（分析化学专业论文）偏中性ph敏感性的壳聚糖制备及其生物催化与生物分离应用.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 不同的p h 敏感高分子均有一个临界相分离p h 值( c r i t i c a lp h a s es e p a r a t i o n p hp o i n t ，简称c p p ) ，在此p h 值附近高分子发生溶解及沉淀的两相转化。本 论文以壳聚糖这种天然p h 敏感高分子为原料，通过过氧化氢氧化降解法改变壳 聚糖的分子量，以及采用偶联精氨酸的化学修饰方法对壳聚糖骨架进行一定的修 饰，使其p h 敏感点发生相应的变化，得到更接近于中性的临界相转变p h 值， 更加适应生物分析的环境条件；研究了壳聚糖修饰、壳聚糖与蛋白质及酶之间的 共价偶联、静电组装以及金属离子鳌合偶联等方法，并将所制得的偶联物应用于 蛋白酶抑制剂的捕获与纯化、蛋白质酶解，以及对蛋白酶的敏感性测定研究中。 本论文共分五章。 第一章分别介绍了p h 敏感性高分子材料，通过改变高分子分子量和骨架结 构达到改变p h 敏感点的目的，以及修饰过的p h 敏感性高分子与生物活性物质 的偶联方法等。 第二章用过氧化氢降解法制备不同分子量的壳聚糖，考察分子量对p h 敏感 点的影响。实验结果表明，壳聚糖的分子量越小，其p h 敏感点越高，从高分子 量壳聚糖到低分子量壳聚糖，大致提高了0 2 个p h 单位，在沉淀一溶解一次循 环后，临界相分离p h 值也有相应的提高，近0 0 2 个单位。 第三章以e d c n h s 为偶联试剂，将精氨酸偶联到壳聚糖上，考察改变壳聚 糖分子骨架对其p h 敏感点的影响。实验结果表明，在p h = 4 6 的m e s 缓冲溶液 中，e d c n h s 与精氨酸摩尔比大于1 时，偶联效果较好。适当的增加反应浓度 可提高偶联效果。壳聚糖经精氨酸修饰后c p p 明显提高，与未修饰前的壳聚糖 相比，c p p 值提高了近乎1 2 个p h 单位，更能适应生物分析与分离。 第四章探讨了生物活性分子与修饰过的壳聚糖偶联方法，比较了几种方法的 偶联效率。其中，共价偶联的方法能将胰蛋白酶有效地偶联到壳聚糖分子上，保 留了c s 的p h 敏感相分离特性及t r y p s i n 的酶催化活性，偶联物在存放3 0 天后 可保留6 9 的初始活性。偶联物经过6 次循环使用后的残余活性为初始活性的 7 9 。以静电方式结合的壳聚糖与b s a ，在p h = 6 0 的时候，就能达到很好的偶 联效果。用配位方式结合的壳聚糖金属离子与胰蛋白酶，只能保持l o 左右的活 t v 浙江大学硕士学位论文 性，偶联效果不甚理想。 第五章探讨了胰蛋白酶一壳聚糖偶联物对胰蛋白酶抑制剂及底物b a p a n 的 催化活性影响，以及a r g c s b s a 静电组装复合物对胰蛋白酶的水解效率。其中， t r y p s i n 与c s 偶联物同时具备了酶催化活性和p i 敏感的相分离特性，使之兼具 均相酶催化的高效特性及固定化酶的的高稳定性和重复使用性，在低于临界相转 变p h 值下进行高效的均相酶解反应，并在高于临界相转变p h 值下将t r y p s i n c s 进行沉淀分离及重复使用，利用复合物的溶解一沉淀可逆特性，可实现均相生物 催化反应、选择性识别与结合，及异相分离。该偶联物能有效捕获酶抑制剂，起 到分离纯化的作用。作为蛋白质降解试剂则可有效消除胰蛋白酶均相催化时自身 酶解产生的肽段对目标蛋白肽谱分析的干扰。此外，a r g c s b s a 复合物对胰蛋 白酶有响应，酶的活性越大，复合物粒子消失速度越快，因此可以直观通过浊度 法来测定试样中胰蛋白酶的活性，从而提供一种新的蛋白酶活性测定方法。 关键词：p h 敏感高分子，壳聚糖，共价偶联，静电组装，b s a ，胰蛋白酶 v 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t p h s e n s i t i v ep o l y m e rm a t e r i a l sa l eo n ek i n do fi m p o r t a n t s m a r t m a t e r i a l s ， w h i c hh a v eac r i t i c a lp h a s es e p a r a t i o np hp o i n t ( r e f e r r e dt oc p p ) i no r d e rt op e r f o r m e f f i c i e n tb i o a f f i n i t y c a p t u r ea n db i o c a t a l y s i sb yu s i n gp hr e s p o n s i v ep o l y m e r c o n j u g a n t ，p o l y m e r sw i t hn e a rn e u t r a lc p pv a l u ea n df u n c t i o n a lg r o u pf o re a s y m o d i f i c a t i o na l eh i g h l yd e s i r e d c h i t o s a n ，an a t u r a lp o l y m e r 、i t hp k av a l u eo f6 3 ， h a sb e e nr e c o g n i z e da sap hs e n s i t i v ep o l y m e rs i n c ei th a sal a r g en u m b e ro fa m i n o g r o u p so ni t sp o l y m e rb a c k b o n e i nt h i sp a p e r , w eu s e dt w om e t h o d st oi n c r e a s et h e c p pv a l u e so ft h ec h i t o s a np o l y m e r o n ew a st o d e g r a d et h ec h i t o s a nm o l e c u l a rt o o b t a i nt h el o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ( l m w c ) ，t h eo t h e rw a st om o d i f yt h e c h i t o s a nw i t ha r g i n i n e ，w h i c hh a sar e l a t i v eh i g h e rp k av a l u e t h em e t h o df o r p r e p a r a t i o no fl m w ca n da r g i n i n em i d i f i e dc h i t o s a n ，a sw e l la st h em e t h o df o r c o n j u g a t i o nw i t hp r o t e i na n de n z y m e ，w a se s t a b l i s h e d f i n a l l y , t h ec o n j u g a n to f c h i t o s a na n dm o d i f i e dc h i t o s a nw i t hb i o l o g i c a lm o l e c u l e sw e r ea p p l i e di nt h ec a p a t u r e o ft r y p s i ni n h i b i t o r s ，p r o t e a s e a c t i v i t yd e t e r m i n a t i o na n dp r o t e i nd i g e s t i o nf o r p r o t e o m i cr e s e a r c h i nc h a p t e ro n e ，r e c e n tw o r k sr e l a t e dw i t hp h s e n s i t i v ep o l y m e rm a t e r i a l s ，s u c ha s t h em e t h o df o rc h a n g i n gt h ec p pv a l u ea n dt h ep r e p a r a t i o no f p h s e n s i t i v ep o l y m e r c o n j u g a n tw i t hb i o l o g i c a lm o l e c u l e sw e r er e v i e w e d i n c h a p t e rt w o ，c h i t o s a nw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tw a sp r e p a r e db y o x i d a t i v ed e g r a d a t i o nm e t h o d ，i nw h i c hh y d r o g e np e r o x i d ew a se m p l o y e da st h e o x i d a n t a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em o l e c u l a rw e i g h ta n dc p pv a l u ew a s d i s c u s s e d r e s u l t ss h o w e dt h a t ，h i g h e rc c pv a l u ec l o s i n gt on e u t r a lp hp o i n tc o u l db e o b t a i n e dw i t ht h el o w e rm o l e c u l a rw e ig h tc h i t o s a n i n c h a p t e rt h r e e c h i t o s a nw a sm o d i f i e d w i t ha r g i n i n eb yu s i n g1 一e t h y l 一3 一 ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e ( e d c ) a n dn h y d r o x y s u c c i n i m i d e ( n h s ) a s c o u p l i n ga g e n t s t h er e s u l t i n gp r o d u c tw a sc h a r a c t e r i z e dw i t hf t i ra n de l e m e n t a r y a n a l y s i s t h ee x p e r i m e n t a ld a t ar e v e a l e dt h a tt h ec p pv a l u eo ft h em o d i f i e dc si s v i 浙江大学硕士学位论文 d i r e c t l yr e l a t e dw i t ht h es u b s i t i u d ed e g r e eo fa r g i n i n eo nc h i t o s a nb a c k b o n d t h e h i g h e rs u b s t i t u t ed e g r e el e a dt oai n c r e a s e dc p p v a l u eo ft h i sc o n ju g a t e c h a p t e rf o u rp r e s e n t e ds e v e r a lc o u p l i n gm e t h o d sb e t w e e nt h ec h i t o s a na n dt h e b i o l o g i c a lm o l e c u l e s ，i n c l u d i n ge l e c t r o s t a t i ca s s e m b l y , c o v a l e n ta t t a c h m e n ta n dm e t a l c h e l m i n gc o u p li n g c o n ju g a t i o no ft h ec h i t o s a no rm o d i f i e dc h i t o s a nw i t hp r o t e i no r e n z y m ew a sc o n f i r m e db yc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e ，e n z y m ea c t i v i t ya s s a y ，a n dg e l p e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( g p c ) i nc h a p t e rf i v e ，w ed i s c u s s e dt h ee f f e c to ft h ee n z y m el n h i b i t o r sa n db a p a no n t h ec s - t r y p s i nc o n j u g a t e ，a n dt h es e n s i t i v i t yo ft r y p s i nt ot h ec s - a r g c - b s a c o n j u g a t e w ef o u n dt h a tt r y p s i n c sc o n j u g a n tc o u l dc a t a l y z et h ed e g r a d a t i o no f p r o t e i ni nh o m o g e n e o u sp h a s ew h e nt h ep hw a sc o n t r o l l e di n l e s st h a nc p pv a l u e ， a n dc o u l db es e p a r a t e df r o ms o l u t i o nb ya d j u s t i n gt h ep ht ob eh i g h e rt h a nc p p h p l cr e s u l t ss h o wt h a tt h es e l fd e g r a d a t i o no ft r y p s i nw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e da n d t h ei n t e r f e r e n c ef r o mt h es e l f - d e g r a d e dp e p t i d ec o u l db ee l i m i n a t e di nt h ep e p t i d e f r a g m e n tm a p p i n g f u r t h e r m o r e ，t h ea r g - c s b s ac o n j u g a n tw a ss e n s i t i v et ot h e t r y p s i n ，a n di tp r o v i d e dan e w m e t h o dt od e t e c tt h ea c t i v i t yo f t r y p s i n k e y w o r d s ：p hs e n s i t i v ep o l y m e r s ；c h i t o s a n ；t r y p s i n ；b s a ；e l e c t r o s t a t i ca s s e m b l y ； c o v a l e n ta t t a c h m e n t v i i 浙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝堑太堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：孚0 移乞 签字日期： 刎吕年l ，月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权浙江大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：昙弗砖垒 导师签名： 签字日期：矽略年月( 日 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 一6 6 一 修 w 年6 其弓日 电话： 邮编： 浙江大学硕士学位论文 第一章：文献综述 1 1 研究背景 智能材料是对环境可感知、可响应并具有功能发现能力的新材料，如温度敏 感性、光敏性( 可见、紫外或射线等) 、p h 敏感性材料等。由于它在物料分离、 药物控制释放、固定化酶、免疫分析等新型材料中有潜在应用价值，因此其研究 令人注目。但受原料( 单体等) 限制，目前研究较多的温度响应性高分子材料大多 是非离子型水溶性聚合物，如聚异丙基丙烯酰胺( p n i p a m ) 、聚氧化乙烯( p e o ) 、 聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 等；p h 敏感性材料以羧基阴离子聚合物居多：对温度、p h 双敏感性聚合物的研究也时有报道，其热点主要集中在新型聚合物的合成及应用 性能的研究。 对于p h 敏感高分子来说，通过调节环境刺激因素，能使之在一定条件下溶 解，而在另一条件下沉淀雎3 。利用这一特性，该类型材料在生物活性大分子的分 离呤3 、酶的固定化h 刊、免疫分析n 吲、药物的控制释放以及生物传感器旧3 等方面得 到应用。 不同的p h 敏感高分子均有一个临界相分离p h 值( c r i t i c a lp h a s es e p a r a t i o np h p o i n t ，简称c p p ) ，在l l t p h 值附近高分子发生溶解及沉淀的两相转化，通过p h 的调控实现均相反应、异相分离。在生物分离与分析应用领域，接近于中性的临 界相转变p h 值是该类高分子材料的理想特性，因为大多数生物分子在偏中性条 件下能保持最大的活性。 比如，应用于免疫分析时，要求p h 敏感高分子在溶液p h 7 4 左右波动时做出 响应，过多偏离生理p h 会对免疫反应生成的抗原一抗体复合物造成不同程度的 破坏目前，p h 敏感高分子并未在免疫分析中广泛应用，这主要是由于高分子 的相转变p h 大多在4 或1 0 左右。p h 敏感高分子均含有酸性基团( 如羧酸、磺酸) 或碱性基团( 如铵盐) ，可通过接收或释放质子响应外界环境变化，使溶解度发生 改变n0 | 。曾有工作者以n 一异丙基丙烯酰胺( n i p ) 和甲基丙烯酸( m a a ) 合成了3 7 一v p h c p p 在5 6 的p h 敏感高分子，并应用于乙肝表面抗原的分析3 。另外有报 道，引入疏水性共聚单体，可以使高分子的p h u 向中性移动，据此在上述高分子 中，引人少量疏水性单体甲基丙烯酸丁酯( b m a ) ，发现p h 。，提高到了6 0 。将其 一1 一 浙江大学硕士学位论文 用作免疫反应的载体，进行兔血清中免疫球蛋白( i g g ) 的测定，结果满意引。 因此得到一个在中性范围的p h 敏感点对生物分析研究有重大意义。 1 2p h 敏感性高分子材料 p h 敏感性高分子材料- f i 因p h 值的变化而产生体积或形态改变。这种变化是 基于分子水平及大分子水平的刺激响应性，具有可重现特性。由于它性质特殊， 并具有广泛的用途，引起了国内外许多专家、学者的重视，并致力于开发这一类 材料。 1 2 1 p h 敏感性高分子材料的机理探索 t a n a k a 把诱导凝胶体系发生相转变的分子问作用归纳为四类：疏水作用、范 德华力、氢键、离子间作用力n 引。这四种作用力被公认为是引发智能凝胶敏感响 应的原动力。在p h 敏感的水凝胶中四种作用力共同起作用引发p h 敏感性，其中 离子问作用力起主要作用，其它三种作用力起到相互影响、相互制约的作用。一 般来说，具有p h 响应性的高分子中含有弱酸性( 弱碱性) 基团，随着介质p h 值、 离子强度改变，这些基团发生电离，造成高分子内外离子浓度改变，并导致大分 子链段间氢键的解离，引起不连续的溶胀体积变化或溶解度的改变。低p h 时， 聚酸类凝胶的羧酸基团不解离，凝胶相对不溶胀，随着p h 的升高，羧酸基团解 离，电荷密度增大，聚合物溶胀；聚碱类凝胶正好相反，即溶胀度随p h 降低而 增大。 1 2 2p h 敏感性高分子材料的分类 p h 敏感性高分子材料的种类很多，可分为聚酸类p h 敏感性高分子材料和聚 碱类p h 敏感性高分子材料两大类。 一2 一 浙江大学硕士学位论文 1 2 2 1 聚酸类p h 敏感性高分子 在聚酸类p h 敏感性高分子材料中，最典型的例子就是丙烯酸类聚合物。丙 烯酸类高分子含有可离子化的c o o h 基团，是研究人员研究得较为成熟的一类 p h 敏感性高分子材料。 ( 1 ) 丙烯酸类共聚物 以甲基丙烯酸为基础共聚的阴离子型水凝胶、阳离子型水凝胶和两性水凝胶 都具有p h 敏感性，两性水凝胶在整个p h 范围内都有一定的溶胀比，且在p h 中性 时，其溶胀速度要高于相应的阴离子型和阳离子型水凝胶。聚( 丙烯酸) 一c o 一( 丙 烯腈) 和聚( 丙烯酸) 一c o 一( n 一异丙基丙烯酰胺聚合物) 两种水凝胶都具有温度 及p h g j 0 重敏感特性。这种特性对于水凝胶在药物控制释放领域中的应用具有较 大的意义n 4 | 。 ( 2 ) 丙烯酸类接枝物 丙烯酸接枝的p h 敏感性功能膜研究也很广泛，几乎所有聚合物功能膜都可 用于接枝丙烯酸，关键在于对膜进行活化处理，产生活化点，从而引发丙烯酸的 聚合。目前常用的活化处理方法有：化学改性、等离子体引发、电流辉光放电和 紫外光辐射等n 5 1 引。 ( 3 ) 丙烯酸类i p n 结构 把互穿网络聚合物( i p n ) 技术引入丙烯酸类p h 敏感性高分子的研究是另一 个研究热点。i p n 水凝胶具有异于共聚物和接枝聚合物的性能。p v a p a a 互穿网 络结构的水凝胶溶胀性可由p h 值和温度控制n 7 侧，将其用于包覆消炎痛的释放研 究，发现在p h 、温度作用下，药物的释放是以脉动方式进行的。 ( 4 ) 丙烯酸类复合物 很多生物体内的反应以及生物化学合成过程都是通过高分子复合物进行的， 因此对高分子间相互作用及其聚集体形成机制和性质的研究受到了人们极大重 视。p m a a 明胶和p a a 明胶复合物可作为p h 敏感凝胶控制释放蛋白质n 引。包 覆模型蛋白质( 肌球素、细胞色素、胃蛋白酶) 的效率都在8 0 以上，并且蛋白质 的释放在极窄的p h 范围内( 0 5 ) 进行。这种高效的包覆和很好的p h 敏感性来源于 蛋白质和阴离子聚合物及明胶的静电相互作用力。 ( 5 ) 其它聚酸类p h 敏感性高分子 一3 一 浙江大学硕士学位论文 按照p h 敏感性机理，在高分子中引入弱酸性基团即有可能得至i j p h 敏感的高 分子材料。d i r kk u c k 1 i n g 等晗们通过把p n i p a m 和丙烯酰胺衍生物( 带上羧基并用 不同问隔碳链连接) 共聚，得到了温度和p h 敏感的共聚物。ab e n r e b o u h 等晗门采用 自由基溶液聚合法合成了包含有胆酸链段的p n i p a m 共聚物，此聚合物同时具有 热敏和p h 敏感性能，且具有了生物相容性。此外，p e t e rm a r k l a n d 等他2 3 合成的新 型交联聚( l 一谷氨酸) 和聚乙二醇聚合物的多肽水凝胶，具有生物降解性、高亲 水性和对p h 敏感的溶胀性。采用溶解酵素做水凝胶的药物控释试验表明有很好 的效果。 1 2 2 2 聚碱类p h 敏感性高分子 ( 1 ) 壳聚糖类聚合物 k c g u p t a 等用糖胶、壳聚糖、戊二醛制备了交联微球，用于控释模型的 研究。发现p h 值对微球溶胀有影响，用维生素b 1 一h c l 作为模型药物进行控释试 验表明这种模型具有应用潜力。把i p n 结构引入壳聚糖的研究也很多。交联的壳 聚糖聚醚半互穿网络水凝胶在不同p h 缓冲溶液中具有不同的溶胀行为陋引。交联 壳聚糖蚕丝蛋白半互穿网络结构聚合物中形成了强烈的氢键作用，也显示出良 好的p h 及离子敏感性心5 1 。壳聚糖的n h 2 可与果胶的c o o h 基团形成电解质复合 物( c s p t n p i c ) 从而制备出分离膜，其溶胀行为的p h 依赖性为在p h ( 2 和p h 7 时明 显溶胀。此分离膜全由生物大分子构成，可望用于精制生物产物的超滤膜，进行 蛋白质的分离与精制。 ( 2 ) n ，n 二烷基氨烷基丙烯酸酯类聚合物 n ，n 一二烷基氨烷基丙烯酸酯类聚合物由于含有氨基，可质子化从而产生碱 性基团。其p h 敏感响应范围与丙烯酸类高分子相反，在碱性范围内。据报道， 此类聚合物与d n a 具有较好的亲合性，在生物医学材料上有着广泛的应用前景， 因此作为p h 敏感性材料，它也被广泛的研究。甲基丙烯酸烷酯( n a m a ) 与二甲 基氨乙基丙烯酸酯( d m a ) 轻度交联形成的凝胶在4 k 乇p h 环境时，叔胺基团质子化 引起凝胶溶胀，而在高p h 环境时叔胺基团失去质子，凝胶收缩。s o o nh o n gy u k 等堙6 删合成了聚n ，n 一二甲氨乙基甲基丙烯酸酯( d m a e m a ) 一( 3 0 一丙烯酰胺 ( a a m ) 、聚n ，n 一二甲氨乙基甲基丙烯酸酯( d m a e m a ) 一c o 一乙基丙烯酰胺( e a a m ) 一4 一 浙江大学硕士学位论文 两种共聚物，都具有p h 、温度双重敏感性。把p ( d m a e m a c o - e a a m ) 体系应用 于响应葡萄糖控释胰岛素的研究中，取得了较好的效果。 1 2 3p i t 敏感性高分子材料的应用前景 1 2 3 1 药物控制释放 在过去的2 0 多年中，药物控制释放已成为一个重要的医药研究领域。自调式 释药系统是利用体内的信息反馈控制药物的释放，不需外界的干预。由于胃肠道 被划分为几个不同的p h 区域，利用p h 的改变来调节释放速率即是其中一种重要 方式。其释药机制主要有p h 敏感型聚合物的溶蚀、溶胀，p h 敏感型聚电解质的 构象改变等汹3 。丙烯酸类高分子是应用研究最多的p h 敏感性高分子材料3 。德 国r o h m 公司产的e u d r a g i tl 和e u d r a g i ts 使用甲基丙烯酸与丙烯酸甲酯摩尔比为 1 ：1 或1 ：2 的共聚物为包衣载体，这种共聚物在胃液酸性环境中能保存3 - 4 h ， 进入肠道后迅速溶解或崩溃，具有良好的缓释效果。 1 2 3 2 酶的固定 酶的固定是一个新兴的生物领域，贺枫等报道了一种新的制备溶解性可调节 的固定化酶的方法。先将木瓜蛋白酶与n 羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯( n a s ) 反应， 再利用自由基溶液聚合反应，制备t p h 敏感相分离的固定化木瓜蛋白酶。这些 固定化酶均具有较敏感相分离的特性，兼有溶液酶和固相酶两者的优点。但不足 的是，固定化过程中的p h 值、反应时间及给酶量对固定化木瓜蛋白酶活力有影 响。 1 2 3 3 生物大分子分离 将多孔性高分子膜的边缘固定在一个圆形环上，当p h 值变化时，膜就会收 缩或膨胀，从而改变膜孔径的大小，控制物质的分离。在色谱分离方面，应用最 多的是蛋白质的分离精制。m i y a m a 等矛n k i m u r a 等人分别用聚丙烯腈的接枝共聚 物和聚砜的衍生物制成两大类阴、阳离子型超滤膜，通过控佑t p h 值来分离蛋白 质及分子量相近的大分子。 一a 一 浙江大学硕士学位论文 1 2 3 4 化学机械 利用p h 敏感性高分子材料的溶胀一退溶胀可以实现机械能一化学能之间的转 换。ak a t e h a l s k y 铝1 备了一种三维网络结构的p a a 或p m a a ，制成膜或长丝，能 在水中溶胀，加入酸或碱，膜或长丝可逆地收缩或膨胀，可提起或放下一定的负 荷。 1 2 3 5 其它应用 p h 敏感性高分子材料还可以用于免疫分析、高精密度仪器、自动化生产、 国防工业等领域，它可作为p h 敏感电极、p h 传感器、p h 执行器等。 1 3 临界相分离p h 值的改变 溶解性受p h 值影响的高分子化合物有一个敏感临界p h 值，在此值附近发生 溶解与沉淀的可逆性变化。这类高分子化合物的p h 敏感相分离特征使其成功地 应用于固定化酶的研究呤0 。3 ，实现了均相催化反应及酶与产物的异相分离。将其 用于免疫分析，可使抗原抗体的特异反应在溶液中进行，调节高分子载体的溶解 性，实现与游离标记物的分离。这种分析模式可望包含均相免疫分析反应速度快 及异相免疫分析灵敏度高的特点，发展新的免疫分析方法，在临床诊断及环境分 析等领域有定的应用前景。 由于是在生物分离与分析应用领域，而大多数生物分子在偏中性条件下能保 持最大的活性，所以为了适应生物分析实验中反应体系偏中性的要求，很多研究 工作在改变高分子临界相分离p h 值上展开，并且取得一定的成绩。 以下，从改变高分子骨架和高分子分子量两个途径改变临界相分离p h 值进 行探讨。 1 3 1 改变高分子骨架 通过改变高分子的骨架，使其临界相分离p h 值适应与相应的生物分析研究。 目前研究成果举例如下： 一6 一 浙江大学硕士学位论文 1 3 1 1 丙烯酸类及其衍生物 ( 1 ) 聚( 甲基丙烯酸一c o 一异丙基丙烯酰胺) p h 敏感高分子的临界相转变p h 值对高分子是否能用于免疫分析非常重要， 临界p h 值越接近中性越好，且发生相变的p h 值范围越窄越好。 将 异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸共聚旧2 侧，合成了3 7 。c 下相转变p h 值在 5 6 左右且性能优良的p h 敏感高分子p ( n i p c o m a a ) ，以其作为免疫反应载体， 建立了乙肝表面抗原的p h 敏感相分离荧光免疫分析系统。 通过调节p ( n i p c o m a a ) 中n i p 与m a a 的物质的量的比制备所需的p h 敏感 高分子。实验结果表明，当溶液p h 值低于5 6 1 j c j - ( 3 7 。c ) ，高分子很快从溶液中沉 淀出来，而当溶液p h 值大于6 1 时，高分子则又很好地溶于水，非常适合用于免 疫分析n 引。 ( 2 ) 聚 甲基丙烯酸c o 一页烯酰胺- c o ( 丙烯酰基一抗体) 聚 甲基丙烯酸c o 一丙烯酰胺一c o ( 丙烯酰基一抗体) 的溶解一沉淀临界p h 值 p h 敏感高分子在溶液中相变化的临界p h 值决定于高分子的结构。 在此三元共聚物中由于丙烯酰基一抗体这一组份很少，所以临界p h 值决定于 甲基丙烯酸和丙烯酰胺的比例，改变这一比例就可以改变临界p h 值。一般来说， 总希望临界p h 值靠近中性，李增吉等似朝研究了聚( 甲基丙烯酸一c o 一丙烯酰胺- c o - 顺丁烯二酸酐) 的p h 敏感性，发现当甲基丙烯酸和丙烯酰胺按1 ：1 投料时临界p h 值达到最高，为3 8 。经检测，聚 甲基丙烯酸一c o 一丙烯酰胺一c o ( 丙烯酰基一抗体) 的溶解一沉淀临界p h 值也在3 8 附近。而且当p h 值为3 4 时，沉淀已趋完全，表明 共聚物对溶液p h 值的变化有较为敏感的特性m 1 。 ( 3 ) 聚丙烯酰氧肟酸酯 据报道呤7 瑚1 ，含氧肟酸酯基团( c o o n h c o ) 的高分子材料，在酸性水溶液中 稳定但在偏碱性条件下易溶蚀，且其溶蚀速度的突跃点在p h 7 4 左右。 有研究通过化学方法合成具有p h 敏感降解性的聚丙烯酰氧肟酸酯，利用其 在生理p h 条件下迅速的降解性能使药物释放具有p h 敏感性，从而得到一种理想 的口服肠溶新型载体材料，并以水溶性小分子和大分子物质，即曲利本蓝( t b ) 和牛血清白蛋白( b s a ) 分别作为模型药物，考察以该聚合物为载体的给药系统的 释药行为碡9 | 。 一7 一 浙江大学硕士学位论文 1 3 1 2 壳聚糖类及其衍生物 p h 敏感型可生物降解药物控释系统壳聚糖是阳离子聚合物，其g e l 一s o l 转变的 临界p h 值为6 2 ，高于此值会变成含水的凝胶状物体。因而基于壳聚糖的控释系 统是p h 敏感型药物控释系统的研究热点n 。 壳聚糖中的碱性氨基可进行多功能基( 氨基、羟基) 化学反应和立体结构修 饰，而这种化学修饰可改善聚合物的某些性能，如生物适应性、生物降解性、p h 敏感型原位胶凝性等。 q u 等卜4 2 1 利用自催化反应将d ，l 一聚乳酸接枝于壳聚糖上制得p h 敏感水凝 胶。这种水凝胶是通过疏水性侧链的聚集和亲水主链的氢键的分子内部作用引起 的所谓“假交联”作用形成的。在水性溶液中，这种接枝共聚物由于其疏水侧链 的聚集作用能够形成智能p h 敏感水凝胶。其溶胀过程因引入了适量聚乳酸形成 的疏水性侧链而得以控制，即可以控制水凝胶的g e l s o l 转变的临界p h 值。 李文俊等h 3 1 以壳聚糖以及聚丙烯酸( p a a ) 为原料，制成了一种新型的以壳聚 糖和聚丙烯酸之间所形成的聚电解质配合物为基础的s e m i i p n 水凝胶膜， s e m i i p n 中交联组分为壳聚糖。实验证明，该水凝胶膜不仅对p h 的变化非常敏 感，而且对离子也显示出特殊的刺激响应性，这些功能使其在药物控制释放体系 的应用提供了可能。 姚康德等口以壳聚糖与明胶构建的杂混聚合物网络具有p h 值响应性，以其 开发的药物控制释放体系能够根据胃及十二指肠p h 值的差异，定位释放药物有 效发挥药物疗效，抑制药物毒副作用。 另外，壳聚糖水凝胶中引入羧甲基后，其溶胀行为发生变化，最明显的是最 低溶胀度从p h 7 o 移l 甸p h 3 o 处；其表面结构也变得粗糙，预示分子问作用力加 强；红外分析证明，上述现象是由羧甲基引入后导致的分子间作用力形式的变化 引起的。上述现象表明，羧基引入壳聚糖水凝胶中，可以调节其溶胀行为，拓宽 其在药物释放等领域的应用p h 范围n 5 i 。 1 3 1 3 其他 聚膦腈是一族较新发展起来由交替的氮、磷原子以交替的单键、双键构成主 链，有机基团作为侧基的高分子，具有强大的侧基功能化特性。邱立焱等n 鄙采用 一8 一 浙江大学硕士学位论文 亲核取代引入侧基再进一步修饰的方法合成了一种新型的可降解聚膦腈一聚膦腈 药物控释系统。这种聚合物降解行为表现出强烈的p h 响应性，即聚合物的降解 在p h 为6 0 7 4 2 _ 问迅速加快，这类聚合物可望作为肠定位口服药物控释制剂的 载体材料。 杜鹃等h 6 1 制备了含聚1 ，3 一二氧戊环链段具有p h 敏感性可解体聚合物凝胶网 络的水凝胶控释系统。随着网络中丙烯酸含量的增加，网络在c h 2 c 1 2 一h 2 0 中的 溶胀度逐渐减小，而在c h 3 0 h 中溶胀度则随着网络中丙烯酸含量的增加而增大。 中国广泛应用的肠溶性包衣材料溶解的p h 值较高，如羟丙基甲基纤维素酞 酸酯( h p m c p ) ( p h 5 0 - - - 5 8 以上、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯( h p m c a s ) p h 5 5 7 1 以上、丙烯酸树脂i l 号( p h 6 0 以上) 及i i i 号( p h 7 0 以上) ，几乎 没有适合十二指肠定位的包衣材料。设计制备一种p h 敏感值在4 0 h i 右的包衣材 料，使药物在十二指肠开始释放，可提高此类药物的生物利用度。 用偏苯三酸酐和顺丁烯二酸酐对羟丙基甲基纤维素( h p m c ) 进行化学修饰， 通过改变原料的配比，得到一系列取代程度不同的羟丙甲纤维素偏苯三酸酯 ( h p m c t ) 和醋酸羟丙基甲基纤维素顺丁烯二酸酯( h p m c a m ) 。h p m c 溶液 在3 o 1 1 o 时很稳定。但当与顺丁烯二酸酐或偏苯三酸酐反应后，产物中因引 入羧基官能团而具有p h 敏感性。高分子化合物中羧基含量越高，则酸值越高， 能在较高的p h 下溶解，具有不同酸值的聚合物具有不同的敏感p h 值。对 h p m c a m 产物，顺丁烯二酸酐( m a ) 投料量增加，羧基含量增加，溶解p h 值 下降，而随醋酐( c a ) 投料量增加，通过与m a 竞争，反而会使羧基含量降低， 造成溶解p h 值增加。通过调节顺丁烯二酸酐与醋酐不同的比例，可得到p h 敏感 点在3 4 - 4 2 的不同产物7 | 。 1 3 2 通过改变高分子分子量 目前，通过改变高分子分子量来改变其临界相分离p h 值这方面的研究较少， 鲜有报道。 有报道称，聚( 甲基丙烯酸一c o 一丙烯酸乙酯) 高分子复合物中，当聚合物分 子量增大时，临界相分离p h 值减小，当聚合物分子量减小时，临界相分离p h 一9 一 浙江大学硕士学位论文 值增大m 4 9 1 。 1 4 壳聚糖简介 壳聚糖( c s ) 是最重要的天然医用高分子材料之一，其良好的生物相容性和 降解性，使其作为生物医用材料的研究备受关注。由于它的分子中有大量羟基和 氨基，极强的氢键使其仅溶解在酸性水溶液中，同时羟基和氨基又使它容易功能 化，随环境p h 值和离子浓度的变化，其结构随之改变，导致复合物性能出现相应 的响应，是制备环境敏感复合物的理想材料。 1 4 1 结构 壳聚糖( c h i t o s a n ) 化学名为聚( 1 ，4 ) 2 一氨基一2 一脱氧一1 3 一d 一葡聚糖，是甲壳 素部分脱乙酰化而得到的一种直链大分子生物多糖。壳聚糖的结构与纤维素很相 似，并且壳聚糖内的p 一( 1 ，4 ) 糖苷键也存在于纤维素中，不同的是纤维素i - 2 位碳的一o h 被一n h 2 取代，但它的性质却不同于纤维素。它们的结构如图1 1 。 甲壳素壳聚糖 图1 1 壳聚糖的结构 。 o h 纤维素 1 壳聚糖是一种天然的可再生资源( 像蟹和虾壳等) ，它可以通过人工养殖得 以增长。目前，实际应用的壳聚糖主要来源于甲壳素。甲壳素( c h i t i n ) ，又名 甲壳质、壳多糖、几丁质，壳蛋白，是自然界中储量仅次于纤维素的第二天然有 机化合物。甲壳素是壳聚糖最实用的资源。壳聚糖的来源丰富，而且具有优良的 生物相容性、生物可降解性和无毒性等特性，因此大大地推动了壳聚糖应用的发 一l o 浙江大学硕士学位论文 展。此外，壳聚糖分子中的活性氨基可与许多功能基反应，生成多种衍生物，这 些衍生物具有更优良的性能。 1 4 2 脱乙酰度 脱乙酰度( d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n ，缩写d d ) 是壳聚糖的一个重要性质， 它决定了多糖中自由氨基的含量。壳聚糖脱乙酰度高低，直接关系到它在稀酸中 的溶解能力，粘度，离子交换能力，絮凝性能和与氨基有关的化学反应能力，以 及许多方面的应用咖3 。测定壳聚糖脱乙酰度的方法有红外光谱法、酸碱电导滴 定法、气相色谱法和折光指数增量法。在这些方法中，紫外光谱法是既不破坏样 品又能精确测定壳聚糖脱乙酰度的方法，而酸碱电导滴定法是最简单而又不需特 殊仪器设备的方法口卜川。 1 4 3 平均分子量 天然甲壳素分子量通常大于l ，0 0 0 ，0 0 0 ，商业用的壳聚糖产品分子量一般在 1 0 0 ，0 0 一1 ，2 0 0 ，0 0 0 。这是由于在加工过程中，激烈的反应条件能导致壳聚糖降 解。壳聚糖分子量测定方法有凝胶渗透色谱法( 即g p c ) ，光散射法和粘度法等。 最常用的方法是粘度法，粘度法是测定壳聚糖分子量最简单和快速的方法。分子 量高低不同，对材料物理机械性能有直接影响，如成膜性及强度等此外，分子 量分布范围宽或窄，对材料物理机械性能影响很大。这是由于天然存在的甲壳素 有一定的分子量分布，另一方面，制备过程中各种因素也会影响分子量分布，尤 其是脱乙酰化时强碱和高温影响最大嘲1 。 1 4 4 溶解性 壳聚糖分子的立体规整性及分子问的氢健使它在多数有机溶剂，水，碱中难 以溶解，但由于有氨基，在稀酸中当h + 活度足够，使- - n h 2 质子化成一n h 3 + ，破 坏了分子间的氧健和立体规整性，使一o h 与水分子发生水合作用，导致壳聚糖 浙江大学硕士学位论文 分子膨胀而溶解驯。因此壳聚糖可溶于p h oom-i空i芍mexn亡山 浙江大学硕士学位论文 蛋白质是两性电解质，在特定的p h 溶液中所带正电荷恰好等于负电荷数， 此时蛋白质在电场中不再移动，此溶液的p h 称为该蛋白质的等电点。在通电情 况下，p h p l ，蛋白质带负电，向阳极移动，p h p i ，蛋白质带正点，向阴极移 动。b s a 的等电点为5 7 ，壳聚糖属于阳离子聚合物，由于含有氨基，在近中性 或酸性条件下带正点，鉴于壳聚糖在p h 大于6 2 0 后呈固态，因此在5 7 p