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声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川大学所有，特此声明。 申枞彩，匆钞 指导教师：彳象彳 四川大学博士学位论文 摘要 法医学降解检材d n 分析的新指标探索 研究生 张海军 导师：侯平教授 法医物证教研室 四川大学华西基础与法医学院 目的为了提高分析d n a 高度降解样本的成功率，探索一些针对高度降解d n a 分析的新方法、新指标十分必要。本课题旨在构建一些有利于分析高度降解d n a 的方法，以弥补商品化s t r 复合扩增试剂盒在分析高度降解d n a 的不足，增加法 医学个人识别能力。 方法从法医检案的实践中挑选出商品化s t r 复合扩增试剂盒d n a 分析成功 率最低的4 个s t r 基因座，通过修改引物结合区的位置，减小扩增片段的长度， 将其构建一个复合扩增荧光检测和自动化分型体系( m i n i s t r ) 。将m i n i s t r 与商 品化s t r 复合扩增试剂盒的分型结果进行一致性、抗降解和抗p c r 抑制物能力比 对实验，依据d n a 分析技术工作组( t w g d a m ) 指南进行法医学可行性研究。 选择5 个单核苷酸多态性基因座( s n p ) 作为研究对象，3 个( r s 9 9 9 8 4 2 、 r s 9 2 2 9 9 2 、r s 9 2 4 1 8 1 ) 定位于常染色体，一个( r s 9 9 7 2 6 2 ) 定位于x 染色体，一个 ( m 9 ) 位于y 染色体。将其构建成一个超短片段长度p c r 复合扩增体系，利用多 重单碱基延伸荧光检测方法进行分型，与构建的m i n i s t r 进行抗降解和抗p c r 抑 制剂能力对比实验，并进行法医学可行性、群体遗传学和性别判断的研究。 构建一个p c r 内对照物，使其能与商品化s t r 复合扩增试剂盒一同扩增，一 同电泳，一同自动化分型。通过观察内对照产物峰高情况，确定p c r 反应中抑制 物的存在和作用情况。结合案例进行法医学可行性评估。 四川大学博士学位论文 结果通过统计2 2 0 份法医生物物证样本的d n a 分型结果，发现商品化s t r 复合扩增试剂盒对d 7 s 8 2 0 、d 1 8 s 5 1 、c s f i p o 、d 2 s 1 3 3 8 、f g a 五个基因座分型的 成功率最低。由于f g a 的核心重复基序的序列太长，无法将其扩增片段长度减小 到理想的程度，不适合进行小片段s t r 设计。于是我们建立了一个含有d 7 s 8 2 0 、 d 1 8 s 5 1 、c s f l p o 和d 2 s 1 3 3 8 共4 个基因座的复合扩增荧光检测体系( m i n i s t r ) 。 通过比对商业试剂盒i d e n t i f i l e r 这4 个基因座的分型结果、分析高度降解d n a 的能力和抵抗p c r 抑制物的作用，发现m i n i s t r 分型结果与商业试剂盒 i d e n t i f i l e r 的结果相同；m i n i s t r 比商业试剂盒更能从高度降解d n a 中得到s t r 基因座分型结果，在p c r 反应时，能从更高浓度的抑制物( 血红蛋白) 中得到分型 结果。法医可行性研究结果显示，该复合扩增体系的灵敏度达到2 0 0 p g ，分型结 果稳定，重复性好，能够对常见基质上的斑痕正确分型，具有较好的组织同一性 和种属特异性。用于实际检案，可以提高d n a 高度降解检材分型成功率。 构建的5 个s n p 复合扩增体系，片段长度在6 0 7 0 b p 之间。应用多重引物单 碱基延伸荧光检测技术进行分型。结果发现s n p 比m i n i s t r 从高度降解d n a 中得 到分型结果的成功率更高，并且能从含更高浓度抑制物( 血红蛋白) 的样本中得到 分型。法医可行性研究显示，检验的最低模板量为l o o p g ，分型结果稳定，重复 性好，对法医常见生物检材，包括毛发、血痕、精斑、烟蒂等均获得正确结果， 并且可以判断检材来源者的性别。通过分别对2 0 名无关男性个体和2 0 名无关女 性个体分型，得出5 个s n p 的等位基因频率分布资料。所有常染色体s n p 的杂合 度均大于0 4 3 ，显示出良好的多态性。 构建的p c r 内对照物，所产生的片段大小为8 3 b p ，与商品化s t r 复合扩增试 剂盒内标为同种荧光染料标记，能与商业试剂盒一同扩增、电泳分离及荧光检测， 不影响商业试剂盒分型结果的准确性、灵敏度和种属特性等特征。可以通过观察 内对照产物峰商情况，评估p c r 反应中抑制物的存在和作用情况。为指导d n a 提 取和p c r 扩增提供参考。 结论本课题构建了一些有利于分析高度降解d n a 的方法，弥补了商品化s t r 2 四川大学博士学位论文 复合扩增试剂盒在分析高度降解d n a 的不足为法医高度降解检材的d n a 分析提 供了新方法和新指标。 【关键词】 s t r ，m i n i s t r ，s n p ，单碱基延伸，p c r 内对照，降解 d n a ，法医遗传学 四川大学博士学位论文 a b s t r a c t e x p l o r e o ff o r e n s i cd n a t y p i n gf o rd e g r a d e ds a m p l e p o s t g r a d u a t eh 两u n 撕 t u t o r p r o f y i p i n gh o u d e p a r t m e n to f f o r e n s i cg e n e t i c s s c h o o lo f p r l i n i c a la n df o r e n s i cm e d i c i n e s i c h u a nu n i v e r s i t y o b j e c t i v ei no r d e rt oi n c r e a s et h es u c c e s sr a t eo fa n a l y s i sf o rd e g r a d e dd n a s a m p l e s , i ti sn e c e s s a r yt oe x p l o r es o m en e wm e t h o d so ff o r e n s i cd n a 姆p i l l gu s i n g c u r r e n tt e c h n i q u ea n de q u i p m e n t s t i l i ss t u d ye x p l o r e ds o m en o v e lm e t h o d so f a n a l y s i s f o rd e g r a d e dd n a s a m p l e s m e t h o d sw es e l e c t e df o u rs t rl o c it h a tg e n e r a t e dl o w e rb - q l o c e s sr a t et h a no t h e r l o c i 丽t hc o m m e r c i a ls t rk i t st oa s s a yt h ed e g r a d e dd n as a m p l e sf r o mf o r e n s i c c a s e w o r k t h r o u g hr e d e s i g n i n gt h ep r i m e rb i n d i n gs i t e s ，t h ea m # i c o n so f e a c hs t r m a r k e rw e r em a d ea ss m a l la sp o s s i b l e 1 1 l i si ss oc a l l e dm i n i s t i l1 1 豫f o u rm i i l i s t r l o c iw c r ec o m b i n e di n t oam u l t i l e x e da m p l i f i c a t i o ns y s t e m p c rp r o d u c t sw e r e d e t e c t e dw i t ha b ig e n e t i ca n a l y z e rf o rf l u o r e s c e n ts y s t e m 1 1 艟s t u d yo ft h e c c 咀r d 缸c e ，t h ed e g r a d e dd n aa n dt h ep c ri n h i b i m r sw e r ep e r f o r m e du s 啦b o t h t h i sm u l t i p l e xs y s t e ma n dac o m m e r c i a ls t rk i t 。as e r i e so fv a l i d a t i o ne x p e r i m e n t s w e r ed o n ef o rt h i sm u l t i p l e xs y s t e ma c c o i d i i l gt ot h er e c o m m e n d a t i o no f t h et e c h n i c a l w b r kg r o u pd n a a n a l y s i sm e t h o d s ( t w g d a m ) w es t u d i e df i v el o c io ft h es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p ) t h r e es n p m a r k e r s 俩9 9 9 3 4 2 ，r s 9 2 2 9 9 2a n df s 9 2 4 1 8 1 ) l o c a t e d0 1 1a u t o s o r n e o n es n pm a r k e r ( r s 9 9 7 2 6 2 ) l o c a t e do nxc h r o m o s o m e a n o t h e r ( m 9 ) l o c a t e do nyc h r o m o s o m e n e 4 四川大学博士学位论文 f i v es n pl o c iw e r ec o m b i n e di n t oa m u l t i p l e x e da m p l i f i c a t i o ns y s t e m t h ea m p l i c o n s w i t l lv e r ys m a l ls i z ew e r ee m p l o y e df o rs i n g l eb a s ee x t e n s i o nr e a c d o mt h ef i v e r e a c t i o n so f s i n g l eb a s ee x t e n s i o nw e r ec o m b i n e di n t oam u l t i p l e xs y s = t e i n t h ep r o d u c t s o ft h ee x t e n s i o nr e a c t i o nw e r ea n a l y z e df o rs n pt y p i n g 、硝t l la b ig e n e t i ca n a l y z e r p o p u l a t i o nd a t aw f f r ec o l l e c t e dw i t ht h em u l t i p l e xs n ps y s t e m ac o m p a r i n gs t u d yo f a s s a y i n gd e g r a d e dd n aa n dr e s i s t i n gp c ri n h i b i t o r sw e r ep e r f o r m e dd e t w e e nt h i s m u l t i p l e xs y s t e ma n dt h em i n i s t rs y s t e m s o m ev a l i d a t i o ne x p e a j m e n t sa n das t u d y f o r i d e n t i f y i n gc o n t r i b u t o r s e xw e r ep e r f o r m e di no r d e rt oa s s e s st h et e c h n i c a l p e r f o r m a n c eo f t h em u l t i p l e xs n ps y s t e m a ni n t e m a lp c rc o n t r o l ( i p c ) d n af r a g m e n tw a sd e s i g n e d t h i sd n af i - a g m e n t w a sa m p l i f i e db yp c ra n dt h ea m p l i c o nw a sa n a l y z e db yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s a l o n gw i mac o m m e r c i a ls t rt y p i n gk i t t h r o u g ha s s a y i n gq u a n t i t yo fp c rp r o d u c t s f r o mi p c e f f e c to fs o m ep c ri n h i b i t o r sw a se v a l u a t e d r e s u l t st h r o u g ha n a l y z i n g2 2 0f o r e n s i cd n as a m p l e sw i t hac o m m e r c i a ls t r t y p i n gk i t , w ef o u n dt h a td 7 s 8 2 0 ，d i g s s i ，c s f l p o , d 2 s 1 3 3 8a n df g al o c i g e n e r a t e dl o w e rs i 】c c e s $ r a t et h a no t h e rl o c i b e c a u s et h ef g a m a r k e rh a dv e r yl o n g r e p e a tm o t i f , w ea b a n d o n e di t a sc a n d i d a t el o c u s s o ，am u l t i p l e x e da m p l i f i c a t i o n s y s t e mw a se s t a b l i s h e df o rf o u rm i n i s t rm a r k e r s ：d 7 s 8 2 0 ，d 1 8 s 5 1 ，c s f l p oa n d d 2 s 1 3 3 8 c o n c o r d a n c es t u d ys h o w e dt h e r ew 唧n od i f f e r e n td n a p r o f i l e rb e t w e e n o u rm u l t i p l e xs y s t e ma n dac o m m e r c i a ls t rk i t i nd n at y p i n go ft h ed e g r a d e d s a m p l e so rt h es a m p l e sc o n t a i n i n g5 0 m ep c ri n h i b i t o r s , t h em i n i s t rm u l t i p l e xs y s t e m w a sc a p a b l eo fi c c o v e r i n gm o r ec o m p l e t ep r o f i l e sw h e nc o m p a r e dt ot h el a r g e rs i z e d a m p l i c o nf o r mt h ec o m m e r c i a lk i t t h ev a l i d a t i o ne x p e r i m e n t sp r o v e d t h a tt h e m i n i s t rm u l t i p l e xs y s t e m 愠sh i g h l yr e p r o d u c i b l ea n dv e r yu s e f u l f o rf o r e n s i c c a s e w o r k a m u l t i p l e xs n pt y p i n gf o r 塔9 9 9 8 4 2 ，r s 9 2 2 9 9 2 ，r s 9 2 4 1 8 1 ，r s 9 9 7 2 6 2a n dm 9w i t h t h em u l t i p l e xp r i r l l e r $ f o rs i n g l eb a s ee x t e n s i o nl 嫂t c t i o n ( s b e lw a se s t a b l i s h e d s u c c e s s f u l l y i nd n at y p i n go ft h ed e g r a d e ds a m p l e so rt h es a m p l e sc o n t a i n i n gs o m e p c ri n h i b i t o r s ，o u rd e s i g n e ds n pm u l t i p l e xs y s t e mw a sm o r ec a p a b l eo fp r o d u c i n g p r o f i l e sw h e nc o m p a r e dt ot h em i n i s t l lt h ev a l i d a t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h i s 四川大学博士学位论文 s y s t e mw a sh i g h l yr e p r o d u c i b l ea n dv e r yu s e f u lf o rf o r e n s i cc a s e w o r k a ni n t e r n a lp c rc o n t r o l0 p c ) d n af t a g m e n tw i t h8 3 b pw a sc o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y i tc 锄b ea m p l i f i e da n dt h ea m p l i c e n 啪b ed e t e c t e db ya b ig e n e t i c a n a l y z e ra l o n gw i t hac o n u n e r c i a ls t rt y p i n gk i t t h e r ew a sn oi n f l u e n c e o n s e n s i t i v i t ya n ds p e c i e ss p e c i f i c i t yf o rt h ec o m m c w i a ls t rk i t t h r o u g ha s s a y i n g q u a n t i t yo fp c rp r o d u c t sf r o mi p c ，w ec a na $ s se f f e c to fs o m e i n h i b i t o r sf o rp c r t h ev a l i d a t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t t h i ss y s t e mw a sv e r yu s e f u l f o rf o r e n s i c c a 朗v o r k c o n c l u s i o nt h i ss t u d yc o n s t r u c t e d8 0 m en e wm a r k u p 3a n de s t a b l i s h e ds o m en e w m e t h o d sf o rd e g r a d e dd n at y p i n g t h e ya p o t e n t i a lt o o l sf o rr e c o v e r i n gm o r e i n f o r m a t i o nf i o mt h ed e g r a d e dd n as a m p l e s t h e yc a nm a k eu pc o m m e r c i a ls t rk i t s i nd e t e c t i n gt h ed e g r a d e dd n ao f f o r e n s i cc a s e w o r k 【k e y w o r d s1s t r m i n i s t r , s n p , d e g r e e dd n a , s i n g l eb a s ee x t e n s i o n r e a c t i o n , i n t e m a lp c rc o n t r o l ，f o r e n s i cg e n e t i c s 6 四川大学博士学位论文 法医学降解检材d n a 分析的新指标探索 前言 法医d n a 检验经常会面临各种疑难检材。源于各类案件或事件现场的许多法 医生物物证检材，由于所处环境的温度、湿度、光，化学及生物因素，d n a 分子 被损坏，发生断裂，分子交小，大片段丢失。与此同时，一些环境“污染物”也 会掺杂其中，尤其一些p c r 抑制剂的加入，使d n a 高度降解检材的分析更加困难。 因此在分析d n a 降解检材时，我们除了考虑到d n a 分子的高度降解，还应注意p c r 抑制因素对法医d n a 分析的影响。降解和抑制成为法医学研究的热点。 利用商业试剂盒进行核心s t r 基因座的分析已经成为当前法医d n a 分析的主 流技术。但在日常d n a 检验中，我们发现商业试剂盒在分析d n a 降解检材时，表 现出随扩增片段长度的增加，扩增效率下降的趋势，使得一些大片段s t r 基因座 分型的成功率下降，降低了个人识别能力。一些文献表明，减小扩增片段长度可 能提高d n a 高度降解检材分析的成功率。 另一方面，分析降解d n a 的同时可能会遇到各种p c r 抑制剂，因此正确评估 这些p c r 的抑制剂的作用，对d n a 高度降解检材的d n a 提取、d n a 纯化和f c r 扩 增有重要意义，可望进一步提高d n a 高度降解检材分型的成功率。 本课题目的在于创建一些有利于分析d n a 高度降解检材的简便方法，包括减 小扩增片段的方法和监控p c r 抑制剂的方法，以弥补商品化s t r 复合扩增试剂盒在 分析高度降解d n a 的不足，进一步增加个人识别率。为发展法医疑难检材的d n a 的分析方法提供新指标。 7 四川大学博士学位论文第一部分 第一部分 m i n i s t r 复合扩增荧光体系的建立 及其法医学应用的研究 自本世纪8 0 年代中期以来，短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r ) 检验已经成为法庭科学鉴定中最常用、发展最成熟的技术 i - 3 ，已被广泛地应 用于法医d n a 分析。由商品化复合扩增试剂盒构建s t r 信息已经成为各国法庭科学 d n a 数据库的主要组成部分 4 。 源于现场的各类法医d n a 检材，由于所处环境的温度、湿度、光、化学及生物 等因素的作用，d n a 分子被损坏，发生断裂，分子变小，大片段丢失 5 。一些文 献研究表明，使用商品化s t r 复合扩增试剂盒检测这些d n a 高度降解样本时，会出 现扩增效率随片段长度增大而逐渐降低现象，呈现出“斜坡现象”( s k is l o p e ) 。 一些长片段s t r 基因座不能检验出结果或出现等位基因丢失 6 。 在原有s t r 的基础上，重新设计p c r 引物，减小扩增片段长度是目前解决d n a 高度降解检材检验问题的一个新的方向 7 1 0 。这些重新设计小片段s t r 称为 m i n i s t r 1 0 。 本研究旨在根据法医d n a 实际检案，从日常检案中筛选出扩增效率低s t r 基因 座，将其设计成一个m i n i s t r 荧光复合扩增体系，并根据d n a 分析技术工作组 ( s c i e n t i f i cw o r k i n gg r o u po nd n aa n a l y s i sm e t h o d s ，t w g d a m ) 指南进行法 医学可行的研究，以弥补商品化多个s t r 复合扩增试剂盒在分析降解d n a 的不足， 以进一步增加个人识别能力。 8 四川大学博士学位论文第一部分 材料和方法 一、材料 ( 一) 样本 本研究使用三组样本 第一组：从四川省公安厅物证鉴定中心d n a 实验室选择2 2 0 份法医生物物证样 本，用于s t r 基因座的筛选。 第二组；4 个s t r 基因座群体遗传学比较样本。从四川地区汉族群体中，随机 抽取1 2 0 名无亲缘关系的个体血样。制作成血样滤纸片，阴干后，室温保存，用于 与商品化试剂盒分型的同一性比较。 第三组：法医学可行性研究样本。 1 、商品化标准d n a ：9 9 4 7 a ( 1 0 0 p g u 1 ) ，用于灵敏度分析。 2 、取常见动物猪、狗、羊、牛、兔、鸡、鱼的血样本，用于m i n i s t r 复合扩 增体系种属特性研究。 3 、提取两具尸体的肌肉组织、骨组织、脑组织、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、 皮肤、血样。用于m i n i s t r 复合扩增体系同一性研究。 4 、取两名健康男性的血液，进行人工降解d n a 。用于检验该系统分析d n a 降解 样本的能力。 5 、取猪的血样一份，用于研究血红蛋白对本系统的影响。 6 、抽取两名志愿者的血样5 m l ，用于m i n i s t r 复合扩增体系重复性和环境因素 的影响的研究。 7 、从四川省公安厅物证鉴定中, d d n a 实验室选取1 0 份高度降解的d n a 样本。骨 骼4 份、肌肉2 份、血痕2 份、烟蒂2 份，用于m i n i s t r 复合扩增体系实际应用能力的 研究。 ( 二) 试剂 i d e n t i f i l e r 试剂盒( 下文简称i d 试剂盒，a p p l i e db i o s y s e t e m s ，美国) 、 d n a - i q 法医案件样本提取试剂盒( p r o m e g a ，美国) 、g e n e s c a n 5 0 0l i z ( a p p l i e d 四川大学博士学位论文第一部分 b i o s y s e t e m s ，美国) 、g e n e s c a n 5 0 0r o x ( a p p l i e db i o s y s e t e m s ，美国) ，去离 子甲酰胺( a p p l i e db i o s y s e t e m s ，美国) 、c h e l e x - - 1 0 0 ( b i o - r a d ，美国) 、其 余试剂为国产分析纯等等。所有引物的合成和标记由大连宝生物技术公司合成。 ( 三) 仪器 3 1 3 0 x i 基因分析仪( a p p l i e db i o s y s e t e m s ，美国) 、3 1 0 基因分析仅( a p p l i e d b i o s y s e t e m s ，美国) 、m j p t c - 2 2 0 型热循环仪( b i o - r a d ，美国) 、9 7 0 0 型扩增 仪( a p p l i e db i o s y s e t e m s ，美国) ，高速离心机( e p p e n d o r f ，德国) 、纯水仪、 水浴箱、可调移液器等。 二、方法 ( 一) d n a 提取 用c h e l e x - 1 0 0 法提取血痕和烟蒂的d n a ，精斑二步消化后，用 c h e l e x 一1 0 0 + p k + d t t 法提取d n a ，肌肉和毛发用酚一氯仿法提取d n a ，骨骼用d n a i q 法提取d n a ( 详见附录1 、2 和3 ) 。 ( 二) 常规商品化s t r 试剂盒分型 取适量d n a ，进行i d 试剂盒扩增，扩增体系按比例减至l o u l 。在a b l 9 7 0 0 热 循环仪上进行。扩增条件如下： 9 5 。c 预变性1 1m i n ，9 4 。c x 6 0 s e c ，5 9 。c 6 0 s e c ，7 2 。cx 6 0 s e c ，3 0 循环，7 0 。c x 3 0m i n ，最后2 5 。c 保存。 采用a b l 3 1 3 0 x l 基因分析仪进行检测分析( 详见附录4 ) 1 0 u l 去离子甲酰胺， 0 2 u lg s 5 0 0l i z 内标，加入1 u l p c r 产物，混匀编号，9 5 变性3 分钟，立即放 入冰水中后，放入自动样品板。进样电压1 5 k v ，时间为5 秒，电泳电压1 5 k v ， 时间2 0 分钟，温度6 0 。c ，p o p - 4 胶，毛细管检测长度3 0 e r a 。采用g e n e m a p p e r ( v 3 2 ) 软件计算片段长度和等位基因判型。等位基因的辨认通过与等位基因分 型标准物( l a d d e r ) 比较来确定，窗口范围士o 5 b p 。有效峰高定义为主1 0 0 相对荧光 强度( r e l a t i v ef l u o r e s e c n e tu n i t s ，r f u ) 。 统计每一个s t r 基因座扩增成功率的计数方法为：当只有一个峰时，疑似纯合 子。峰高 1 0 0 r f u ，计为0 ，当峰高l o o r f u 计为1 当有二个峰时，疑似杂合子， 1 0 四川大学博士学位论文第一部分 峰高均奎l o o r f u ，计为l ，有一个峰高大于l o o r f u ，另一峰高 p r o t o c o lm a n a g e r ：在i n s t r u m e n tp r o t o c o l 窗 口点n e w 打开p r o t o c o le d i t o r 对话框；完成编辑：输入一个名字；在t y p e 下 拉菜单选择r e g u l a r ；在r u nm o d u l e 下拉菜单选择 h i d f r a g m e n t a n a l y s i s 3 6 _ p o p 4 _ l ；在d y es e t 下拉菜单选择相应的染料组合。 o k 。 1 3 新建r e s u l t sg r o u p ：在d a t ac o l l e c t i o nv 2 0 软件的树形浏览窗依次点击g a i n s t r u m e n t s r e s u l t sg - r o u p ；点n e w 打开r e s u l t sg r o u pe d i t o r 对话框：在 g e n e r a lt a b 输入名字；在a n a l y s i st a b 设置自动分析；在d e s t i n a t i o nt a b 设置 数据保存路径；在n a m i n gt a b 设置数据文件和文件夹名称；在a u t o m a t e d p r o c e s s i n gt a b 设置数据自动处理方式。o k 。 1 4 新建g e n e m a p p e ri ds 0 1 a r ep l a t er e c o r d 用于自动分析：在d a t ac o l l e c t i o n v 2 0 软件的树形浏览窗依次点击g ai n s t r u m e n t s g a 3 1 3 0g a 3 1 3 0 p l a t e m a n a g e r ；完成n e wp l a t e 对话设置：名称，在a p p l i c a t i o n 下拉菜单选择 g e n e m a p p e r - g e n e r i c ( 手工分析) 或者g e n e m a p p e r - ( 自动分 析) ，输入板型、操作者名称等，o k ，打开编辑窗口，完成样品表( p l a t e r e c o r d ) 。 将样品板组装好，放至u 3 1 3 0 上；找到p l a c er e c o r d 并选中它，然后点击对应 样品板的p l a t e p o r t i o ni n d i c a t o r ，点击r u n 按钮开始电泳。 2 g e n e m a p p e ri dv 3 2 软件数据分析 2 1 首次使用需要输入p a n e l s 和b i n s 。新建分析方法，其中脚dc l a s s m 适用于苹 果系统数据，i - i da d v a n c e d 适用于p c 系统数据。 2 2 在f i l e 下拉菜单中选a d ds a m p l e s ，然后根据样品文件所在路径找到并导入样 品文件，每个文件夹中必须包括l a d d e r 。 2 3 选择设置如下参数：t a b l es e t t i n g , s a m p l et y ：p e ，a n a l y s i sm e t h o d , p a n e l ，s i z e 四刖太堂丝堂位盈塞 s t a n d a r d , 2 4 点击r u n 按钮，输入p r o j e c t 名称，点击o k 开始分析。 2 5 查看数据图谱，生成报表。 3 作s p e c t r a lc a l i b r a t i o n 3 1 m a t r i xs t a n d a r ds e td s _ 3 3f o r3 1 0 0s y s t e m 试剂盒p n4 3 2 3 0 1 6 ，其中包括1 管 标准品，在4 - 8 0 c 保存，内含5 种染料：6 - f a m 、v i c 、n e d 、p e t 、l i z 。 3 2 m a t r i x 标准品制备m d i 甲酰胺1 9 5t t lm a t r i x 标准品5 儿 3 33 1 0 0 ：在9 6 - 孔板的两排1 6 个孔中分装1 0 “l ，9 5o c 变性5m i n 一+ 冰冷3r a i n 。 切勿在m a t r i x 标准品中加入g s 分子量标记。 3 4 在3 1 3 0 d a t a c o l l e c t i o n 软件的p l a t e v i e w 页面，点击n e w 。然后在p l a t e e d i t o r 页面，完成以下设置：为检测板命名；选择适当的s p e c t r a lc a l i b r a t i o n ；在p l a t e t y p e 栏选择9 6 - w e l l ；点击f i n i s h 。如下填写完成h a t ee d i t o r 表( 样品表) ： 每一个样品填入样品名；在d y es e t 栏选择g 5 ；r u nm o d u l e 选 s p e c t 3 6 _ p o p 4 d e f a m t m o d u l e ；s p e c t r a lp a r a m e t e r 选择m b 【s t d g e s c 孤 s e t c 5 p a r 。 附录5 ：a b l 3 1 0 遗传分析仪的操作方法 1 开机 1 1 打开3 1 0 主机，然后打开微机，打开d a t ac o l l e c t i o n 软件。 1 2 在i n s t r u m e n t 菜单下，选择m a n u a l c o n t r o l 1 3 选中s y r i n g eh o m e ，点e x e c u t e 执行。 2 安装毛细管，灌胶 2 1 从4 冰箱取出p o p 一4 胶，室温回温3 0 分钟。 2 2 吸取少量p o p 一4 ，将注射器来回抽动几次使胶浸润注射器内壁，然后将胶排 净。 2 3 吸取p o p 一4 适量( o 2 m 1 ) ，用d ih 2 0 洗净注射器外壁，擦干，于p u m pb l o c k 右侧上紧。将胶放回4 c 冰箱。 2 4 装好毛细管。 2 5 进入m a n u a l c o n t r o l 菜单，关闭缓冲阀f ( b u f f e r v a l v e c l o s e ) ，松开废液阀门， 手指压注射器排净管道中气泡，关上阀f ( b u f f e r v a l v e c l o s e ) 。 2 6 进入m a n u a lc o n t r o l 菜单，打开缓冲阀f ( b u f f e rv a l v eo p e n ) ，同样方法排净管 道中气泡，然后关闭缓冲阀门。 2 7 松开c a p i l l a r yf i t t i n g ，排净毛细管一侧的气泡，关紧f i t t i n g ，注意毛细管顶端 位于管路十字架的右边缘。 2 8 将毛细管固定于检测窗口h o l d e r 处，注意毛细管窗口之清洁( 可用无水乙醇清 洗) ，毛细管窗口应与机器检测窗口位置吻合( 此点可用毛细管上的m a r k e r 位 于检测窗边缘来证实) 。 2 9 毛细管另一端插入电极端，使尖端比电极略低约o 5 m m ，同时用手指轻轻左 右调节毛细管，使之尖端贴近电极尖端( 间隔约2 毫米) ，调好后用胶带固定， 合上控温板门。 2 1 0 在h s t r 呦e n t 菜单下执行a u t o s a m p l e rc a l i b r a t i o n 命令。出现a u t o s a m p l e r 四刖太差簋堂位j 金窑 c a l i b r a t i o n 窗口根据右下角的提示进行操作。 2 1 l 打开m a n u a lc o n t r o l ，执行s y r i n g eh o m e ，然后选择s y r i n g ed o w n ，输入合 适的值并执行，使曲柄几乎与注射器的活塞顶部接触。 2 1 2 具体方法：可先输入较大的值，如2 0 0 ，然后待靠近后，将值减少，如1 0 0 ，5 0 ， 2 0 5 。 3 创建m a t r i x 文件和定义分子量标准： 点击样品名栏的栏标题以全选s a m p l ef i l e s ，然后在s a m p l e 下拉菜单中选 i n s t a l ln e wm a t r i x ，再依据m a t r i x 文件所在的路径找到并导入与所用d y es e t 相匹 配的m a t r i x 文件，点击o k 。 在s i z es t d 栏点击第一个样品右边的小三角形按钮，选择d e f m en e w ，根据 所显示的分子量标准图谱输入各片段的b p 数。如果使用的s i z es t a n d a r d 是 g s r o x 5 0 0 ，则各片段的大小是：5 0 、7 5 、1 0 0 、1 3 9 、1 5 0 、1 6 0 、2 0 0 、3 0 0 、3 4 0 、 3 5 0 、4 0 0 、4 5 0 、4 9 0 、5 0 0 。其中2 5 0b p 不定义，数值为0 ，取名保存；所有样品 均分别指定内标或共用该p r o j e c t 内电泳质量比较好的样品的内标； 4 设置参数 运行g e n e s c a n 3 i 软件，在s e t t i n gm e n u 中设置分析参数、设定毛细管温度和 进样时间。 a n a l y s y sr a n g e ：2 4 0 0 - - 7 0 0 0 d a t ap r o c e s s i n g ：b a s e l i n ea n dm u l t i c o m o n n e n t p e a k