（分析化学专业论文）分子烙印固相萃取—高效液相色谱法测定喹诺酮类药物的研究.pdf

摘要 摘要 分子烙印技术( m i d 是一种将特定的分子识别位点引入聚合物基质的有效方法。由 于其构效预定性、特异识别性和广泛实用性等特点而应用广泛。其中分子烙印聚合物 ( m d ) 作为固相萃取填料是分子烙印技术最具应用前景的一个发展方向。分子烙印固相 萃取( m i s p e ) 克服了传统固相萃取技术选择性差的缺陷，实现了对复杂样品中特定分析 对象或杂质的选择性提取，从而大大提高了分析测试的精度和准确性，并降低了检测限。 本文将所制备的分子烙印聚合物用于固相萃取高效液相色谱对体液和鸡肉中多种喹诺 酮药物进行了分离和测定。全文分为如下四个部分： 第一章：概述分子烙印及固相萃取技术的基本知识，引入分子烙印固相萃取的相关 概念和应用，并对分子烙印技术在喹诺酮类药物中的研究进行了综述。 第二章：建立一种同时检测人体尿液中吡哌酸、依诺沙星、氟罗沙星、培氟沙星 洛美沙星，环丙沙星、恩诺沙星7 种喹诺酮类药物的反相高效液相色谱法。调节缓冲 溶液的组成及有机系和水系的比例，确定流动相的组成，使多种喹诺酮类药物得到很好 的分离，所提出的方法简便，快速，可靠。 第三章：以甲基丙烯酸为功能单体，氧氟沙星为模板分子，制备了一种新型的分子 烙印聚合物，并对其识别特性、吸附特性、固相萃取条件等进行了探讨和优化。结果显 示烙印聚合物对结构相近的氟喹诺酮类药物有很好的选择吸附性。所制备的分子烙印 聚合物用于固相萃取高效液相色谱可有效分离血清中6 种氟喹诺酮。 第四章：以甲基丙烯酸为功能单体，恩诺沙星为模板分子在强极性溶剂甲醇水体 系中制备了一种新型的分子烙印聚合物，并对其识别特性、吸附特性、色谱行为等进行 了探讨和优化。结果显示烙印聚合物对结构相近的氟喹诺酮类药物有很好的选择吸附 性。鸡肉样品经乙腈提取浓缩后过分子烙印固相萃取柱，经乙腈清洗和乙腈一三氟乙酸 ( 9 9 ：1 ，蜘洗脱后由高效液相色谱法分离。所制备的分子烙印聚合物用于固相萃取高效 液相色谱可有效分离和测定鸡肉中4 种氟喹诺酮。 关键词分子烙印固相萃取高效液相色谱喹诺酮尿液血清鸡肉 a b s t r a c t a b s t r a c t m o l e c u l a r l yi m p r i i i t e dt e c h n o l o g y ( m i ，r ) i sa ne m c i e n tm e t l l o dt 0i r l 们d u c es p e c i 丘c m o l e c u l a rr e c o 鲥t i o ns i t e si n t oap o l y m 耐cm a t r i x m i th a sb e e n 诚d e l yl l s e d ( h l ct 0i t s p r e d e t e m i n a t i o n ，s p e c i f i cr e c o g i l i t i o na l l dp r a c t i c a b i l i 吼i ti sah o p e 如ld o m a i n 儆tu s e s m o l e c u l a r l yi r n p r i n t e dp 0 1 y m e r ( m i p ) 嬲s o l i dp b a s ee x t r a c t i o np a c k i n g ( m i s p e ) m i ph a s a l r e a d y 印p e a r e da sn e ws e l e c t i v es o f b e n t s 氨”s o l i dp h a s ee x 昀c t i o n ( s p e ) o fo 玛锄i c c o n l l ) 0 u n d si 1 1 d i 侬i r e n ts a i i l p l e sb ye x 乜侧i n gc e n a i na 1 1 甜y t e s s e l e c t i v e l y 丘o mc o m p l e x m a ：t r i c e s 诵t h o u tm a 仃i xi n t e r f e r e n c e i nt h i sp 印e r ，u s eo ft 1 1 cp r e p a r e dm di ns o l i dp l 娜e e x t r a c t i o 尚曲p e r f i o 册a n c el i q u i dc h r d m a t o 孕a p h y c a ne f f e c t i v e l y s 印a r a t e ，m a n y n u o r o q u i n o l o n e si nb i 0 1 0 9 i c a lf l l l i d sa n dc l l i c k 髓ni n c l u d e sf o u rc h a m e r sa sf o l l o w s ： c h 印t e r l ：ar e 、r i e w 姒r d yc 0 n c e m e dm m i t ，s p ea n dm i s p em l u d i n gp r 憾i p l e ， d e v e l o p l e ma n da p p l i c a t i o i l s b e s i d e s ，t h ca p p l i c a t i o l l so fm i t o nq u i n o l o n e 锄a l y s i sw e r e i n n _ o d u c e d 洫d e t a i l s c h a - p t e r 2 ：t b e 曲a b l i s han e wm e t h o df o re 妇f e c t i v e s e p 2 u r a t i o na 1 1 d s i m u l t a n e o u s d e t 锄i n a t i o no fp i p e 戚d i ca c i da n ds i x 丑u o r o q u i n o l o n e si nh u m 雒u r i n eb yr e v e r s e dp h a s e h i g l lp e 响r i l l a n c el i q u i dc l l r o m a t o 铲a p h y 砌ld i o d ca r r a yd e t e c t o r i km o b i l ep b 脑ei s c o 川! m n e db yr e g u l a t i o no ft 1 1 ec o m p o n e n to fb 时r e rs 0 1 u t i o na 1 1 dt 1 1 ep 】p o n i o no fo 玛a i l i c s 0 1 v e n ta n dw a t e r ，a i l dm a i l yq u i r l 0 1 0 n e sa r e s e p a r a t e de x c e l l e n t l y t h em e t h o dw 嬲 c o n v e i l i e n t ，m p i da i l da c c 删e c h a p t e r 3 ：n o v e lm o l e c u l a r l yi m 】啦n t e dp 0 1 y m e r ( m i p ) w a ss y n i l l e s i z e du s i n go n o x a c i n 猫t e n l p l a t ea i l dm e 血a c 巧l i ca c i d 硒m n c t i o n a lm o n o m e r m o l e c u l a rr e c o g l l i t i o np r o p e n i e s ， 绷f n 够a n ds o l i dp l l a 舭t i o nc o n d i t i o no fn l em 口、v e r ee v a l u a t e da n d0 p t i m i z e d 1 1 1 e r e s u l t sr e 、，e a l e dn l a t l em 妒h a v el l i 曲a m n 时a i l ds e l e c t i v 时f o rs 仃u c u r a l l yr e l a t e d f l u o r o q u i l l o l o n e s u s eo fm ep r e p a r e dm i pi i ls o l i dp h a s ee x 仃a c t i o i 卜植曲p e 响m a i l c el i q u i d c h ) m a t o 鲫h yc 趾e 恐c t i v e l ys 印盯a t es i ) 【n u o r o q u i n o l o n c si ns e m ms a i r l p l e s c h 印t e “：n 0 v e lw a t e r - c o m p a t i b l em o l e c l l l 砌yi i i l p r i n t e dp 0 1 严e r 似d ) w 勰 s y n t h e s i z e di i lm e m 锄o l _ 眠她rs y s t e m s 、i t l le n r o f l 0 x a c i n 硒t c m p l a t e s 锄dm e t l l a c r ) r c l i ca c i d 勰如n c t i o l l a lm o n o m e r s m o l e c u l a r r e c o g 枷o nm e c l l a 血s m s ，d i i l gc 印a b i l i 够， c h r o m a t 0 伊a p l l i c 曲m 拟e r i s t i c 、e r ei n v e r s n i g t e da n de v a l u a t e d t h es 如叩l e sw e r ee x 协i c t e d h a b s t r a c t 诚n la c e t o n i t r i l ea n dp 证f i e db ym o l e c m 础yi n l p r i m e ds o l i d - p h a s ee x 位蜘o nc o l u m n 灿l f o u rk i n d so f 丑u o r o q m n 0 1 0 n e si i ls p 她dc h i c k e ns 锄叩l e s 谳勰e x 缸a c t e dw i ma c e t o m 仃i l e 觚d a c e t o i l i t r i l e t r i n u o m c e t i ca c i d 硒w a s h i n g 趾de l u t i o ns o l u t i o 玛r e s p e c t i v e l y ，f o l l o w e db y s e p a r a t i o nl l s i n gh i 曲p e 墒m 跹c el i q u i dc h r o m a t o 笋a p h y u s eo ft h ep r e p a r e dm 口i ns o l i d p h a s ee x 衄c t i o n - j h i g hp e r l o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o 聊h yc a ne 丘e c t i v e l ys 印a r a t ef o u r n u o r o q u i n o l o n e si nc h i c k e n k e y w o r d s ：m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d s o l i dp l 粥ee x t r a u c t i o n ( m i s p e ) ；1 l i 曲p e 渤m a i l c el i q u i d c l l l - o m a t o g r 印h y ；q u i r l o l o n e s ；u r i n e ；s e n l m ；c h i c k e n 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：墨2 主宝日期：l 年生月日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口 2 、不保密 月日解密后适用本授权声明。 ( 请在以上相应方格内打“”) 保护知识产权声明 伶a 烯即闻相等取一辜潋 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 潼帮咆嚼l 衰阻废睦缮l 啾) 的学立论文，是我个人在导师矽汉手指导并与毒；襄踹的研究成果，研 究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资 助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的 各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：室立之：宝：= ：二=日期：生年l 月旦日 作者签名： 导师签名： 日期：! 童年l 月生日 日期：! 年上月生日 第1 章概述 第1 章概述 1 1 分子烙印技术 1 1 1 分子烙印技术的基本原理 分子烙印( m o l e c u l a ri m p r i r i t i n g ) 概念是在2 0 世纪4 0 年代，由著名的诺贝尔奖获 得者p a u l i n u 研究抗体和抗原的相互作用时提出以抗原为模板生物体合成抗体的设想， 启蒙了分子烙印技术的理论模型。1 9 4 9 年，d i c k e y 【2 】成功地将甲基橙烙印在硅胶表面上， 首次提出了“分子烙印( m o l e c u l a ri i n p r i r l t i n g ) 的概念。但由于种种原因，此项工作进 展甚微。直到1 9 7 2 年，w u l 俨】研究小组报道成功制备出人工合成的有机分子烙印聚合 物，分子烙印技术才逐渐为人们所关注。1 9 9 3 年，m o s b a d l 【4 】报道了非共价分子烙印聚 合物的合成和应用，极大地拓宽和促进了m i p 的研究领域和应用范围。经过研究人员 近十年的共同努力，将m i p 技术逐步引向成熟，在分子烙印聚合物合成方法、机理研究、 应用研究等方面取得了前所未有的进展。实现分子烙印通常需要经过以下三步：( 1 ) 首先 用功能单体和模板分子以共价键或非共价键( 氢键、静电作用力、金属螯合作用力、分 子间作用力、基团之间作用力以及疏水作用等) 在溶液体系里形成复合物。( 2 ) 选择适合 的交联剂、引发剂和有机溶剂，在一定的条件下加热，紫外光或其它射线照射引发自由基 聚合，使之生成聚合物。( 3 ) 通过洗脱的方法，将模板分子从聚合物中除去。这样就在聚 合物上留下了和模板分子在空间结构，结合点位完全匹配的三维“空穴 ，这个三维“空 穴 可以重新专一的、高选择性的再和模板分子结合，从而使该聚合物对模板分子具有 专一的识别功能。过程如图1 1 所示。用不同的模板分子制备的分子烙印聚合物具有不 同的结构和性质，当烙印分子进入到m i p 之后，由于其结构和功能集团都和“空穴”相 匹配，与识别位点发生相互作用；而非印迹分子的体积大小和功能集团都不能很好的与 m i p 匹配，不具备特异性的识别作用。所以一种烙印聚合物只能与种分子结合，类似 于“锁 与“钥匙 的关系，也就是说烙印聚合物对该分子具有选择性结合作用。 河北大学理学硕十学位论文 + 士 马 + 功能单体 聚合上交联剂 掣叁妙拶 模板分子分子烙印聚合物 图1 1 分子烙印过程示意图 f i g 1 - 1 s c h 锄a t i c so f m pp r 印a m t i 1 1 2 分子烙印聚合物类型 根据烙印分子和功能单体形成复合物时作用力的性质，通常将分子烙印聚合物 ( m o l e c u l a ri m 研m e dp o l y m e r s ，m i p s ) 分为三种类型：共价型，非共价型和混合型。 ( 1 ) 共价型又称为预组装型( p r e o r g a n i z a t i o n ) ，此方法中，烙印分子和功能单体 以可逆的共价键相互连接，交联聚合，然后再通过化学途径使共价键断裂除去烙印分子， 从而得到分子烙印聚合物。在分子烙印聚合物的应用过程中，以条件的变化使共价键形 成和断裂，从而实现对模板分子的吸附与解附。其优点是聚合中能获得在空间精确固定 排列的结合基团，且所得复合物稳定性好，在进行分子识别时选择性高。然而，由于共 价键作用一般较强，在烙印分子自组装或识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热力 学平衡，不适于快速识别，而且识别能力与生物识别相差甚远，另外这种制备方法较为 复杂，从而限制了共价型m i p 的应用。 ( 2 ) 非共价型也称作自组装型( s e l f a s s e i l l b l i n g ) ，由瑞典的m o s b a c h 等人【5 】在2 0 世纪8 0 年代后期创立，其分子识别过程更接近天然分子识别系统。烙印分子和功能单 体通过非共价作用( 如氢键作用、静电引力、金属螯合、电荷转移、范德华力和疏水作 用等) 形成超分子复合物，利用自由基聚合原理形成高度交联的共聚物，然后抽提出烙 印分子，当烙印分子再次进入聚合物网络时，就会通过非共价作用与结合位点再结合。 在生物体内，分子复合物的形成通常借助非共价键相互作用。虽然单个非共价键比单个 共价键键能低，但多重非共价键的耦合和多个作用位点的协同会形成很强的相互作用， 从而使复合物具有很高的稳定性。如果通过聚合把这些多重作用位点固定下来，当模板 2 霪 第l 章概述 分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间和结合位点上相匹配的有多重作用点 的三维空穴，这个三维空穴可以选择性的重新与模板分子结合，即对模板分子有专一性 识别作用。非共价法合成m i p 操作起来比较简便，亲和性和选择性较高，类似于抗体； 可供选择的功能单体更为广泛，可以使用多种单体同时烙印；合成方法多种多样，极大 地拓宽了m i p 的应用范围。该方法一定程度上依赖烙印分子与功能单体是否能通过弱 的相互作用形成比较稳定的复合物，比较稳定的复合体系可以使聚合物具备较大浓度的 选择性亲和识别位点，因此选择合适的功能单体与印迹分子产生较强的相互作用是非常 必要的。由于这种方式普遍，简单，作用温和，因而成为分子烙印技术中较重要的一种 形式。 ( 3 ) 混合型综合了共价和非共价分子烙印技术和优点创建了一种新的分子烙印技 术。即聚合时单体与烙印分子间作用力是共价键，而在对烙印分子的识别过程中，两者 的作用是非共价型的。w h i t e c o m e 等【6 】用4 一乙烯基苯基碳酸酯作单体，通过共价作用 同印迹分子形成复合物，用碱水解时失去一个c 0 2 打开共价键，在相应位置上便产生一 个非共价型的分子识别位点，该位点上的酚基可以通过氢键进行分子识别。这种方法被 称为“牺牲空间法 ( s a 耐f i c i a ls p a c e rm e t h o d ) 分子烙印技术。该法实际上是把分子自组 装和分子预组装两种方法结合起来形成的方法。首先烙印分子与功能单体以共价键的形 式形成烙印分子的衍生物( 单体烙印分子复合物) ，这一步相当于分子预组织过程，然后 交联、聚合，使功能基固定在聚合物链上，除去烙印分子后，功能基留在空穴中。当印 迹分子重新进入空穴中时，烙印分子与功能单体上的功能基不是以共价键结合，而是以 非共价键结合，如同分子自组装。 1 1 3 分子烙印聚合物的制备 m i p 的制备通常包括烙印分子与功能单体形成主客体复合物，在大量交联剂存在下 光引发或热引发进行自由基聚合反应，洗去烙印分子得到具有与烙印分子空间构型的相 匹配的三维“空穴 三个步骤。最终得到对烙印分子具有特异识别能力和特效选择性的 分子烙印聚合物。 1 1 4 制备方法 由于不同的应用领域对所用的m 口要求不同，在实际操作中要综合分析研究的对象 和目的，选择和设计最佳的合成方案。迄今为止，分子烙印聚合物主要有以下几种制备 3 河北大学理学硕十学位论文 方法： 本体聚合法传统的本体聚合、法【他】是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂按 一定比例溶解在惰性溶剂中置于安培瓶中，充氦气抽真空后用热引发或光引发手段来得 到块状的烙印聚合物，经过研磨、筛选、沉降等处理得到适合分析的一定粒度范围的无 定形m i p 颗粒。这种方法在合成阶段受条件限制较少，制备出合乎要求的m i p 方法简 单，条件易于控制，因而应用最广。但本体聚合法在研磨筛选等后期处理操作过于复杂， 费时费力且损失较大，且烙印位点在合成过程中被包埋在聚合物内部，表现为低的吸附 量，得到的大小和形状均不规则的无定形颗粒作为色谱固定相分析时柱效也较低。所以 随着制备技术的提高，这种方法将逐渐被其他方法所取代。 原位聚合法针对上述方法的缺点，发展了一种在色谱柱中直接聚合的原位聚合方 法2 1 ，可以直接制得可使用的分子烙印色谱柱，大大简化了色谱固定相的合成。将合 适比例的模板分子、功能单体、交联剂、引发剂和制孔剂充分混合作用后，在不锈钢色 谱柱管中以热引发的方法直接进行聚合。省去制备过程中了研磨筛选等复杂操作，制得 的连续棒状整体m p 柱体内，既分布着一些输运流动相和溶质的大孔结构，有助于降低 柱压降，同时也存在孔径分布较为均匀的中孔，比表面相应增大，兼顾低柱压和大表面 积两方面的要求，识别的位点数量较多分布较均匀，适用于色谱分离过程中快速高效的 分离检测。 表面印迹法表面烙印技术是在硅胶颗粒表面印迹，在硅胶或三氧化二铝等微球形 介质表面印迹形成微球，其机理类似于键合，此法得到的m i p 微球接近于h p l c 色谱 固定相，因而近来得到许多学者的关注。为了分离大分子，刘晓春等将核糖核酸酶b ( r n a s eb ) 利用了硼酸盐和糖类的相互作用，可在载体表面烙印单层的大分子，做成 高效液相色谱填料，分离了核糖核酸酶a ( 1 h a s e a ) 和核糖核酸酶b ( i u 硒eb ) 。 球形分子烙印聚合物的制备方法在悬浮分散体系中，通过交联剂和烙印分子一单 复合体系本身形成聚合物微球【1 4 小】，按照溶剂( 致孔剂) 、分散剂( 表面活性剂) 、稳定 剂等聚合条件和聚合方法的不同又可以分为乳液悬浮聚合法，分散聚合法，种子溶胀聚 合法和沉淀聚合法等。 1 2 固相萃取技术 1 2 1 固相萃取的原理与特点 4 第1 章概述 由于生物样品成分复杂，在进入色谱柱分离前需要进行净化。常用固相萃取( s p e ) 法对样品进行净化处理。固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取 中，固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。当样品溶液通过固体填料时，分 离物浓缩在其表面，其他样品成分通过固体填料，这样通过只吸附分离物而不吸附其他 样品成分的固体填料，可以得到高纯度和浓缩的分离物。根据样品中不同组分在固体填 料上的作用力强弱不同，被测组分与其它组分分离。改变洗脱剂组成、填料的种类及其 它参数以达到不同的分离目的。与传统液液萃取相比，s p e 具有很多优点【1 9 】，如：速 度较快，缩短了预处理时间；较高的精密度和准确度；分析物的高回收率；有机溶剂的 低消耗，减少了对环境的污染；不出现乳化现象，易获得较为纯净样品；操作简单，易 于自动化等。 1 2 2 固相萃取的步骤 s p e 操作一般有四步( 如图1 2 所示) ：固定相活化、上样、淋洗和洗脱。在上样 与淋洗两步中，要尽可能使分析物完全吸附在填料上，即不发生穿透现象；而在分析物 洗脱过程中，则要使分析物尽可能被完全解吸( 或洗脱) ，即不发生残留。 ( 1 ) 活化其目的是为了创造一定的溶剂环境和除去柱内的杂质。一般首先使用一 种强洗脱能力的溶剂( 始溶剂) 润湿和净化s p e 柱，然后再用弱洗脱能力的溶剂( 终溶 剂) 平衡s p e 柱。( 2 ) 上样即样品上柱，1 只s p e 的柱容量一般为固定相中重量的 1 3 。在整个s p e 过程中流速一般采用3 1 0 m u r i l i n ( 离子交换s p e 宜稍低) 。在能 保证样品溶解时应尽可能用弱溶剂溶解样品，使组分在柱上有强保留( 最好在柱床起始 部位形成一窄的谱带) ，用较小溶剂体积即可将组分洗脱，也可减少杂质流出。( 3 ) 淋 洗其目的是除去不需要的组分或杂质，所用溶剂一般是合适的中等强度的溶剂。对反 相萃取柱，清洗溶剂是含适当浓度有机溶剂的水或缓冲溶液。通过调节清洗溶剂的强度 和体积，尽可能多地除去能被洗脱的杂质。( 4 ) 洗脱洗脱溶剂必须谨慎选择，以保证 用较小体积的溶剂将组分洗脱下来，并且避免溶剂太强洗出不必要的组分。使用混合溶 剂是获得适宜强度溶剂的有效方法。淋洗或洗脱溶剂体积一般为0 5 加8 m l 1 0 0 m g ，如 淋洗和洗脱溶剂不互溶，则用空气或氮气对柱床进行干燥后再洗脱。 5 河北大学理学硕+ 学位论文 洁化上祥淋洗洗脱 o o e 9 囝 国 圆 图l 2 崮相萃取过程不恿图 f i g 1 - 2 s c h 伽舱石c so f s p e 1 3 分子烙印固相萃取( m i s p e ) 1 3 1m i s p e 简介 固相萃取由于具有回收率和富集倍数高，有机溶剂用量少，对环境友好，无相分离 操作，易于收集组分，能处理小体积试样，操作简单，易于实现自动化等优点。目前已 成为最常用的样品处理方法之一。常见的固相萃取填料有：c 1 8 、c 8 、 硅胶、氧化铝、 聚苯乙烯和二乙烯基苯类树脂等。但这些填料由于选择性差而限制了它们的进一步发 展。分子烙印聚合物( m 口) 具有识别性能好、选择性可预定、化学性质稳定、对环境 耐受性强和制备相对简单等优点，因此它非常适合用作固相萃取( s p e ) 的吸附剂【2 1 1 。 将m i p s 固定相用作固相萃取，称为分子烙印固相萃取( m i s p e ) 。m i s p e 通常的操作 步骤是将大约5 0 2 0 0 m g m i p 装入柱子中，然后进行柱子活化，上样，洗涤，洗脱四步， 操作步骤示意图如图1 3 所示。m i p 因其具有很好的机械稳定性和热稳定性，对酸、碱 有耐腐蚀性，可以同时在水相和有机相使用的优点【2 2 1 ，使其在样品的富集和净化中显示 巨大的应用前景。为了有选择性的提取目标分子，在m i s p e 的活化，上样，洗涤，洗 脱四个不同的操作步骤中，选择合适的溶剂是是十分重要的。m i p 不仅可以选择性的萃 取所需要的目标物，而且可以富集目标物且同时降低样品基体的干扰【2 3 1 。分析目标物经 m i p 富集和净化后在色谱定量分析中可以得到更准确的结果且检出限大大降低了。 6 第1 章概述 - 铷1 a i y 协 i n t e r b r e n c c 霉 口b 缸d h 珥8 i t e 图卜3 分子烙印固相萃取的操作步骤 f i g 1 - 3 s c h 钮l a t i cp 】c a d u r eo fm i s p e 1 3 2m i s p e 的操作方式及其在药物分析中的应用 m i s p e 的操作主要分为离线固相萃取操作模式、在线固相萃取操作模式和脉冲洗脱 分析。离线固相萃取操作模式与典型的s p e 是一致的。通常是将m i p 颗粒装入塑料的 类似注射器的小柱中，经过活化，上样，洗涤，洗脱四步来分析实际样品。在线固相萃 取就是首先将m i p 颗粒装入一只不锈钢色谱柱子中与分析柱连接采用柱转换的方式在 h p l c 上进行操作【2 化6 】。具体方式是将样品在装有m i p 的预处理柱子富集和洗去杂质后， 再采用合适的流动相进行洗脱在分析柱上进行分析。在线固相萃取比离线固相萃取具有 更多的优点，首先在富集和分析步骤之间没有样品处理，因此可以减少分析物的损失和 污染，提高回收率和降低检出限。另外样品经提取后直接进入分析柱，这样所需要的样 品体积和有机溶剂的需要量大大减少，自动化程度大大提高了。这种方式特别适用于识 别结构相似的混合样品中的分析物。1 1 h e o d o 订d i s 等【2 7 】以咖啡因为模板合成了嘌呤碱类 生物碱的分子烙印聚合物，并将其应用于饮料中嘌呤碱的萃取，他们将可乐样品用水稀 释1 0 0 倍后直接上样于分子烙印萃取柱，然后用1 0m lp h = 9 醋酸氨缓冲溶液洗涤由于 非烙印作用吸附的杂质，最后用乙腈一1 三氟乙酸将吸附于分子烙印聚合物柱上的嘌呤 碱洗脱下来进行液相色谱的测定，回收率大于8 0 。e s t c rc a r o 【2 8 】等则将o 戚sh l b 柱 同恩诺沙星柱连用，测定了尿和组织中恩诺沙星和环丙沙星含量。m u l d o o n 等【2 9 】借 p s d v b 固相萃取盘，重复过两次分子烙印柱提纯，用胶束电动色谱测定了猪肝中的除 草剂一阿特拉津。b j a n l a s o n 等【3 0 】将c 1 8 固相萃取柱、分子烙印固相萃取柱和c 1 8 分析柱 7 艿百2 么 。酉o o 百 河北大学理学硕十学位论文 液相色谱在线联用，建立了尿样、苹果中三嗪类除草剂的在线固相萃取分析方法。 ，n l e o d o r i d i s 等f 3 l 】将h p l c 和连续流动注射连用，设计出一个自动、快速，性能好的固 相萃取装置。c e n t e 等【3 2 】利用在线分子烙印固相萃取测定了水样中双酚a 。在线脉冲 洗脱方式是指进行这种萃取操作时，首先选择合适的流动相上样过柱，在该条件下，分析 物模板分子被特别强地保留在萃取柱中，然后再注射几个微升的质子极性溶剂，这样可 以产生一个快速的脉冲式洗脱，从而将分析物洗脱下来。而在在线微分脉冲洗脱方式中， 当分析物被特别强地保留在萃取柱上后，首先采用非质子性的极性溶剂以脉冲方式将非 选择性吸附的干扰物质洗脱干净，再利用一个质子性的极性溶剂以脉冲方式将分析物洗 脱下来进行检测。这种技术的优点是通过加大样品的进样体积而对目标分析物进行富集 或预富集，方法检出限低，分析时间短，费用少。目前这种操作方式已被应用到血清和 药物中的茶碱3 3 。4 1 、抗高血糖药物甲福明二甲双胍阅以及头孢抗生素药物【3 7 】等物质的 萃取。 1 4 分子烙印技术在喹诺酮类药物中的研究现状 国内邴乃慈等【3 8 3 9 】以左旋氧氟沙星( l v f x ) 为模板，采用热聚合方式，通过条件优化 获得了对左氧氟沙星有特异选择性吸附的分子烙印聚合物( m i p s ) ，并对其合成条件，识 别性能及识别过程中的动力学和热力学行为进行了探讨，以进一步认识其识别机理。杜小 燕等【加】以沙拉沙星为模板分子合成了分子烙印聚合物，并用平衡吸附实验研究了其吸附 性能。结果表明该聚合物对沙拉沙星有较高的亲和性和选择性。周路掣4 i 】以甲磺酸帕珠 沙星手性药物( 左旋p f m ) 为模板分子，通过热自由基聚合了左旋p f m 的分子烙印聚合 物( m i p ) ，将m i p 超声分散于氨基苯磺酸溶液中，通过在金电极表面电聚合氨基苯磺酸， 掺杂固载m i p ，然后用十二硫醇封闭电极表面使电极绝缘，构建了一种新型电容型传感 器，并用于尿样中左旋p f m 的测定。检出限为1 8n 咖l ，回收率在9 4 肚1 0 2 。o 之间。 孙慧等【4 2 】以氧氟沙星合成了分子烙印聚合物用做色谱固定相，并通过高效液相色谱法研 究了烙印聚合物的识别特性，成功的分离了洛美沙星、诺氟沙星与氧氟沙星。高俊刚等 【4 3 】以环丙沙星为模板分子，采用悬浮聚合的方法制备了球形分子印迹聚合物，并用扫描电 镜对聚合物进行了表征，通过平衡吸附法研究了聚合物对模板分子及其类似物的吸附行 为和选择识别能力。结果表明，该分子印迹聚合物有很好的选择吸附性和再生性，可用于 环丙沙星药物的分析和分离。卢春阳等【删以聚偏氟乙烯微孔滤膜为支撑膜，氟哌酸为模 第1 章概述 板分子，用紫外光引发原位聚合方法制备了分子烙印聚合物膜。研究了模板分子与功能单 体之间的相互作用，进行了混合底物渗透实验。结果表明烙印膜所形成的空穴通道对模板 分子氟哌酸能优先选择性结合，该印迹膜对模板分子起着富集作用。邴乃慈掣4 5 】还以聚 偏氟乙烯中空纤维超滤膜为支撑膜，左氧氟沙星( l 、，f 为为模板分子，采用热聚合方法制备 了分子烙印聚合物膜，并应用于固相萃取选择性分离氧氟沙星外消旋体( o f l x ) 。固相萃 取实验结果表明：所制备的分子烙印聚合物膜中存在着空间结构和大小均与模板分子 l v f x 互补的孔穴组成的通道，该通道可选择性地透过底物分子。该方法为分子烙印膜萃 取技术用于手性药物拆分提供了理论和实验方法。杜黎明等【删采用分子烙印技术合成了 吡哌酸分子烙印聚合物。运用平衡结合实验研究了聚合物的吸附特性和选择性识别能 力，所制备的吡哌酸分子烙印聚合物对吡哌酸呈现较高的选择识别特性，并成功的应用到 人血清中吡哌酸的固相萃取。 国外e s t e rc a r o 【2 8 】等以恩诺沙星为模板分子合成分子烙印聚合物并将其作为选择性 的吸附剂，采用分子烙印固相萃取与商品的h l b 固相萃取柱相结合萃取了人体尿液中 的恩诺沙星和猪肝中的恩诺沙星和其代谢物环丙沙星。y 狮h o n 胛等【4 7 】以环丙沙星 为模板分子，在强极性溶剂甲醇一水中合成水兼容性的分子烙印聚合物，所制备的m i p 在 水环境中对环丙沙星有很好的选择吸附性，并成功的应用于尿样的在线固相萃取，检出 限为0 0 3 g m l 回收率大于9 4 5 。 1 5 展望 在分子烙印技术应用领域中，m i s p e 是目前最有希望实现商业化的领域，有广泛的应 用前景，但其进一步的发展还面临一些关键问题必须解决，主要体现在分子烙印技术方 面：首先是机理研究不够深入。有关分子烙印机理的报道还很少，对于模板分子与功能 单体之间的作用力、结合位点的作用机理、聚合物的形态以及传质机理还缺乏系统研究， 仍需努力。其次，目前使用的功能单体、交联剂和聚合方法都有较大的局限性。尤其是功 能单体的种类太少以至于不能满足某些分子识别的要求。发现更多性能更佳的功能单体 和交联剂，达到更高的分子识别要求，也是研究的一个热点之一。第三，目前分子烙印 聚合物的制备和识别大多局限在非极性环境中，而天然的分子识别系统大多是在水溶液 中进行，如何能利用特殊的分子间作用力在水溶液或极性溶剂中进行分子烙印和识别仍 是一大难题。对于生物产品的分离和纯化，研究水相中分子烙印聚合物的制备和应用尤 9 河北大学理学硕+ 学位论文 其具有重大意义。随着分子烙印技术研究的不断深入和应用领域的不断扩展，人们越来 越清楚的看到分子烙印技术具有广阔的应用前景和深刻的理论意义，也必将吸引越来越 多的研究者从事这方面的工作。 l o 第2 章反相高效液相色谱法有效分离和同时测定人体尿液中7 种喹诺酮 第2 章反相高效液相色谱法有效分离和同时测定 人体尿液中7 种喹诺酮 摘要：建立一种同时检测人体尿液中吡哌酸与6 种氟喹诺酮类药物的反相高效液相色 谱法。色谱柱为z y l l 0 4 型c 1 8 色谱柱( 2 5 0 m m 4 6 m m ，5 岬) ，柱温3 0 ，流动相为 乙腈_ 0 0 2m o 。四丁基溴化铵三氟乙酸缓冲液( 体积比为9 ：9 1 ，p h2 8 7 ) ，流速1 o m 沁检测波长2 8 21 1 l n ，进样量2 0p l 。7 种药物的校准曲线在o 5 1 0 0p 咖l 浓度 范围内呈良好的线性，相关系数r 0 9 9 9 6 ，检出限为o 0 3 6 o 0 8 8 耀衄l ，样品的平均 加标回收率在9 1 6 9 9 5 之间，r s d 3 5 0 时，培氟沙星与洛美沙星及环丙沙星色谱峰部分 重叠；当p h 3 0 0 3 2 0 时，培氟沙星与洛美沙星色谱峰重合；当p h 2 5 0 时，环丙沙星 与恩诺沙星色谱峰部分重叠；当p h2 5 0 2 9 0 时，7 种药物能完全分离。通过对比并且 考虑到p h 过低会对色谱柱造成损坏，本实验p h 值选择2 8 7 ，可抑制峰拖尾且分离效果比 较理想。 本实验考察了三个水平( 1 2 ，9 ，5 ) 的乙腈体积分数对分离效果的影响，乙腈体 积分数为5 时，分析时间需要3 0 m m 。随着体积分数的增加，各药物的保留时间均缩短。 当乙腈体积分数为9 时，7 种药物在1 4m 洫之内就能够有效分离且峰形对称性好。乙腈体 积分数为1 2 时，分析时间缩短为8 m 饥但是培氟沙星与洛美沙星及环丙沙星的色谱峰 出现重叠。本实验选择乙腈_ 0 0 2m o l l 四丁基溴化铵水溶液( 体积比为9 ：9 1 ) 为流动 相，以三氟乙酸将流动相的p h 值调至2 8 7 。 2 3 2 2 流速的影响 考察了流速分别为0 6 、o 8 、1 o 、1 2m i n 时的分离效果。流速为1 2m i n 时， 分析时间为1 1 m i n ，各组份保留时间均减小，分离度变差。流速为o 6m l m i n 时，分析时间 增长为2 l m i n ，同时色谱峰扩宽但分离度较好。考虑到分离效果和分离速度，本实验选择 的流速为1 om u m i n 。 2 3 2 3 温度的影响本实验考察了3 0 、3 5 、4 0 、4 5 温度下7 种分析物的分离效果。温度 越高，出峰越快，但洛美沙星与环丙沙星分离度变差且两组分的色谱峰出现重叠。同时 考虑到温度太高对色谱柱不利，本实验柱温设定为3 0 。 2 3 3 样品处理 甲醇、乙腈、三氯乙酸都可作为沉淀蛋白的试剂，乙腈沉淀蛋白的效果要优于甲醇。 本实验探索了用乙腈与三氯乙酸作为蛋白沉淀剂对实验的影响。由于尿样中的蛋白较 少，乙腈或1 0 三氯乙酸添加量与空白尿样的比例为3 ：1 时，都能较好地除去蛋白。但是， 若以作为流动相成分的乙腈来沉淀蛋白，离心液中所含乙腈将会影响检测结果，使色谱 峰出现异常。当采用l o 三氯乙酸沉淀蛋白时，色谱蜂较好。在2 3m i n 时，空白色谱虽有 一杂质峰，但对待测分析物无干扰。 2 3 4 分离度、线性与检出限 1 4 第2 章反相高效液相色谱法有效分离和同时测定人体尿液中7 种喹诺酮 在最佳的实验条件下，7 种分析物在1 4 m i n 内分离完全，色谱图如图2 2 所示。相邻两 组分的分离度等于或大于2 4 6 ，见表2 1 。 图2 - 27 种分析物的标准色谱图 f i g 2 2c h r o m a t o g m mo fs e v e na n a l y t 鹤i i ls t 锄d a i r ds o l u t i o n 检测波长：2 8 2 姗；流速：1 0 山m i n ；进样量：2 0 儿；柱温：3 0 ；分析物浓度：2 5 p 酌n l ； 1 吡哌酸；2 依诺沙星；3 氟罗沙星；4 培氟沙星；5 洛美沙星；6 环丙沙星；7 恩诺沙星 表2 1 相邻组分的分离度 几i b l e 2 - 1r e s o l u t i o no ft h en e i g l l b o u r i n ga n a l y t e 分析物分离度 吡哌酸与依诺沙星 依诺沙星与氟罗沙星 氟罗沙星与培氟沙星 培氟沙星与洛美沙星 洛美沙星与环丙沙星 环丙沙星与恩诺沙星 1 0 7 l 3 5 l 3 1 2 2 6 0 2 4 6 3 2 8 在最佳色谱条件下的线性回归方程、线性范围及检出限列于表2 2 中。分析物的峰 面积与其浓度呈良好的线性关系，线性相关系数r o 9 9 9 6 ，检出限在o 0 3 6 o 0 8 8p 咖l 之间。 表2 27 种药物的线性方程与检出限 t a b l e 2 2l i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o n s 锄dd e t e c t i o nl i i i l i t sf o rt h es e 、，e i lq u i n o l o n e s 1 5 河北大学理学硕+ 学位论文 2 3 5 尿样分析 在最佳的实验条件下，加标样品中的7 种药物在1 4 m i n 内可有效分离，如图2 2 所示。 为考察本方法的准确度，空白尿样中分别添加5 “咖l 和2 0 “咖l 的7 种药物的混合标 准，在所选定的色谱条件下，对尿样中7 种药物加以5 次平行测定，回收率列于表2 3 中。7 种喹诺酮类药物的平均加标回收率为9 1 6 9 9 5 ，r s d 7 。 图2 3 加标样品( a ) 与空白样品( b ) 的色谱图 f i g 2 3c h r o m a t o g r 锄so fs p i k e ds 锄p l e ( a ) a n db l a i l ks a m p l e ( b ) 检测波长：2 8 2 姗；流速：1 om u m i i l ；进