（动物学专业论文）包囊游仆虫不同时期超微结构变化及γ微管蛋白分布变化.pdf

顾立刚硕士学位论文答辩委员会成员名单 论沈锡祺教授华东师范火学 文 答 侯连生教授华东师范人学 辩 朱振勤教授华东师范大学 委 口 贝倪兵副教授华东师范大学 a 百 鲁心安副教授华东师范大学 成 口 贝 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：刎吼缒：幺，。 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名 日期： 6 ：l ! 导师签名 洌多 日期：! ：! 生) 论文摘要 包囊游仆虫不同时期超微结构变化及y 一微管蛋白分布变化 研究生姓名：顾立刚 学号：y s 0 2 2 6 1 0 2 0 专业名称：动物学 研究方向：细胞与分子生物学 导师姓名：顾福康 为揭示纤毛虫从休眠期到营养期转换过程中细胞超微结构的变化，以及y 一 微管蛋白分布的变化，应用常规透射电镜技术、扫描电镜技术、免疫荧光显微术， 对包囊游仆虫营养细胞、休眠细胞、脱包囊过程中的细胞，分别作了比较研究。 所得主要结果如下： 1 透射电镜揭示的超微结构变化 脱包囊过程中，包囊游仆虫包囊壁变薄断裂，特别是其内壁，如脱包囊过程 中期，内壁断裂为一些小的片断。大核内部结构变化较大：休眠期染色质颗粒不 均匀分布、核仁数量不多：脱包囊中期染色质颗粒分布均匀、核仁融合成膨大球 形，而且核膜上粘连的染色质减少；而在脱包囊后期和营养期，大核染色质颗粒 形状变得不规则，核仁数量增多。内膜系统经历一个逐步发达的过程，特别是内 质网，；并且出现一些未知的膜- f 生囊泡结构。线粒体在休眠期内部结构模糊、边 界不清晰、嵴的数量少；经过脱包囊过程恢复，直至营养期内部结构清晰、嵴数 量多。各种在形成包囊时退缩掉的纤毛结构，也逐步恢复。如脱包囊中后期围棘 毛篮外出现微管层；某些纤毛腔外，毛基体列基部微管柬变得发达。其它，如小 核没有明显变化，可能与休眠解脱过程联系不大。这些结果表明，细胞生理状态 的转换，伴随内部结构的巨大变化。对此的研究，为纤毛虫细胞休眠和脱包囊机 制的阐明提供了基础。 2 扫描电镜揭示的大核结构 营养细胞中，正常非分裂时期大核近似“c ”字型：而在d n a 复制期，大 核中间凹陷，形状变为“3 ”字型，两端各出现一个复制带。大核含有直径lu m 左右的染色质颗粒，它们是由直径约5 0 n m 的小颗粒组成。复制带也是由类似小 颗粒松散组成，靠近复制带的染色质颗粒正经历解体的过程。染色质颗粒以直径 约1 0 0 n r n 的纤维相连接。大核内部深处有复杂的骨架结构。对于休眠细胞和脱包 囊过程中的细胞，由于完整大核提取时的困难，未能成功观察到大核内部的结构。 营养细胞所得结果，比较与透射电镜观察到的大核内部结构，证实了大核染色质 的存在形式。迸一步有关休眠细胞和脱包囊过程中细胞大核的扫描电镜研究，将 加深对包囊解脱过程中大核染色质形态变化的认识。 3 免疫荧光显微术揭示y 一微管蛋白分布变化 营养细胞所有纤毛结构都显示强荧光，而大、小核无荧光。休眠细胞背面残 存微管结构显示为多列荧光组成的瓜纹状结构，每一列均由“v ”字形结构整齐 排列而成，由其下的连线串联起来；背腹交界处荧光较强：腹面无明显荧光。包 囊内部压缩后的口围带有强荧光。细胞脱出包囊过程中，背面瓜纹结构中间出现 断裂，并在此形成包囊脱出裂口。这些结果，与以往n 、b - 微管蛋白的分布研 究结果相一致，进一步了证实脱包囊过程微管蛋白的分布变化和去向。 关键词：纤毛虫；包囊游仆虫；营养细胞；休眠细胞；超微结构；y 一微管 蛋白 t h e c o m p a r a t i v es t u d y o nu l t r a s t r u c t u r ea n dy t u b u l i no f t h e v e g e t a t i v e c e l la n d r e s t i n gc y s t o f e u p l o t e se n c y s t i c u s t or e v e a lc i l i a t e s c h a n g eo fu l t r a s t r u c t u r ef r o mr e s t i n gc y s t st ov e g e t a t i v ec e l l s ，a n do ft h e l o c a t i o np a t t e r no f y t u b u l i n ，t h er e s t i n gc e l l s ，v e g e t a t i v ec e l l sa n de x c y s t i n gc e l l sw e r e s t u d i e da s e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，b yu s i n gt h e t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e ( t e m ) ， s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e n ) a n di m m u n o f l u o r e s c e n c e 1 t h ec h a n g eo fu l t r a s t m c t u r er e v e a l e db yt e m d u r i n g t h ep e r i o do fe x c y s t m e n t ，e u p l o t e se n c y s t i c u sc y s tw a l lu n d e r g oap r o c e s so f b e c o m i n g t h i n n e ra n d b r e a k i n g e s p e c i a l l y , t h e i n n e rl a y e ro fc y s tw a l lb r e a k si n t o p i e c e s t h ei n n e r s t r u c t u r eo fm a c r o n u c l e u s c h a n g e sg r e a t l y ：t h e c h r o m a t i n p a r t i c l e s o f c y s t a r en o tw e l l d i s t r i b u t e d ，a n dt h en u m b e ro fn u c l e o l ii sn o tl a r g e ；w h i l ei nt h em i d t e r mo fe x c y s t m e n t ，t h e c h r o m a t i np a r t i c l e sa r ew e l ld i s t r i b u t e da n dt h en u c l e o l i m e r g ei n t o al a r g e s p h e r e ，a n dt h e c 1 1 r o m a t i na t t a c h e dt ot h en u c l e a rm e m b r a n ed e c r e a s e ；i nt h el a t e rs t a g eo fe x c y s t m e n ta n di nt h e v e g e t a t i v es t a t e ，t h ec h r o m a t i np a r t i c l e sa r en o ts p h e r a la n ym o r e ，b u ti na l ls o r t so fs h a p e s ，a n d t h en u m b e ro fn u c l e o l ii n c r e a s e t h ei n n e rm e m b r a n es y s t e mb e c o m e sc o m p l i c a t e dg r a d u a l l y , e s p e c i a l l y t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms o m eu n k n o w nm e m b r a n o u ss t r u c t u r e s a p p e a r t h e s t r u c t u r eo fm i t o c h o n d r i a ea l s oc h a n g e sg r e a t l y t h ei n n e rm e m b r a n eo f c y s t sm i t e c h o n d r i a ei s v a g u ea n dm eb o u n d a r yl i n e sa r eu n c l e a r , a sc o m r a s tw i t ht h es t r u c t u r eo fv e g e t a t i v ec e l l s m i t o c h o n d r i a ew h i c hi sd i s t i n c ta n di t sb o u n d a r yl i n e sa r ec l e a r a tt h es a m et i m e ，t h en u m b e ro f m i t o c h o n d r i a er i d g e si n c r e a s e s t h ed e t e r i o r a t e dc i l i a t u r eo f c y s tr e c o n s t r u c td u r i n gt h ep e r i o do f e x c y s t m e n t f o re x a m p l e ，i nt h el a t e rs t a g eo fe x c y s t m e n t ，t h em i c r o t u b u l a rl a y e ra p p e a r so u to f t h ev e s i c l e sc o n t a i n i n gc i l i a t a r ys h a f t s ，a n do u to fs o m es i m i l a rv e s i c l e s ，m i c r o t u b u l eb u n d l e s b e n e a t ht h ek i n e t o s o m e sb e c o m eo b v i o u sa n ds t r o n g o t h e rs t r u c t u r e s ，s u c ha sm i c r o n u c l e u s ，k e e p t h es a n l em o r p h o l o g y , w h i c hm e a n si ti sn o tr e l a t et ot h ep r o c e s so fe x c y s t m e u tm a y b e 。a l lt h e s e r e s u l t si l l u s t r a t et h eg r e a tc h a n g eo fi n n e rs t r u c t u r ed u r i n gt h ep h y s i o l o g i c a lt r a n s f o r m a t i o nf r o m c y s tt ov e g e t a t i v ec e l l ，a n dp r o v i d em o r ed o c u m e n t sf o rt h es t u d yo n t h em e c h a n i s mo fc e l l u l a r r e s t i n ga n dd i f f e r e n t i a t i o ni nc i l i a t e s 2 t h es t r u c t u r eo f m a c r o n u c l e u sr e v e a l e db ys e m i nv e g e t a t i v ec e l l s ，t h ea p p e a r a n c eo fm a c r o n u c l e u si sl i k et h ew o r d c ，o rt h ed i g i to f 3 w h e nd n ai s s y n t h e s i z i n gw i t ht w or e p l i c a t i o nb a n d s ( 1 t 1 3 ) a te a c h e n d t h em a c r o n u c l e u s c o n t a i n sc h r o m a t i np a r t i c l e so f1g m ，w h i c hi sc o n s t i t u t e do f5 0 n mc h r o m a t i ng r a i n s t h er bi s a l s om a d eu pw i t h5 0 n mc h r o m a t i ng r a i n s t h ec h r o m a t i n p a r t i c l e sn e a rt or b a r ed i s i n t e r g r a t e d t h ec h r o m a t i np a r t i c l e sa l el i n k e du pw i t hl o o n mf i i a m e n t si nt h ed e e ps t r u c t u r e ，t h e r ea r e c o m p l i c a t en e t so ff i l a m e n t s a st ot h ec y s t sa n de n c y s t i n gc e l l s ，t h e i n n e rs t r u c t u r ec a n n o tb e o b s e r v e ds u c c e s s f u l l yb e c a u s eo ft h ed i f f i c u l t yo f e x t r a c t i n gi n t a c tm a c r o n u c l e i a f t e rc o m p a r i n g w i t ht h em a c r o n u c l e a rs t r u c t u r er e v e a l e db yt e m ，t h ee x i s t e n c em o r p h o l o g yo fd n ai sv e r i f i e d t h es u c c e e d i n gr e s e a r c ho fc y s t sa n de x c y s t i n gc e l l sm a c r o n u c l e ib ys e mw i l l e x p a n do u r k n o w l e d g e o f c i l i a t e sc h r o m a t i n m o r p h o l o g y 3 t h el o c a t i o np a t t e r no fy t u b u l i n i nt h ev e g e t a t i v ec e l l s ，a l lt h ec i l i a r ys h a f t sa r el a b e l e dw i t hs t r o n gf l u o r e s c e n c e ，w h i l et h e m a c r o n u c l e u sa n dm i c r o n u c l e u sa r en o t i nt h er e s t i n gc y s t s ，t h er e m n a n ts t r u c t u r e so f m i c r o t u b u l e o nt h ed o r s a ls i d ea r el a b e l e da s v s t r u c t u r e s a n da l lt h e s e v s t r u c t u r e sc o n s i s tj ns o m e a r c - l i k e1 i n e s t h eb o r d e ro fd o r s a ls i d ea n da b d o m i n a ls i d ea r ea l s oi a b e l e d w h i l et h e r ei sn o t f l u o r e s e n c ei nt h ea b d o m i n a ls i d e e x c e p t ac i r c l e - l i k es t r u c t u r e t h ea z m ( a b o r a lz o n eo f m e m b r a n e ) c o m p r e s s e di nt h ec y s ti s l a b e l e ds l i g h t l y d u r i n gt h ep e r i o do f e x c y s t m e n t ，t h el i n e s o fd o r s a lf l u o r e n s e n c ea r eb r o k e na n df o r mac r e v i c ew h e r et h ec e l lg o e so u t t h ef l u o r e n s c e n c e s l o c a t i o n p a t t e r n a n dd i s t r i b u t i o no fy t u b u l i ni s s i m i l a rt ot h e1 2 1 一b t u b u l i n s t h i s p h e n o m e n o nv e r i f i e st h et u b u l i n so u t l e ta f t e re n c y s t m e n t k e yw o r d s ：c i l i a t e ，e u p l o t e se n c y s t i c u s ，v e g e t a t i v ec e l l ，c y s t ，u l t r a s t r u c t u r e ，y - t u b u l i n 一3 - 第一章纤毛虫包囊现象的研究及其意义 纤毛虫在一些特定的环境条件下，如温度突变、p h 值变化、食物短缺、种 群密度过高等，其生命活动受到阻碍，运动状态减弱，细胞团缩，同时分泌物质 包被细胞，这一特殊的生命现象，称作形成包囊( e n c y s t m e n t ) ，或者称作细胞休 眠。当外界环境条件改善后，休眠后的细胞，会脱出包囊壁，恢复原有的形态和 结构，重新开始正常的生命活动。 纤毛虫形成包囊的现象，作为研究细胞分化的个模式系统，正引起越来越 多的重视，已成为真核细胞结构与功能、细胞模式形成与控制机理等方面研究的 一个热点。近几十年来，关于它的研究层面不断深化，从最初的结构描述、皮层 纤毛器发生，到亚细胞水平的各种细胞器功能变化，再到分子水平上对蛋白质组 成、基因调控机制等等。 1 纤毛虫形成包囊的原因和过程 1 9 6 2 年，h a s h i m o t o 等详细报道了伪尖毛虫( o x f l r i c h af a l l a x ) 取食和形成 包囊的关系( h a s h i m o t o 等，1 9 6 2 ，1 9 6 3 ) 。在贻贝棘尾虫佑t y j o n y c h i a m y t i l u s j 的培养中，于1 8 - - 2 2 下提供适当食物，至纤毛虫达到较高密度后，连续数天 不换培养液，造成培养液“老化”，此时中断食物，能使纤毛虫形成包囊( 张作 人等，1 9 8 1 ) 。将包囊游仆虫( e u p l o t e se n c y s t i c u s ) 接入食物耗尽的培养液中， 不供给食物，l 一2 小时后大部分细胞形成包囊( 顾福康等，1 9 9 1 ) 。 实验证明，纤毛虫形成包囊与栖息环境的变化有关，或与纤毛虫本身生理状 态的转变有关。环境温度突然变化、食物不足是纤毛虫形成包囊的主要原因。还 有其他多种因子起作用，如温度、离子浓度、食物条件、p h 值、氧含量等等。 包囊游仆虫形成包囊前，运动状态由匍匐爬行变为滞留在培养皿底部，在原 地转圈或作翻滚运动。细胞停止摄食动作，伸缩泡的活动也明显减慢。细胞按原 有状态，即背面向上，腹面朝下定向，以背腹交接处的腹侧边缘突出部分附着在 基质上。此时细胞向基质分泌粘性物质，虫体牢固附着在基质上的同时，经历剧 烈收缩，同时发生腹面结构内陷的过程。约5 6 个小时，游仆虫便形成圆球形 的休眠包囊。大多数包囊位于培养液中的边缘区域，它们以数十个甚至上百个挤 排在起( 顾福康，1 9 9 1 ) 。 细胞在形成包囊的过程中，结构进行了一系列的变化。l e a d b e a t e r 等( 2 0 0 1 ) 对d e s m o x e j l am o n i l i f o r m i s 形成包囊过程中结构变化作了详细的研究：细胞 分泌纤维状物质，首先沉积在口部周围，然后包围细胞后半部，内部细胞器出现 连续的变化，最终形成包囊。 2 纤毛虫休眠现象的研究历史和现状 上世纪4 0 年代中期，b e e r s 有数篇文章发表，报道了双环栉毛虫( d y d i n i u m n a s u t u m ) 及修饰篮口虫( n a s s u l ad m a t a ) 包囊的解脱过程( b e e r s ，1 9 4 5 ，1 9 6 6 ) ， 另外，他还研究了影响纤毛虫t i l l i n am a g n a 包囊解脱的各种因素( b e e r s ，1 9 4 6 ) 。 g r i m e s ( 1 9 7 3 ，1 9 8 2 ) 将伪尖毛虫形成包囊和脱包囊期间纤毛结构的分化等现象， 应用于细胞模式形成机理的研究，提出了“信息系统”的假设：w a l k e r 等 ( 1 9 7 5 ，1 9 8 0 ) 在观察到贻贝棘尾虫形成包囊期间毛基体的去分化特征后，又发 现栀形双睫虫( d i o p h f f ss c u t u m ) 休眠细胞中毛基体被保留下来的现象，便提 出腹毛目纤毛虫形成“毛基体吸收型”和“毛基体非吸收型”两类包囊的假设； r e i d 等( 1 9 8 3 ) 检查了多膜纲纤毛虫某些代表属的包囊，发现在属水平包囊结构 相当稳定，提出了应用包囊结构确定纤毛虫系统分类的设想；在毛基体吸收型包 囊的研究中，g u t i e r r e z 等( 1 9 8 3 a ，1 9 8 3 b ) 观察到尖尾劳伦泰拉虫( l a u r e n t f e d l a a c u m i n a t a ) 的包囊壁由壁“前体”形成，包囊壁结构的主要成分是碳水化合物 和蛋白质；m a t s u s a k a 等( 1 9 8 4 ) 在纤毛单元水平观察到苔藓织毛虫伽占打j c “s 删s ，册) 形成包囊和脱包囊过程中结构的分化。在毛基体非吸收型包囊的研究 中，r a w l i n s o n 等( 1 9 8 5 ) 应用光镜和扫描电镜观察了粘游仆虫( e u p i o t e s m u s c i c o l a ) 细胞脱包囊中的形态；c a l v o 等( 2 0 0 3 ) 发现粘游仆虫的休眠细胞 有完全不同的两层包囊壁：m a t s u s a k a 等( 1 9 8 9 ) 在光镜水平显示了包囊游仆虫 形成包囊中纤毛结构的形态发生：顾福康等( 1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) 应用光镜和扫描电镜 观察到包囊游仆虫形成包囊中纤毛结构的部分去分化和脱包囊时在原结构基础 上的再分化，并用显微光度术获得了在此期间大核d n a 含量减少、合成至恢复正 常水平的证据；此后，顾福康等( 1 9 9 5 a ，1 9 9 5 b ) 应用透射电镜揭示了包囊游仆 虫去分化和再分化期间其纤毛器皮层、表膜下微管、细胞器及核器的形态学以及 结构去分化的自噬泡消化作用。在纤毛虫休眠细胞细胞器的功能研究方面，李恭 楚等( 1 9 9 9 ) ，陈灵等( 2 0 0 0 ) 应用电镜酶细胞化学技术在几种纤毛虫的休眠细 胞内观察到多种细胞器标志性酶的反应活性，证实了细胞在休眠期间同样经历着 物质的消化、能量利用和细胞代谢等活动。在休眠细胞的骨架体系研究方面，杨 振云等( 2 0 0 1 ) 利用电镜包埋一去包埋技术，首次在休眠细胞上证实了中间纤维 一核纤层一核骨架体系的存在，为核骨架体系存在的普遍性提供了重要依据。 当前对纤毛虫休眠现象的研究更多的只是集中在亚显微水平观察分析和推 论方面，距离解答真核细胞模式形成与控制机理的奥秘，尚有很远的路要走。从 根本上说，纤毛虫休眠现象的形成与解除，特定结构的分化( 包囊壁等结构的出 现) 与脱分化( 特有纤毛器的消失) 等等表象，无不与细胞内特定基因的关闭与 表达存在直接或间接的关系。只有深入到分子水平的工作，才能对这些问题作出 解答。当前，关于纤毛虫休眠细胞的分子水平上的工作尚不多见，g u t i e r r e z 等 ( 1 9 9 0 ) 根据以往的一些形态学及生理学研究，提出了一个旨在解释纤毛虫形成 包囊机理的通用模式，他认为由于成包囊基因的表达促使一些颠的转录本出现， 从而合成特定的蛋白质来调控包囊的形成。这是第一次提示人们从寻找成包囊基 因入手，来揭示纤毛虫的休眠机理。为了证实休眠包囊中是否存在与包囊化相关 的转录本，t o u r a n e h e a u 等( 1 9 9 9 ) 以休眠包囊为材料建立了c d n a 文库。分 离出的转录本已经确定在休眠包囊中存在一个m r n a 库。对c d n a 文库进行序列分 析，发现在其上存在一个开放读码框，此读码框和目前已知的一类具调控作用的 蛋白有非同寻常的相关性：i ) n i f r 3 ，是一种细菌内的氮调控系统的成分之一。 2 ) c r o c l ，是一种位于人类细胞中的转录圉子。作者推溅在纤毛虫中分离出的 这个假定的调控基因可能和这两个大核基因具有类似功能。同时，对比营养期细 胞的c d n a ，发现了个休眠细胞特有的转录本，此转录本已经被分离了出来， 但其表达产物尚未被证实，尚不能确定此基因是否参与了形成包囊的过程。同时， g u t i e r r e z 等( 1 9 9 0 ) 在对形成包囊期间新合成的转录本的检测中发现，转录活 动在包囊形成的最后阶段急剧降低直至停止。由此这一休眠阶段既是形成包囊的 “终点”也是脱包囊的“起点”。 对于纤毛虫休眠现象的分子作用机理、休眠细胞的分化与其基因调控、蛋白 质的修饰、细胞的信号传递等等，是现今研究的热点。例如大核d n a 分子的甲基 化修饰作用参与了休眠的形成。在纤毛虫的大、小核中，都存在甲基化的胞嘧啶 或6 一甲基腺嘌呤( g r o s s k y 等，1 9 7 3 ) 。利用几种对去甲基化残基敏感的限制性 酶对纤毛虫细胞的d n a 和营养细胞的d n a 酶切片段是不同的。体眠细胞d n a 被h s g l 酶切，表明57 甲基胞嘧嚏发生了去甲基化，可以说明某些基因有了颓 的表达( a m n e r m a n n 等，1 9 8 1 ) 。再譬如，蛋白质的糖基化电在休眠现象中起重 要作用。p a l a c i o s 等( 1 9 9 4 ) 认为膨大肾形虫( c o l p o 幽i n 戌a t a ) 的包囊形成 依赖于蛋白质糖基化。采用抑制糖基化起始的t u n i c a n y c i n ，其浓度达到一定程 度时，细胞休眠受阻。对此类问题，不仅是现在迫切需要解决的任务，更是将来 研究的主要方向。 3 纤毛虫休眠现象中超微结构的变化 3 1 细胞周缘的变化情况 纤毛虫形成包囊时显著的形态学特征之一是皮层纤毛器和有关微管结构的 脱分化和相应结构的再分化，但不同类群纤毛虫皮层结构脱分化和再分化的特征 不一样，尖毛虫科( o x y t r i c h i d a e ) 的伪尖毛虫形成包囊后，有四层包囊壁，细 胞皮层内部全部吸收了毛基体、纤毛杆和微管结构；游仆虫科( e u p l o t i d a e ) 的 盾形双睫虫休眠包囊有三层壁结构，细胞皮层内保留了大部分微管，仅部分纤毛 杆被吸收。目前己证实，可形成毛基体吸收型包囊的纤毛虫有杯状腹柱虫 ( g a s t r o s t y l as t e i n i i ) 、贻贝棘尾虫、似织毛虫( h i s t r i c u l u ss i m i l 8 ) 、苔藓织毛虫 ( h i s t r i c u l u sm u s c o r u m ) 、尖尾劳伦泰拉虫( 如盱p 乃 j 8 如a c u i i j j d c 3 t a ) 、阔口 尖毛虫( o x y t r i c h a p l a t y s t o m a ) 等；可形成毛基体非吸收包囊的纤毛虫有盾形双 睫虫、粘游仆虫、齿脊肾形虫( c o l p o d as t e i n i i ) 等。“毛基体吸收型包囊”的特 点是具有四层包囊壁，细胞皮层内全部吸收了毛基体、纤毛杆和微管结构，线粒 体呈聚集状态，具融合大核等；“毛基体非吸收型包囊”的特点是具二或三层壁 结构、细胞皮层内保留有毛基体和大部分微管，大部分纤毛杆被吸收。 1 9 8 5 年，r i o s 等在尾柱虫科大尾柱虫( u r o s t y l a g r a n d i s ) 中发现，其形成包 囊后，细胞皮层内已吸收了全部纤毛杆、微管及大部分毛基体，包囊壁也有三层 ( r i o s ，1 9 8 5 ) 。并在艾氏全列虫( h o l o s t r i c h aa d a m i ) 、冠突伪尾柱虫 ( p s e u d o u r o s t y l ac r i s t a t a ) 和近亲殖口虫( g o n o s o m u ma f f i n e ) r _ 中也观察到了这样特征 的包囊。因此被看作第三类包囊“尾柱虫型包囊”。 包囊壁是细胞形成包囊前期，由细胞质内一定位置产生的前体或由某些细胞 器充当“前体”输送到细胞外围形成的。这些细胞器有高尔基体、内质网、各种 粘液泡、各种形状的膜性小体等。据对多种纤毛虫的研究，各层包囊壁前体的形 态不一样，壁结构形成顺序也有先后( w a l k e r1 9 8 0 a ，1 9 8 0 b ) 。冠突伪尾柱虫形 成包囊期间，胞质内产生由许多膜管聚集在一起的高尔基体，其分泌物组成颗粒 层、内层壁及外层壁的壁结构( 顾福康等，2 0 0 2 ) 。 3 2 细胞质的变化情况 纤毛虫在形成包囊的过程中，伴随着一系列形态学及生理学上的显著变化， 因失水浓缩两导致细胞质密度增加及细胞体积缩小是形态学变化之一，这一点在 “毛基体吸收型包囊”上尤为显著。如杯状腹柱虫( g a s t r o s t y l as t e i n i i ) 的包囊 仅仅保留约占营养细胞7 一2 0 的体积；尖毛虫类形成包囊后，与营养细胞相 比，其表面积仅占营养细胞的2 5 左右，体积约占2 0 。细胞质失水浓缩以及 包囊壁的存在，使得细胞对极端环境条件的抵抗力增加。此外，休眠后细胞呈球 形，与营养细胞相比，表面积与体积的比值降低，这在某种程度上抵消了失去某 些表面结构所带来的不利，有利于休眠细胞生命活动的维持。 t r a g e r 等曾描述了纤毛虫在包囊形成过程中发生的四个常见变化，其中之一 即为细胞质中贮存物质的出现( t r a g e r , 1 9 6 3 ) ，如在杯状腹柱虫的休眠包囊中有 大量的贮存小体的存在，小体为卵圆形，里电子透明。在伪尖毛虫( g r i m e s ，1 9 7 3 ) 、 简单卡氏虫( k a h l i e l l as i m p l e x ) ( f o i s s n e r , 1 9 8 7 ) 上同样观察到了这种现象。在 贻贝棘尾虫正在形成包囊的细胞及休眠细胞里有大量的嗜锇小体存在，小体有的 成圆形，有的呈六角形，平均直径为0 _ 2 1 微米，超薄切片显示小体表面呈锯齿 状，且附有核糖体( w a l k e r , 1 9 7 5 ) 。这些小体和伪尖毛虫上所见到的贮存物质 毫不相同，其结构、功能和来源尚不能确定。 细胞质除基质外，就是细胞器。纤毛虫在体眠以后，其细胞器的变化不一。 作为“动力工厂”的线粒体，在休眠过程中，不仅数量急剧减少，而且定位方式 和形态特征也发生了某些异常变化( 李恭楚，1 9 9 9 ) 。由于线粒体是一种半自主 性细胞器，既受自身遗传系统的控制，又受核基因组的调控以及它在生命活动中 的特殊作用，所以形成包囊过程中，线粒体的变化特征越来越引起人们的关注。 研究发现，贻贝棘尾虫休眠细胞中，线粒体大量聚集在一起，并呈不规则形态 ( w m k e g l 9 7 5 ) ；包囊游仆虫休眠细胞中，线粒体的管状嵴显著膨大，它与周围 细胞质的差异己不甚明显( 顾福康，1 9 9 5 ) ：阔口尖毛虫休眠细胞中线粒体高度 凝缩，且多个线粒体聚集在一起，被包裹在胞质球状体内( 顾福康，1 9 9 7 ) ：齿 脊肾形虫休眠细胞中，自噬泡内有处于不同消化阶段的线粒体( 李恭楚，1 9 9 9 ) ； 魏氏拟尾柱虫( p a r a u r o s t y l aw e i s s e i ) 体眠细胞中，线粒体有三种定位方式：少 数分散分布的线粒体：多个相互聚集在一起的线粒体；处于自噬泡内的线粒体。 自噬泡内的线粒体明显异常，其结构处于瓦鳃、消化的不同阶段，少数分散分布 的线粒体显示凝缩变小的状态，但线粒体的内、外膜及其嵴清晰可见；多个相互 聚集的线粒体的内、外膜及嵴不如少数分布的线粒体的清晰( 陈灵等，2 0 0 0 ) 。 在简单卡氏虫休眠细胞中，线粒体变为球形，且成簇存在，嵴的管腔变得很小， 基质内充满了核糖体( f o i s s n e r ，1 9 8 7 ) ；在贻贝棘尾虫的休眠细胞中存在高密 度的核糖体，细胞内的膜性细胞质成分除了线粒体外，表面都吸附有核糖体，食 物泡表面吸附有数层核糖体；在正在形成包囊的细胞中，线粒体聚集压缩，由于 紧密压缩，每个线粒体的形状都不规则。在形成包囊的晚期，这些线粒体呈带状 排列，定位于包囊的周缘( w a l k e r , 1 9 7 5 ) 。这些现象提示，线粒体形态特征和定 位方式的变化可能与包囊的形成及包囊在休眠状态下生理功能的改变有关。 3 3 细胞核的变化情况 目前对纤毛虫形成包囊及包囊解脱过程中大、小核的变化情况研究不多，而 且大多集中于形态描述方面。总的来说，有几个大核的纤毛虫，在形成包囊时， 大核融合在一起，小核被吸收；包囊解脱时，大核发生改组，大、小核经分裂后， 数目恢复正常。有一个大核的纤毛虫，形成包囊时，大核凝缩，含量藏少；包囊 解脱时，大核发生改组，含量恢复正常，关于前者的研究如贻贝棘尾虫 ( w a l k e r , 1 9 7 5 ；张作人等，1 9 8 1 ) 、伪尖毛虫( g r i m e s ，1 9 7 3 ) 、杯状腹柱虫 ( w a l k e r , 1 9 8 0 ) 等，关于后者的研究如包囊游仆虫( 顾福康等，1 9 9 2 ) 。 伪尖毛虫形成包囊时，原营养细胞的两个大核融合成一个，有些小核被细胞 质吸收，包囊解脱时，大、小核分裂，恢复到正常数目和形态( g r i m e s ，1 9 7 3 ) 。 c o r r a d o 等( 1 9 9 6 ) 对膨大l 肾形虫作了研究，此后，t i a r l o 等( 1 9 9 9 ) 对膨大肾形 虫休眠细胞大核动态变化作了研究。这些研究进一步完善了大核d n a 改组、大核 分裂、大核数量变化等方面的认识。 贻贝棘尾虫营养细胞有两个大核，在形成包囊时，两个大核融合成一个圆球， 大核染色质聚集成为独立存在的圆形或卵圆形的小体。随着休眠化的进行，大核 中出现两种类型的核仁，一种大而致密，位于核的中央，另一种小而弥散，定位 于核的周缘。小核数目也减少，小核染色质趋于凝缩( w a l k e r , 1 9 7 5 ) ；包囊解脱 时，融合大核染色质变为中部着色深而周边着色浅，以后周边染色质着色也变深， 或是染色质变为一部分着色深，另一部分着色浅，以后另一部分着色也变深，发 生染色质的改组现象( 张作人等，1 9 8 1 ) 。 包囊游仆虫含大、小核各枚，大核近于“c ”形，小核呈圆球形，形成包 囊后，细胞变为圆球形，大核团缩成圆环形，大核染色质大小不一，在整个大核 内松散分布，使大核呈现为蜂窝状，小核未见明显变化。在诱导包囊解脱的过程 中，在大核的一端或两端发生染色质粒浓集，其后染色质粒浓集区趋于向核中部 发展至脱包囊的后期，整个大核内的染色质粒高度浓集，原有的蜂窝状结构消失， 脱包囊后进入营养期，大核恢复正常形态。顾福康等在包囊游仆虫包囊形成和解 脱时大、小核的研究中，采用细胞显微光度计电镜扫描的方法，测量了不同阶段 细胞核面积、相对含量和密度，首次证明了包囊游仆虫在形成包囊时，大核含量 低于正常水平，研究中发现，在包囊解脱时，随着染色质粒的浓集，含量逐渐恢 复正常，至染色质粒在整个大核浓集时，含量恢复正常，而小核在形成包囊和脱 包囊过程中，形态大小，含量均无明显变化( 顾福康等，1 9 9 2 ) 。此研究结果提 示人们，纤毛虫大核的变化与其包囊形成和解脱有某种联系，只有从基因表达水 平入手，才能揭示纤毛虫包囊形成与解脱的真正原因。 在研究中人们还发现，在纤毛虫形成包囊和脱包囊的过程中，伴随着细胞核 的变化，不同的纤毛虫中往往还有特殊现象。如在贻贝棘尾虫形成包囊的早期阶 段，可见到多层扁平的囊泡与大核的外缘相联系，在后期，这些结构转移到细胞 质中。此外在形成包囊的过程中，小核的染色质经历进一步的浓缩，浓缩过程中 可见到核内有成束的微管，在休眠细胞中不在存在，推测已经解聚成微管蛋白前 体，在包囊解脱时，小核内也发现有随机定向的微管，其功能未知( w a l k e r ，1 9 7 5 ) 。 在盾形双睫虫休眠细胞内小核的外周也有被微管围绕的现象( w a l k e r , 1 9 8 0 b ) 。在 杯状腹柱虫形成包囊和脱包囊的过程中，染色质经历一个浓缩与分解的过程，在 此过程中伴有微管的出现和消失，提示两者之间有某种联系。在形成包囊过程中， 大核中出现许多微管束，这些微管束随机定向，有时可发现靠近核膜内层、染色 质及核仁，随着休眠化的进行，染色质聚集成大的中央染色质，此时微管位于大 核的中部，和正经历浓缩化的染色质的周缘相联系，微管束上有电子致密物质形 成的横带，休眠化的后期，大核染色质变为小球体，微管束消失；在包囊解脱的 早期，大核内出现微管束，这些微管束或分散或聚集，靠近内层核膜或与之相联 系，可见到单根的微管贯通细胞质和大核( w a l k e r , 1 9 8 0 a ) 。 4 纤毛虫休眠现象研究的意义 4 1 纤毛虫形成包囊的生物学意义 纤毛虫形成包囊后，除“生殖型”包囊细胞在内部进行生殖外，大部分包囊 的细胞处于休眠的生理状态，没有生长和生殖，细胞内的生活物质仅在消耗少部 分呼吸能的情况下维持下去。包囊壁和细胞的休眠特征是纤毛虫抵御外界各种有 害因子，在极端环境下生存的重要条件。大部分包囊能抵抗高温、低温、干燥等 多种有害因子，甚至能在这些因子的长时间影响下存活下来。包囊的上述特征一 方面为纤毛虫种群的延续提供了条件，另一方面又为纤毛虫从一处向另一处扩散 或传播提供了途径。有人检查，每立方米空气中含2 个原生动物包囊，并且在鸟 的羽毛和腿粘着的泥土上，或在水生甲壳动物的体表也有原生动物包囊，因此推 测，包囊可能随空气流动携带一定距离，或经由某些动物的迁移向另一处传播。 另外，某些寄生纤毛虫形成包囊也是其避开严酷环境的影响，保证有效地感染宿 主的一种最“安全”的方法。另外，纤毛虫的年龄和衰老程度是无性分裂次数决 定的，包囊形成可使纤毛虫较长时间停止分裂，这也是纤毛虫延缓其无性系衰老 的一种方法。 4 2 纤毛虫休眠现象研究对纤毛虫系统学的意义 尽管没有理由认为纤毛虫形成包囊具有种群特异性，但从一定类群的纤毛虫 产生特定结构的休h 民包囊，而表现出一定的遗传和发育特点来看，纤毛虫的休眠 现象可能与其系统进化有联系。这些已经引起各国学者的重视。近年来对纤毛虫 包囊问题的研究己成为探讨纤毛虫系统学的组成部分。 w a l k e r 等首先根据休眠包囊的特征提出了对腹毛目纤毛虫的再分类问题 ( w a l k e r 等，1 9 8 0 ) 。r e i d 等检查了多膜纲( p o l y m e n o p h o r e a ) 中某些代表属的 包囊发现，尽管不同属的营养细胞结构变异十分明显，但相应包囊的结构则相当 稳定，他们推测“包囊结构可能是确定不同类群纤毛虫之间系统学关系的重要标 准之一”，便提出了这一纲中几类有不同包囊结构的纤毛虫具有不同起源的假设 ( r