（分析化学专业论文）高效液相色谱手性固定相法分离药物对映体.pdf

摘要 摘要 本论文是关于大环抗生素及其衍生物手性固定相，纤维素类手性固定相的药 物对映体的手性分离研究。主要包括手性化合物对映体的分离及影响对映体分离 各要素的考察与手性识别机理的探讨。 论文的第一章为引言，简要介绍了对映体分离的意义和常用方法。 论文第二章对大环抗生素手性固定相、多糖衍生物手性固定相、p i r k l c 型手 性固定相的研究及进展进行简要的评述。 论文第三章在极性有机模式下，在替考拉宁手性固定相上成功地分离了阿替 洛尔、美托洛尔、富马酸比索洛尔、普萘洛尔、异丙肾上腺素、沙丁胺醇、拉贝 洛尔等7 种b 一受体阻滞剂类药物，并初步探讨了固定相对溶质的手性分离机理。 异丙肾上腺素和沙丁胺醇获得了很好的分离，说明氢键可能对分离有利。阿替洛 尔保留最强，其次为普萘洛尔，说明溶质与手性固定相之间的兀啦作用、氢键作 用对溶质的保留起主要作用。保留最强的阿替洛尔和普萘洛尔并没有获得最好的 分离，说明强的保留并不意味着好的分离。固定流动相中的冰醋酸或者三乙胺的 含量，都得出了相似的结果，那就是手性溶质的保留因子均随着流动相中冰醋酸 三乙胺含量的增加而减小，分离因子基本保持不变，分离度减小，说明了流 动相极性的改变不影响手性识别的实质。手性溶质的结构才是产生手性识别的关 键因素。 论文第四章在极性有机模式下，七种氨基醇类药物，普萘洛尔、富马酸比索 洛尔、阿替洛尔、沙丁胺醇、异丙肾上腺素、美托洛尔、拉贝洛尔在替考拉宁， 苯异氰酸替考拉宁，3 ，5 二甲基苯异氰酸替考拉宁上进行了手性分离，考察了分 离机理，比较了3 种手性固定相上的不同的分离行为。手性固定相的不同结构影 响着手性分离的行为。在相同的情况下，7 种氨基醇类药物在每一种手性固定相 上的分离趋势相似。保留因子随着h o a c r e a 浓度的增加而降低。总的来说， 氨基醇类药物在3 ，5 二甲基苯异氰酸替考拉宁上的保留因子最长，而替考拉宁上 最短。这是因为替考拉宁上的 k - t 和偶极一偶极作用比苯异氰酸替考拉宁和3 ，5 二甲基苯异氰酸替考拉宁要少。说明冗吼和偶极一偶极作用对保留有利。总的来 说，氨基醇类药物在替考拉宁上的分离最好。替考拉宁上存在的氢键最多，说明 氢键对手性分离有利。增加h o a c 和t e a 能改变溶质和手性固定相表面的电荷， 摘要 甚至手性空腔也能影响分离的结果。在不添加h o a c 的情况下，固定t e a 的含 量0 0 5 ，普萘洛尔，富马酸比索洛尔，美托洛尔在3 ，5 二甲基苯异氰酸替考拉宁 比苯异氰酸替考拉宁上得到了更好的分离。这说明也许这些溶质更适合3 ，5 二甲 基苯异氰酸替考拉宁的空腔。强的保留并不意味着好的分离。在每一种手性固定 相上，各个溶质的分离因子基本不变，说明h o a c t e a 的比例并不影响手性分 离的实质。 论文第五章在三种涂敷型的纤维素生物手性柱( c d m p c ，c t b ，c r m b ) 与p i r k l e 型的( s ，s ) 一w h e l k - o l 手性柱上对一组结构相近的手性化合物，即安息香，安息香 乙醚和安息香丁醚进行了对映体分离研究。对这组化合物，c i ) m p c 显示出了很 好的手性识别性能，3 个化合物都得到了手性分离。本章对这组化合物在纤维素 衍生物手性固定相以及( s ，s ) - w h e l k o l 手性固定相上的识别机理进行了的探讨： ( 1 ) 在c d m p c 上，安息香获得了最好的分离，其次是安息香丁醚。醇类添加剂 通过与c d m p c 手性空腔当中或其附近的吸附点相结合，从而改变c d m p c 手性 空腔的立体环境而引起对手性识剐的影响。并且氢键也对手性识别产生影响。( 2 ) 在c t b 上，安息香和安息香乙醚得到了分离，而安息香丁醚在任何流动相下都 未获得分离，说明其不适应c t b 的手性空腔。氢键并不对手性识别起关键作用。 小体积的醇对安息香物质在涂敷型c t b 上的对映体分离优于大体积的酵。( 3 ) 在 c t m b 上，只有安息香获得了手性分离，安息香乙醚和安息香丁醚在任何流动相 条件下均为获得分离，说明这两种溶质不适合c t m b 的手性空腔。氢键对手性 识别起关键作用。( 4 ) 立体因素在p i r k l e 型手性固定相手性识别中起了重要的作 用。 论文第六章用万古霉素手性固定相( v a nc s p ) 及其四种衍生物手性固定相：苯 基异氰酸酯万古霉素手性固定相( p h e - v a nc s p ) ，间甲基苯基异氰酸酯万古霉素手 性固定相( m p v a n ) ，3 ，5 二甲基苯基异氰酸酯万古霉素手性固定相m p v a n c s p ) 和对氯苯基异氰酸酯万古霉素( p c i v a n ) 在极性有机相体系下，对3 个手性 化合物进行了对映体分离的研究。p h e v a n ，m p - v a n 和d m p v a nc s p 是通过衍 生化试剂苯基异氰酸酯，间甲基苯基异氰酸酯，3 ，5 二甲基苯基异氰酸酯或对 氯苯基异氰酸酯，分别和v a nc s p 反应而得。与v a n 相比，衍生物c s p 减小了 极性，减少了静电作用和氢键作用点，但同时增加了m f 【作用并增加了疏水性。 摘要 在不同的流动相中。不同的作用力对溶质的保留和手性识别起了不同的作用。在 极性流动相中，溶质与c s p 之间的肛兀作用，氢键作用力和空间位阻共同参与了 手性识别。盐酸氟西汀在5 种c s p 上都得到了分离，盐酸度洛西汀和盐酸帕罗 西汀在m p v a n 和d m p v a nc s p 上得到了分离。 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so i lt h ee n a n t i o s e p a r a t i u nu s i n gm a c r o c y c l i ca n t i b i o t i c s c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p s ) b yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( m l c ) ， i n c l u d i n ge n a n t i o s e p a r a t i o no fc h i r a lc o m p o u n d s ，s t u d yo fs e v e r a lf a c t o r sc o n c e r n i n g c h i r a ls e p a r a t i o na n dd i s c u s s i o no fc h i r a lr e c o g n i t i o nm e c h a n i s m i nc h a p t e r1 ，t h ei m p o r t a n c ea n dm e t h o d so fc h i r a ls e p a r a t i o ni s b r i e f l y i n t r o d u c e d i n c h a p t e r2 ，t h el i t e r a t u r e s o ft h r e ek i n d so f c s p s ，m a c m c y c l i cc s p s ， p o l y s a c c h a r i d ed e r i v a t i v ec s p sa n d p i r k l et y p ec s p sa m b r i e f l yr e v i e w e d i nc h a p t e x3 ，u n d e rp o l a ro r g a n i cm o d e ，t h es e v e na l n i i l oa l c o h o l sp r o p r a n o l o l ， m e t o p r o l 0 1 b i s o p r o l o lf u m a r a t e ，a t e n o l o l ，s a l b u t a m o l ，i s o p r e n a l i n e ，m e t o p r o l o l ， l a b c t a l o lw c r ee n a t i o n s e p a r a t e d0 1 1t e i c o p l a n i nc s p , u s i n gm e t h a n o la sm o b i l ep h a s e a n dh o a ca n dt e aa sm o b i l ep h a s ea d d i t i v e s w h e nt h ep r o p o 衔o no fh o a ca n d t e aw a s1 ：1 t h er e t e n t i o nf a c t o r sa n dt h er e s o l u t i o n so fs e v e na m i n oa l c o h o l sw e d e c r e a s e dw j t i lt h ei n c r e a s eo fh o a c t e ac o n c e n t r a t i o n , s e p a r a t i o nf a c t o r sk e p t c o n s t a n t t h ee x c e s s i v ea c i di n c r e a s e dt h ep o l a r i t yo fm o b i l ep h a s e ，t h ee l u t i n ga b i l i t y w a si n c r e a s e d w i t h o u th o a ca d d i t i v e 。t h er e t e n t i o nf a c t o r so ft h ea l n i n oa l c o h o l s w e r ed e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h ea m o u n to ft e a s e p a r a t i o nf a c t o r sk e p t c o n s t a n t ，e x c e p tl a b e t a l 0 1 t h ep o l a r i t yo fm o b i l ep h a s ei n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n g o ft e ac o n c e n t r a t i o n ，s ot h eh y d r o g e nb o n d i n gb e t w e e ns o l u t e sa n dc s p sd e c r e a s e d a l lt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o p o r t i o no fh o a ca n dt e ad i d n tc h a n g et h e e s s e n t i a lo fc h i r a ls e p a r a t i o n i nc h a p t e r4 ，u n d e rp o l a ro r g a n i cm o d e ，t h es e v o i la m i n oa l c o h o l sp r o p r a n o l 0 1 m e t o p r o l o l ，b i s o p r o l o lf u m a r a t c ta t e n o l o l ，s a l b u t a m o l ，i s o p r e n a l i n e , m e t o p r o l o l , l a b e t a l o lw e r ee n a t i o n s e p a r a t e do i lt e i c o p l a n i nc s p , p h e n y l i s o c y a n a t et e i c o p l a n i n ( p h e - t e ) ，a n d3 ，5 m i m e t h y l p h e n y l i s o c y a n a t et e i c o p t a n i n ( d m p - t e ) u s i n gm e t h a n o l 笛 m o b i l ep h a s ea n dh o a ca n dt e a 勰m o b i l ep h a s ea d d i t i v e s t h em e c h a n i s mo f e n a n t i o s e p a r e t i o nw a ss t u d i e da n dt h ed i f f e r e n tb e h a v i o ro fc h i r a ls e p a r a t i o nw a s c o m p a r e d d i f f e r e n t s t r u c t u r eo fc s pi n f l u e n c e dt h eb e h a v i o ro fc h i r a l a b s t r a c t s e p a r a t i o n s e v e na m i n oa l c o h o lh a v et h es i m i l a rt r e n do i le a c hc s e r e t c n t i o nf a c t o r s d e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s e do fc o n c e n t r a t i o no fh o a c ，i e a a l li na 1 1 a m i n oa l c o h o i g o tt h el o n g e s tr e t e n t i o no nd m p t i ec s e w l f i l et es h o r t e s t t i l i si sb e c a u s e 一扛a n d d i p o l e d i p o l eo f r ew a sl e s st h a np h e - t ea n dd m p 一 r e i ti n d i c a t e dt h a t l t - 兀a n d d i p o l e - d i p o l eb e n e f i tt or e t e n t i o n t h ee n a n t i o s e p a r a t i o no fa m i n oa l c o h o lw a sb e s to n t c t h eh y d r o g e nb o n d i n gw a sm o s to n r e s oh y d r o g e nb o n d i n gc o n t r i b u t e dt o e n a n t i o s e p a r a t i o n h o a ca n dt e a c a nc h a n g et h ec h a r g eo ft h es u r f a c eo fs o l u t e sa n d c s p s e v e nt h ec h i r a lc a v i t yc a ni n f l u e n c et h er e s u l to fe n a n f i o s e p a r a t i o n w i t h o u t h o a c ，b y f i x e dt h ec o n c e n t r a t i o no ft e aa t 0 0 5 ，p r o p r a n o l o l 。b i s o p m l o l f u m a m t e ，m e t o p r o l o lg o tb e t t e re n a n t i o s e p a r a t i o no nd m p - t et h a no i lp h e - t e m a y b e t h e s es o l u t e sa m o r es u i t a b l ef o r t h ec a v i t yo fd m p - t e s t r o n gr e t e n t i o nd i d n tm e a n g o o dc h i r a ls e p a r a t i o n n 忙s e p a r a t i o nf a c t o rw a sn e a r l yu n c h a n g e do ne a c hc s e i t i n d i c a t e dt h a tt h ep r o p o r t i o no fh o a c t e ad i d n ti n f l u e n c et h ee s s e n t i a lo fc h i r a l s e p a r a t i o n i nc h a p t e r5 , t h ee n a n t i o s e p a r a t i o no fag r o u po fc h i r a lc o m p o u n dw i t hs i m i l a r s t r u c t t l r ec o r r e s p o n d i n e j yw a ss t u d i e do nt h r e ek i n d so fc o a t e dc e l l u l o s ed e r i v a t i v e c h i r a l c o l u m n s ( c d m p c ，c t b ，c t m b ) , p i r k l et y p e( s ，s ) 一w h e l k - o l c h i r a l c o l u m n - - b e n z o i n ，b e n z o i ne t h y le t h e hb e n z o i nn - b u t y le t h e r t h r e es o l u t e sa l lg o t e n a n t i o s e p a r a t i o no nc d m p c o nf o u rc s p s ，t h em e c h a n i s mo fc n a n t i o s c p a r a t i o no f t h e s et h r e es o l u t e sw a sd i s c u s s e d ：( 1 ) b e n z o i ng o tt h eb e s tc h i r a ls e p a r a t i o no n c d n 伊c a n dt h e nb e n z o i ne t h y le t h e r t h ea l c o h o la d d i t i v e si nt h em o b i l ep h a s e i n f l u e n c et h ec h i r a lr e c o g n i t i o nt h r o u g ht h ec h a n g eo fs o l i de n v i r o n m e n to ft h ec h i r a l c a v eo nc d m 田c 肺e h y d r o g e n b o n di n t e r a c t i o na l s oi n f l u e n c et h e e n a n t i o s e p a r a t i o n ( 2 ) b e n z o i n ，b e n z o i ne t h y le t h e rg o te n a n t i o s e p a r a t i o no nc t b ，b u t b e n z o i nn - b u t y le t h e rd i d n tg o tc h i r a ls e p a r a t i o nu n d e ra n ym o b i l ep h a s e ri n d i c a t e d t h a tb e n z o i nn - b u t y le t h e rd i d n ts u i t a b l ef o rt h ec a v i t yo fc t b t h eh y d r o g e n b o n d i n gi n t e r a c t i o ni sn o ti m p o r t a n tf o rt h ee n a n t i o s e p a r a t i o n a l c o h o lw i t hs m a l l v o l u m ni sb e n e f i tf o re n a n t i o s c p a r a t i o no i lc t b ( 3 ) o n l yb e n z o i ng o te n a n t i o s e p a t i o n o nc t m b ，b e n z o i nn - b u t y le t h e rd i d n tg o tc h i r a ls e p a r a t i o nu n d e ra n ym o b i l e p h a s e i ti n d i c a t e dt h a tb e n z o i ne t h y le t h e ra n db e n z o i nn - b u t y le t h e rd i d n ts u i t a b l e v a b s t r a c t f o r t h ec a v i t yo fc t m b t h eh y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o ni sn o ti m p o r t a n tf o rt h e e n a n t i o s e p a r a t i o n ( 4 ) s t e r e of a c t o ri si m p o r t a n tf o rt h ee n a n t i o s e p a r a t i o no np i r k l e t y p e ( s ，s ) 一w h e l k - o lc h i r a lc o l u m n h i c h a p t e r6 ，f o u r n e wc s p s ，p h e n y l i s o e y a n a t e t e i c o p l a n i n ( p h e - t e ) ， m m e t h y l p h e n y li s o c y a n a t ev a n c o m y c i n ( m p - v a n ) ，3 ，5 - d i m e t h y l p h e n y l i s o e y a n a t e t e i c o p l a n i n ( d m p - t e ) a n dp - c h l o r o p h e n y li s o c y a n a t ev a n c o m y c i n 口c l v a n ) a 地 s y n t h e s i z e d f r o mt h em a c r o e y c l i c 舀y c o p e p t i d cv a n c o m y c mc s p ( v a n ) , u s i n g d e r i v a t i v e a g e n t s ，p h e n y l i s o c y a n a t e ，t e i c o p l a n i nm m e t h y l p h e n y li s o c y a n a t e ，3 ， 5 - d i m e t h y l p h e n y l i s o c y a n a t e0 1 p - c h l o r o p h e n y li s o e y a n a t e e v a l u a t i o na n dc o m p a r i s o n o ft h e s ef i v ev a n b a s e dc s p sa 佗p r o c e s s e dw i t h3r 比e m a t e $ u n d e rp o ( p o l a ro r g a n i c ) m o d e t h ep o l a r i t y , h y d r o g e nb o n d i n ga n de l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no fd e r i v a t i v ec s p s d e c r e a s e dw h i l e 氕冗a n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o ni n c r e a s e d f l u o x e t i n eg o tc h i r a l s e p a r a t i o no i lt h ef i v ec s p s w h i l ed u l o x e t i n ea n dp a r o x e t i n eg o tc h i r a ls e p a r a t i o no i l n t p v a na n dd m p v a n v i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎鎏盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位做储躲刍、贝够签字魄哕月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘茔有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名；召，r 膨导师签名： 签字日期：砷年6 月c f 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 签字日期：玺订年多月o 日 电话： 邮编： 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下完成的成果，该成 果属于浙江大学理学院化学系，受国家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公 开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以 任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本人完全意识到本声明 的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名 笏，只崔 嘲聊年g 月1 日 9 1 引言 第一章引言 手性分子是实物不能与其镜像重叠的分子。自然界以及生命体中蕴藏着大量的 手性分子，如氨基酸、单糖分子以及由它们构成的多肽、蛋白质和多糖等。互为 镜像与实物关系的两个分子为对映异构体( 简称对映体) ，它们具有相同的熔点、 沸点、偶极矩、折光率、相对密度、和在一般溶剂中的溶解度，也具相同的光谱 性质。对映体在物理性质上的不同，反映在具有不同的旋光性，即对偏振光的作 用不同。与非手性试剂作用时，其化学性质也一样。拜奥特( b i o t i b ) 最先发现某 些有机化合物的液体或者溶液具有偏转旋光作用，当时就推想这和物质组成的不 对称性有关系。1 8 4 8 年法国科学家巴斯德( l p a s t e u r ) 提出了光活性是由于分子的 不对称性所引起的，并且他用放大镜和镊子挑出了酒石酸钠铵两种不同的结晶晶 体，发现种晶体能使偏振光右旋，另一种晶体能使偏振光左旋。它们等浓度的 水溶液，其旋光度相等，方向相反。1 8 7 0 年不特列夫注意到，左旋、右旋和外消 旋的乳酸。1 8 8 4 年范霍夫和勒贝提出不对称碳原子的概念，并且预言某些分子， 如丙二烯型分子，即使没有不对称碳原子，也应有旋光异构体存在 1 1 对映体分离的意义 手性药物对映体与人体内的酶、受体、离子通道等生物大分子作用，表现出 错综复杂的对映体选择性，在人体内的药理作用、代谢过程及毒性存在着显著的 差异。大多数药物单一对映体疗效高，不良反应小，该类对映体称为优对映体， 而对于无活性或活性低的对映体称之为劣对映体，两个对映体的生物活性之比称 为优劣比值。在很多情况下，劣对映体不仅没有药效，而且还可能部分抵消对 映体的作用，甚至产生严重的不良反应。对映体之间表现出药理和临床应用性质 上的差异，并非偶然的现象，是因为手性药物对映体之问在药动学方面具有不同 的性质，若忽视对映体之间在药理作用上的差异，将付出高昂的代价甚至生命。 例如，2 0 世纪6 0 年代在欧洲市场上销售的镇静药酞胺哌啶酮( 反应停) 的疗效 来自r 对映体，而s 对映体却能引起胎儿畸形，曾带来了灾难性的后果，研究 发现这是由于药物对映体的立体选择性所造成。这引起了科学家的高度重视，由 引言 此在国外引发了手性药物开发的课题。 观察手性药物市场，可以发现其里现逐年增长态势。在1 9 9 3 年，手性药物的 全球销售额只有3 3 0 亿美元；1 9 9 4 年为4 5 2 亿美元；1 9 9 8 年达到8 6 7 亿美元；1 9 9 9 年为9 6 3 亿美元( 也有资料统计为1 1 5 0 多亿美元) ；2 0 0 0 年为1 3 3 0 亿美元。至2 0 0 3 年，手性药物市场以每年8 的速度递增。吲。世界上单一对映体形式手性药物的 销售额持续增长。单一对映体药物制剂的市场份额从1 9 9 6 年的2 7 增加到目前的 约6 1 。2 0 0 4 年销售总额名列前2 0 的药物，手性单一对映体药物为1 0 个，占整个 数目的5 0 。销售额在前l o 位的单一对映体“重磅炸弹级”药物是p f 磁_ r 公司的 阿托伐他汀钙( a t o r v a s t a t i nc a l c i u m ) ( 心血管药) 、m e r c k 公司的辛伐他汀 ( s i m v a s t a t i n ) ( 心血管药) 、b m s 公司的普伐他f f ( p r a v a s t a t i n ) ( 心血管药) 等。其中 “p i t o t ( a t o r v a s t a t i nc a l c i u m ) - - 项便超过1 0 0 亿美元。无论是新药开发还是生产专 利过期药，手性制药( 单一对映体) 己成为世界新潮流。要成为医药行业的强者， 想要打开世界市场，手性是一个不可回避的问题。 为此，美国食品与药品管理局f f r d a ) 在总结手性药物临床经验与教训的基础 上，于1 9 9 2 年颁发了手性药物指导原则。该原则要求所有在美国上市的消旋体类 新药，生产者均需提供报告，说明手性药物中所含的对映体的药理、毒理和临床 效果。在香料、食品添加剂、农药等的研发过程中，同样存在手性的要求。欧共 体国家及日本、加拿大等国随后也规定了类似的法规。手性药物已引起了国内外 医药界的广泛重视。 1 2 对映体分离的方法 一直以来，对映体分离方法层出不穷，目前，对映体分离的方法主要分为两 大类：一类是非色谱法，包括结晶法、手性选择性膜分离法、手性萃取法、手性 选择性蒸馏与泡沫浮选法、生物转化不对称催化法和传感器法；另一类为色谱法， 包括气相色谱法 1 2 ) 和柱容量，并具有制备分离能力。不过迄今为止还没有一种 c s p 能满足上述要求。本文仅就大环糖肽抗生素、多糖衍生物和p i r l d e 型手性固 定相的研究与进展予以简要评述。 2 1 大环抗生素手性固定相 1 9 9 4 年，a r m s t r o n g 等首次使用大环抗生素制备c s p ，在正相和反相模式下 拆分了一系列对映体【嘲，开辟了手性分离科学领域一个新的研究热点。自此以 后，短短几年的时间，大环抗生素应用于高效液相色谱( h p l c ) 、薄层色谱( t ic ) 、 毛细管电泳( c e ) 、毛细管电泳一质谱( c e - m s ) 和毛细管电色谱( c e c ) 已成功分离 了多类光学异构体，分离机理的研究也逐步深入【1 6 。2 2 1 。大环抗生素手性固定相显 示出了高效、高选择性和大载样量等独特的优势，而且可以在多种流动相模式下 ( 正相、极性有机相和反相) 进行对映体分离，成为目前最具发展潜力的一类新型 手性固定相。 2 1 1 大环抗生素类物质的结构和物化性质 大环抗生素类物质分子具有多种官能团和不对称中心，糖肽型还含有孔穴结 构，可与被分离物质产生多种作用，如疏水作用、包合作用、偶极偶极叠加作 用、纠电荷转移、形成氢键、立体排斥、范德华力等。在大环抗生素类分子中， 高效液相色谱手性固定相 除了疏水部位，通常还有亲水基和可离子化的基团，因而具有良好的水溶性。目 前报道的用于对映体分离的大环类抗生素有1 0 种【5 1 ，根据其结构特点可分为三 大类：糖肽类、柄状霉菌素类、多肽与氨基糖苷类。其中糖肽类抗生素对对映体 选择性较高，显示出较广泛的手性识别能力，而且在固定相键合和装柱过程中较 稳定，所以大环抗生素手性固定相的研究也主要集中在糖肽类抗生素上。 1 糖肽类( g l y c o p e p t i d e s ) 用作手性选择剂的糖肽类抗生素包括阿伏帕星( a v o p a r c i n ) 、瑞斯托菌素 a ( r i s t o c e t i na ) 、替考拉宁( m i c o p l a n i n ) 、万古霉素( v a n c o m y c i n ) 及其衍生物。在自 然界中，万古霉素以二聚体的形式存在，其他三种物质均由几种在结构上相似的 物质混合而成。这类物质结构( 见图2 1 ) 上的共同点是：含有由数个大环稠合而 成的糖苷配基，呈“提篮”状( b a s k e ts h a p e ) 并与糖类化合物相连。其中，万古霉素、 替考拉宁和瑞斯托菌素已有相应的商品化手性柱。它们的物理性质见表2 - 2 。 表2 2 大环抗生素的结构特征同 9 高效液相色谱手性固定相 阿伏帕星 2 1 2 大环抗生素类手性固定相的制备和应用 瑞斯托菌素a 在大环抗生素类物质中，万古霉素最早被键合于聚丙烯酰胺树脂，用来测定 络合反应的稳定常数譬3 1 。现在大量的研究集中在以硅胶为基质的抗生素类固定 相的研制方面。由于大环抗生素含有氨基、羟基和羧基等多种官能团，可以通过 不同的偶联剂键合到硅胶上，制得手性固定相1 5 弘凋。a r m s t r o n g 等1 5 1 介绍了抗 生素类固定相的一般制备方法：根据抗生素分子结构上的不同，用含有不同官能 团( 酯基、氨基、环氧基) 的硅烷偶联剂作为间隔臂，通过两步反应合成了一系列 抗生素类手性固定相。万古霉素和硫链丝菌素可以用含有羧基端基的有机硅， 【1 - ( q j 氧甲酰) 一乙基】甲基二氯硅烷、【2 - ( 甲酯基) 一甲基】三氯硅烷等键合；利福平b 可以利用含有氨基端基的有机硅，如( 3 氨丙基) 二甲基乙氧基硅烷、( 3 氨丙基) 三乙氧基硅烷等来键合【1 9 】。c l a u d i a 等人在超声条件下，将硅胶上的二醇首先氧 化成醛基，然后将万古霉素键合至硅胶 2 s 】，用此手性固定相分离了一系列碱性 1 0 高效液相色谱手性固定相 物质。 大环糖肽类抗生素由于其特殊的理化性质和结构特点，相对于其他抗生素来 说，有着更广泛的用途。万古霉素、替考拉宁、阿伏帕星、瑞斯托菌素、利福霉 索b 、硫链丝菌素的h p l c 手性分离的应用见表2 3 。 2 1 3 大环抗生素类手性固定相的手性识别机理 对于h p l c 而言，大环抗生素都是多模式的手性固定相( c s p s ) ，它们不仅可 用手正相模式和反相模式。还可以用于极性有机相1 5 2 4 西】。在反相模式中可以溶 解的很多物质在正相和极性有机相中大多不能溶解，反之亦然。也就是说除了极 少数物质之外，在每种模式中可以溶解的物质是完全不同的，这表明每种情形下 的手性识别机理是不同的。 反相模式中所有被溶解的物质大部分是阴离子或者中性化合物，所以在反相 模式中分子间发生的相互作用主要是带负电的分析物功能团与糖肽手性固定相 中铵基间的电荷或静电相互作用，以及分析物与固定相上疏水基团的配合作用 ( 毫无疑问包含氢键和空间效应) 嘲。虽然丁【m 相互作用是可能的，但是在反相模 式的极性溶液中并不明显，然而在以非极性有机溶剂为主的正相模式中翮互 作用和氢键作用却非常显著。此外，正相模式中并不存在反相模式中十分重要的 疏水作用。大多数在极性有机相模式中分离的物质都包含1 个或多个自由胺或胺 基、羟基、苯环或者萘环、苯( 甲) 酰基、羧基或酯基等，所有这些基团使得分析 物和手性固定相之间有可能存在氢键作用或空间效应。因此极性有机相模式中的 主要相互作用是氢键、m 兀相互作用和空间效应，在某种程度上静电相互作用也 可能存在1 2 5 。 万古霉素中“篮子”糖苷配基上的仲胺是对酸性或离子分析物的手性识别中 最基本的作用点，糖苷配基上的羧基在手性识别中所起的作用很不明显【5 5 1 。n a i r 等对用铜一万古霉素晶体作为毛细管电泳中的手性选择试剂进行了评价并利用x 射线对其晶体结构进行了分析。结果表明，c u 2 + 与万古霉素中n 甲基亮氨酸上 的第2 个胺相配合，分子中二糖一边的伯胺并未与c u 2 + 配合，从而可以自由地 与手性分析物作用。实验发现，在毛细管电泳中天然的万古霉素可以对一些化合 物进行很好的分离，而这个c u 2 + 配合选择试剂在同一系列化合物手性分离中的 高效液相色谱手性固定相 选择性会明显的降低或者根本无法进行。 替考拉宁上的“篮子”糖苷配基对氨基酸的识别有重要作用，而糖单元对非氮 基化合物的对映体分离过程是有益的l 蚓。b e r t h o d 等通过去除替考拉宁分子中3 个 糖单元而形成糖苷配基的方法对替考拉宁分子进行了修饰并分离提纯，用相同的 方法分别制各了具有完整的替考拉宁分子和仅有“篮子”的糖苷配基的两种手性 固定相，并用一系列外消旋化合物对两种手性固定相的对映体识别能力进行了比 较和评价。b e r t h o d 等认为，对手性分离，替考拉宁上糖单元至少有以下三种作 用因素影响它的手性识别：( 1 ) 糖单元占据了。篮子”的内部空间，限制了其它 分子的进入及键合；( 2 ) 阻塞了糖苷配基上可能的作用位点，在这里两个糖单元 通过酚羟基相连，第3 个糖单元通过醇基相连；( 3 ) 提供了竞争的作用点，这3 个 糖单元含有羟基、醚基和氨基而且本身还具有手性。 糖肽抗生素中n h 3 + 与被分析物中c o o 之间的静电作用是手性识别中最基 本的相互作用【5 6 】。在p i - 1 3 5 - 5 范围内，万古霉素、替考拉宁和大多数氨基酸以 两性离子的形式存在，静电作用是溶液中存在的最强的相互作用之一，所以体系 中有可能存在两种静电作用：抗生素的铵基与氨基酸的羧基作用，或氨基酸的铵 基与抗生素中的羧基作用。由替考拉宁_ 手苯胺的球状分子模型可知，替考拉宁上 的铵基和糖苷配基上的羧基之间距离远大于苯胺中两个相对应基团之间的距离， 对于一般的氨基酸来说同时发生两种静电作用是不可能的。换句话说，替考拉宁 糖苷配基上只有一个带电基团能与被分析物发生静电作用。由于羧基处于两个大 体积的糖残基之间，毫无疑问应该是糖苷配基上铵基易与被分析物的羧基发生静 电作用，因为这个位置比羧基更容易接近。其他的研究也证明了这个结论1 1 5 , 1 6 ，蜘。 值得注意的是在此球状模型中环都是扭曲的且彼此相关，形成了一个“c ”形的糖 苷配基。 此外，有机改性剂对溶质的保留和对映体选择性也有所影响以1 。用1 0 0 的 缓冲液洗脱对保留值最大，保留值随有机改性剂浓度的增大而降低，但是等量的 乙腈比甲醇使保留值的降低程度更大。在较高有机改性剂浓度( 8 0 ) 下，分析 物的保留行为也有明显的区别。对于乙腈，当浓度从8 0 增加到1 0 0 时保留值 也随之增加，但甲醇并不存在这种情况。高浓度乙腈存在时保留值的增加主要是 因为分析物与手性固定相之间的氢键作用增强。对于含有竞争性形成氢键基团的 高效液相色谱手性固定相 纯有机改性剂如甲醇并不存在这种情况。这种现象已在以万古霉素和瑞斯托菌素 a 为手性固定相的分离中得到证实仔, 2 4 , 2 5 1 。 流动相p h 值对不同的溶质的影响并不一致1 1 5 , 2 4 1 ，柱温对溶质的影响却都表 现为高温不利。 由于大环抗生素手性固定相的手性识别机制组合了蛋白质、多聚糖、环糊精 等手性固定相所具有的识别机制，与手性化合物间可以产生多种手性识别作用， 因而应用范围较广。而且大环抗生素可以稳定键合于硅胶上，具有较高的柱容量， 不仅可用于分析，也可用于制备。此外，大环抗生素手性固定相之间还具有互补 拆分性质，使得它们在液相色谱手性拆分的研究中受到越来越多的关注。同时由 于结构可精确测定衍射) ，故可就手性拆分机理进