了琉水作用在分离中性氨基酸上的应用。第二章研究了大孔磺 酸树脂对氨基酸盐溶液的脱盐性能。第三章研究了磺酸树脂交换容量对分离中 性氨基酸的影响。第四章合成了大孔s t - d v b - m m a 磺酸树脂并研究了它们对 中性氨基酸的分离性能。第五章合成了不同交联度的大孔新型磺酸树脂( d p s ) 并研究了它们对中性氨基酸的分离性能。第六章研究了大孔新型磺酸树脂对中 性氨基酸盐溶液的脱盐性能。第七章研究了如何从毛发水解液中提取分离氨基 酸。 通过研究比较，发现大孔新型磺酸树脂不仅有很好的分离中性氨基酸的性 能，还对中性氨基酸的盐溶液有很好的脱盐性能。这主要是因为在该树脂骨架 上引入了苯基这疏水配基，增强了对氨基酸侧链的疏水作用，使得氨基酸的 保留时间延长而至。 关地t 司攘破，驰阿犬嘲嘲怫蚕 a b s t r a c t t h et h e s i si sc o m p o s e do fs e v e nc h a p t e r s i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h eb a s i cp r o p e r t i e s ， p r e p a r a t i v es e p a r a t i o na p p r o a c h e sa n da n a l y s i sm e t h o d o f a m i n oa c i d sw e r er e v i e w e d f o c u s i n g o nt h e a p p l i c a t i o no f p o l y m e r i cr e s i n si nt h es e p a r a t i o no f a m i n oa c i d s t h e d e s a l i n a t i o n p m p o r t i e so ft h em a c r o p o r o u s s u l f o n a t e d i o n - e x c h a n g e rf r o mt h e a m i n oa c i d sa q u e o u ss o l u t i o nw e r es t u d i e di nt h es e c o n dc h a p t e r t h ei n f l u e n c eo f t h e e x c h a n g ec a p a c n y o f t h es u l f o n a t e di o n e x c h a n g e ro nt h es e p a r a t i o no f n e u t r a la m i n o a c i d sw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i li nt h et h i r de h a p t e r i nt h ef o u r t hc h a p t e r , w e s y n t h e s i z e dt h ei o n - e x c h a n g e r sb a s e do nt h es u l f o n a t e dm a c m p o r o u ss p h e r i c a l s t - d v b - m m a c o p o l y m e r t h es e p a r a t i o np r o p e r t i e so f t h i sk i n do fr e s i n sf o rn e u t r a l a m i n oa c i d sw e r ea l s os t u d i e d i nt h ef i g t h c h a p t e r , an e w s u l f a n a t e di 0 1 1 - e x c h a n g e r s ( d p s ) a n dd i f f e r e n tc r o s s l i n k i n gd e g r e ew e r es y n t h e s i z e da n dt h e i r s e p a r a t i o np m p e a t i e s f o rn e u t r a la m i n oa c i d sw e r ea l s os t u d i e d t h ed e s a l i n a t i o n p r o p e r t i e sa n dt h ep r a c t i c a la p p l i c a t i o ni nt h ed e s a l i n a t i o nf r o mt h eh y d r o l y z e dh a i r a q u e o u ss o l u t i o no f t h er e s i n sp r e p a r e di nt h ef i f t h p a r tw e r es t u d i e di nt h es i x t h c h a p t e ra n d t h es e v e n t h c h a p t e rr e s p e c t i v e l y c o m p a r i s o n t h er e s u l t so b t a i n e df r o mt h es t u d i e sa sd i s c l o s e di nt h o s e c k 甲渤瞎 i t c a nb ef o u n dt h a td p sr e s i np o s s e s s e sb o me x c e l l e n ts e p a r a t i o np r o p e r t i e sf o rn e u t r a l a m i n oa c i d sa n dd e s a l i n a t i o np r o p e r t i e sf r o mt h ea q u e o u ss o l u t i o no fn e u t r a la m i n o a c i d s t h e s ep r o p e r t i e sr e s u l tm a i n l yf r o mt h ei n t r o d u c t i o no ft h eh y d r o p h o b i cp h e n y l g r o u po n t h es u r f a c eo ft h e r e s i n s ，w h i c hi n c r e a s et h eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n b e t w e e nt h er e s i na n dt h ea l k y lr e s i d u eo ft h en e u t r a la m i n oa c i d s t h i sk i n do f i n t e r a c t i o nc a l lm a k el a r g e rd i f f e r e n c eo ft h er e t e n t i o nt i m eo f d i f f e r e n tn e u t r a la m i n o a c i d so nt h er e s i np a c k e dc o l u m n 第一章前言 1 1 氨基酸的分类及其理化性质 1 1 1 氨基酸的分类【” 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，它在研究生命起源，人体营养与代谢， 生物的遗传与变异诸方面有着非常重要的作用和地位。生物体内由基因决定的 氨基酸有2 0 种，除脯氨酸外，所有的氨基酸均有一通式，如下图所示： n h 2 c h _ c o o h i r 其中r 代表侧链基团。表l 一1 中的二十种氨基酸是按其侧链基团的物理性质， 特别是根据与水的相互作用分类的，这样的分类对研究氨基酸混合溶液的分离 是有用的。由此表可发现一个明显的特点，有些氨基酸的侧链，相对来说， 是疏水性的( 如a l a , v d ，l e u ，i l e ，m e t ，p r o ，p h e ，t r y ) ，有些氨基酸的侧链在生命自 然条件下总可以电离，因而是强亲水性的( 如a s p ，g l u , l y s ，a r g ) 。组氨酸由于 在p h7 时能变成质子化的形式，因而很接近于后一类。所有其它氨基酸处于这 两个极端之间。 1 1 2 氨基酸的酸碱性质及p i 值【2 。3 1 氨基酸一般能溶于水，但不溶予象乙醚这样的非极性有机溶利中，氨基酸 的熔点很高，一般在2 0 0 0 c 以上，这说明在它们的结构中具有带电荷的极性基 团。实际上，所有的氨基酸都含有酸性的羧基，能电离成c o o - 和h + ，还含有 一个碱性的氨基( 或亚氨基) ，它能接受质子，形成四级铵盐( 如r n h 3 + ) 这 种情况可用下式表示： n - h 3 +n h s + n h l r 一6 一c o o h 3 h + 十r 一3 c o o 一土h + r 一0 二c o o 一 上 l i h h 分类名称三字母f t 号单字母代号遗传丧码 结构 武 i二 _ o u ￥ 酸 f 1 辱氟酸 5 p d n h r c c h c o o h o c c o o h 性 氯 基 h 咎氟毫 o j ue e n 琏一c c h t c h r c o o h 啦 o g 1 c 0 0 h h i 甘氟蠢 g j y gg o ( n ) n 也_ 宁一h c o o h h 丙氟 l ic - c ( n n h r 一 q h 一 i c 0 0 h t h 蠢氯奠 v a lvo u ( n ) n h r 一咚 一函。隶粤- c u ( n ) f ：尸。 亮氨蠢 l e “l u u u f r o n “，譬啊咚l 掣 0 0 口l i ：，c h 扣 蛐r 7 c o o ；4 h c h t c h a u u 蛙 l l ci u c 界亮氯瞳 氟 u 墓 鬣 u c n 4 ) h 兰氯艘 s e ts o u n h 广c c h l o i i g c c o o h h o h 苏氯艘 t h ft c ( n )n h r 一0 3 h c h c o o h u n h ：一0 一c h r 2 一n h ， n 冬畿敞 i nn c o o h 、 c 结鞫式 分 舞 名称 三字母代号单字母代号 遗传密码 ho c a n h 广一 一c h ，一c h ，一e n h 。 备氯酰胺 g l n0 c g c o o h h 、 u o u n h ，一6 c h ，一s h 半耽氨随 c ” c u g c 0 0 0 h h 氯蠢 m e tm u 0 n h 。一 一c h ，一c h ：一s c h 。 i c o o h u u u m 一 一c n t o幕丙氯麓 p h ef c o o h u u c o ， 早 氟麓 t y r y u u w 地一 c 吼一o 。n u c c o o h 色氟般 t r p w u o o n h ：一嚣i 飞 h h h l 啸氟艘 p r o c c ( n ) h 2 c c c h 广c 7 l o o h 镰 h 性 hh n c n 氯龃王氟馥 h i h c u i j j 基 c c n h l 一c - - c h i c = 一c h i 麓 c o o h h i 赣氟艘l ” k n h l c - - c h t c h i c h ：一c h z h h l o j c o o h c g n ) 7n l t i 精扛豫 q g n h 1 一一c h l 一c h l 一c h l 一n h c g g c o o hn h t ，规在船j 乏的遗传鸯再排期，指的照倩曛接糖接盈的棱苷摩啊序，箕巾， 矗埠瞽麓，ct l 台t f l l t ，g 是鸟苷蠢u 悬 罐瞥琏，n 是上述四种艟t f i l l , p l i - - t , , i , 因此，氨基酸是一个两性电解质，它在溶液中的带电情况，随溶液的p h 值而 变化。改变溶液的p h 值，可以使一个氨基酸带正电，也可以使其带负电或不 带电。如果氨基酸不带净电荷，那它在电泳系统中就不会发生向正极或负极移 动的现象。在这种状态下。溶液的p h 值称为该氨基酸的等电点，以_ p i 表示。 由于每氨基酸的酸性和碱性基团数目不同，以及每个基团的p k 值的差别， 使得不同氨基酸有不同的p l 值。等电点是氨基酸的一个特征值。在等电点时， 分子间容易聚集成大分子而沉淀析出，其溶解度最小，故在生产上可作为提取 氮基酸的理论依据，如于谷氨酸的等电点p h 3 2 2 提取谷氨酸。表1 - 2 列出了 常见氮基酸的p k 值及p i 值。 表l 2 氨基酸解离基团的p k 值及p i 值 氨基酸p kc - c o o n )p k ( - - n h ，)p k ( r )p i a l a2 3 59 6 96 、o o v a l2 3 29 6 25 9 6 l e u2 3 69 6 05 9 8 l i e2 3 69 6 86 0 2 p r o 1 9 91 0 6 06 3 0 m e t2 2 89 2 15 7 4 p h e1 8 39 1 35 4 8 t r p 2 3 89 3 95 8 9 g | y 2 3 49 6 05 9 7 s e r2 2 l9 1 55 6 8 t i l f2 6 31 0 4 36 1 6 t y r 2 2 09 1 11 0 0 75 6 6 c y s 1 7 ll o 7 85 0 7 a s n2 0 28 8 05 4 l g l n2 1 79 1 35 6 5 a s p 2 0 99 8 23 8 62 7 7 g l u2 1 99 6 74 2 53 2 2 l y s 2 1 88 9 5 1 0 5 39 7 4 a r g 2 1 79 0 41 2 4 81 0 7 6 h i s1 8 29 1 76 o7 5 8 4 1 i - 3 氨基酸侧链性质1 4 1 由于2 0 种氨基酸分别带有不同的侧链，因而侧链就成了决定或影响氨基 酸结构和性质的重要因素。总的说来，除解离性基团之外。天门冬酰胺和谷氨 酰胺上的侧链酰胺基，丝氨酸和苏氨酸上的羟基都是亲水性基团。另一方面， 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等 的侧链基团都属于疏水性基团。基团的亲水性或疏水性可通过测定它们在极性 及非极性溶剂中的化学位定量表述出来。 设溶质为i 。当它溶于水中时，其化学位ui ，可表示如下： ui - = uo i + r t l n x i 。+ r t l nt i w 其中，x 为溶质i 的浓度，用摩尔分数表示，ti 。为活度系数。uo i w 为标准 态时的化学位，包含溶质分子自身的自由能以及溶质和溶剂相互作用的自由能 西部分。当该溶质溶于某溶剂a 时，其化学位ui 同样可表示为： ui a = uo i + r t l n x i a + r t l n t 。a 在饱和溶液中，溶质i 的化学位与结晶的化学位相等， ui = ui a = | li ( 结晶) 凶此，这时有以下关系成立 uo l 。+ r t l n x i , + r t l nt i f u o i + h l n x i a + r t l n t i a 无论是在水或溶剂a 中，溶质自身的自由能没有差别，因而( uo i w - po i a ) 代 表无限稀释时溶质i 和水及溶剂a 相互作用时化学位的差值，这便是溶质 从 溶剂 转移到水中时自由能的变化a g ，由于 g 。= r t l n x i a x i 。+ r t l nt 。 丁。 所以根据溶质i 在溶剂a 及水中的溶解度可以测定其a g 。值。为了测定氨基酸 侧链肇团的亲水性或疏水性，可以先测定某氨基酸从非极性的有机溶剂( 如： 氧六环) 转移到水中时自由能的变化，然后城去甘氨酸在同样转移过程中自由 能的变化，其差值a g 。便代表氨基酸侧链基团转移时自由能的变化，结果见表 卜一3 ，g 愈正，显示疏水性增强，小正值以及负值则表示为亲水性。了解侧 链疏水性或亲水性对分离氨基酸也是十分必要的。 表1 3氨基酸侧链基团疏水性的衡量( j g ) 氨基酸侧链 x g t ( k c a l m o l 1 )氨基酸侧链a g 。( k c a l m o t 。1 ) 甘氨酸 o半胱氨酸+ 1 0 丙氨酸 + 0 5丝氨酸一0 3 缬氨酸 + 1 5 苏氨酸 + 0 4 亮氮酸 + 1 8天门冬酰胺一0 2 异亮氨酸 + 1 8谷氨酰胺一o 1 苯丙氨酸 + 2 5 天门冬氨酸 一2 5 酪氨酸 + 2 3谷氨酸一2 5 色氨酸 + 3 4组氨酸+ 0 5 脯氨酸 + 1 4赖氨酸一3 0 蛋氨酸 + 1 3精氨酸一3 0 1 1 4 氨基酸的显色反应 氨基酸能和许多试剂作用，产生特异性的显色反应。在纸层析中，常常用 这些反应来识别和鉴定一些氨基酸。尤其是氨基酸与茚三酮的反应，在生化中 是特别重要的，因为它能用来定量测定氨基酸。 氨基酸与茚三酮的水合物一起加热起氧化脱氨反应，放出的氨与一分子茚 三酮及一分子茚三酮还原产物反应生成蓝色化合物。所生成的酮酸则被加热分 解放出c o 。反应中蓝色的深度及c 0 2 的量可以作为氨基酸分析的依据。其反应 式如下： 6 o o 葡三木舍氯基t + r - - c o q ( + 玛o i n 珏 0 茚三一连曩产熏氯基奠 r c - - - 4 3 0 0 i+ 珏o n h i + r c 电o o h 舰 i i r o r - r 0 0 h 蝴+ + 一： l - - - c o + + r c o、h 奠 该络合物颜色的强度直接与氨基酸的浓度有关。该反应十分灵敏，1 ：1 5 0 0 0 0 浓度的氨基酸水溶液即能有颜色反应，比色法在5 7 0 h m 处测定吸光值可用于氨 基酸的定量测定。 脯氨酸由于其亚氨基酸结构，与茚三酮反应能产生独特的黄色。该黄色产 物的最大吸收波长是4 4 0 h m ，所以必须选择这个波长来单独测定脯氨酸的含量。 1 2 氨基酸的主要应用口。2 0 】 1 2 1 氨基酸在医药工业上的应用 氨基酸是人体内合成蛋白质、激素、酶及免疫物质( 抗体、干扰素等) 的原料。人体的疾病状态和氨基酸的存在情况有着密切的关系。大量的研究 结果和临床实践，显示了氨基酸类药物的重要性。 氨基酸在医药工业上主要是用于制备复方氨基酸输液，作为外科手术前 后、烫伤、骨折、癌症、肝脏疾患、消化道溃疡等病人的营养补给输液及治 疗输液。发达国家目前i 豳床上主要应用第三代平衡氨基酸输液，其配方见表 1 4 所示。 表1 4 日本含1 8 种氨基酸的输液配方( m g l o o m l ) 成分m i l k a m i n ( 3 )m i l k a m i n ( 9 ) 异亮氨酸 2 1 06 3 0 亮氨酸2 9 4 8 8 2 蛋氨酸 1 6 04 5 0 赖氨酸2 9 3 8 7 9 色氨酸 6 04 6 8 苏氨酸1 5 64 6 8 苯丙氨酸2 5 57 6 5 缬氨酸 1 8 05 4 0 精氨酸盐酸盐2 3 6 7 0 8 组氨酸盐酸盐2 2 0 6 6 0 脯氨酸9 0 2 7 0 丝氨酸 1 2 03 6 0 天冬氨酸 2 l o3 6 0 谷氨酸 3 6 01 0 8 0 酪氨酸 1 54 5 胱氨酸 61 8 甘氨酸2 4 5 7 3 8 丙氨酸 1 4 44 3 3 备种特殊氮基酸输液的出现是氨基酸输液发展的新动向。近年发现，在 刨伤及手术早期输给含支链氨基酸( l e u 、i l e 、v a l ) 比例较高( 4 5 黼町的氨 基酸输液能阻止创伤后蛋白质的分解。根据f i s c h e r 发现的肝性脑病患者血 液氨基酸谱失常，即支链氮基酸含量下降，芳香族氨基酸( p h e 、t y r 、t r p ) 含量升高的实验结果，设计了含高浓度支链氨基酸、低浓度芳香族氨基酸的 输液f o - 8 0 。用予肝昏迷，可使9 0 9 6 的病人苏醒。肾衰竭病人h i s 及必需氨基 酸非必需氮基酸比值下降。如用必需氨基酸与h i s 配制的输液，可使血中尿 素氮合成非必需氨基酸而得到显著的疗效。对癌症病人，支链氨基教能加强 其免疫能力。因此目前正在研究不平衡氨基酸输液配合化疗以抑制癌细胞的 生长。 我国生产的氨基酸输液主要有：低分子右旋糖酐氨基酸注射液、1 4 - 氨萋 酸注射液- 8 0 0 ( 治疗肝昏迷用) 、支链氨基酸输液( 治疗肝昏迷用，分为含3 种和6 种支链氨基羧等) 、必需氨綦酸输液( 治疗肾衰竭用，含9 种氨基酸) 、 灼伤用氨基酸输液( 营养用，含1 7 种氨基酸) 、平衡氨基酸输液( 营养用， 分为含1 4 种和1 8 种氨基酸等) 。 另外，根据病人的营养要求，配制各种“要素膳食”即口服氨基酸制剂也 正在得到发展。 1 2 2 氨基酸在食品工业上的应用 据统计，食品工业中应用的氨基酸量占氨基酸总产量的6 0 ，如用作食 品调味剂的谷氨酸钠( 味精) 和甘氨酸是世界上用量最大的调味品。作为食 品营养强化荆应用的氨基酸也占有相当比重。有些国家已规定实用面包需用 赖氨酸强化，以增强国民的身体素质。氨基酸还可用作食品除臭荆、增香剂、 发色剂以及油脂抗氧化剂等等。 1 2 3 氨基酸在饲料工业上的应用 氨基酸的添加对于提高饲料效率、改善肉质和促进发育效果显著。除蛋 氨酸和赖氮酸已大量用作饲料添加剂外，甘氨酸、谷氨酸、色氮酸和苏氨酸等 也被指定为饲料添加齐j 1 2 4 氨基酸在化学工业上的应用 在化工方面，氨基酸的应用也是多方面的。氨基酸具有氨基和羧基两种 9 相反的亲水性基团，因此在这两个基团上分别引入高级脂肪酸或高级脂肪醇， 就成了阴离子型或阳离子型表面活性剂，它们可使海面上污染的石油凝固而易 于回收。用氨基酸制造无公害农药，也引起人们的重视。以甘氨酸为原料生产 的除草剂已投放市场。聚t 一谷氨酸因性质上接近角蛋白，被开发作为人造革的 涂料，使人造革具备有天然皮革的特点。 另外，因氮基酸及其衍生物的天然性，作为化妆品对皮肤有保护作用，具 有维持p h 值及抗紫外辐射等效果。 1 3 氨基酸的制备分离 氨基酸制备的主要来源有： ( 1 ) 由天然蛋白质水解液中分离提取；( 2 ) 应用微生物发酵生产； ( 3 ) 应用酶的催化反应生成氨基酸；( 4 ) 有机合 成法，合成的产物为外消旋氨基酸，须进一步拆分出l 一型及d 一型氨基酸。各种 途径受市场价格支配，竞争十分激烈。但无论用哪种方法生产，都有一个分离 纯化的过程。 1 3 1 吸附分离 目前吸附树脂对氨基酸的吸附研究已经比较成熟 2 t - 2 3 】。o t a n im a s a r u 等人采用d i a i o nh p i o 、h p 5 0 、s p 一2 0 7 和) 【a 肛2 、x a d 一4 等吸附树脂精制 苯丙氨酸发酵液中的苯丙氨酸取得了成功。a d d o y o h o ( 2 5 1 用a m b e r l i t ex a d 一2 吸附树脂进行吸附色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸的研究，并测定了吸附热，发现 吸附热从大到小的顺序为色氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸。说明该树脂对色氨酸 有很高的吸附选择性。 由于吸附树脂仅对芳香族氨基酸表现出较高的吸附选择性，所以在制备分 离上使用有限。 i 3 2 离子交换分离 ( 一) 离子交换柱分离 a ，分离原理 借助离子交换柱层析法分离氨基酸，大多数采用苯乙烯一二乙烯苯磺酸树 脂，苯乙烯和二乙烯苯通过共聚反应形成由惰性烃链构成的三维网状结构，磺 化后则在网状结构上带上大量的磺酸功能基，形成疏水的树脂基体与亲水的磺 1 0 酸功能基的有机结合。其结构模型如图1 1 所示】。 曼嘲簖“n a 蚶q 辜；鬻辍联 一l l 童于交换辩精的培扣簟型重 8 r h t n 一圭c - - c o o h + h + - - - h ；n - - 一c 。h -r 一一 h a rr 。：小例n 一 c o 佣一r es s 咛h + n 一丰一c 。h 州 h h 随着洗脱液p h 值升高，n 一羧基将呈离子态，这时各种氨基酸的净电荷将 是：酸性氨基酸带负电荷；中性氨基酸挣电荷为零，呈电中性；碱性氨基酸则 带正电荷。所以当p h 值升高时，离子交换反应将向着方程式的左方进行，结果 是酸性氨基酸最先被洗脱下来，接着是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。至于 中性氨基酸如何被进一步分离，则主要靠解离基团的离子交换作用和侧链的疏 水作用二者的协同。 关于疏水作用的本质，1 9 5 9 年k a u z m a n n 曾以碳氢化合物在极性和非极性 溶剂中的热力学数据为基础，比较详细地从热力学角度进行了分析。现在普遍 认为，产生疏水作用的驱动力并不是非极性基团间固有的吸引力，而是一种能 量效应。对此不妨以两个非极性基团为例，通过热力学关系式来加以说明乜。 在热力学关系式a g = a h t s 中：g 是自由能的变化：h 为焓，h 近似等于键能的变化；s 为熵，它是体系有序性的量度，s 是熵变；t 是绝对 温度。自由能g 可以衡量一个反应能否进行，若g 为负值，反应可自发进行。 对于某一个特定的变化过程来说，g 为负值表明体系内的键合作用由弱变强， s 为正值表明体系由有序变为无序。假定两个非极性基团原来和水接触，当 非极性基团围绕着水时，这在能量上是不利的，经过变化，两个非极性基团相 互接近或键合，结果将它们周围一部分原来排列整齐的水分子排入自由水中， 如图1 2 所示。 _ l z # 摄性基困麓生建永作用示意圈 一中一白葺_ i 屯囊永舟千 择列接齐的水分子排入自由水，水分子的无序程度增加。由于熵是衡量无 序程度的物理量，无序程度越大，熵就越大。因此，当两个非极性基团在水介 质中相互接近或键合时，整齐排列在非极性基团附近的水分子转移到自由水中 的过程伴随着熵的增大。或者反过来说，由于熵增加是自发过程，是一个使体 系能量驱于极小即能量上有利的过程，所以上述变化是熵所驱动的。 疏水作用力在一定范围内随着温度的升高而增强，超过一最高温度( 4 0 - 6 0 0 c 左右，因侧链基团不同而异) 后复又减弱。 由于树脂基体的烃链网络结构相对固定，其与氨基酸之间的疏水作用大小 依赖予氨基酸侧链的非极性大小，即氨基酸疏水性标度x g ，的大小。事实证明， 中性氨基酸从阳离子交换树脂柱上的流出顺序确实与x g 。大小的顺序一致。依 次为丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸。 b 。柱分离的最新实例 近年来采用离子交换柱分离氨基酸的研究成果列于表1 5 中。 表l 5 离子交换柱分离实例 i o ne x c h a n g e r sl m i n oa c i d sr e f e r e n c e s p o r o u s c a t i o ne x c h a n g er e s i n s t r p 2 9 3 0 s t r o n g a c i dc a t i o ne x c h a n g er e s i n sp r o ，l y s ，p h e 3 1 i o ne x c h a n g e rm i x t u r eo fa m i n o 3 2 3 3 a c i d s 3 4 3 5 s t r o n g a c i dc a t i o ne x c h a n g er e s i n sv a l ，i l e 3 6 s t r o n g a c i dc a t i o ne x c h a n g er e s i n s m i x t u r eo fa m i n o 3 7 3 8 a c i d s 3 9 4 0 i o ne x c h a n g e r l y s 4 1 a m b e r lit ei r2 0 ( n h , + )v a l i l e 4 2 a n i o ne x c h a n g er e s i n sm i x t u r eo fa m i n o 4 3 a c i d s c ，影响柱分离的重要因索 ( 1 ) 树脂骨架的影响：由苯乙烯一二乙烯苯交联共聚而得到的网状结构 的高分子骨架，由于单体性质，交联剂性质以及交联度等方面的各不相同，对 氨基酸分离的影响很大。如作为交联剂的二乙烯苯由于存在间、对位等几种异 构体形式，其间、对位的比例可以严重影响树腊柱的分离效率。对于t h r - s e r ， g i y - a i a ，l e u - i l e ，p h e - t y r 等氨基酸对的分离，随着树脂柱中m - d v b 的增大， 分离效率逐渐提高。使用纯m - d v b 时达到最好分离效果，但在用m - d v b 合成的 树脂柱时，随p h 值及离子强度变化，离子交换柱体积显著收缩，造成柱阻力显 著增大和通过能力下降。较理想的配比为m - d v b p d v b 等于5 2 。前苏联在交 联度方面做了很多工作j ，发现如下规律：对树脂交联度，过高会影响氨基酸 的扩散，过低则随洗脱剂p h 值改变，柱中树脂膨胀度变化太大，二者均使柱效 率降低。当交联度为8 - 1 2 时能得到较理想的结果。 另外，树脂骨架中添加不同的单体对氨基酸的分离影响也很大。 ( 2 ) 流速的影响：流速增大，则氨基酸在液相和圃相中的分配偏离平衡 分配越大，从而降低柱效，这已被大量实验h 吣证实。丽流速太小。则扩散严重， 也降低柱效。 ( 3 ) 树脂颗粒度的影响：h a m i l t o n ”卅3 曾就此进行研究，其结果表明， 树脂粒度越小，分布越窄，则柱效越高，而树脂颗粒的形状对分离效果影响不 大。 ( 4 ) 洗脱剂的影响：汤家芳h 8 1 等人曾使用n h 。0 h 、n h 4 a c 、n a c i 和n r , c l 等四种洗脱剂洗脱阳柱上猪毛水解液的氨基酸，发现以n h c 1 洗脱分离效果最 佳。这是因为用n a c l 和n h c l 做洗脱剂时，阳柱上的反应方程式如下： r s o ；a + n c l 二- r so ：n b + a ：c l r s o ；a + n h ic ；一一r - - s e ；n h ：中誓r c r 洗脱溶液呈酸性，即氨基酸仍呈阳离子状态，在离子交换柱上进行吸附与解吸 附的再分配过程，从而增加了分离效果。但是因为n a + 离予比n 也+ 离子鼍抉能力 大，选择性小，所以n h 4 c i 较n a c l 的洗脱分离氨基酸的效果要好。 当用n h a c 等弱酸弱碱的盐类洗脱剂时，虽有上述反应，然而a c ”是弱酸根， 与氨基酸阳离子形成的盐，溶解度小，在离子交换柱上形成沉淀，大大影响了 氨基酸的洗脱和分离效果。 当用n h 4 0 i l 弱碱类洗脱剂时，则因被洗脱下来的氨基酸呈等电点状态，或 呈负离子状态。没有吸附与解吸附的再分配过程，洗脱能力太强而分离效果差。 ( 5 ) 柱长的影响t大多数分离氨基酸的过程中均采用了洗脱串柱，增 加置换展层鼯离，以达到分离氨基酸的目的。 另外。影响分离的因素还很多，如装柱技术，温度等等。 ( - - )离子交换膜分离 膜分离h “”就是利用固体或液体薄膜将混合物组分选择性地分离。将离子 交换树脂与聚乙烯压成膜即可得离子交换膜，它因具有能耗低( 膜分离无相变) ， 可反复使用，操作简便，装置简单，不产生第二次污染等优点而受到极大的重 视。日本利用离子交按膜分离氨基酸的工作做得很多，近年来这方面的研究成 果见表1 _ 6 。 1 3 3配位交换分离 ， “配位交换”( l i g a n d - e x c h a n g e ) 的概念由h e l f e r i c h 在1 9 6 1 年提出油】， m u z z a r e l l i t ”1 和d a v a n k o v m l 等较详细地描述了配位交换过程。 a 。以库仑力固定配位中心离子分离氨基酸 a r i k a w ay o s h i j i r o 【7 ”用强酸树脂分别吸着n i + 、c u + 和c o + ，然后装柱 分离氨基酸，以一般缓冲液作洗脱剂并加入微量与载体配位中心离子相同的金 属离子，结果使分离时间缩短。d f r a n c i s 【? 钉用这一技术提取了糖中的氨基酸。 b ，以配位键固定配位中心离子分离氨纂酸 用含有氨基，羧基的螯合树腊同金属离子叠合，然后对氮蓁酸进行拆分的 研究较多 t a 删。s i e g e l 和d e g e n s 细町用c h e l e x l o o - - c u = * 配体树脂从海水中提取 a 一氨基酸，并发现f e 3 + 对酸性和疏水性氨基黧具有较高的亲合性。另外两类能 同过渡金属离子配位的树脂是含羧基( b i o - r e x 7 0 ) 和含磷酸功能基( b i o r e x 6 0 ) 表1 6离子交换膜分离氨基酸实例 m e m b r a n ea m i n oa c i d s r e f e r e n c e 8 c a t i o n i c a l l yc h a r g e d m e m b r a n e sn e u t r a la m i n o 5 2 a c i d s i o ne x c h a n g em e m b r a n e sa l a 5 3 f i b r o i nm e m b r a n e sm i x t u r eo fa m i n o 5 4 a c i d s l i q e m u s i o nm e m b r a n e s p h e 5 5 s u l f o n a t e dp o l y s u l f o n ea c i d i ca m i n oa c i d s 5 6 u l t r a f il t r a t i o nm e m b r a n e s c h a r g e dp o r o u sm e m b r a n e s m i x t u r eo fa m i n o 5 7 a c i d s b i p o l a rm e m b r a n ew h i c hc o m p r is eaa s pp h e 5 8 c a t i o nl a y e ra n da na n i o nl a y e r v a r i o u se x t r a c t a n t m e m b r a n em i x t u r eo fa m i n o 5 9 c o m b i n a t i o na c i d s l i q s u r f a c t a n tm e m b r a n e s ( l s m )h y d r o p h o b i c a l l y 6 0 a m i n oa c i d s e 1 e c t r o d i a l y e rc h a m b e rb o u n d e db ya m i x t u r eo fa m i n o 6 1 c a ti o ne x c h a n g em e m b r a n ea n da na c i d s a n i o ne x c h a n g em e m b r a n e m e m b r a n e sc o m p le x e dw jt hc o p p e rh i s 6 2 i o n s i o ne x c h a n g em e m b f a n e sm i x t u r eo fa m i n o 6 3 6 4 a c i d s 6 5 3 6 6 c h a r g e do r g 一i n o r g n a n o f i l t r a t i o n m i x t u r eo fa m i n o 6 7 m e m b r a n e sa c i d s 博 的树脂。d o u r y b e r t h e d 和p o i t r e n a u d 徊5 1 曾就此两种树脂的c u 2 + 盐树脂对蛋白 水解液中的1 8 种氨基酸进行分离，并与c h e l e x l o o - c u 2 + 进行比较，发现b i o - r e x 7 0 一c u “具有较好的结果。对分离条件进行实验发现，当氨基酸性质相近时， 流动相中c u 2 + 含董越低，分离效果越好。对中性氨基酸采用低c u “含量和低氨 水浓度洗脱时分离效果较好。 近年来应用配体树脂分离氨基酸的研究结果列于表1 7 中。 表1 7 应用配体树脂分离氨基酸的实例 r e s i n sa n dm e t a li o n sa m i n oa c i d sr e f e r e n c e s o o w e x5 0 x 一1 0 一c u 2 +l - a l an l p r ol - t h r 8 6 a m i n og r o u p c o n t g r e s i n s c u 2 +l e ui l e 8 7 a m b e r lit ei r 一1 2 0 c u ”m i x t u r eo fa m i n oa c i d s 8 8 s u m i c h e l a t er e s i nm c 一7 6 一c o “i l el e u 8 9 a m b e r l i t ei r 一1 2 0 c u 2 +m i x t u r eo fa m i n oa c i d s 9 0 ( m n ”，f e “，z n 2 + ) s u m i - s e p a r ea s - 1 3 _ c u 2 + ( c 0 2 + ) m e t c y s 9 1 s u m i - s e p a r e a s - 1 3 - c u ”l e u1 1 e 9 2 3 1 4氨基酸的分析方法 早期的氨基酸分离分析主要采用纸色谱法和薄层色谱法 9 ”，二者原理相 似，均是由于不同的氨基酸在展开荆中有不同的分配系数，移动速率不同，从 而达到分离。经与茚三酮显色后，可进一步进行定性分析或定量测定阳“。 随着离子交换技术的发展，现在广泛采用氨基酸自动分析仪5 ”对氨基酸 进行分离分析，其原理是利用各种氨基酸的酸碱性，极性和分子大小等性质的 不同，使用阳离子交换树脂在层析柱上进行层析，被洗脱下来的氨基酸与茚三 酮显色，进行定量分析。目前出产的各种型号自动分析仪可测定仅含0 0 0 5 微 克分子氨基酸的样品，一般2 小时就可完成一次测定。图1 3 和1 4 分别为贝 克曼1 2 1 型氨基酸自动分析仪的实验操作流程及其色谱图。 1 7 兜 密 度 毙 密 成 洗脱渣体积( 毫升) 曙l 一掘音钮葛艘拉馥酿型难苯乙烯辩脂上进行屡拼t 1 的情况 分离过程熏在蟹篮艘自础分所杖冉进行，艇拇雄三一厦应柞定量捌定j f ii g 动记录姨t 记录5 7 0 m 址的光密度韭化 引自d h s p a c k m a n ，w h s o = i a ，a t t ds m 0 0 1 e a n a l ( ：r e m ，3 0 ，1 1 9 0 1 9 5 8 ) c o p y r i g h t 1 9 5 8 b 、l h ea m e r i c n nc b e m i c a s c l c i e tr ) 随着生化技术的发展，毛细管电泳成为近年来发展最快的一种分离分析新 技术1 ， 岛效毛细管咆泳( h i g hp e r f o r m a n c e c a p i l l a r y clo c ir o p h o r e s i s ，h p c e ) 是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管l | 按其 淌度或和分配系数小i 司进行高效，快速分离的一种电泳新技术。h p c e 最基本 一j 仪器结杉j 如】吲1 5 月i j i 。 图l5 毛细管| 电泳基本仪器结构示意嘲 h v 高压电豫o 寸3 0 k v ) ，c 量细萝j 。# 一电爨零e 0 - 。 f i 电极，骁在桂 检测器；s 样品 d r , 数据采集处理系统 i hr 。邑细锊j 女仃良好的散热效能，允许在毛细管两端加上高至3