（发育生物学专业论文）发育相关几个重要信号通路分子的研究.pdf

几个发育相关重要信号通路分子的研究 中文摘要 脊椎动物的胚胎图式形成需要多种保守的信号通路删a l 、b m p 、w n t 、 h e d g e h o g 和f g f 等，它们构成一个复杂的调控网络，参与调控胚胎发育过程中 的各种生命活动。 左右轴是脊椎动物三个重要的体轴之一，它的形成同样需要多种信号通路 的共同调节。 本论文的第一部分利用氯化锂( l i c i ) 作为经典w n t 信号通路的特异激活剂， 通过原位杂交技术，首次发现了经典w n t 信号参与体节发生的左右对称性调节。 研究发现，在斑马鱼原肠胚早期用l i c i 处理，能使胚胎在早体节期产生不对称 性体节。体节发生中的两个关键调控分子：脚和h e r l ，在l i c i 处理过的胚胎 中也出现两侧不同步表达的现象。并且，在胚胎发育后期，心脏和肝脏的左右位 置特性也发生了改变。但是，n o d a l 信号通路的关键组分( s o u t h p a w ，l e f t y l 和 p i t x 2 a ) 的表达图式却没有发生相应的改变，这些结果表明，在斑马鱼中，l i c i 造成的不对称性体节和器官水平上左右位置的缺陷并不是由于n o d a l 信号的改 变引起的另外，我们也发现，l i c i 处理可能通过干扰中轴中胚层的发育间接引 起s o u t h p a w ( s p a w ) 的异位表达。 h e d g e h o g 信号通路在胚胎发育中起着重要作用。它参与细胞增殖、分化和 多种组织的模式形成。在脊椎动物中，s o n i ch e d g e h o g 作为一种形态发生素，能 形成浓度梯度，诱导周围的不同位置的细胞产生不同的分化命运。 本论文的第二部分是以头索动物文昌鱼为实验材料，利用文昌鱼在生命演化 过程中独特的进化地位，首次对h e d g e h o g 信号通路的几个关键组分( h e d g e h o g ， p a t c h e d , s m o o t h e n e d ，g l i ，s u p p r e s s o r - o f - f u s e d ) 在系统进化学、基因组结构和表 达图式上，进行了系统地研究。研究发现，文昌鱼h e d g e h o g 通路几个主要分子 在系统进化上都位于脊椎动物同源分子进化学分支的基部，符合文昌鱼在传统分 类学中的进化地位。在基因组结构特征方面，文昌鱼与脊椎动物更相似。文昌鱼 山东大学硕士学位论文 无论是对于无脊椎动物果蝇，还是对于脊椎动物斑马鱼和人而言，都倾向于拥有 更多数量的外显子，甚至存在一些在其他物种中既没有相应大小也没有对应蛋白 序列的外显子，说明文昌鱼h e d g e h o g 通路几个主要基因，在基因表达产物的调 节上具有一定的特殊性，还具有有头索动物的原始属性；在时空表达方面， h e d g e h o g 通路几个主要基因的表达图式有很大的相似性，都在形成中和新形成 的体节、分化中的原肠腔壁和头部中内胚层表达，这与在果蝇和脊椎动物同源基 因的表达情况也很相似，说明h e d g e h o g 信号通路在进化中十分保守。 本论文的第三部分研究了e c s i t 在斑马鱼早期胚胎发育中的功能。e c s i t 是目 前已知的b m p 信号通路和t o l l 信号通路的唯一交叉点，在脊椎动物的胚胎发育 和自身免疫调节中都具有重要的作用。通过在斑马鱼胚胎早期注射m o r p h o l i n o ， 抑制e c s i tm r n a 的翻译，本研究首次发现，胚胎早期绝大部分b m p 信号，像 b m p 4 ，v o x ，e v e l 等，都受到了抑制，但v e n t 的表达却没有明显的改变。这些结 果说明e c s i t 只介导部分的b m p 信号。此外，还发现巨噬细胞的早期m a r k e r 基 因t c p l 的表达也受到了抑制，表明e c s i t 可能同样参与巨噬细胞的成熟分化。 关键词：左右信号；体节不对称；l i c i ；h e d g e h o g 通路； e c s i t 2 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t v e r t e b r a t ee m b r y o n i cp a t t e r n i n gr e q u i r e ss e v e r a lc o n s e r v e di n d u c t i v es i g n a l s ， i n c l u d i n gn o d a l ，b m p ，w n t , h e d g e h o ga n df g fs i g n a l s ，w h i c hh a v es h o w nt o c o n s t i t u t eac o m p l e xr e g u l a t o r yn e t w o r kt h a ta r er e s p o n s i b l ef o ra l lt h ee v e n t si n e m b r y o g e n e s i s l e f t r i g h t ( l r ) a x i si so n eo ft h et h r e em a j o ra x e si nv e r t e b r a t e s t h eg e n e r a t i o n o fl o ra s y m m e t r ya l s or e q u i r e si n t e r a c t i o no fm a n y s i g n a l s t h ef i r s tp a r to ft h i ss t u d yf i r s t l yd i s c o v e r sas e c o n dr o l eo fw n t s i g n a l i n gi nl - r r e g u l a t i o no fs o m i t o g e n e s i s ，u s i n gl i c lc h l o r i d e ( l i c l ) a sas p e c i f i ca c t i v a t o ro f c a n o n i c a lw r i ts i g n a l i n g ，o u rd a t as h o ww h e ne m b r y o sa r et r e a t e db yl i c la t e a r l y - g a s t r u l a t i o n ，a s y m m e t r i cs o m i t e sa r ef o u n di ne a r l ys o m i t es t a g e t h eb i l a t e r a l s y m m e t r i ce x p r e s s i o n so fh e r la n d f g f 8 a ，t w oc r i t i c a lm e m b e r si ns e g m e n t a t i o nm o d e l ， a r ed e s y n c h r o n i z e di nl i c i t r e a t e de m b r y o s l - ra s y m m e t r i e so ft h eh e a r ta n dl i v e r a r ea l s od e f e c t i v ei nt h es u b s e q u e n td e v e l o p m e n t h o w e v e r , t h ee x p r e s s i o n so fn o d a l p a t h w a yc o m p o n e n t s ( s o u t h p a w ，l e f l y la n dp i t x 2 a ) d on o tc o r r e s p o n d i n g l yc h a n g e d t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t ed e f e c t si ns o m i t o g e n e s i sa n d o r g a na s y m m e t r i e si n d u c e db y l i c ia r en o td u et ot h ei n t e r r u p t i o no fn o d a ls i g n a l i n g m o r e o v e r , a b e r r a n ts p a w e x p r e s s i o n sa f t e rl i c it r e a t m e n tp r o b a b l yr e s u l tf r o mt h ei m p a i r m e n to ft h en o t o c h o r d d e v e l o p m e n ti nz e b r a f i s h h e d g e h o gs i g n a l i n gp l a y sam u l t i p l er o l ei nm a n yp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gc e l l p r o l i f e r a t i o n ，c e l l f a t e d e t e r m i n a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fv a r i o u st i s s u e s i n v e r t a b r a t e s ，s o n i ch e d g e h o ga c t sa sam o r p h o g e nt h a ti n d u c e sc e l l si n t od i f f e r e n tc e l l f a t e sb yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n t h es e c o n dp a r to ft h i ss t u d yf i r s t l yf o c u s e so nt h ep h y l o g e n e s i s ，g e n o m i c sa n d e x p r e s sp a t t e mo fs e v e r a li m p o r t a n tm e m b e r so fh e d g e h o gs i g n a l i n gi na m p h i o x u s i n t h i sp a r t ，w eh a v es h o w nh e d g e h o gp a t h w a y g e n e s ( h e d g e h o g , p a t c h e d , s m o o t h e n e d , g na n ds u p p r e s s o r - o f - f u s e d ) a r eb a s e do nt h ev e r t e b a t eb r a n c h e s i ng e n o m i cs t r u c t u r e 3 山东大学硕士学位论文 o ft h e s eg e n e s ，a m p h i o x u si sm o r es i m i l a rt ov e r t e b r a t e s a m p h i o x u st e n d st op o s s e s s m o r ee x o n st h a nd r o s o p h i l aa n dz e b r a f i s ha n dh u m a n t h e s er e s u l t si n d i c a t et h e h e d g e h o gp a t h w a yg e n e si na m p h i o x u ss t i l lh a v ep r i m i t i v ec h a r a c t e r i s t i c si ng e n e r e g u l a t o r y i ne x p r e s s i o np a t t e r n ，t h e s eg e n e sh a v em a n ys i m i l a r i t i e st oe a c ho t h e r i n c l u d i n gs o m i t e ，a r c h e n t e r o n a n dh e a dm e s o e n d o d e r ma n dt o h o m o l o g e s i n d r o s o p h i l aa n dv e r t e b r a t e s t h i sd e m o n s t r a t e sh e d g e h o gs i g n a l i n gi se v o l u t i o n a r y c o n s e r v e d t h et h i r dp a r to ft h i ss t u d yi sm a i n l yo ne c s i ti nz e b r a f i s he m b r y o g e n e s i s e c s i t i ss of a rt h eo n l yk n o w ni n t e r m e d i a t eb e t w e e nt o l la n db m p s i g n a l i n gi nv e r t e b r a t e s a n dp l a y sac r i t i c a lr o l ei nb o t he m b r y o g e n e s i sa n di m m u n i t yr e g u l a t i o n b yi n j e c t i o n o fe c s i tm o r p h o l i n oi n t ol - c e l ls t a g eo fz e b r a f i s he m b y o s ，w ef i n dt h a tm o s tb m p s i g n a l i n g , i n c l u d i n gb m p 4 ，v o xa n de v e la r ei n h i b i t e d t h e s er e s u l t ss h o we c s i t c o n v e y sp a r to fb m ps i g n a l i n g f u t h e r m o r e ，e a r l ym a c r o p h a g em a r k e rg e n et c p li s a l s os u p p r e s s e d ，w h i c hs h o we c s i tm a yi n v o l v ei nm a t u r a t i o no f m a c r o p h a g e s k e y w o r d s ：l e r - r i g h ts i g n a l s ；a s y m m e t r i cs o m i t e s ；l i c i ；h e d g e h o gs i g n a l i n g ；e c s i t 4 山东大学硕士学位论文 i i 符号说明 英文缩写英文全名 l i c ll i m i u mc h l o r i d e l p ml a t e r a lp l a t em e r s e d e m a p a l k a l i n ep h o s p h a t a s e b p b a s ep a i r b c 口 5 一b r o m o 一4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y - p h o s p h a t e b s ab o v i n es e r u ma l b a m d ad a l t o n d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i g d i g o x i g e n i n d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d e e g t a e t h y l e n eg l y c o l b i s ( 2 一a m i n o - e t h y l e t h e o - t e t r a a c e t i ca c i d i p t g i s o p r o p y l - -1 3 - t h i o g a l a c t o p y r a - n o s i d e n b tn i t r ob l u et e t r a z o l i u m p b s p h o s p h a t a t e - b u f f e r e ds a l i n e p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t r i st r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) - a m i n o m e t h a n e s d ss o d i u md o d e c y ls u l p h a t e s s cs t a n d e r ds a l i n ec i t r a t e x g a l5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l p - d - g a l a c t o s i d e uu n i t 中文 氯化锂 侧板中胚层 碱性磷酸酶 碱基对 5 溴4 氯3 吲哚磷酸盐 牛血清白蛋白 道尔顿 焦碳酸二乙酯 地高辛 二甲亚砜 乙二胺四乙酸 乙二醇双( 2 氨基乙基) 四乙酸 异丙基一1 3 d 一硫代半乳糖 苷 硝基四氮唑盐 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 三( 羟甲基) 氨基甲烷硫氧 还原蛋白 十二烷基苯磺酸钠 标准柠檬酸盐溶液 5 溴4 氯3 吲哚1 3 d 半 乳糖苷 酶活性单位 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 日期：型：墨：l 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷 件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：受r , ，宣星i l 导师签名：勉 山东大学硕十学位论文 第一部分 lici 对斑马鱼胚胎早期左右信号转导的影响 上- - ! b 刖菁 左右轴是脊索动物三个重要的体轴之一。以人为例，器官位置的左右不对 称是非常明显的。心脏、脾脏、胃和胰腺位于左侧，而胆囊和大部分肝脏位于右 侧，支气管同样存在左右不对称性，左支气管分为三支，右支气管分为两支。在 胚胎发育过程中，心脏是形态学上最早表现出左右不对称的器官。例如，在斑马 鱼中，直向的心管在胚胎受精后2 4 h 才开始向左扭曲( a h m a de ta 1 ，2 0 0 4 ) ，然而在 分子水平上，左右不对称性早在胚胎体节形成期( 1 8 h p f ) 就已经显现出来。n o d a l 家族中很多成员，如驴j ( 1 e f t y l ) ，l f t 2 ( 1 e f t y 2 ) ，n o d a l 并n p i t x 2 等，在这个时期均 在左侧特异性表达( t i a na n dm e n g ，2 0 0 6 ) 。一些研究表明，左右不对称性的产生， 能够分为三个连续阶段：在第一阶段，改变胚胎的两侧对称机制，这依赖于物种 的不同，在原肠作用前后不久发生；在第二阶段，左右极性信号自组织者 ( o r g a n i z e r ) 转导至边侧的侧板中胚层( 1 a t e r a lp l a t em e s o d e r m ，简称l p m ) ，激 活基因的不对称表达；在第三阶段，左右信号分子的不对称表达引起部分细胞水 平上的改变，进而导致组织和器官的不对称发生( s h i r a t o r ia n dh a m a d a ，2 0 0 6 ，t i a n a n dm e n g ，2 0 0 6 ) 。 在小鼠中，腹节流( n o d a lf l o w ) 是指腹节( n o d e ) 处向左运动的液体流，它 在改变对称性机制中起着非常关键的作用。腹节不同于亨氏节，亨氏节是位于小 鼠柱形胚胎内部、围绕小鼠胚胎原节的背部突出部分( h i r o k a w ae ta 1 ，2 0 0 6 ) ，而 腹节看起来就像原肠胚中期胚胎的一个表面凹口( 图1 a ) ，腹节细胞表面的纤毛 向后倾斜并高速旋转产生的向左特异流动的腹节流( 图1 d ) 。在腹节流的作用下， 一些膜包被的微粒，称为腹节囊泡( n o d a lv e s i c u l a rp a r c e l s ，简称n v p s ) ，也随之 发生迁移，并最终在胚胎左侧引起细胞内c a 2 + 浓度的特异性升高和基因的不对称 表达。在斑马鱼中，k u p f f e r 泡( k u p f f e r sv e s i c l e ) 是小鼠腹节的同源器官。n o d a l 的一个配体，s p a w 最初在尾芽的两侧( 4 6 体节期) ，围绕k u p f f e r 泡对称表达。随 后，印伽开始在左侧l p m 中表达( 1 0 1 2 体节期) ，并且这种特异表达图式随着时 问的推移自j i 向前移动进而在前端l p m 巾辙活其他捧冈( 如所，i f t 2 ，c y c ，p i t x 2 等) 的表达( 图1 e ) 。 围1 腹节纤毛的旋转产生的向左的液体流。( a ) 8 0d p c 小鼠胚胎的侧面观标尺1 0 0 u m ( b ) 脱节空腔的腹面观，前一后轴( a - p ) 和左肃( l - r ) 轴方向已彝标明，打色箭头代表腹节流 的方向。标尺p 1 0 u r n ( c ) 高倍分辨率f 的小鼠胚眙的单纤毛。标尺l u r n 。( d ) 腹节纤毛 的局速旋转产生一个向左的腹节流的模式图。( e ) 斑马龟中左右信号转导过帮。芹右信号 自尾芽转导 u 矗侧l p m ，进而激活基因的表达。前= 幅改自( $ h i r a t o r ia n d h a m a d a ，2 0 0 6 ) t 削 d 改自f h i r a k a w ac ta 1 2 0 0 6 ) ，幽e 改 | p e e t e r se ta l ，2 0 0 6 ) 。 在胚胎左一右轴形成的过程巾，体节会在胚胎f 部脊索两侧自前向后有条= _ 卜 素地形成。根据“分子时钟和波振商”模型( a n d r a d ee ta i ，2 0 0 5 ，a u l e h l aa n d h e r n n a n n ，2 0 0 4 ，b e s s h oa n dk a g e y a m a ，2 0 0 3 ，g i u d i c e l l ia n dl e w i s ，2 0 0 4 ，k i e f e r , 2 0 0 5 ) ，如图2 所示，在体节形成过程中，波浪式的n o t c h 信号作为分子时钟时 问周期性地扫过预定体节叶l 胚层而白后向前的f g f s 浓度梯度作为波振面，逐渐 退回至尾芽尖端。| j 订者将确定新生体节的边界，后者将确定新生体节的大小。另 外，视黄酸信号白前向后形成与f g p d 相反的梯度，从而稳定波振面的位置。 b 山东大学硕士学位论文 c d c 心 c c 玲 协 j = 拦 o z c 玲 c c c 乃 们 段 已 s 孙 s l 8 0 图2 鸡中体节发生的分子机制。n o t c h 信号作为分子时钟，周期性地扫过p s m 。魄庐自后向 前的浓度梯度作为波振面，逐渐退回至尾芽尖端。图版改i 刍( a n d r a d e e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 经典w m 信号同样也参与体节发生，它同时调节分子时钟( c l o c k ) 和波振面 ( w a v e f r o n t ) ( a u l e h l aa n dp o u r q u i e ，2 0 0 6 ，a u l e h l ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在小鼠中，w n t 信号通路的一个负调节因子a x i n 2 呈现时钟周期性振荡的表达图式，甚至在n o t c h 信号缺失的小鼠中也是如此( a u l e h l ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ，这暗示w n t 信号在体节发生过 程中位于n o t c h 信号上游。另外，在w n t 3 a 的次形态突变( h y p o m o r p h i cm u t a t i o n ) 小鼠中，龟留的表达也受到了抑$ 1 j ( a u l e h l ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 同时，n o t c h 、w n t 、f g f 信号通路也参与了脊椎动物的左右信号转导。在小 鼠中，无论是n 0 t c h 信号的配体d l l l 的功能缺失，还是其受体n o t c h l 和n o t c h 2 的突 变体都表现出多种器官左右特异位置的缺陷( k r e b se ta 1 ，2 0 0 3 ) ，并且n o t c h 信号 对n o d a l 在腹节的特异表达也是必需的( k r e b se ta 1 ，2 0 0 3 ，r a y ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。f g t s 在鸡和兔中是右侧决定予( f i s c h e re ta 1 。2 0 0 2 ) ，而在鼠中是左侧决定子( f i s c h e re t 7 山东大学硕士学位论文 a 1 ，2 0 0 2 ，m e y e r sa n dm a r t i n ，19 9 9 ) 。 至于w n t 信号参与脊椎动物的左一右决定已有一系列研究报道。在爪蟾中，将 x w n t 8d n a 注射到背部分裂球中增加发育后期异位心脏的比例( d a n o sa n d y o s t ， 1 9 9 5 ) 。在斑马鱼胚胎早体节期，过表达w n t b e t a c a t e n i n 信号引起n o d a l 通路相关 基因在脑和l p m 中的两侧对称表达( c a r le ta 1 ，2 0 0 7 ) 。在鸡中，经典的w n t 信号通 路对n o d a l 信号的调节是完全充分且必要的( r o d r i g u e z e s t e b a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。w n t 3 a 突变体小鼠也表现出左右信号的紊乱( n a k a y ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 研究表明，w n t 信号在体节发生和左一右决定中都能调节d e l t a n o t c h 信号 ( a u l e h l ae ta 1 ，2 0 0 3 ，n a k a y ae ta 1 ，2 0 0 5 ) ，而在斑马鱼中，抑$ 1 j d e l t a n o t c h 会引起 左右轴图式形成的缺陷和暂时的不对称性体节( k a w a k a m i ，2 0 0 5 ) 。但是w r i t 信号 是否参与体节发生的对称性调节，还需要进一步的研究。 本研究发现，w n t 信号在体节发生的两侧对称性调节中起到十分关键的作 用。在斑马鱼原肠胚早期用l i c l 处理，能使胚胎在早体节期产生左右不对称性体 节。体节发生模型中的两个关键组分：h e r l 并1 f g l 8 a ，在l i c l 处理后也出现两侧不 同步现象。并且在胚胎发育后期，心脏和肝脏的左右位置特性也发生了改变。但 是，n o d a l 信号通路的各种组分( s o u t h p a w ，l e f l y l t f l p i t x 2 a ) 的表达图式却没有发 生相应的改变，这些结果表明，在斑马鱼中，l i c l 造成的不对称性体节和器官水 平上左右位置的缺陷并不是由于n o d a l 信号的改变引起的。另外，我们也发现， l i c l 处理可能通过干扰中轴中胚层的发育，进而引起s p a w 的异位表达。 材料和方法 一、斑马鱼的养殖、胚胎的采集和l i c l 处理 野生型斑马鱼购自济南市水族管，养殖于2 8 5 0 c 过滤循环水系统，控$ 1 j 1 4 h 光照时间。饵料为水蚯蚓( 学名叫水丝蚓，l i m n o d i l u s h o f f i n e i s t e r i ，隶属于环节 动物门，寡毛纲，颤蚓科) ，每日饲喂2 次。具体条件参照t h ez e b r a f i s hb o o k ( w e s t e r f i e l d ，2 0 0 0 ) 。胚胎取自早上光照前追尾的斑马鱼。 l i c i 处理参照( k i me ta 1 ，2 0 0 2 ) 。将同时期的胚胎在2 8 5 0 c ，o 3ml i c l q b 浸 山东大学硕士学位论文 泡8 分钟，用海水冲洗数遍后，转至2 8 5 0 c 环境中培养。不同时期的胚胎在4 多 聚甲醛p b s 固定液中室温固定1 4 , 时或4 0 c 过夜，然后换至甲醇中保存在一2 0 0 c ， 用于整封原位杂交。 二、斑马鱼中各种m a r k e r 基因的克隆 l 、材料与试剂 r n a g e n t st o t a lr n a i s o l a t i o ns y s t e m p r o m e g a b da d v a n t a g e t m2p c rk i t c l o n t e c h p g e m - te a s yv e c t o r p r o m e g a t a qp o l y m e r a s e ( 5 i ， l i ，) t i a n g e n d n t p(10mm)tiangen h q & q g e le x t r a c t i o nk i ti iu g e n e h q & q p l a s m i dm i n ik i tu - g e n e p g e m te a s yv e c t o r p r o m e g a t 4d n a l i g a s e p r o m e g a dh5a菌株promega x - g a l ( 4 0 m g m l ，溶于二甲基甲酰胺) s i g m a i p t g ( 2 ，溶于水)s i g m a l b 液体培养基：胰化蛋白胨1 0 9 ；酵母提取物5 9 ：氯化钠1 0 9 ；加蒸馏 水至1 0 0 0 m l ，溶解后用n a o h 调p h 至7 4 ，高压灭菌。 l b 固体培养基：胰化蛋白胨1 0 9 ：酵母提取物5 9 ：氯化钠1 0 9 ：琼脂1 5 9 ， 加蒸馏水至1 0 0 0 m l ，溶解后用n a o h 调p h 至7 4 ，高压灭菌。 2 、斑马鱼胚胎总r n a 的提取 所有使用的一次性t i p 、离心管经1 2 1 0 c 湿热高压灭菌后烤干备用。 ( 1 ) 向胚胎中，加入6 0 0u l 冰浴的裂解液，剧烈振荡至细胞完全裂解。 ( 2 ) 加入6 0u l 乙酸钠，颠倒混匀。 ( 3 ) 加入等体积的酚氯仿异戊醇( 2 5 2 4 1 ) ，颠倒混匀3 5 次，剧烈 振荡1 0 秒，冰浴1 5 m i n 。 ( 4 ) 1 0 ，0 0 0 94 0 c 离, l , 2 0 m i n 。 9 山东大学硕士学位论文 1 0 ( 5 ) 取上清液转移至一个新的1 s m l 离心管中，加入等体积的异丙醇， 混匀后2 0 0 c 放置3 0 m i n 。 ( 6 ) 1 0 ，0 0 0 94 。c 离一已, 1 0 m i n ，收集r n a 沉淀。 ( 7 ) 加入冰浴的7 5 乙醇( d e p c 水配制) ，吹散沉淀，1 0 ，0 0 0 94 。c 离 , 1 二, 1 0 m i n ，洗涤r n a 后弃7 5 乙醇。 ( 8 ) 空气干燥1 0 m i n ，加18 0u ln u c l e a s e f r e e 水溶解r n a 沉淀。 ( 9 ) d n a s e 消化 1 0 x b u f f e r2 0u l d n a s e ( r n a s e f r e e )2u l 总r n a 1 8 0 u l 总体积 2 0 2u l ( 1 0 ) 混匀后，3 7 0 c1 5 m i n 消化d n a 。 ( 1 1 ) 加入等体积的酚氯仿异戊醇，颠倒混匀。离心。 ( 1 2 ) 取上清液至新的1 5 m l 离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇，颠 倒混匀。离心。 ( 1 3 ) 取上清液至另一个1 5 m l 离心管中，加入2 0u l 乙酸钠、等体积的 异丙醇，2 0 0 c 放置3 0 m i n 。 ( 1 4 ) 1 0 ，0 0 0 94 。c 离，l 1 0 m i n ，收集r n a 沉淀。 ( 1 5 ) 加入冰浴的7 5 乙醇( d e p c 水配制) ，吹散沉淀，1 0 ，0 0 0 94 0 c 离, 1 二, 1 0 m i n 洗涤r n a ，弃乙醇。 ( 1 6 ) 空气晾干1 5 m i n 。) j t l 2 0u ld e p c 处理的水溶解r n a 沉淀。 3 、c d n a 第一链的合成 ( 1 ) 于离心管中加入如下反应物 总r n a ( 1 - 5u g ) 9 5u l d n t p ( 2 5 m m ) 2u l r a n d o mp r i m e r ( 1 0t a x i ) 2u l 总体积 1 4 5u l 山东大学硕士学位论文 ( 2 ) 7 0 0 c 加热5 m i n 后，迅速冰上冷却2 m i n 。短暂离心后，再加入以下组 分 5 x f i r s ts t a n db u f f e r 4u l d t t ( o 1 m ) lu l r a s i n ( 4 0 u u l ) 0 5 u l t i a n s c r i p tm m l v ( 2 0 0 u u l ) 1u l ( 3 ) 2 5 0 c 温浴10 m i n 后，4 2 0 c 温浴5 0 m i n 。 ( 4 ) 9 5 0 c 加热5 m i n 终止反应，冰上保存。 ( 5 ) 用r n a s e f r e ed d h 2 0 将反应体系稀释到5 0u l ，冻存。 4 、引物设计与合成 g e n b a n k 数据库中获取了斑马鱼m y o d ( n m _ 1 3 1 2 6 2 ) ，鬼儡( n m _ 1 3 1 2 8 1 ) ， h e r l ( n m 一1 3 1 0 7 8 ) ，m n t 2 ( n m 一1 5 2 8 9 3 ) ，f a b p l o ( n m 一1 5 2 9 6 0 ) ， s p a w ( n m 一1 8 0 9 6 7 ) ，驴j ( n m 一1 3 0 9 6 0 ) ，p i 红2 a ( n m 一1 3 0 9 7 5 ) 的基 因序列。针对这些序列，设计的引物序列如下： m y o d ： s ：5 c a a c g a c a t g c a c t t c l h t g3 a ：5 g t c a t a g c t g t t c c g t c t t c3 产物长度4 8 0 b p 鬼儡： s ：5 a c t a a a c g c a c c c g c w 屺3 a ：5 c t c g g a a a c c a t c g a a a t3 产物长度3 6 7 b p h e r l ：s - 5 c c a g c a a t c c a a c c c a c c3 a ：5 a g c c a c t a a a c c g c a c c c3 产物长度4 2 0 b p t n n t 2 ：s - 5 a t g a c a t c c a c c g t aa g c3 a ：5 t g c c g a a c t g a t a c t g t a a c t c3 产物长度4 7 0 b p f a s p l o ： s - 5 a g aaa g c a t g g c c t t c a g c g g 3 a ：5 a c g c t t c a g a t c t t c t t g c t c t t c c3 产物长度3 9 3 b p 山东大学硕士学位论文 1 2 s p a w ： s ：5 a t t c g c a a t g c a g c c g g t c a t a g c3 a ：5 t c t t a c a c c g g t c t a t c c a c t g c g3 产物长度1 2 2 2 b p 驴j ： s ：5 a t g a c t t c a g t c c g c g c c g c g t g3 a - 5 t t a t a c a a c t g a a a t a t t g t c c3 产物长度l k b p i t x 2 a ： s - 5 a a g t t a t a g c t g c t t g c g a g c c g t c3 a - 5 g a c a t t c c a t c a c a g g a t t g g a c g c3 产物长度l k b 5 、p c r 反应与检测 反应体系 1 0 x t a qp o l y m e r a s eb u f f e r 5 d n t p ( 1 0m m )2 引物s ( 1 0u m ) 2 引物a ( 1 0u m ) 2 m g c l 2 ( 2 5 m m ) 3 t a q 酶( s u u 1 ) 1 c d n a 模板 2 d d i - 1 2 0 3 4 总体积5 0 ( u l ) p c r 产物用0 8 琼脂糖凝胶电泳检测，估算产物大小与浓度。 4 、p c r 产物的纯化 ( 1 ) j h 3 倍p c r 产物体积的p c r - ab u 仃e 开p c r 产物中，混匀； ( 2 ) 将d n a p r e pn l b e 置于2 m l 的离心管中，将上述混合液加入d n a p r e p t u b e 中，2 5 0 0 9 离一已, im i r a ( 3 ) 弃去流出液，于d n a p r e pt u b e 中加入7 0 0u lw 2b u f f e r 。2 5 0 0 9 离 心1 m i n ( 4 ) 重复上一步； 山东大学硕士学位论文 ( 5 ) 将d n a p r e pt u b e 置于一新的1 5 m l 的离心管中，1 2 0 0 0 9 离一i 二, l m i m ( 6 ) 将d n a p r e pt u b e 置于一新的1 s m l 的离心管中，于d n a p r e pt u b e j j l l 入2 5u l d d h 2 0 ，室温静置2 m i n 后，1 2 0 0 0 9 离心l m i n ； ( 7 ) 电泳检测，估计回收p c r 产物的浓度； 5 、p c r 产物的连接、转化和筛选 连接反应体系： 产物 3u l t 4d n a l i g a s e 1u l p g e m te a s yv e c t o r ( 5 0 n g u 1 ) 1u l 2 x r a p i dl i g a t i o nb u f f e r 5u l 总体积1 0u l 反应混合物4 0 c 连接过夜。 6 、转化与和蓝白斑筛选 ( 1 ) 将3u l 连接反应液加至2 0 0u l 感受态大肠杆菌d h 5 a ，轻弹混匀； ( 2 ) 冰浴4 5 m i n ； ( 3 ) 4 2 0 c 热激9 0 秒，之后立即置冰上冷却2 m i r a ( 4 ) 加5 0 0u l 液体l b 培养基，3 7 0 c ，1 0 0 转r a i n ，震荡培养l h ； ( 5 ) 细菌培养期间，用含有3 3 3u l4 0 m g m lx - g a l ( 溶于二甲基甲酰胺 和6 6 7u l2 i p t g ( 溶于水) 的混合液涂布直径9 c m ，含1 0 0u g m l 氨苄青霉素的固体l b 培养基平板。避光，3 7 0 c 干燥； ( 6 ) 将培养好的菌液涂布于上述平板上，3 7 0 c 避光培养1 2 1 6 d , 时； 7 、质粒d n a 的提取( h