（物理化学专业论文）蟾蜍膀胱上皮细胞的nah交换.pdf

摘要 p 胞内邮调节椭昧证了细胞内环境的稳定，与细胞 的代谢活动密切相关。细胞质膜上的n a + h + 交换系统参与细胞多种功 能，如：p h i 的调控，细胞体积的调节，存在于肾、小肠上皮细胞顶 膜的n a + h + 交换系统对n a + 的重吸收和酸分泌起重要作用。卜 本实验论证蟾蜍膀胱膜上存在n a + h + 交换及其对p h i 的调节作 用。用p h 敏感荧光物质2 删7 1 - b is ( c a r b o x y e t h y l ) 一5 ( 6 ) 一 c a r b o x y f l u o r e s c e in ( 简称b c e c f ) 作荧光探针，取组织膜做实验对 象，利用分隔的两室对组织膜有选择地作用。由于严格控制了灌注作 用的上皮细胞的极性，首次使用氨脉冲酸载取得成功，在此基础上得 到结论：蟾蜍膀胱上皮细胞p h 值为7 2 l ：在蟾蜍膀胱的粘液面即顶 膜存在n a + h + 交换，它参与调节p h i ，在交换过程中对细胞外n a + 有依 赖性；能被l m mn a + h + 交换阻止剂a m i l o r id e 大部分阻止：p h i 对n a + h + 交换活性影响很大，属细胞内调节；表皮生长因子( e g f ) 和促肿瘤 分裂剂佛波脂( p d b ) 都参与激活和调节n a + h + 交换而对p h i 产生影 响，e g f 使p h i 升高，p d b 使p h i 降低。将我们的实验结果与文献综 述相比较，可认为存在于蟾蜍膀胱膜上的n a + h + 交换剂( n a + h + e x c h a n g e r ，n h e ) 应属于n h e 家族中的n h e 3 亚型。 关键词：n a + h + 菱颔，p h i hi 诵节，蟾蜍膀面膜，氨脉冲酸馘，荧筅，关键词：+ 交。换，p调节，蟾蜍膀胱膜，氨脉冲酸载，荧光， b c e 昨a m i1 。r 轴e ，e g f ，p 晶。 a b s t r a c t i n t r a c e l l u l a rp h ( p t i ) ism a i n t a i n e da tan e u t r a lr a n g e ( 7 2 ) u n d e r p h y s f o i o g i c a lc o f t d i t i o nb ys e v e r a lp l a s i l i am e f l l b r a i l eh + e x t r u s i o ns ys t e m s o n uo ft h es y s t e n l sw h lc hiss p e c i a l lys t u d ie disn a + h + e xc h a r t g e i t s cxis t e n c eh a sb e e nd e sc r i be di nv i rc u a l l ya 1 1c e l lt y d e sir l c l u d i l 1 9 p j o k a r y o t e sa n de u k a r y o t e s i na d d i t i or lt op h i r e g u l a t i o f t ，t h en a + h + e xch o 1 1 9 eisi n v o lv e di i lc e l lv o ik i l n er e g u l a t i o n i nt h ee p i t h e l i a lce 1 1s ( ) f k i d n e ya n di 1 1 t es t in e ，t h ea p ic a le x c h a n g ep l a ysa ni m p o r t a n tr o l ei n n a r e a b s o f d t i o na n da c ids e c r e t i o n t 1 3o r d e rt oi n v es t ig a t et h em e m b r a n et r a ns p o r tp r o c e s s e sif l v 0 1 r e d in p h ir e g u l a t i o i l ，t h et o a dl i f ir l a f y b l a d d e re p i t h e l i a lc e l lsa f e1 0 a d e d w it ht h e t r a p p a b ie ， p h s e n s i t iv e f l u o r e s c e n td y e2 7 一b is ( c a r b o x y e t h y l ) 一5 ( 6 ) 一c a r b o x y f l u o f e s c e n ta c e t o x ym e t h y le s t e r ( n c e c f - a m ) i nt h ep 1 7 es e n tt h e s ls ，t o a du r l n a r yb l a d d e r ism o l i n t e do n al is s u eh 0 1 d e rt h a tf i t si n t oas t a n d a r df l u o r o m e te rc l i v e t t e t h et is s h e s e p a r a t e st w of l u i dc o m p a r t m e n t s t h eo h t e i - c h a r h b e ra n dt h ei t i n e i - c h a r n b e r 1 h e ya ll o wi n d e p e n d e n ts u p e r f u s i o f to ft h em u c o s a la n ds e r o s a ls u r f a c e s a n dm a i n t e f l a n c eo f f u t i c t lo n a l c e l l p 0 1 a r i t y i nh e p e s b u f f e r e d s o iu t i 0 1 1 ，b a s a lp h iis7 2 i i e s e l e c tt h es e r os a ls i d et ous ea m l l l o r l i a p r e p u ls et e c h n i q u et oa c id i f yc e l l s tm o l l i t o rp h ir e c o v e r ya n de v a l u a t e d t h er 0 1eo fs e c e r a l f a c l ；o r sw h i c hir l v o l v ep h ir e c o v e r y w ef i n d t h a t n a + 一d e d e n d e n tn a + h e x c h a n g e isl o c a t e di nt h ea p ic a l m e m b r a n e 1 m t , t a m i1o r i d ec a l li n h i b i tm os tp a r to ft h en a + 一d e p e n d e n tp t t i r e c o v e r y t h e p i t i - d e p e n d e n tn a + h + e x c h a r t g e isa c t i v a t e db ym a n ys t i i l l l l l i ，s u c ha se g f a n dp d b l o o n g m lo fe g fc a n i n c r e as ep h ib y0 17 p h ，w h i1e 1 0 7 t , ip d bc a r l d e c r e a t s ep h ib y0 1 4 p t j i tm a yb et h a te g fa n dp d bs t i m u l a t e d p r o t e i n k in as ec ( p k c ) w h i c hisir l v o l v e dir l t h ea c t i v a t i o no fn a + h + e x c h a n g e - 1 1 h c s ee v i d e n c ess u g g es tt h a tt h en a + h + e x c h a n g e ri nt o a dl i t i n a r yb l a d d e r islh en f f e 3is o f o i - m k e y w o r ds ：n a + i t + e xch a n g e ， p h ir e g u l a t i o n ，t o a du 1 2 i n a - y bl a d d e r ， a r n m o n i a p r e p u l s e t e c h n i q u e ， b c e c f t a m i l o r ld e ，e g f ，p d b 第一部分基本原理及资料分析 卜1 细胞内p h 的调控 在生命体系中，细胞内p h ( i n t r a c e l l u l a rp h ，简称d h i ) 的变 化与诸多生命活动密切相关，如：细胞分裂、酶活性、通道活性及蛋 白质去质子化所导致的构型变化都伴有p h i 的变化。尽管如此，p h i 总是被严格控制在一个极窄的范围。人们认识到胞浆p h 受到严格调 控是近二、三十年的事。真核细胞胞浆p h 被控制在7 o 7 4 ，是由 于一套离子交换机制和胞浆的有效缓冲作用的结果。细胞质膜参与 p h 调节的离子转运系统有：1 n a + h + 交换系统( n a + h + a n t i p o r t e r ) ： 2 依赖n a + 的c 1 c o ，2 一交换系统( n a 。d e p e n d e n tc l 一h c o ，” e x c h a n g e r ) ；3 不依赖n a + 的c l 一h c 0 3 ”交换系统( c i - h c o3 2 。 e x c h a n g e r ) 和4 其他( 如a t p 依赖的h * - a t p 酶等) 。前二者的作用 主要在于升高胞内p h 和矫正酸中毒2 “；后者在于降低胞内p h 和 缓解碱中毒 3 ，其作用机制如下图所示 。 图i ：细胞质膜三种主要p h 的调节系统 卜2 n a + h + 交换系统 卜2 一1 简介 n a h + 交换系统参与细胞多种功能，其研究受到很大重视，研究 相当深入综述6 - 7 9 1 3 11 4 。p i t t s 于五十年前提出了n a + h + 交换的概念；1 9 7 2 年，h a r o l d 等1 首次在类链球菌中证实n a + h + 交 换活动：l9 7 6 年，m u r e r 等1 在哺乳动物肾和小肠刷缘膜制备物中证 明有电中性的n a + h + 交换存在。此后发现几乎在一切原核细胞、真核 + 1 蚕一 细胞中部有n a + h + 交换系统。n a + h + 交换系统除了调节细胞内p h 外， 还参与细胞体积的调节，存在于肾、小肠上皮细胞顶膜的n a + h + 交换 系统对n a + 重吸收和酸分泌起重要作用。 卜2 2 特征 n a + h + 交换过程由质膜两侧的n a + 与h + 化学梯度联合驱动。在生理 条件下，胞外存在高浓度的n a + ，n a + h + 交换系统“催化”n a + 的摄取 并向胞外排出h + 。n a + h + 交换不需要a t p 作为能量，但n a + h + 交换的 激活过程需要a t p 。化学计量学和热力学研究表明，n a + 与h + 的交换为 1 ：1 ，因而n a + h + 交换是电中性的。膜电位改变不影响n a + h + 交换过程。 l i + 可替代n a + ，影响n a + h + 交换 ”“9 1 2 “ 。还有证据表明n a + h + 交 换蛋自能转运n h 。“2 ，但n a + h 交换系统毕竟有选择性，除l i + 、 n a + 、h 和n h 。+ 外，其他一价阳离子不能通过。 在生理条件下，n a h + 交换系统依赖向内的n a + 梯度，向外运输h ， 然丽很多实验表明n a h + 交换是可逆沁“，即在胞外不存在n a + 的条件 下，n a + h + 交换可逆转。种种迹象表明n a + h + 交换系统属细胞内调节， 如当胞内h + 浓度增加时，n a + 的摄入速率明显加大；而胞外h + 浓度增 大时n a 的排除速率要馒得多。生理条件下，调节n a + h + 交换的最重 要因素是胞内p h 23 。”2 “，胞内h + 显著刺激n a + h + 交换活动，即p h i 的 微小变化会引起交换速度的陡变。 实验证明n a + h + 交换的进行有一设定值( s e t p o i l 2 t ) 2 “2 7 “， 当胞内p h 高于此设定值时，n a + h + 交换系统无活性；当胞内h + 积累到 一定程度，低于设定值时，n a + h + 交换便被激活。当然n a + h + 交换的 设定值也受调控，细胞状态改变时，如被生长因子诱发细胞分裂时， 细胞分化时，受精或细胞生长受抑制时，细胞内p h 设定值都不同。 一般认为氨氯吡脒( a m i l o r i d e ) 是n a + h + 交换的抑制物。 a m “o r i d e 为临床使用的利尿剂，其结构式为 菽：广- - - - - o k h - - - - n p e a = 8 7 ，在生理p h 范围内，它以一份阳离子形式存在，可与n a + 在 n a + h + 交换系统的结合点上发生竞争而抑制该交换过程。抑制效应与 胞外n a + 浓度有关- ”1 9 ”3 i 】，当胞外n a + 浓度低时，a m i f o r i d e 抑制效应增大。a m i lo f i d e 可作为研究n a + h + 交换的工具。 n a + h + 交换能被有丝分裂原或非有丝分裂信号激活“”1 ，如：生 长因子、癌基因产物、精子、神经递质、激素、凝激素、渗透改变、 2 、 剪切力、细胞扩散等信号迅速激活。 以上是n a + h + 交换的一般性特征，对不同的实验材料，它们在药 理学、动力学、和激活调节上又有不同的表现，综述文献列入表一。 表一：n a + h + 的个体表现 实验材料 a r n i l o r i d e刺激物抑制物 l l c p k ，b b m敏感c a m p ，p h o r b 0 1 e s te r l l c p k ，c o n f lu e l 、t敏感 cl i l t u r e s o p p o s u mk i d n e y ce 11s敏感t h y i - o xir l ec a m p p h o r b o l e s t e i - r a b b i tr e n a lb b m敏感 q， q 2 一c 矗疑p 。 r e c e p t o r s c 1 0 i l i d in e ， p h o r b 0 1e s t e rc ir i l e t i d ir l e 0 sn l o t ic s h r i n k i l 3 9 l i a b b i te l l t r oc y te1 3e 3 1 1敏感 r a te r t t r o c v t eb 1 3 m敏感 e g fc a m p ，c a 2 + r a tc o l o n c y t eb 1 3 m不敏感 h ur l l a l l p 1 a c e t e tb 1 3 , i不敏感 c 1 0 n id i n e ， c i i n e t i d i n e l o p e r a t m id e r a ter l t r o c y t eb l m不敏感 r a tp a r o ti d9 1 a n db l ， l l c p k l ，b l m p h o r b o les t e t l l c p k ls u b c o n f l u en t不敏感 r a tc h o r o i dp le x u s不敏感 r a tr e n a lc o r t ic a l不敏感 c 0 1 l e c t i n gt u b u l eb l m r a tc o l o r i o c y t e1 3 i 。m敏感 i t l 一6 0c u l t u l s e dc e l ls不敏感 p h o r b o le s t e r h un 1 a nn el i t r o p hi1s不敏感 p h o r b o le s t e r t r a b b i t e r y t h r o c y t es不敏感 c a m p r a ts l l o o t hm u s c l e不敏感 e g f ， q 、一r e c e p t o r ， t h r o n l b i n a n g i o t e i t s ir t i i c h ic kc a r d ia cm usc 】e不敏感 c h lc ks k e l e t a li l l usc 】e不敏感 3 e r u m ， p h or b 0 1es t e r c c l 一3 9 不敏感i ns u l i n ，e g f ， t h r o m b i n s w is s3 t 3 c u i t u r e d不敏感3 e r u m ， c e l lsp h o r b 0 1e s t e r a 4 3 1 h u m a l lf i b r o b l a sl不敏感e g f ， p h o r b o le s t e r ， 1 3 r a d y k in i n ， 0 s m o t i c s h f ir l k i n g c o r n e a ls i r cc e l ls不敏感 一2 9 i n t e s t ir l a lc e i l不敏感 l in e c l c 0 2in t e s t in a l不敏感 c c l ll in e r l t p n e ur f l o c y t e s ，不敏感 l y p e 2 r 、ta d r e n a i不敏感 g 】o r i l e rl 1 1 0 s ac e l ls r a tc o f t ic a l) ：敏感 s yr l a d t o m e s 淀：b b m ，b r u s h b o r d e rm er a b r a n e ( a p i c a ld o m a i n ) 刷缘膜或顶膜 b l m ，b a s o l a t e r a lme m t ) f a r e ，底侧膜 e g f ，e p i d e r m a lg r o v t t h f a cl o r 表皮生长因子 卜2 3 n a + h + 交换分子水平的研究 由于n a + h + 交换的不同表现，人们猜想有多种亚型的n a + h + 交换 蛋白( n a + h + e x c h a n g e r ，n h e ) 。1 9 8 9 年，s a r d e t 等b 2 1 首次克隆出 人类的n h e c d n a ，并演绎出其氨基酸序列，由此n a + h + 交换分子水平 研究取得了突破性进展。近期几篇综述“”3 4 1 已将n h e 基因家族五 位成员( n h e l ，n h e 2 ，n h e 3 ，n h e 4 ，1 3n h e ) 的结构、分布及调节做 了阐述。它们在氨基酸序列及基因结构上有较高的同源性，但在细胞 分布、功能作用及活性调节方面存在差异，具体见下表二。 表二：n h e 不同亚型的特点 n h e l8n h e n h e 2n h e 3 n h e 4 氲基酸数 8 l5 ：入7 5 9 ：鳟鱼8 0 9 ：兔8 3 2 ：兔 7 1 7 ：鼠 8 i6 ：兔 8 l3 ：鼠8 3 1 ：鼠 8 2 0 ：鼠 9 0 7 0 4 ：人8 5 11 8 ：鳟9 0 7 8 7 ： 9 2 7 4 7 ：8 1 4 2 7 ：鼠 9 0 7 1 6 ：兔 诗 兔兔 9 15 0 6：9 1 2 9 6 ：9 2 9 9 7 ： 鼠 鼠鼠 组织分布j 泛分布鳟鱼红细胞肾、肠、肾、肠、胃多，肠、肾、 胃、肾上胃脑少 腺多，骨 骼肌、心 肌、子 宫、j h _ 上皮细胞顶膜，底侧 顶膜，底顶膜 作用极性膜 侧膜 对敏感敏感敏感拮抗 a m i1 0 r id e 等的反 比 调节生 ：= 因子，同n h e l生氏因 生长因高渗激活；a t p 佛波脂， 子，精子，精子缺失抑制 精子，高 子佛波激活；佛 渗a t p 缺 脂激活：波脂，高 失都激活高渗激活 渗，a t p 或抑制：缺失抑制 a t p 缺失 抑制 其它特点 相一求俘， n 一糖基化， 0 一糖基有二聚与钙调蛋白结 n 一和0 一糖p k a 磷酸化 化，与钙体，与钙 基化，与钙 调蛋白结调蛋白结 调蛋白结合 分子生物学研究表明，人类n h e l 的8 l 5 个氨基酸分子在膜上分 为二个功能区：约5 0 0 个氨基酸组成的n 端疏水区和3 0 0 个氨基酸组 成的c 端亲水区。k 端约十余个氨基酸向胞外延伸，其余氮基酸嵌合 于细胞膜形成1 2 个跨膜区段，n 端是介导细胞n a + h + 交换的必要条件， 即当n 端缺失则丧失交换活性。c 端位于胞浆内，功能是决定n a + + 交换的p h i 调定点，还能介导生长因子、有丝分裂原、佛波脂及激素 等信号对n h e l 的激活。n h e l 的磷酸化反应是激活调节的重要方式， 另外一个激活调节方式与c a 2 + 钙调蛋白有关。其它亚型的活性调节 以磷酸化反应进行，但所涉及的信号传导途径和蛋白激酶不同。其中 n h e l 的转录及活性调节机制与某些疾病的病理生理过程有关，是近年 医学研究的新领域。 卜2 4 n a + h + 交换的激活和调节的机制 在过去十余年内，对n a h + 交换的激活和调节进行了许多研究。“ 川。大量的工作表明，几乎所有的生长因子都能激活n a + h + 交换。因 此人们f 认为n a + h + 交换的激活是生长因子诱导的细胞原初反应之一， 是最早发生的受体后事件之一。除生长因子外，某些神经肽如蛙皮素 ( b o m b e s i n ) ，血管肠肽如血管紧张素，加压素等也能激活n a + h + 交 换系统。钙离子导体a 2 3 1 8 7 ，g 蛋白激活剂氟铝酸盐都能引起n a + + 交换的激活，某些细胞外基质如纤维结合素( f ib r o n e c t ir 1 ) ，层粘连 蛋白及i i i 、v 型胶原等都可激活n a + h + 交换活动。用低p h 培养液 培养上皮细胞，引起n a + h + 交换的“慢”激活，n a + h + 交换蛋白的m r n a 表达增强。甲状腺素、糖皮质激素也能慢激活n a + h + 交换，视黄酸 ( r e t i n o ica c id ) 在诱导细胞分化中，也出现n a + h + 交换增强的现 象。如此多的因素能激活n a + h + 交换，说明n a + h + 交换与细胞的多种 功能密切有关。关于n a + h + 交换的调节机制研究表明，不同细胞的 n a + h + 交换的激活调节机制不同。其中很多实验是用肾刷缘膜完成 的，发现短程调节作用都是通过蛋白磷酸化和去磷酸化实现的。实验 证明，蛋白激酶c 通过一种或多种刷缘膜蛋白磷酸化激活n a + h + 交换 蛋白；c - a m p 一依赖的蛋白激酶( p k a ) 在辅助因子协同下抑制n a 一h + 交换：c a2 + 钙调蛋白一依赖的多功能蛋白激酶i i 抑制n a + h + 交换，此 反应涉及的磷酸化蛋白与上述p k c 和p k a 途径的磷酸化蛋白不同。另 外，一些生长因子的激活调节作用，是通过活化受体自身的酪氨酸蛋 白激酶，再磷酸化靶蛋白酪氨酸残基，引起细胞的n a + h + 交换反应。 1 3 p h 敏感荧光探剂法 细胞内p h 测量方法有多种，如荧光探剂法“2 1 “，放射性 同位素标记的弱酸弱碱跨膜平衡法7 3 ，p h 敏感的微电极法阳“川 及无机磷p “n m r 法“”i 。荧光探剂法以其绝对灵敏度高，无破坏性 侵入，操作简捷灵活而被广泛采用来表征细胞内p h 。 l 一3 1 荧光物质 发生荧光的物质必需具有吸收结构和高的荧光效率。荧光通常是 发生于具有刚性结构和平面结构的n 一电子共轭体系的分子中，且n 一 电子共轭度越高，荧光效率越高。荧光物质发生荧光的过程，可分为 四步：1 处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射， 吸收了和它所具有的特征频率一致的光谱，跃迁到第一电子激发态的 各个振动能级。2 处于第一电子激发态各个振动能级的分子，通过辐 射跃迁，降落到第一电子激发态的最低振动能级。3 降落到第一电子 6 激发态最低振动能级的分子，继续降落到基态的各个振动能级，同时 发射出相应的光量子，即荧光。4 ，到达基态各个振动能级的分子，又 由无辐射跃迁，回落到基态的晟低振动能级。多种因素影响荧光强 度，如：溶液浓度、溶剂、温度、溶液的p h 值、激发光的照射时间 等。 卜3 2 b c e c f 的特征 2 、7 一b is ( c a r b o x y e t h y l ) 5 ( a n d 6 ) 一c a r b o x y f l u o r e s c e i n 是一种广泛采用的荧光探剂3 “5 ，“”，结构式h ，。3 文x z 。 n 叫争” p k a = 6 9 7 。b c e c f 的激发光谱在4 9 0 5 0 0 n m 对p h 敏感，在4 4 0 n m 是 对p h 不敏感的等激发点，发射光谱在5 3 0 n m 附近。它有五个主要优 点：1 p k a = 6 9 7 。与很多细胞的p h 接近，测量准确度高；2 它的酯 形式b c e c f a m 由于乙酰甲酯化具有亲脂性，容易穿过细胞质膜，被 胞内酯酶水解为荧光物质b c e c f ；3 b c e c f 在结构上有四个羧基，难 以渗透过细胞膜而被质膜捕获；4 b c e c f 能在胞质滞留足够的时间， 以准确反应胞内h + 水平；5 荧光显微实验表明，表皮细胞均导入了检 测荧光物质b c e c f 。实验证明3 5h 内，b c e c f 维持在一定浓度水平。 卜3 - 3 荧光比率法测p h 8 c e c f 在4 9 0 5 0 0 h m 处激发光强与介质的p h 和b c e c f 浓度有关； 在4 4 0 n m 处激发光强与p h 无关，与b c e c f 浓度有关。将两处强度相 比，比值( f i r ) 与b c e c f 浓度无关而仅与p h 相关。实验证明，p h5 8 范围内，f i r 与p h 呈线形关系 ，这便是用于测细胞p h 的根据。 由于荧光探剂导入不损伤细胞功能，因此可将其一次性给予细胞，然 后连续观察细胞在不同代谢条件下的p h 变化。 b c e c f a m 自身没有荧光，但渗透到细胞后被分裂成有荧光的 b c e c f 。将导入荧光物质的细胞浸浴在高k + 的含n ig e r i c i l i 的生理溶 液中，由于转运离子抗生素n i g e r i c i n 促进k + h + 交换，使h + 顺利通 过质膜达到平衡。调节高k + 的生理溶液到不同p h ，在n ig e r i c i n 的 作用下，使细胞内p h 与溶液p h 平衡且相等。测不同p h 时的f i r ， 就可做出细胞内的p h f i r 工作曲线。在p h i6 2 7 8 范围内，p h 与 f i r 呈线性关系 4 。 卜4 蟾蜍膀胱膜 膀胱膜的结构从内到外由四层组织构成，即粘膜( 顶膜) 、粘膜下 层、肌层、和浆膜( 底侧膜) 。膀胱膜的最大特点是粘膜上度属变移 上皮。上皮组织的结构特点是由大量密集的上皮细胞和少量细胞间质 构成。这种紧密结构决定了一些小分子，如n a c l 等必需通过上皮细 胞才能渗透到细胞膜内。从这方面讲，正是粘膜决定了对离子的选择 性通透。 蟾蜍膀胱膜也是一种典型的紧密上皮组织，其结构与人的肾小管 相似。自1 9 5 5 年，l e a f 对其传输性能 5 ，e w e r 对响应重体后叶激素 的水通透性哺1 作了描述后，它已被广泛作为一个“模型”上皮来研 究。蟾蜍膀胱膜上的离子传输是典型的紧密上皮细胞的离子转运模 型，决定整个膀胱膜离子传输性能的是它的粘膜层哺“。粘膜层的变移 上皮细胞有规则地排列，使粘膜上皮细胞表现出高度极化的结构：对 n a + 通透的粘液层一侧的顶膜( a m ) 和含有k n a 泵及对k + 通透的浆膜 层一侧的底侧膜( b l m ) 。这两道具有选择通透性的连续屏障决定了整 个上皮组织细胞膜对离子的选择通透。因此，膀胱膜虽有复杂的结构， 但当它绷紧时，真正从功能上影响物质传递的只有一层细胞。 图2 ：蟾蜍膀胱膜的结构示意图 图3 ：蟾蜍膀胱膜粘膜层高度极化的粘膜上皮细胞层示意图 在许多上皮细胞的顶端及底部的质膜内褶都发现有n a + h + 交换活 性，但特点不同拍4 “56 ”j 。几篇近期综述“3 1 川也论述了不同亚 型n h e 在不同组织上的分布，但都没有提到膀胱组织。m a r s h a l l s 33 报 导了鳟鱼膀胱膜的n a + h + 交换研究，是我们所见到的仅有的用膀胱组 织研究n a + h + 交换的论文。我们按照k in g 4 副等的推荐，对组织膜片 进行荧光测试以测定上皮细胞的p h i 。这是因为上皮细胞是种极性 清晰的细胞，它的顶膜和底侧膜传输性能明显不同。若以悬浮细胞做 研究对象，细胞极性完全丧失哺“；在滤片上培养的细胞能保持部分极 性，但结果与真实生命体系没有可比性“”】；用冷冻蚀刻法分离顶 膜与底侧膜后制成囊泡( v e s i c l e ) ，虽然可保存大部分极性，但却无 法有选择地作用于顶膜或底侧膜。 卜5 n a + h 交换的研究方法 如前所述，在生理条件下n a h + 交换过程包括内向n a + 流和外向 的h + 流。多采用2 2 n a 同位素示踪法测量n a + h + 交换过程中n a + 流的变 化情况，找出n a + 与n a + h + 交换的关系，以及该过程的动力学特征n “ “2 “6 “。用p h 敏感的微电极“4 “4 “”3 或p h 荧光探剂q “ 。n ”3 测量该过程中质子流的变化，及其动力学特征。本实验室正 用22 n a 同位素失踪法做类似的工作，用p h 荧光探剂b c e c f 表征质子 流的工作已取得初步进展 6 “。 由于n a + h + 交换在生理条件下处于静止状态，通常需要将细胞酸 化，使该过程中n a + h + 交换活化以便观察。常用的细胞酸载的方法有 两种。 卜5 一1 c o ，酸载法 1 9 5 8 年，c a ld w e l 】【“1 首次使用p h 敏感玻璃电极观测到c o ：使蟹 肌纤维和乌贼的巨大轴突的p h i 降低0 5 个p h 单位。用含1 0 0 c o 。 的溶液处理这两种材料几分钟后，采用d m o 弱酸弱碱跨膜平衡法也测 量到p h i 的降低3 。 a c o b s 1 阐述c 0 2 使细胞酸化的机制是：进入 细胞内的c o 。与h ! o 水合成h ：c 0 。，再解离成h + 和h c o ；一。尽管在含c o ： 的溶液中有向内的h c o 。一电化学梯度存在，但因为它渗透速度慢、跨 膜电势的阻碍作用等原因，由它引起的对酸化的钝化很小。当外界p c o 。 减小时，细胞内的c o 。浓度降低，导致反应h + + h c o3 - ：c 0 2 + h 2 0 而使 p h i 升高。 c 0 ，的作用有两种趋向：1 ) 起始p h i 低则c o ：使细胞的酸化程度 低。t h o m a s 刚以蜗牛神经元为实验对象，观察到当起始p h i 分别为 7 5 ，7 3 ，6 9 时，1 0 的c 0 2 溶液( p h = 6 5 ) 使蜗牛神经元的p h i 分 别降低0 7 ，0 5 ，0 3 。这是因为p h i 低时，可逆反应h + + h c 0 3 - = h 2 c o 向右移动，形成的h ，c o 。很少解离使p h i 的变化不大。2 ) 对给定的 p h i ，c o 。使细胞酸化的程度与p c o 。不成比例。如藤壶肌分别被l ，2 ， 5 ，1 0 c o 。处理，2 e 0 2 使p h i 的降低值小于1 c 0 2 使p f f i 降低值的 二倍；1 0 c o ，的作用效果也比5 c o ，作用效果的二倍小。 a ld e re ta 1 叫用d m o 法研究p h i 与p c o ，的关系发现：( 1 ) 当 p c o ，= 4 0 7 0m m h g 时( p h = 7 4 7 1 ) ，p h i 不变化。( 2 ) p c o ，= 7 0 2 0 0 m m h g 时( p h = 7 1 6 7 ) ，p h i 从6 9 6 6 直线降低。( 3 ) p c o ：= 4 0 9 0 m m h g ( p h = 7 4 8 0 ) 时，p h i 从6 9 7 4 5 直线升高。 c o 。使细胞酸化归结于c o 。和h c o f 的跨膜主动运输。但由于这两 者进入细胞后导致c l h c 0 3 - 交换的发生，不能肯定p h i 的变化完全 由n a + h + 交换调控；再者一些细胞膜对c o ：的渗透性差 o 。所以，在 我们的实验中采用氨脉冲法酸化细胞。 卜5 - 2 氨脉冲酸载法 1 9 7 4 年，t h o m a s 引用5 m m ( n h 。) ，s 0 。作用于蜗牛神经元，用p h 敏感电极测量p h i 的变化，看到了快速、可逆的p h i 升高。j a c o b s 阳 解释其机制是：溶液中的n 叱+ 解离成n h 。和h + ，n h 3 是不带电的小分子 可自由进出细胞膜，由于它扩散进入细胞膜使p h i 升高。除去铵盐的 作用后，p h i 比初始值低。b o r o nd e w e e r 3 用n h 4 + 处理乌贼的巨大轴 突也看到类似的现象。并且铵盐作用的时间长，在快速的p h i 升高后 是p h i 的缓慢降低；除去铵盐后p h i 过低冲击( p h iu n d e r s h o o t ) 。 这些实验现象说明n h 。+ 可以渗透到细胞内，否则在除去铵盐后p h i 应 恢复到初始值。正是n h 。+ 的渗透性，使由n h 。引起的碱化有所钝化； 溶液中的n h 。+ 除去后，细胞内的n h 。顺着浓度梯度扩散到溶液，使可 逆反应n h 。+ = n h 。+ h + 右移，h + 积累而使p h i 降低。在整个过程中，n h 。 扩散是快速的，由它引起的p h i 的升高也是快速的；n h 。+ 是带电离子， 进出细胞的速度较慢，因此由它引起的p h i 升高的钝化，以及p h i 的 过低冲击也是个慢过程。 氨脉冲酸载法的优点( 1 ) 可用于大的、伸长细胞的酸化；( 2 ) 酸载过程结束后，残留的n h 。+ 浓度低；( 3 ) 可以通过控制溶液中n h i 的浓度和作用时间获得不同的酸化效果。其缺点是可能会引起有些细 胞的皱缩，膜电势比正常生理状态降低，n h ，可能会影响代谢。 卜5 3 组织膜的酸载 本实验室曾用所建立的新的测定离子交换膜外质子流的方法 “，来测定蟾蜍膀胱膜上由n a + 浓度梯度所引起的质子流 7 3 ，但由于 体系过于复杂，不能肯定所测质子流由n a + h + 交换引起。m a r s h a l l 和 b r y s o n 5 引报道了鳟鱼膀胱膜上的n a + h + 交换研究，但他们用氨脉冲酸 载不成功，即加氨脉冲后并未观察到p h i 先升高后向低p h 的反弹： 在加c 0 2 酸载，用a m i l o f i d e 阻止p h i 回升的实验中，也仅将p h f 从 7 15 降至7 0 5 左右。一般文献报道用酸载方法研究n a h 交换实验 中，往往要酸载至p h 6 2 6 8 。相比之下，上述作者的酸载是不太成 功的。 细胞酸载后再观察p h i 的回复是研究n a + h + 交换的主要手段之 一。因为n a + h + 交换剂向细胞外排出h + 引起p h i 的回升，当某部分回 升能被a m i l o f id e 阻止时，就可以基本肯定这部分回升反映了n a h + 交换功能。所以，成功的酸载对研究n a + h + 交换至关重要。我们在实 验中发现前人氨脉冲酸载膀胱上皮细胞不成功的原因是选择了错误的 作用极性。m a r s h a l l 的实验从粘液面对上皮细胞进行酸载，而上皮细 胞的顶膜( 即粘液面) 对n a + 通透，底侧膜对k + 、n h 。+ 通透。因此只有 从组织膜的浆液面( 即底侧膜) 酸载才能获得成功的酸化效果。 参考文献 ir o o saa n db o r o nw f ，i n t r a c e l i u i a rp h ，p h y s i o lr e v ，1 9 8 i ，6 i ：2 9 6 4 3 4 2 o r i ns t e i n ，s ，s c o h e n a n dr o t h s t e i n 。c y t o p l a s m l cp hr e g l u l a t i o n i nt h y m i c1y m p h o c y t e sb ya na m i i o r i d e s e n s i t i v en a + h + 8 n t l p o r t e r t j o fg e n p h y s i o l o g y ，l 9 8 4 ，8 3 ：3 4 l 3 6 9 3 s i m c h o w i tz 。l ，a n da r o o s ，r e g u l a t i o no fin t r a c e l l u l a rp hi nh u m a n n e u t r o p h i l s ，j o fg e n p h ys i 0 1 0 9 y 1 9 8 5 ，8 5 ：4 4 3 4 7 0 4 g r i n s t e i n ，s ，a n dw f u r u y a ，c h a r a c t e r i z a t i o no f t h ea m il o r id e s e n s i t i v en a + h + a n t i p o r t o fh u m a n h e n t r o p h i l s ，a m j o f p h y s i 0 1 0 9 y ，1 9 8 6 ，2 5 0 ：c 2 8 3 c 2 9 1 j林克椿吴本价医学生物物理学，北京医科大学中国协和医科大学联合 ，l f 出版社，1 9 9 6 6 a r o n s o n ，p s ，k i 3 e t ic p r o p e r t i e s o ft h e p 1 e t s t i l tm e m b r a n en a + h + e x c h a n g e r ， a nr l u r e v p h y s i 0 1 ，1 9 8 5 ，47 ：5 4 5 5 6 0 7 f l ie g e l ，l ta n d0 f r o e h l ic h ，t h en a + h + e x c h a n g e ra nu p d a t eo i l s t l 7 l ic tl i r e ，r e g u l a t i o n ，ar l dc a r d i a cp h y s i 0 1 0 9 y ，b i o c h e m j ，1 9 9 3 ， 2 9 6 ：2 7 3 2 8 5 8 g r i n s t e i n ，s 。d ，r o t ir l ，a n d m j m a s o n ，n a + h + e x c h a n g e ra n dg r o w t h f a c t o r i n d uc e dcy t o s o i ic p hc h a n g e s，r o l ei 1