（有机化学专业论文）南海软珊瑚内生真菌aspergillus+sp的代谢产物研究.pdf

中山大学硕士学位论文 论文题目：南海软珊瑚内生真菌a s p e r g i l l u ss p 的代谢产物研究 专业：有机化学 作者：蔡永通 指导教师：李厚金副教授 摘要 海洋微生物与海洋动植物共生是一个非常普遍的现象，近年来许多具有抗 菌、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性的化合物从海洋共附生微生物的代谢产物中 分离得到，而且很多物质已成为新药开发的先导化合物或作为生命科学研究的重 要工具。微生物在不同的培养条件下能产生不同的代谢产物，因此，对微生物在 不同培养条件下的代谢产物研究将是发现具有生物活性的新化合物的有效途径。 本论文主要研究了一株分离自南海扭曲肉芝软珊瑚s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m 的 内生真菌a s p e r g i l l u ss p 在不同培养条件下的代谢产物。以g p y 培养基( 葡萄糖 1 0e , l ，蛋白胨5e , l ，酵母膏2 l ，1 0 0 海水，p h7 5 ) 对真菌a s p e r g i l l u ss p 进行1 5 0 l 大规模培养发酵，从发酵液的乙酸乙酯提取物中分离得到四个化合物， 分别为青霉酸( 1 ) ，3 ，6 二异丁基2 ( 1 h ) 吡嗪酮( 2 ) ，3 异丁基6 ( 1 羟基2 甲基丙基) 2 ( 1 h ) 吡嗪酮( 3 ) ，3 甲氧基4 甲基2 ，4 二烯戊酸( 5 ) 。 接着我们在g p y 培养基的基础上分别添加蒽酮、香茅醇和樟脑( 1 0 0m e l ) 对真菌a s p e r g i l l u ss p 进行发酵，以获得一些新颖的、有药用价值的葸酮和单萜 转化产物，以及促使真菌产生不同的代谢产物，结果又从它们的发酵液的乙酸乙 酯提取物中分离的到6 个化合物，分别为3 ，6 二异丙基2 ( 1 日) 吡嗪酮( 4 ) ， 1 0 一羟基葸酮( 6 ) ，3 ，7 一二甲基一l ，6 一辛烷二醇( 7 ) ，l ，7 ，7 一三甲基二环【2 2 1 】 己烷2 ，5 一二酮( 8 ) ，( 4 一羟基苯丙- 苯丙) 二肽( 9 ) ，( 异丙基仲丁基) - - 肽( 1 0 ) ， 这些化合物的结构通过n m r ，m s 等分析技术确定。 化合物5 是新化合物。化合物2 - 4 是吡嗪酮类化合物，这类化合物具有促进 水稻秧苗生长的功效，具有很好的农业应用前景，化合物2 在以前的文献中被认 为是黄曲霉素的互变异构体，但从h 和1 3 cn m r 谱图中只发现酰胺式结构的信 中山大学硕士学位论文 号，因此，我们确定酰胺式在溶液中是稳定的，不会发生互变异构而产生烯醇式。 化合物1 是青霉酸，是一个很强的多聚乙酰类霉菌毒素，一个潜在的致癌物和诱 变剂，当我们添加葸酮对真菌发酵后，发现青霉酸在发酵液提取物的含量从6 m e , m 增加到5 7m g l ，这可以为该真菌a s p e r g i l l u ss p 发酵法生产青霉酸这一活 性物质提供新的培养条件。 总之，本文通过研究真菌a s p e r g i l l u ss p 在四种培养条件下的代谢产物，共 发现1 0 个单体化合物，其中1 个新化合物，3 个吡嗪酮化合物，1 个强的霉菌毒 素，还发现促进该真菌产生青霉酸的培养方法。上述研究结果为研究培养条件与 代谢产物产生之间的关系影响奠定了基础。 关键词：扭曲肉芝软珊瑚；曲霉属真菌；代谢产物；吡嗪酮 中山大学硕士学位论文 t i t l e ：m e t a b o l i t e so ft h em a r i n ef u n g u sa s p e r g i l l u ss p c o l l e c t e df r o mh a i n a ns o f t c o r a l s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rh o u j i nl i a b s t r a c t i ti sv e r yc o m j 3 3 0 nt h a tm a r i n em i c r o o r g a n i s m sa n dm a r i n ea n i m a l so rp l a n t sa r e s y m b i o t i c i nr e c e n ty e a r s ，m a n ya n t i m i c r o b i a l ，a n t i t u m o r , a n t i v i r a l ，a n do t h e r b i o a c t i v ec o m p o u n d sw e r ei s o l a t e df r o ms y m b i o t i cm a r i n em i c r o o r g a n i s m s ，a n dm a n y o ft h e s ec o m p o u n d sh a v eb e c o m ep r e c u r s o r sf o rn e wd r u g sd e v e l o p m e n to ra n i m p o r t a n tt o o lf o rl i f e s c i e n c er e s e a r c h m o r ea n dm o r el i t e r a t u r e sr e p o r t e dt h a t m i c r o o r g a n i s mc u l t u r e di nd i f f e r e n tc u l t u r ec o u l dp r o d u c ed i f f e r e n tm e t a b o l i t e s ， t h e r e f o r e ，s t u d y i n gt h em e t a b o l i t e so fm i c r o o r g a n i s m sc u l t u r e di nd i f f e r e n tm e d i u m s i sa l le f f e c t i v ew a yt od i s c o v e rn e wc o m p o u n d sw i t hb i o l o g i c a la c t i v i t y t h i st h e s i sm a i n l yi n t r o d u c e dt h es t u d yo ft h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e so ft h e f u n g u sa s p e r g i l l u ss p ，w h i c hw a si s o l a t e df r o mh a i n a ns o rc o r a ls a r c o p h y t o n t o r t u o s u m t h ef u n g u sw a sc u l t u r e di ng p ym e d i u mc o n t a i n i n gg l u c o s e10g l ， p e p t o n e5e d l ，y e a s te x t r a c t2g l ，s e aw a t e rll ，a tp h7 5 f o u rc o m p o u n d s ， p e n i c i l l i ca c i d ( 1 ) ，3 , 6 - d i i s o b u t y l 一2 ( 1 4 ) 一p y r a z i n o n e ( 2 ) ，3 - i s o b u t y l - 6 一( 1 - h y d r o x y 一2 一 m e t h y l p r o p y l ) 一2 ( 1 邱一p y r a z i n o n e ( 3 ) ，3 - m e t h o x y - 4 - m e t h y l - 2 ，4 d i e n - p e n t a n o i ca c i d ( 5 ) w e r eo b t a i n e df r o mt h ea c o e te x t r a c to ft h ec u l t u r eb r o t h w ea d d e da n t h r a c e n o n e ， c i t r o n e l l o la n dc a m p h o rt og p ym e d i u m 、析mad o s eo f10 0m g lt og e ts o m e c o n v e r s i o np r o d u c t so fa n t h r a c e n o n ea n dt e r p e n o i d sw h i c hh a v ec e r t a i na c t i v i t i e s ，o r t of a c i l i t a t et h ef u n g u st op r o d u c ed i f f e r e n tm e t a b o l i t e s a n dt h e na n o t h e rs i x c o m p o u n d s ，3 , 6 一d i i s o p r o p y l 一2 ( 1 - ) - p y r a z i n o n e ( 4 ) ，9 - h y d r o x y a n t h r a c e n 一1 0 ( 9 h ) - o n e ( 6 ) ，3 ，7 一d i m e t h y l l o c t a n e 一1 ，6 一d i o l ( 7 ) ，1 , 7 ，7 一t r i m e t h y l b i c y c l o 2 ，2 ，1 h e p t a n e s - 2 ，5 - d i o n e ( 8 ) ，2 ，5 - p i p e r a z i n e d i o n e ，3 - 【( 4 - h y d r o x y l p h e n y l ) m e t h y l 一6 - ( p h e n y l m e t h y l ) ( 9 ) ， 3 - i s o b u t y l 一6 i s o p r o p y l 一2 ，5 一p i p e r a z i n e - d i o n e ( 1 0 ) ，w e r ei s o l a t e df r o ma c o e te x t r a c t o f t h ec u l t u r e b r o t h t h e i rs t r u c t u r e sw e r ee l u c i d a t e dm a i n l yb a s e dn m ra n dm s 中山大学硕士学位论文 c o m p o u n d6 i san e wc o m p o u n d c o m p o u n d2 - 4a r ep y r a z i n o n e s t h e p y r a z i n o n e sc a l lp r o m o t et h er i c es e e d l i n g sg r o w t h i np r e v i o u sl i t e r a t u r e s ，c o m p o u n d 2w a sc o n s i d e r e da st h et a u t o m e ro ff l a v a c o l ，h o w e v e r , i nl ha n d1 3 cn m r s p e c t r a , w eo n l yo b s e r v e dt h es i g n a l so ft h ea m i d cf o r m s ow ec o n c l u d e dt h a tt h ea m i d ef o r m f o r2w a ss t a b l ei nt h es o l u t i o n c o m p o u n d1i sp e n i c i l l i ca c i dw h i c hc a nf u n c t i o n 嬲 m y c o t o x i n ，p o t e n t i a lc a r c i n o g e na n dm u t a g e n t h ey i e l do fp e n i c i l l i ca c i di nt h e a c o e te x t r a c t so ft h ec u l t u r eb r o t hw a si n c r e a s e df r o m6m e g lt o5 7m g lw h e n a d d e da n t h r a c e n o n et og p ym e d i u m 、杭t l lad o s eo f10 0m g l i tc a np r o v i d ean e w c u l t u r ec o n d i t i o nt of e r m e n ta s p e r g i l l u ss p t op r o d u c ep e n i c i l i i ca c i d s u m m a r i l y , t h i sw o r ko b t a i n e dt e nc o m p o u n d sb ys t u d y i n gt h em e t a b o l i t e so ft h e f u n g u sa s p e r g i l l u ss p i nf o u rc u l t u r ec o n d i t i o n s o n eo ft h e mi san e wc o n p o u n d ，a n d t h e r ef i l et h r e ep y r a z i n o n e sa n do n es t r o n gm y c o t o x i n b e s i d e s ，w ef o u n dan e w c u l t u r ec o n d i t i o nt o p r o m o t et h ef u n g u st op r o d u c ep e n i c i l l i ca c i d t h er e s u l t sh a d m a d ef o u n d a t i o nf o rt h er e a s e a c ha b o u tt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec u l t u r e c o n d i t i o n sa n dt h ep r o d u c t i o no fm e t a b o l i t c s k e yw o r d s ：s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m ；a s p e r g i l l u ss p ；m e t a b o l i t e s ；p y r a z i n o n e 原创性说明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位做储签名辆 日期：汐归年舌月e l 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：乐拯 导师签名：李厚参 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下完成的成果， 该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识产权法保护。在学期间与 毕业后以任何形式公开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人，未经 导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布 学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论支作者签名：豢如函 伊f o 年6 月 中山大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章前言 在人类的历史长河中，人类一直与疾病作斗争，而药物在人类与疾病的斗争 史中发挥着非常重要的作用。因此，开发疗效显著的新药是每个医药科学工作者 的目标，而新药的开发离不开具有生物活性的新化合物和先导化合物的发现。只 有这样才能有目的地进行人工合成或结构修饰，才有可能开发出具有临床应用价 值的新型药物。具有生物活性的化合物往往首先来自于地球上各种各样的动物、 植物和微生物。 而海洋作为地球上最大的生物资源宝库，含有丰富多彩的各种动物、植物和 微生物，为天然产物研究工作者提供丰富的资源【1 1 。此外，由于海洋生态环境的 特殊性( 高压、高盐、缺氧、缺少光照等) ，使得海洋生物物种间的生存竞争非常 激烈。为能在严酷的环境下进化生存，迫使很多海洋生物在生命过程中代谢产生 一些结构特殊、生物活性显著的化学物质即次生代谢产物 2 1 。自从2 0 世纪6 0 年 代，人们开始对巨大的海洋生物资源进行了世界范围的大规模研究以来，天然产 物研究工作者从海洋生物中发现新化合物的数量和速度均超出了人们的想象。大 量新骨架化合物的发现对有机化学、海洋生物学、海洋药物、以及生态学的发展 均提供了丰富的材料。 目前，海洋天然产物的研究对象主要集中在一些海绵、珊瑚、海鞘类动物、 苔藓、海藻等低等海洋动植物。这些生物在海洋中能够形成有效的自我保护主要 依靠产生一些特殊的化学物质防范潜在天敌的进攻，避免海洋微生物及浮游杂物 附着，以及物种之间的信息传递 3 ，4 ，5 1 。有研究认为这是由于这些生物没有发达的 细胞免疫系统，取而代之的是发达的化学免疫系统，正是这种化学免疫系统提供 了一个潜在有用的化合物资源宝库 6 1 。 这些低等海洋动植物往往会有许多海洋微生物与其有共附生的关系，而且这 些微生物在宿主的密度最高可达到宿主总重量的4 0 t 7 1 。近年来，有些研究表明 从海洋动植物中获得的结构独特的活性代谢产物，如河豚毒素、海葵毒素等，其 真正来源是与之共附生的海洋微生物【8 】。而且由于海洋动植物采集困难，数量有 1 中山大学硕士学位论文 限，新化合物的含量低，并且大量采集会对生态造成不可挽回的破坏。而对微生 物样品的采集相对容易，不会对环境造成很大的破坏，而且微生物样品由于生长 繁殖快，可以进行大量培养。因此，对海洋微生物活性代谢产物的研究越来越受 到科学工作者的重视，人们对从海洋微生物中找到新的特效药物寄予极大的希 望。 1 2s a r c o p h y t o n 软珊瑚代谢产物研究概况 珊瑚是海洋中常见的动物之一，为海洋低等无脊椎动物，属于腔肠动物门， 珊瑚虫纲，主要生活在热带海洋中。珊瑚全球有6 1 0 0 种，我国有4 9 6 种 9 1 。珊 瑚礁在热带地区包括多种生态群落，并且软珊瑚常是这些生态群落中的主要组成 部分。据科学工作者调查，我国南海诸岛的软珊瑚种类繁多、生长发育良好，往 往在礁盘上成片生长、成为优势物种，相当可观，也是珊瑚礁生态环境中的主要 类群之一，资源十分丰富。 近2 0 年，从软珊瑚中得到很多结构新颖，有强烈生物活性的化合物，使对 软珊瑚次级代谢产物的研究一直受到广泛关注，是现代海洋药物研究的重点生物 物种。 近年来，对s a r c o p h y t o n 软珊瑚的研究越来越受到天然产物工作者的重视， 其中主要集中在对t o r t u o s u m ，& c r a s s o c a u l e ，l a t u m ，& g l a u c u m 和& t r o c h e l i o p h o r u m 等这些种属的代谢产物的研究。研究发现很多代谢产物具有良好 的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性，其中一些化合物被认为是重要的药物先导 化合物。 1 9 8 6 年苏镜娱等从扭曲肉芝软珊瑚s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m 中得到2 个罕见的 四环四萜化合物m e t h y ls a r t o r t u o a t e ( 1 ) 和m e t h y li s o s a r t o r t u o a t e ( 2 ) 【1 2 1 ，打破了文 献记载中只有胡萝卜素类型碳架四萜的现状以来，扭曲肉芝软珊瑚马上成为了研 究热点。近几年有几个新的四萜先后从该软珊瑚的代谢产物中被分离得到，其中 中山大学药学院蓝文健等 1 3 - 1 5 1 从扭曲肉芝软珊瑚的甲醇和氯仿浸提物的乙酸乙 酯萃取部分分离得到4 个新的四萜化合物m e t h y lt o r t u o a t ea ( 3 ) ，m e t h y lt o r t u o a t e b ( 4 ) ，m e t h y lt o r t u o a t ec ( 5 ) ，m e t h y lt o r t u o a t ed ( 6 ) 。它们对小鼠s 18 0 ，c n e 一2 ， p 3 8 8 ，h t - 2 9 ，c n e 1 显示了不同程度的抑制作用。其中m e t h y lt o r t u o a t e a 和b ， 2 中山大学硕士学位论文 对c n e 2 ( 鼻咽癌细胞) ，p 3 8 8 ( 鼠白血病癌细胞) ，h t - 2 9 ( 人体结肠癌细胞) ， c n e 一1 ( 人鼻咽癌细胞) 的i c 5 0 值分别为2 2 7 和2 4 7p g m l ，3 5 和5 0r t g m l ， o 2 和0 5i t g m l ，0 8 和o 3 嵋l l ，而m e m y lt o r t u o a t ec 对c n e 一2 ，p 3 8 8 和 h t - 2 9 的i c 5 0 值分别为0 8 ，0 1 和2 6l 上g m l ，抗肿瘤药用前景明显。此外，2 0 0 7 年郭跃伟等【l6 】对中国南海玳瑁岛s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m 的代谢产物进行了研究 分离得到5 个新的大环四萜类化合物。x i m a o l i d e s a e ( 7 1 1 ) ，2 0 0 8 年他又从该软 珊瑚的次级代谢产物中得到两个新的大环四萜化合物x i m a o l i d e sf g ( 1 2 1 3 ) 【1 7 1 。 还有p r i s c i l a 等【】8 】也从澳大利亚海域的s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m 软珊瑚中得到另一 个四萜化合物m e t h y ln e o s a r t o r t u a t ea c e t a t e ( 1 4 ) 。 4 7 2 5 8r = h 8 a r = a e 3 3 6 9r = h 9 a r = a e 中山大学硕士学位论文 a e 1 2 1 3 1 4 2 0 0 6 年曾陇梅等【1 9 1 从三亚采集的s a r c o p h y t o nc r a s s o c a u l e 软珊瑚中分离得到 5 个新的c e m b r a n e 型二萜s a r c r a s s i n sa e ( 1 5 1 9 ) 和一个已知化合物e m b l i d e ( 2 0 ) ， 除s a r c r a s s i n sc 外，其它几个化合物对人口腔癌k b 细胞均有一定的细胞毒活 性。其中化合物1 4 、1 6 和1 8 对k b 细胞的i c 5 0 分别为5 0 ，4 0 ，5 0i t g m l ，化 合物1 3 和1 7 对k b 细胞的i c 5 0 分别为1 9 0 和1 3 0p g m l ，2 0 0 7 年他们在后续 的研究中，又从该软珊瑚9 5 的乙醇提取物中得到两个多羟基甾醇s a r c r a s t e r o l ( 2 1 ) 和2 4 亏m e t h y l c o l e s t a n e 3 p ，5 p ，6 a ，2 5 t e t r o l ( 2 2 ) ，其中化合物1 9 是新化合物，化合 物2 0 对胃癌细胞m g c 8 0 3 有中等程度的抑制活性，i c 5 0 为2 3 0r t g m l t 2 0 1 。2 0 0 3 年徐效华等【2 1 1 从南海西沙群岛采集的s a r c o p h y t o nc r a s s o c a u l e 软珊瑚的乙醇提取 物中得到一个氢过氧化物c e m b r a n e 型二萜s c r a c o p h y o c r a s s o l i d ea ( 2 3 ) ，该化合物 对小鼠白血病癌细胞p 3 3 8 有强抑制作用，i c 5 0 为o 1 “g m l 。 郭跃伟等 2 2 。2 5 1 从海南三亚采集的s a r c o p h y t o nl a t u m 软珊瑚的丙酮提取物中 分离得到11 个新的c e m b r a n e 型二萜s a r c o p h y t o n o l i d e se - l ( 2 4 - 3 1 ) ， d i e p o x y s a r c o p h y t o n e n e ( 3 2 ) ，s a r c o n p h y t o n o l ( 3 3 ) ，i s o s a r c o p h y t o n o l i d ed ( 3 4 ) ，两个 新的四萜b i s l a t u m l i d e sa ( 3 5 ) 和b ( 3 6 ) ，其中化合物4 8 和4 9 对a 5 4 9 ，h t 一2 9 和 p 3 8 8 肿瘤细胞系均具有中等强度的抑制活性，其i c 5 0 分别为7 0 ，7 0 ，5 8i t g m l 。 4 - ： c h a = = r ra0 01 1 中山大学硕士学位论文 1 5 1 6 1 9 2 0 o 屯h 1 7 h o h h o 一 2 1 2 4 2 82 9 3 2 3 3 5 ： 3 4 中山大学硕士学位论文 3 5 h 综上所述，s a r c o p h y t o n 软珊瑚的次级代谢产物结构新颖，生物活性多样， 尤其是从s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m 的次级代谢产物中分离得到的四萜化合物，不仅 结构独特，而且具有显著的生理活性，因此，已经有科学工作者开展对该类化合 物的全合成研究，如上海有机所的许杏祥教授开展了m e t h y li s o s a r t o r t u o a t e 的全 合成研究【2 6 j 。鉴于该类化合物有很好的药用前景，而珊瑚的生长环境要求高、 生长速度极慢，资源非常珍稀，作为天然药用资源有很大的局限性，而且由于生 态环境遭受破坏，使珊瑚礁生态系统退化，更重要的是，出于对保护环境的需要， 珊瑚等自然资源不可能无限量的采集，有些活性化合物结构复杂，也难以人工合 成，从而导致化合物来源问题难以解决，制约这些化合物开发成药物。 近年来国外对海洋低等动物中次级代谢产物及其生态学作了探讨性研究，结 果发现，某些活性物质实际上可能是由与其共附生的微生物产生的，并从海绵共 附生微生物中发现许多与其宿主相同或相关的结构新颖、活性独特的次级代谢产 物。因此，对海洋生物共附生微生物的大规模发酵培养，可以实现其宿主中的活 性化合物的工业化生产，这将为解决药物开发中的化合物来源问题提供一条可行 的途径。因此，对海洋生物共附生微生物的研究已经成为一个热点。 1 3 海洋生物共附生微生物研究概况 海洋微生物广泛分布于各个海域中，而且在高盐、高压、高温、严寒等极端 环境中都有微生物存在。这些微生物有的自由生活在海水中，有的存在于一些沉 淀物、海底泥的表面，还有一部分与海洋动植物处于共附生、共栖、寄生的关系。 我们将此类微生物称为共附生微生物。 共附生海洋微生物的宿主主要是一些海洋低等动植物，例如藻类植物，腔肠 6 中山大学硕士学位论文 动物、软体动物、甲壳动物、须腕动物、棘皮动物、刺胞动物、节肢动物等。海 洋微生物与海洋动植物共附生是一个非常普遍的现象，但是，对海洋微生物与其 宿主之间关系仍然知之甚少，有研究认为作为宿主的海洋动植物可以为共附生的 微生物提供富营养环境，从而有利于微生物的生长，而共附生微生物则产生各种 活性物质，从而有利于宿主的生长或提供化学保护【2 7 之引。 近年来，共附生微生物正受到越来越多研究者的重视。有很多研究者指出， 许多以前被认为是由植物或无脊椎动物产生的活性物质实际上是由与其共附生 的微生物产生的。 由于微生物的繁殖速度很快，可以用工业发酵的方法来大规模的培养。甚至 可以利用生物技术克隆d n a 的方法来大规模的获取这些活性化合物。这就为一 些有前景成为药物的化合物的供应问题提供了新的解决方法。而且，用微生物的 方法来获取活性化合物避免了对海洋生物的过渡开采，也避免了这些行动带来的 生态破坏和环境污染方面的问题。目前，从共附生海洋微生物中已分离得到包括 毒素、抗生素、抗肿瘤活性物质、酶类、色素等多种具有较强生物活性的物质， 并有许多已经开始工业化生产。这里就针对海洋生物共附生微生物代谢产物的研 究概况作一介绍。 在国际上，海洋共附生微生物产生的具有抗肿瘤、抗菌等生理活性的物质已 经得到广泛深入的研究。例如g i l t u m e s 等人【2 9 】发现用抗生素处理除去覆盖于 河口海虾p a l a e m o nm a c r o d o c t y l u s 卵表面的a l t e r o m o n a ss p 细菌，这些卵很快就 会因病原性真菌感染而死亡。经过进一步研究发现，a l t e r o m o n a ss p 可产生化合 物2 ，3 二氢吲哚( 2 ，3 i n d o l i n o d i o n ) i s a t i n ( 3 7 ) ，这是一种有力的抗真菌活性物质， 正是这种物质使卵免受病原性真菌的侵害。h i o r t 等【3 0 】从海绵样品h a l i c l o n as p 中获得的1 株未鉴定的真菌，产生3 个新的倍半萜类化合物h i r s u - t a n o l s a c ( 3 s 4 0 ) 和e n t g l o e o s t e r e t r i o l ( 4 1 ) 其中h i r s u t a n o la ( 3 s ) 和e n t g l o e o s t e r e t r i o l ( 4 1 ) 对枯草杆菌有较弱的抗菌活性。 n e e d h a n 等【3 1 】从分离自阿拉斯加w a l e s 岛的被囊类动物中的一株微生物 p s e u d o m o n a sf l u r e s c e n s 中获得两个有抗菌活性的化合物a n d r i m i d ( 4 2 ) 和 m o i r a m i d e sa c ( 4 3 4 5 ) ，它们结构中含有酰基琥珀霉素部分，因而对有甲氧基苯 基青霉素抗性的s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 有显著的拮抗作用。 7 中山大学硕士学位论文 4 4r = o h o 3 8r = a o h 3 9r = b - o h 4 0 4 1 o 黜。h 4 b h i o r t 等【3 2 】从地中海海绵a x i n e l l a d a m i c o r n i s 中分离到真菌a s p e r g i l l sn i g e r ， 产生2 个新化合物b i c o t a n a n i g r i n ( 4 6 ) 和a s p e r n i g r i n sb ( 4 7 ) ，用m t t 法测试显示， b i c o u m a n i g r i n 对白血病细胞有增殖抑制作用，给样量2 0 1 t g m l 时抑制率为5 0 ， 而a s p e m i g r i i l sb 在给样量为5 0i t e g m l 时有较强的细胞毒作用。 t s u d am 3 3 】等从一条海鱼的肠胃中分离得到的一株青霉属真菌p e n i c i l l i u m c i t r i n u m ，然后从其培养液的提取物中分离得到三个新的吡咯烷生物碱 s c a l u s a m i d e sa c ( 4 s 5 0 ) ，其中化合物4 8 具有抗隐球酵母c r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s ( m i c = 1 6 7r a g l ) 和抗球状细菌m i c r o c o c c u sl u t e u s 活性( m i c = 3 3 3 r a g l ) 。t s u d am 【3 4 】等又从同一株真菌中分离得到一个新的三环生物碱p e r i n a d i n e a ( s d ，它具有弱的抗鼠白血病l 1 2 1 0 细胞的活性( i c 5 0 = 2 0r a g l ) 和抑制球状细菌 m i c r o c o c c u sl u t e u s ( m i c = 3 3 3r a g l ) 和杆状菌b a c i l l u ss u b t i l i s ( m i c = 6 6 7m g l ) 的 活性。 8 哪 足 q 心 _ o 且 q 舣 从 中山大学硕士学位论文 柏 o h h o h o h 5 1 z h ih o n gx i n 3 5 1 等从来源于海绵的真菌p e n i c i l l i u ma u r a n t i o g r i s e u ms p 0 1 9 的代谢产物中分离得到三个新的喹啉类生物碱a u r a n t i o m i d e s a c ( 5 2 5 4 ) ，其中化 合物5 2 表现出抗人急性粒细胞白血病h l 6 0 细胞株和鼠白血病p 3 8 8 细胞株活 性，化合物5 3 则表现出抗人肝癌b e l 7 4 0 2 细胞株和p 3 8 8 细胞株活性。 p e t e r 等【3 6 】从地中海海绵a x i n e l l av e r r u c o s a 中分得的真菌p e n i c i l l i u ms p 中 分离得到2 个新的衍生物c o m m u n e s i n sc ( 5 s ) 和d ( s 6 ) 。通过m t t 法测试发现这 两个化合物对6 种白血病细胞有细胞毒活性，其中5 5 对m o l t - 3 ，8 0 对s u p b 1 5 的e d s o 值分别为8 6 ，9 0p g m l 。 l i uh o n g b i n g 等【3 7 1 从分离自亚德里亚海的海绵s u b e r i t e sd o m u n c u l u s 的一株 内生真菌a s p e r g i l l u su s t u ss t l a j n8 0 0 9 的代谢产物中分离得到两个新的倍半萜类 化合物( 5 7 5 8 ) 。这两个化合物对l 5 1 7 8 y 、p c ，1 2 、h e l a 细胞株均表现出一定的 细胞毒活性。 9 中山大学硕士学位论文 c o n h 2 c o n h 2 5 7r = r 5 5r = h 5 8r = 5 6r - c h o o o h h c o n h 2 t a p i o l a s 等【3 羽从一株加利福尼亚海沟珊瑚p a c i f i g u g i as p 表面的链霉菌的发 酵液中分离得到了两个结构新颖的化合物o c t a l a c i o n s a 和b ( 5 9 6 0 ) 。o c t a l a c i o n s a 在体外有抗b 1 6 f 1 7 鼠黑素瘤和h c t - 11 6 人胃瘤细胞活性，其i c 5 0 值分别为 0 0 0 7 2 ，o 5i _ t g m l 。 l u i sj c r u z 等【3 9 】一株未鉴定的海绵中分离得到一株海洋真菌c l o n o s t a c h y s s p e s n a a 0 0 9 ，从其菌丝体发酵提取物中分离得到了一个环酯肽i b 0 1 2 1 2 ( 6 1 ) 。 i b 0 1 2 1 2 对1 4 种不同肿瘤细胞株均有较强活性，其中对前列腺癌l n c a p 细胞 株、乳腺癌s k b r 3 细胞株、大肠癌h t - 2 9 细胞株和宫颈癌h e l a 细胞株的g i s o 值均为o 0 1m m 。 o 三5 9 最6 0 遵棘 赂舶o c h s h 3 吐久工。义上天义、 ：冬基心 v 土i p 广 1 0 6 1 中山大学硕士学位论文 综上可见，海洋生物共附生微生物具有产生多种结构新颖，生物活性显著的 代谢产物的巨大潜力，为寻找新的药用先导化合物提供了宝贵的资源。另外，研 究海洋生物共附生微生物活性物质具有其独特的优势，海洋微生物作为药物的生 产者没有原材料的后顾之忧，微生物发酵工艺成熟、成本低廉、产物质量有保证， 这将是解决海洋药物药源问题的重要突破。我国具有广阔的海域，海洋微生物资 源非常丰富，如果重视这一宝贵资源的开发利用，将有助于得到更多的具有自主 产权的药物先导化合物。 尽管己知有前景的化合物结构数以万计，但目前最严重的问题是已用于人体 治疗的化合物仍缺乏足够的化学多样性。未来我们所面临最严峻的挑战是如何寻 找更多的在化学结构和作用机理上有前景的新药以满足人类治疗的需求。而如何 进一步提高药物的化学多样性是解决问题的根本所在1 4 0 1 。虽然微生物的物种多 样性决定了其代谢产物的化学结构多样性，但是要体现这种多样性，必须要研究 数量庞大的不同微生物，这必将造成筛选菌种的工作量以及成本的大大增加。如 果能够从一株微生物得到各种结构的活性物质，这将是极大提高药物的化学多样 性。近年来，有不少文献报道通过改变培养条件而从一株微生物的代谢产物中获 得不同的化合物。因此，通过改变培养条件可能是实现微生物代谢产物结构多样 性的重要方法。 1 4 微生物代谢产物多样性 近年来，有不少文献报道通过改变培养条件而从一株微生物的代谢产物中获 得不同的化合物。例如，对于真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u sd s m 7 4 2 8 ，在运用微生 物代谢产物多样性方法之前，该菌被认为主要产化合物a s p i n o n e n e ( 6 2 ) ，产率为 8m g l t 4 1 1 。但是，当运用微生物代谢产物多样性方法改变各种培养参数以后，从 该菌的代谢产物中分离得到另外1 5 个化合物，产率达到9 4m g l ，这些化合物 是通过改变培养该真菌的容器而获得。x a n t h o m e g n i n ( 6 3 ) ，这是一种常见的真菌 色素，当运用锥形瓶在摇床培养该真菌周后能分离得到该化合物，并且该化合 物成为该真菌黄色孢子的主要色素 4 2 , 4 3 】。当使用锥形瓶静置培养该菌后，从其代 谢产物中分离得到三个苯并二氮化合物a s p e r l o x i na c ( 6 4 6 6 ) 4 4 1 。当该株真菌在 静置的液态培养基中培养后，有三个来源于氨基酸的化合物a s p e r g a m i d e sa c 一一 坐盔堂堡圭堂垡笙窭 ( 6 7 - 6 9 ) 从其培养液中分离得到【4 5 1 。 6 5 6 6 6 7 6 8 6 9 还有真菌s p h a e r o p s i d a l e ss p f - 2 4 7 0 7 ，这是一株主要产生螺环双萘化合物 c l a d o s p i r o n eb i s e p o x i d e ( 7 0 ) 的真菌t 4 6 4 引，当运用湿燕麦作为固态培养基在锥形瓶 中对该真菌进行培养时，可能由于营养条件比标准的液态培养基更好，从而得到 八个新的螺环双萘化合物( c l a d o s p 衲n e sb i ( 7 1 7 s ) ) t g j 。 7 0 7 1 7 4 7 6 1 2 中山大学硕士学位论文 综上可见，微生物在不同的培养条件下能产生不同的代谢产物。因此，只要 对微生物在不同培养条件下进行培养，就能够分离得到不同的代谢产物，这将是 发现新的具有生物活性的化合物的有效途径。本课题就是对一株南海软珊瑚 s a r c o p h y t o nt o r t u o s u m 内生曲霉属真菌a s p e r g i l l u ss p 在不同培养条件下的代谢产 物研究，从而得到一系列结构各异的化合物。海洋曲霉菌是一类很重要的海洋微 生物，其产生的具有显著生理活性的物质已得到广泛深入的研究，下面将介绍近 年来对海洋曲霉菌代谢产物研究的概况。 1 5 海洋曲霉菌代谢产物研究概况 海洋曲霉菌是海洋微生物的一个重要组成部分，自上世纪9 0 年代以来，随 着研究手段的飞速进步，海洋真菌天然产物的研究