（微生物与生化药学专业论文）蚯蚓蛋白对烫伤作用的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：监日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 黼：腿一髭塑日 期：加i o f 列 山东大学硕士学位论文 目录 摘要l a b s t r a c t 4 符号说明7 前言8日吾； 1 蚯蚓的药理活性研究8 1 1 蚓激酶9 1 2 抗菌肽9 1 3 钙调素结合蛋白1 0 1 4 溶血蛋白1o 1 5 其他活性成分1 1 2 烫伤治疗的研究进展1 1 2 1 烫伤定义和程度分级1 1 2 2 烫伤的临床过程1 2 2 3 烫伤创面愈合过程1 3 2 4 烫伤治疗研究1 4 3 本课题的研究内容、创新点和意义1 6 第一章蚯蚓蛋白的粗分离提取及其活性研究1 8 1 实验材料1 8 1 1 实验原料1 8 1 2 主要药品与试剂1 8 1 3 实验仪器1 9 2 实验方法2 0 2 1 蚯蚓的含水量及总蛋白含量的测定2 0 2 2 蚯蚓粗蛋白的提取分离2 0 2 3 蚯蚓粗蛋白对n i h 3 t 3 细胞的促进增殖作用2 1 2 4 统计学处理2 2 3 实验结果2 2 3 1 蚯蚓的含水量及蛋白含量的测定2 2 山东大学硕士学位论文 3 2 蚯蚓粗蛋白的提取分离2 2 3 3 蚯蚓粗蛋白对n i h 3 t 3 细胞的促进增殖作用2 2 4 讨论2 3 第二章蚯蚓粗蛋白e f p 离子交换层析分离及活性组分筛选2 5 l 实验材料2 5 1 1 实验原料2 5 1 2 主要药品与试剂2 5 1 3 实验仪器一2 5 2 实验方法2 5 2 1 蚯蚓粗蛋白e f p 的离子交换柱层析2 5 2 2 离子交换柱层析后各组分活性筛选2 6 3 实验结果。2 6 3 1 蚯蚓粗蛋白e f p 的离子交换柱层析2 6 3 2 离子交换柱层析后组分活性筛选2 7 4 讨论2 9 第三章蚯蚓蛋白e f p 2 凝胶层析分离及组分活性筛选3 0 1 实验材料3 0 1 1 实验原料一3 0 1 2 主要药品与试剂3 0 1 3 实验仪器3 0 2 实验方法3l 2 1 蚯蚓蛋白e f p 2 的凝胶柱层析3 1 2 2 凝胶柱层析后各组分活性筛选3 l 2 3e f p 2 1 蛋白性质的初步研究3 1 3 实验结果3 4 3 1 蚯蚓蛋白e f p 2 的凝胶柱层析3 4 3 2 凝胶柱层析后各组分活性筛选3 5 3 3e f p 2 2 蛋白性质的初步分析3 6 4 讨论3 8 第四章蚯蚓蛋白e f p 2 2 对n i h 3 t 3 细胞的作用研究。4 0 山东大学硕士学位论文 验材料4 0 1 1 实验原料4 0 1 2 主要药品与试剂4 0 1 3 实验仪器4 0 2 实验方法4 1 2 1e f p 2 2 对n i h 3 t 3 细胞的促增殖作用4 l 2 2 e f p 2 2 促进n i h 3 t 3 细胞划痕创面愈合实验一4 1 2 3 细胞培养液中羟脯氨酸含量的检测4 2 2 4 统计学处理4 2 3 实验结果4 2 3 1e f p 2 2 对n i h 3 t 3 细胞的促增殖作用4 2 3 2e f p 2 2 促进n i h 3 t 3 细胞划痕创面愈合实验4 4 3 3 细胞培养液中羟脯氨酸含量的检测4 6 4 讨论4 7 第五章凝胶剂的制备及性质考察4 9 l 实验材料4 9 1 1 主要药品与试剂4 9 1 2 实验仪器5 0 2 凝胶剂处方及制备的研究5 0 2 1 凝胶剂辅料的选择5 0 2 2 正交试验5 2 2 3 凝胶剂工艺条件考察5 4 2 4 凝胶剂的制备5 5 2 5 凝胶剂的性质考察5 5 2 6 凝胶剂的初步稳定性考察5 6 2 7 药效学考察5 7 3 实验结果5 8 4 讨论5 8 第六章蚯蚓蛋白e f p 2 2 对大鼠深i i 度烫伤的促进愈合作用6 0 1 实验材料6 0 1 山东大学硕士学位论文 i v 1 1 实验原料6 0 1 2 主要药品与试剂6 0 1 3 实验仪器6 l 2 实验方法6 1 2 1 实验动物分组及模型的建立6 l 2 2 给药方法。6 1 2 3 检测指标6 1 2 4 统计学处理6 2 3 实验结果6 2 3 1 创面愈合率6 2 3 2 创面愈合时间6 3 3 3 创面含水量6 4 3 4 创面羟脯氨酸含量6 5 3 5m a s s o n 三色染色6 6 3 6 创面病理切片6 7 4 讨论6 9 论文总结7 2 参考文献7 4 致谢8 0 攻读学位期间发表的论文8 1 山东大学硕士学位论文 c o n t e n t s a b s t r a c ti nc h i n e s e 1 a b s t r a c ti ne n g l i s h 4 s y m b o l i cd e s c r i p t i o n 7 p r o f a c e 8 1e a r t h w o r mp r o t e i np h a r m a c o l o g ya c t i v i t y 8 1 1l u m b r u k i n a s e 9 1 2a n t i b i o t i cp e p t i d e 9 1 3c a l d e s m o n 10 1 4h e m o l y s i sp r o t e i n 10 1 5t h eo t h e ra c t i v ec o m p o n e n t 11 2s c a l dt h e r a p i cr e s e a r c ha n dp r o g r e s s i o n 11 2 1s c a l dd e f i n i t i o na n dd e g r e e 11 ：! 2s c a l dc l i n i c a lc o u r s e 1 2 2 3b u mw o u n dh e a l i n gc o u r s e 13 2 4s c a l dh e a l i n g 1 4 3t h ei n v e s t i g a t i o nc o n t e n t ，i n n o v a t i o np o i n ta n dm e a n i n go f t h et o p i c ：1 6 c h a p t e r1 e x t r a c t i o na n da c t i v i t yr e s e a r c ho fe f p 18 1 e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 18 1 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l 18 1 2m a j o rd r u ga n dr e a g e n t 18 1 3l a b o r a t o r ya p p a r a t u s 19 27 i e s tm e t h o d 2 0 2 1t h ec o n t e n to fw a t e ra n dt o t a lp r o t e i ni nt h ee a r t h w o r m 2 0 2 2e x t r a c t i o no fe f p 2 0 2 3p r o m o t i n gn i h 3 t 3c e l lp r o l i f e r a t i o no fe f p 2 1 2 4s t a t i s t i c a lt r e a t m e n t 2 2 3r e s u l t s 2 2 3 1d e t e r m i n a t i o no ft h ec o n t e n t so f p r o t e i na n dw a t e r 2 2 v 一 些奎莶堂堡主兰垡堡壅 一 _ l _ _ _ _ - _ - - _ _ - - _ - - _ _ _ - i - _ - _ _ - - _ - - - _ _ _ 一一 v i 3 2e x t r a c t i o no fe f p 2 2 3 3p r o m o t i n gn i h 3 t 3c e l lp r o l i f e r a t i o no f e f p 2 2 4d i s c u s s i o n 2 3 c h a p t e r2 a n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n da c t i v i t yr e s e a r c h o fe f p 2 5 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 2 5 1 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l 2 5 1 2m a j o rd r u ga n dr e a g e n t 2 5 1 3l a b o r a t o r ya p p a r a t u s 2 5 2t o s tm e t h o d 2 5 2 1a n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo fe f p 2 5 2 2s c r e e n i n go fa c t i v ec o m p o n e n t 2 6 3r e s u l t s 2 6 3 1a n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo fe f p 2 6 3 2s c r e e n i n go fa c t i v ec o m p o n e n t 2 7 4d i s c u s s i o n 2 9 c h a p t e r3 g dc h r o m a t o g r a p h ya n da c t i v i t yr e s e a r c ho fe f p 2 3 0 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 3 0 1 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l 3 0 1 2m a j o rd r u ga n dr e a g e n t 3 0 1 3l a b o r a t o r ya p p a r a t u s 3 0 2t e s tm e t h o d 3 1 2 1g e lc h r o m a t o g r a p h ye f p 2 3 1 2 2s c r e e n i n go fa c t i v ec o m p o n e n t 31 2 3i n i t i a lc h a r a c t e ra n a l y s i so fe f p 一2 2 3 1 3r e s u i t s 3 4 3 1g e lc h r o m a t o g r a p h ye f p - 2 3 4 3 2s c r e e n i n go fa c t i v ec o m p o n e n t 3 5 3 3i n i t i a lc h a r a c t e ra n a l y s i so fe f p 一2 - 2 3 6 4d i s c u s s i o n 3 8 山东大学硕士学位论文 c h a p t e r4 t h ec e l lp r o l i f e r a t i o na c t i v i t yo fe f p - - 2 - 2i nn i h 3 t 3 e e l l 4 0 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 4 0 1 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l 4 0 1 2m a j o rd r u ga n dr e a g e n t 4 0 1 3l a b o r a t o r ya p p a r a t u s 4 0 2t e s tm e t h o d 4 1 2 1t h ec e l lp r o l i f e r a t i o na c t i v i t yo fe f p 一2 2i nn i h 3 t 3c e l l 4 1 2 2n i h 3 t 3c e l ls c r a t c hw o u n dh e a l i n ge x p e r i m e n t so f e f p 2 2 4 1 2 3c o n t e n to ft h eo h pi nt h ee e l ln u t r i e n tf l u i d 4 2 2 4s t a t i s t i c a lt r e a t m e n t 4 2 3r e s u l t s 4 2 3 1t h ec e l lp r o l i f e r a t i o na c t i v i t yo fe f p 一2 2i nn i h 3 t 3c e l l 4 2 3 2n i h 3 t 3c e l ls c r a t c hw o u n dh e a l i n ge x p e r i m e n t so f e f p 2 2 4 4 3 3c o n t e n to ft h eo h pi nt h ec e l ln u t r i e n tf l u i d 4 6 4d i s c u s s i o n 4 7 c h a p t e r5p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e ro ft h et r a n s d e r m a lg e l 4 9 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 4 9 1 1m a j o rd r u ga n dr e a g e n t 4 9 1 2l a b o r a t o r ya p p a r a t u s 5 0 2p r e s c r i p t i o na n dp r e p a r a t i o no ft h et r a n s d e r m a lg e l 5 0 2 1s e l e c t i o no ft h et r a n s d e r m a lg e la d j u v a n t 5 0 2 2o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 5 2 2 3t e c h n o l o g yo ft h et r a n s d e r m a lg e la d j u v a n t 5 4 2 4p r e p a r a t i o nt h et r a n s d e r m a lg e l 5 5 2 5c h a r a c t e ro ft h et r a n s d e r m a lg e l 5 5 2 6i n i t i a ls t a b i l i t yo ft h et r a n s d e r m a lg e l 5 6 v 玎 山东大学硕士学位论文 v i 2 7p h a r m a e o d y n a m i c s 5 7 3r e s u l t s 5 8 4d i s c u s s i o n 5 8 c h a p t e r6e a r t h w o r mp r o t e i n w o u n dh e a l i n ga c t i v i t yo nr a t sd e e p s e c o n dd e g r e es c a l d 6 0 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 6 0 1 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l 6 0 1 2m a j o rd r u ga n dr e a g e n t 6 0 1 3l a b o r a t o r ya p p a r a t u s 6 1 ：! t e s tm e t h o d 6 1 2 1e x p e r i m e n t a la n i m a lg r o u p i n ga n dm o d e l 6 1 2 2t h em e t h o do fa d m i n i s t r a t i o n 6 1 2 3d e t e c t i o ni n d e x 6 1 2 4s t a t i s t i c a lt r e a t m e n t 6 2 3r e s u l t s 6 ：2 1 3 1w o u n dh e a l i n gr a t e 6 2 3 2w o u n dh e a l i n gt i m e 6 3 ：；3c o n t e n to ft h ew a t e ri nt h ew o u n d 6 4 3 4c o n t e n to ft h eo h pi nt h ew o u n d 6 5 3 5m a s s o nm o t h e d 6 6 3 6p a t h o l o g ys l i c e 6 7 4d i s c u s s i o n 6 9 s u m m a r y 7 2 r e f e r e n c e 7 4 a c k n o w l e d g m e n t 8 0 a r t i c l e sp u b l i s h e d 81 山东大学硕士学位论文 蚯蚓蛋白对烫伤作用的研究 摘要 蚯蚓( e i s e m i af o e t i d a ) 又称地龙、曲蟮，环节动物门寡毛纲陆 生动物。我国对蚯蚓的药用历史悠久，是一种传统的中药。全世界已 知的蚯蚓种类有3 0 0 0 多种，分为水栖种类、陆栖种类以及少数寄生， 可供养殖的陆栖蚯蚓种类只有十几种。 随着现代生物技术的发展关于蚯蚓的药理活性的研究也越来越 多，但是主要还是集中在其纤溶活性方面，关于其他的药理活性的研 究还很少，将提纯后的蚯蚓蛋白制成外用凝胶剂用于烫伤治疗的研究 就更少了，而能查到的蚯蚓治疗烫伤的资料也主要是停留在对蚯蚓未 分离纯化的混合物的研究。民间中医使用蚯蚓捣烂外敷治疗烧烫伤效 果显著，为了寻找蚯蚓中治疗烫伤的有效成分，本论文对蚯蚓蛋白进 行了分离纯化，得到了一种对大鼠深i i 度烫伤具有良好的促进愈合效 果的蛋白组分e f p 2 2 ，并对其可能的促进愈合作用的机理进行了研 究。论文主要内容如下： 1 蚯蚓蛋白的分离提取。将鲜活蚯蚓冰浴匀浆，硫酸铵盐析，透 析4 8 h 后冻干即得蚯蚓粗蛋白e f p ，得率为1 3 4 。对蚯蚓粗蛋白e f p 进一步分离纯化及活性组分筛选。采用n i h 3 t 3 成纤维细胞为实验材 料，以促进其增殖为主要指标，通过逐级分离纯化与促进n i h 3 t 3 细 胞增殖实验相结合的方法，筛选得到生物活性强的蚯蚓蛋白e f p 2 2 ， 确定了e f p 2 2 的分离纯化条件：蚯蚓粗蛋白冻干粉加水溶解，通过 d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 离子柱，2 0 m m o l l ，p h 7 8 的磷酸盐缓冲液 洗脱两个柱体积，然后用2 m o l l 氯化钠溶液进行线性洗脱，紫外检测 器2 8 0 n m 检测到4 个峰，收集活性高的第二个峰( e f p 2 ) 浓缩并冷 冻干燥；e f p 2 加水溶解，通过s u p e r d e x 7 5 凝胶柱，蒸馏水洗脱，紫 外检测器2 8 0 n m 检测得到2 个峰，收集活性高的第二个峰，透析( 截 留分子量3 5 0 0 ) 除盐，浓缩并冷冻干燥得蚯蚓活性蛋白e f p 2 2 。 2 蚯蚓蛋白e f p 2 2 对n i h 3 t 3 细胞的作用研究。选取烫伤愈合 中的优势细胞n i h 3 t 3 成纤维细胞为研究对象，m t t 法检测细胞增殖 山东大学硕士学位论文 率结果表明，e f p 2 2 在高剂量( 1 0 p g m 1 ) 时促进增殖作用最好，与 模型组比较细胞数量明显增多，且此增殖作用呈现出一定的剂量依赖 性；n i h 3 t 3 细胞的划痕愈合实验结果分析表明，给药4 8 h 后不同浓 度的e f p 2 2 都有促进n i h 3 t 3 细胞划痕创面愈合的作用，且e f p 2 2 在高剂量组( 1 0 “g m 1 ) 时这种促进划痕创面愈合的作用最好，其给药 4 8 h 后划痕创面已经基本愈合；羟脯氨酸测定结果表明不同浓度的蚯 蚓蛋白都有增加培养基中羟脯氨酸含量的作用，且e f p 2 2 在高剂量 组( 1 0 i t g m 1 ) 时的这种促进作用最好，其统计学结果与模型组比较具 有显著差异( p 0 0 1 ) 。 3 凝胶剂的制备及性质考察。本实验选择卡波姆9 4 0 为凝胶基 质，甘油、丙二醇为保湿剂，尼泊金乙酯为防腐剂，三乙醇胺为p h 调节剂，选择将卡波姆9 4 0 自然溶胀的方法制成卡波姆溶液，再加入 p h 调节剂制成凝胶剂。实验制成的凝胶剂外观均匀、无色透明，兼具 水化吸收双重功效，高温低温下物理化学性质稳定，可以进行高温高 压蒸汽灭菌而外观、性质不发生变化，是非常理想的外用创伤敷料。 4 蚯蚓蛋白e f p 2 2 对大鼠深i i 度烫伤的促进愈合作用。实验将 蚯蚓蛋白e f p 2 2 加入到凝胶剂中制成蚯蚓蛋白外用凝胶剂，探讨其 对大鼠深i i 度烫伤的促进愈合作用。生化指标和形态学结果表明：对 烫伤愈合率和烫伤愈合时间进行分析，我们发现高剂量组的e f p 2 2 能够明显地提高烫伤愈合率和缩短烫伤愈合时间：对早期创面含水量 进行分析表明e f p 2 2 能够明显减少创面早期水肿；m a s s o n 三色染色 法结果表明e f p 2 2 组未变性的蓝色区域明显多于模型组，具有减少 早期创面胶原变性的作用；羟脯氨酸含量测定结果表明，e f p 2 2 可 以增加创面羟脯氨酸含量。 5 蚯蚓蛋白e f p 2 2 的初步结构研究。考马斯亮蓝法测定蚯蚓蛋 白e f p 2 2 的蛋白含量为6 1 2 5 ；紫外可见光谱发现蚯蚓蛋白 e f p 2 2 在2 1 0 n m 和2 8 0 r i m 波长有较强的紫外吸收；s d s 聚丙烯酰 胺凝胶电泳发现所分离得到的蛋白共有两个蛋白泳带，进一步采用凝 胶定量软件q u a n t i t yo n e 对s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分子量预测 发现我们分离的两种蛋白分子量分别是2 2 3 1 k d a 、1 8 0 1 k d a 。 2 山东大学硕士学位论文 本课题通过逐级分离纯化与细胞实验相结合的方法，得到生物活 性强的蚯蚓蛋白e f p 2 2 ，并对其性质进行了初步的分析。实验结果 表明e f p 2 2 具有促进大鼠深i i 度烫伤愈合作用，且对n i h 3 t 3 细胞 具有明显的促增殖作用。本实验从蚯蚓中发掘出具有促进烫伤愈合的 蛋白成分，并将其添加到凝胶剂中用于大鼠深i i 度烫伤模型，对其开 发成外用烫伤制剂的研究提供了一定的理论依据。 关键词：蚯蚓蛋白；分离纯化；深度烫伤；n i h 3 t 3 ；凝胶剂 3 s c r e e n i n g t h eo p t i m i z e de f p 一2 2s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n w a si d e n t i f i e d ：f i r s t l y , t h ee a r t h w o r mc r u d ep r o t e i nw a ss e p a r a t e db y d e a es e p h a r o s ef a s tf l o wa n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yi n t o4 p e a k ， w h i c he q u i l i b r a t e db yp h o s p h a t eb u f f e rs a l i n ei n t o2c o l u m nv o l u m ea n d t h e n2 m o l 1n a c ll i n e a rg r a d i e n te l u t i o na n d2 8 0 n m d e t e c t i n g ，a n dt h e2 t h p e a k ( e f p 2 ) w a sc o l l e c t e d e f p 一2w a ss e p a r a t e db ys u p e r d e x 7 5g e l c h r o m a t o g r a p h yi n t o2p e a kw i t hd i s t i l l e dw a t e re l u t i o na n d2 8 0 n m 4 一 些奎奎堂堡主兰垡笙壅 一一 一一一 d e t e c t i o n a n dt h e2 n dp e a k ( e f p 2 2 ) w a sc o l l e c t e d a n dt h e ne f p - 2 2 w a sd e s a l t e di nb a gf i l t e rf o r4 8 hi n4 0 ca n d f r e e z e d r y i n ga tl a s t 2 t h er e s e a r c ho fe i s e m i af o e t i d ap r o t e i no nn i h 3 t 3c e i l s t a k i n g t h en i h 3 t 3 c e l l sa se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，e f p - 2 2 h a st h eb e s t p r o l i f e r a t i o ne f f e c ta t 10 t g m la n dt h ep r o l i f e r a t i o ne f f e c tw i l ld e p e n do n t h ed o s eo ft h ee f p 一22 a f t e rd r u g e df o r4 8 h ，t h ee f p - 2 - 2 h a st h eb e s t p r o m o t i n gi n j u r e da r e ac i c a t r i z a t i o ne f f e c ta t lo i x g m lo nn i h 3 t 3c e l l s , a n dt h ei n j u r e da r e ai s c i c a t r i z e da f t e rd r u g e df o r4 8 h t h ee f p - 2 - 2 i n c r e a s e st h eh y d r o x y p r o l i n e ( o h p ) c o n t e n t s i nt h ec e l ln u t r i e n tf l u i da t lo l x g m la n dt h ee f f e c ti sm a r k e dc o m p a r i n gw i t h t h er o o d e lg r o u p 3 t h ep r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e ro f t h eg e l w ec h o o s ec a r b o m e r - 9 4 0 a st h eg e lb a s em a t e r i a l ，g l y c e r o l a n dp r o p y l e n ea st h e h 啪e c t a n t s ， e t h y l p a r a b e na st h ep r e s e r v a t i v e ，t r i e t h a n o l a m i n e a st h ep hm o d e r a t o l w ec h o o s et h em e t h o do fc a r b o m e r - 9 4 0n a t u r a l s w e l l i n g ，a n dt h e np u t i n t ot h ep hm o d e r a t o rt op r e p a r et h eg e l t h eg e lh a st h e c h a r a c t e ro ft h e t 珊s p a r e n t a n de v e na p p e a r a n c e ，t h eh y d r a t i o n a n dm 0 1 s t e n ，t h e p h