（微生物学专业论文）莱氏野村菌nomuraea+rileyi几丁质酶基因的克隆、表达与分析.pdf

西南大学硕士论文中文摘要 莱氏野村菌n o m u r a e ar i l e y i 几丁质酶 基因的克隆、表达与分析 微生物学硕士研究生王金芳 指导教师万永继教授 中文摘要 莱氏野村菌( n o m u r a e ar i l e y i ) 是一种重要昆虫病原真菌，可以感染许多重要的害虫如棉铃 虫( h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ) ，斜纹夜蛾( s p o d o p t e r al i t u r a ) ，粉纹夜蛾( t r i c h o p l u s i an i ) 等，并在 田问引发多种害虫病害流行病，在生物防治及害虫综合治理( i p m ) 中有很大的应用潜力。二十 世纪七十年代到现在国内外对n o m u r a e ar i l e y i 的研究集中在三个方面：生物学、生物防治及 遗传多样性分析。但目前为止国内尚未涉及侵染宿主分子机制的研究。 昆虫病原真菌在穿透寄主体壁的过程中会产生多种水解酶例如蛋白酶、几丁质酶、脂肪 酶。而昆虫体表几丁质约占3 0 ，构成了昆虫病原真菌入侵主要障碍。因此几丁质酶在侵染 阶段起着至关重要的作用。n o m u r a e ar i l e y ic q 菌株为本实验室分离，先后对其生物学、生态 学及最适产几丁质酶的发酵条件做了研究。本实验对n o m u r a e ar i l 掣ic q 菌株几丁质酶基因进 行了克隆，与其它昆虫病原真菌几丁质酶基因进行了比较分析，并将该基因转入酵母细胞中， 进行了表达和特性分析。 实验结果如下： 1 实验采用c t a b 法提取n o m u r a e ar i l e y i 菌丝基因组，利用p r i m e r 5 0 设计不同阶段引 物进行多次p c r ，得到了长度为2 7 5 6 b p 的含有几丁质酶基因的序列( g e n b b a n k 登录号为 e u 7 9 5 7 1 1 ) ，几丁质酶基因开放阅读框( o r f ) 1 5 1 1 b p ，其中包含3 个内含子，编码4 2 4 个氨基 酸。n o m u r a e ar i l e y ic q 菌株与国外n o m u r a e ar i l e y im j 菌株几丁质酶基因编码的氨基酸 ( a a p 0 4 6 1 6 ) 序列相似性达9 9 ，但在4 个不同的位点存在四个氨基酸的差异，同时信号肽 剪切位点、分子量、等电点、蛋白质二级结构也存在差异；n o m u r a e ar i l e y ic q 菌株与其它病 原真菌m e t a r h i z i u mf l a v o v i r i d e ( c a b 4 4 7 0 9 ) 、h y p o c r e at x 豇( b a u 4 0 5 8 9 ) ，l e c a n i c i l l i u m l e c a n i i ( a b d 7 7 0 9 6 ) 、i s a r i a f a r i n o s e ( a b d 6 4 6 0 6 ) 、s t a c h y b o t r y se l e g a n s ( a a m 7 0 4 7 8 ) 、b e a u v e r i a b a s s i a n a ( a a n 4 1 2 6 0 ) 几丁质酶氨基酸序列的相似性分别为7 9 、7 4 、7 4 、7 4 、6 9 、 6 4 。 2 将构建的p p i c 9 k - c h i t l 表达载体线性化后，电击转化进毕赤酵母中，采用浓度为 1 5 m g m l 的g 4 1 8 平板筛选，然后对优势菌落进一步采用p c r 验证。对验证正确的菌落进 西南大学硕士论文中文摘要 行发酵培养。收集2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 诱导产几丁质酶的发酵液，分别做透明圈验证几丁质酶存 在的实验，结果4 8 h 和7 2 h 均出现透明圈，而7 2 h 的透明圈最明显；测其o h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 发酵液中酶的活性，结果7 2 h 酶活性出现最高值：最后采用t c a 法沉淀4 8 h 和7 2 h 发酵液中 蛋白质，将处理的蛋白质进行s d s p a g e 电泳，由于酵母自身几乎没有分泌外源蛋白，所以 经s d s - p a g e 电泳显示的蛋白条带估算分子量为4 1 k d a ，且与预测蛋白分子量大小相当，确 定该蛋白为目的蛋白几丁质酶。 关键词：莱氏野村菌几丁质酶酵母表达酶活性分析 西南大学硕士论文 a b s t r a c t c l o n ea n de x p r e s s i o no ft h ec h i t i n a s ec h i t lg e n e f r o me n t o m o p a t h o g e n i cf u n g in o m u r a e a r i l e y ic q s t r a i n c a n d i d a t e ：w a n gj i n f a n g a d v i s o r ：p r o f w a ny o n g j i a bs t r a c t n o m u r a e ar i l e y ii sa l li m p o r t a n te n t o m o p a t h o g e n i cf u n g u st h a ti sa b l et ok i l lm o r et h a n4 0 n o c t u i di n s e c ts p e c i e ss u c ha sh e l i c o v e r p aa r n i g e r a ，s p o d o p t e r ae x i g u a 、t r i c h o a l u s i an ia n do f t e n c a u s e se p i d e m i co ft h ei n s e c ti nt h ef i e l d i th a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e dt oc o n t r o la g r i c u l t u r a la n d f o r e s t r yp e s t sa n ds h o w sag r e a tp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni ni p m ( i n t e g r a t e dp e s tm a n a g e m e n t ) s y s t e m t h er e s e a r c h e sa b o u tn o m u r a e ar i l e y ia r ef o c u s e do nb i o l o g y 、b i o l o g i c a lc o n t r o l 、g e n e t i c v a r i a b i l i t yf r o mt h e1 9 7 0 st on o w , b u tn oa n yr e s e a r c hp a p e r sa b o u tm o l e c u l a rb i o l o g yo fi n f e c t i o n m e c h a n i s m d u r i n gi n f e c t i o n ，t h ef u n g a lp a t h o g e n sp r o d u c eas e r i e so fc u t i c l e - d e g r a d i n ge n z y m es u c ha s c h i t i n a s e , p r o t e a s e sa n dl i p a s e s w h i c hf a c i l i t a t ep e n e t r a t i o n t h r o u g hc u t i c l e u n d e ri nv i t r o c o n d i t i o n s ，f u n g im a yb ei n d u c e dt op r o d u c ee x o c e l l u l a rc h i t i n a s e st h a td i g e s ta v a i l a b l ec h i t i n s u b s t r a t e s h o w e v e r , t h ec u t i c l eo fi n s e c ti sc o m p o s e do fa b o u t3 0 c h i t i n ，w h i c hi sm a j o rb a r r i e r d u r i n gi n f e c t i o no fe n t o m o p a t h o g e n i cf u n g u s ，s u c hc h i t i n a s e sp l a yar o l ei ni n f e c t i o np r o c e s st o d i s r u p tt h ec u t i c l eb a r r i e r n o m u r a e ar i l e y ic qs t r a i ni si s o l a t e df r o ms o u t h w e s tu n i v e r s i t yi nc h i n a w er e p o r tt h ee x p r e s s i n ga n dc l o n i n gc h i t i n a s ef r o mt h ed i m o r p h i ce n t o m o p a t h o g e nn o m u r a e a r i l e y ic qs t r a i n ，c o m p a r ei t ss e q u e n c et oo t h e rf u n g a lc h i t i n a s e s t h ec h i t i n a s ew e r ee x p r e s s e di n p i c h i ap a s t o r i sa n dt e s t e df o re n z y m a t i cp r o p e r t i e s t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g s ： 1 g e n o m i cd n aw a se x t r a c t e df r o mt h em y c e l i a lp r e p a r a t i o n su s i n gam o d i f i e dc t a b m e t h o d ，u s i n gp r i m e r 5 0d e s i g n e dd i f f e r e n ts p e c i a lp r i m e r sf o rd i f f e r e n tp c ra m p l i f i c a t i o n s w e a n a l y z e dc l o n e ds e q u e n c eb yd n a m a ns o f t w a r e a m p l i f i c a t i o no ft h eg e n o m i cd n ap r o d u c e d 2 7 5 6b ps e q u e n c et h a ti sa v a i l a b l ef r o mt h en c b ig e n b a n kd a t a b a s ew i t ht h ea c c e s s i o nn u m b e r e u 7 9 5 7 1 1 t h el o n g e rf r a g m e n tc o n t a i n sa7 6 b pu n t r a n s l a t e ds e q u e n c ea tt h e5 e n d ，a1 5 1 1 b p o p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) e n c o d i n g4 2 4a m i n oa c i d s ，a n da1 1 6 9 b pu n t r a n s l a t e ds e q u e n c ea t3 e n d t e r m i n a t i n g a n a l y s i so ft h eo r fp r e d i c t e da2 0a as i g n a ls e q u e n c e ，t h e4 0 4a am a t u r ec h i t i n a s e i i l 两南大学硕士论文a b s t r a c t h a dam o l e c u l a rm a s so f4 4k d aw i t hac a l c u l a t e dp ，o f5 2 7 t h i ss e q u e n c ec o n t a i n e dt w oh i g l l l y c o n s e r v e dr e g i o n so ft h ea c t i v ed o m a mo ft h ef a m i l y1 8g l y c o s y lh y d r o l a s e sm c l u d m gap r e s u m e d e n z y m a t i ca c t i c es i t ea n dap o t e n t i a lc h i t i n - b i n d i n gd o m a i n ab l a s t xs e a r c ho ft h ed e d u c e d a m i n oa c i ds e q u e n c ed e m o n s t r a t e ds i m i l a r i t i e st oan u m b e ro ff u n g a lc h i t i n a s e sc l a s s i f i e di nf a m i l y 1 8 o ft h e g i y c o s y lh y d r o l a s e ss u c h a sn o m u r a e a r i l e y im j ( a a p 0 4 6 1 6 ) ，m e t a r h i z i u m f l a v o v i r i d e ( c a b 4 4 7 0 9 ) ，h y p o c r e al i x i i ( b a b 4 0 5 8 9 ll e c a n i c i l l i u ml e c a n i i ( a b d 7 7 0 9 6 ) ，i s a r i a f a r i n o s e ( a b d 6 4 6 0 6 ) ，s t a c h y b o t r y se l e g a n s ( a a m 7 0 4 7 8 ) ，b e a u v e r i ab a s s i a n a ( a a n 4 1 2 6 0 ) ， r e s p e c t i v e l y , i d e n t i f y 丽t h9 9 ，7 9 ，7 4 ，7 4 ，7 4 ，6 9 a n d6 4 ，r e s p e c t i v e l y 2 t h e 吐缸zg e n ew a sc l o n e di n t 0t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kt oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp p i c 9 k - c h i t la n dw a se x p r e s s e di n 只p a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e ma n dc h i t i n a s ee h i t lw a s s e c r e t e di n t ot h ec u l t u r em e d i u mu n d e rt h ei n d u c t i o no fm e t h a n 0 1 t h et i m ec o u r s eo fc h i t i n a s e a c t i v i t ys h o w e dt h ea c c u m u l a t i o no fc h i t lp e a k e da t7 2 ha n do n eb a n do fp r o t e i n sw i t hm o l e c - u l a r m a s so fa r o u n d4 1k d aw e r ec l e a r l ya p p e a r e di nt h et r a n s f o r m a t si ns d s - p a g ea n a l y s i sa n d d i g e s t i o no f c h i t i ns h o w e dt h et r a n s p a r e n t p a r t sw a sm o s to b v i o u si n7 2 h k e y w o r d s ：n o m u r a e ar i l e y i c h i t i n a s e e x p r e s s i o na n a l y s i so fc h i t i n a s ea c t i v i t y i v 独创性声明 学位论文题目：苤医墅挝苴丛丝丝丝丝逝i 丛工厦酶 基固的杰隆) 麦达皇盆板 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：五金易 签字日期： w ，7 年r 月影日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被奄阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 一一7 a t ga a rg a y t g gg g y1 1 yg a tg g c c ca rat w cc r tt c t c c c a g c t t ag t ag c ct g ag t a t c g t c gg t e aa t gc a at c aa a tc c cc c g tc a ag g gt g g t g tt c c g a tt g tc c tt g g t a tg c ct g t c g gt a gg a tc c cg c ag a ac g ac g gc c ag a a ac t gg c cg t cc a ag a cg c e g gt a gg a t c c c g c a g a a c c t t g c gg c t c t tg t tc a g c gt g gc g tt g a g a tt c c ag a a t i cc i q g c gg c ta 盯g t rc a a 盯g c gg c c g c tg t at g t g c ca g ca a g a c 3 扩增c h i l l 基因全长o r f 。 用n o ti 和e c o r1 分别双酶切空载体p p i c 9 k 和带有c h t 基因的质粒。 2 1 西南大学硕十论文第三章材料与方法 酶切系为； n o ti m l ( 4 - 1 2u ) e c o ri 1 “l ( 8 2 0 u ) 质粒d n a p p i c 9 k 4 0 - 5 0n g 1 0 b u f f e r 犁l b s a 犁l 共2 0 z l 体系，3 7 。c 下温育，3 h 然后进行连接。1 6 c 反应3 0 m i n 。连接产物直接用于转化e c o l i 感受态细胞。连 接体系为： 幽以基因片段缸l p p i c 9 k跏l t 4 l i g a s e堆l 1 0 x t 4 l i g a s e犁l 去离子水 1 l 3 2 8 酵母表达载体的线性化及去磷酸化 质粒的线性化：为了使质粒能高效的整合进酵母的基因组中，使用内切酶 p m e i 将重组质粒线性化。 酶切体系： 重组质粒1 3 毗l ( 即g ) p m e i 2 弘l ( 5 u t l ) 1 0 x b u f f e rb 跏l 共1 5 似l 体系，3 7 。c 下温育，2 h 去磷酸化处理：琼脂糖电泳检测酶切完全后，按如下方法进行去磷酸化处理： 在酶切混合物中加入1 7 t l 去磷酸化酶缓冲液( p r o m e g a 公司) ，1 , l 去磷酸化酶 ( 5 u t l ) ，混和均匀后于3 7 反应1 h 。使用d n a 回收试剂盒回收去磷酸化的产 物，加入1 0 吮ld d h 2 0 洗脱目的产物后，利用d n a 真空浓缩仪将总体积浓缩至 1 0 t l 以下。 3 2 9 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 ( 1 ) 于y p d 平板上划线活化只p a s t o r i sg s l l 5 ，过夜培养( 1 2 h ) ，挑取单菌 落于盛有5 m l 液体y p d 培养基的5 0 m l - - - 角瓶中，振荡培养过夜( 3 0 。c ，2 0 0 r p m ) ； ( 2 ) 取l m l 过夜培养物接种至1 0 0 m l 新鲜培养液体y p d 培养基中，振荡培 养( 3 0 * c ，2 0 0 r p m ) 至o d 6 0 0 达到1 3 1 5 ； 西南大学硕+ 论文第三章材料与方法 0 ) 4 c ，6 ，0 0 0r p m 离心5 m i n 收集细胞，弃上清后用1 0 0 m l 冰预冷的无菌 水将细胞沉淀重悬； ( 4 ) 按第3 步方法收集细胞，用5 0 m l 冰预冷的无菌水将细胞沉淀重悬： ( 5 ) 按第3 步方法收集细胞，用4 m l 冰预冷的l m o l l 的山梨醇溶液将细胞 沉淀重悬； ( 6 ) 按第3 步方法收集细胞，用2 0 0 z l 冰预冷的l m o l l 的山梨醇溶液将细 胞沉淀重悬； ( 7 ) 将溶液按照8 0 卫l 的体积分装于离心管中，此时感受态细胞已经制备好。 最好立即进行电转化杯中转化； ( 8 ) 将约酗g 的线性化d n a 与8 0 a l 的上述步骤所得的感受态细胞混匀，转 至0 2 c m 冰预冷的电转化杯中； ( 9 ) 冰浴5 m i n ； ( 1 0 ) 电压1 5 k v ，电击时间为5 m s ，进行电击； ( 1 1 ) 电击完毕后，加入l m l 冰预冷的l m o l l 的山梨醇溶液将细胞混匀， 迅速转至1 5 m l 的离心管中； ( 1 2 ) 取3 毗l 菌液悬浮液涂布于m d 平板上，同时作一个加不含目的基因的 质粒为对照； ( 1 3 ) 将平板倒置于3 0 1 2 恒温培养，直至单个菌落出现。 3 2 1 0 酵母转化子的g 4 1 8 筛选 为了得到多拷贝的转化子，将转化得到的单菌落进行g 4 1 8 筛选。配制2 0 m l y p d ，加入终浓度为1 5 0 m g m l 的g 4 1 8 ，制备平板。 ( 1 ) 取p c r 管，每管加入2 0 0 1 l y p d ； ( 2 ) 用灭菌牙签从m d 平板挑取单菌落在p c r 管里搅拌重悬，每管对应一个 菌落； ( 3 ) 3 0 静置培养两天； ( 4 ) 用移液器重悬菌液，每管取耻l 菌液于g 4 1 8 浓度为1 5 0 m g m l 的y p d 平板上生长； ( 5 ) 3 0 c 恒温培养并观察。 3 2 1 1 酵母转化子的p c r 验证 挑取g 4 1 8 平板上生长最快的菌落进行p c r 验证，以转化p p i c 9 k 的g s l l 5 菌株为对照，所用引物为r n a l 6 4 0 和r n a 4 5 。 扩增体系为：2 5 比l 1 0 xb u f f e r , 2 lm m o l lm g c i a ，犁l2 5m m o l ld n t p , 1 l 模板d n a , 0 2 z lr n a 4 5 瓜n a l 6 4 0 ( 1 0 0f l m o l l ) ，o 2 5 【l lt a q 加水至2 5 2 3 西南大学硕士论文第三章材料与方法 l 。 扩增程序为：9 4 5m i n ； 9 4 c3 0s e e , 4 9 ( 24 5s c c7 2 1 21r a i n ，3 0 个循环； 7 2 延伸5m i n 。琼脂糖凝胶( 1 o ) 电泳检测。 3 2 1 2 重组酵母的表达系统 ( 1 ) 将上述验证正确的转化子分别置于盛有1 0 m lb m g y 液体培养基的 1 0 0 m l 三角瓶中，振荡培养( 3 0 c ，2 0 0 r p m ) 至o d 6 0 0 达到2 - 6 。 ( 2 ) 室温下6 ，0 0 0 t p m 离心5 r a i n 收集菌体，按o d 6 t x ，= 1 用1 5 m lb m m y 液体培养基重悬于1 0 0 m l 三角瓶中继续振荡培养。 ( 3 ) 每2 4 h 向其中添加1 0 0 甲醇至终浓度为1 。 ( 4 ) 在不同的时间点o h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 分别取l m l 菌液样品，移于1 s m l 离心管中，以1 0 ，0 0 0 t p m 离心3 r a i n ，分别收集上清液和菌体。 ( 5 ) 检测上清液中几丁质酶活性。 ( 6 ) 以不含目的基因质粒转化的酵母为对照。 3 2 1 3g i c n a c 标准曲线的制定 在1 0 m l 离心管中加入3 2 0 a 不同浓度的g i c n a c ( 0 1 、0 0 5 、0 0 2 5 、 0 0 0 1 p m o l m l ) ，8 毗lh 3 8 0 3 k o h ( 0 8m o l l ，p i l l 0 2 ) ，沸水浴3 m i n ，加入2 4 m l d m a b ，3 7 ( 2 温浴2 0 m i n ，测定吸收值( o d 5 4 0 ) 。以g i c n a c 浓度为纵坐标，吸 收值为横坐标，绘制标准曲线。 3 2 1 4 几丁质平板的制备 用l 的胶体几丁质，1 7 的琼脂制备固体平板，1 0 0m l 平均倒入三个直径 9 0 c m 的玻璃培养皿中。 3 2 1 5 几丁质酶活性的测定方法 胶体几丁质的制备：按h s u 等( 1 9 7 5 ) 的方法制备胶体几丁质。称取2 9 几 丁质到4 0 m l 浓h c i 中，于冰上剧烈搅拌几分钟使几丁质溶解，然后加热至3 7 轻轻搅拌，直至混合物的粘稠度下降，溶液变得澄清。用玻璃棉过滤此混合物 并将过滤后的胶体几丁质缓慢倒入4 c 预冷的去离子水中，边加边搅拌，于4 沉 淀过夜。然后用滤纸过滤收集胶体几丁质，用去离子水冲洗在滤纸上的胶体几丁 质直至流出液的p h 值为7 o 左右，再用去离子水洗下胶体几丁质浓度为 1 0 m g m l 。 收集发酵液的上清液，取2 5 陬l 样品，2 5 毗ll o o m m o l l 磷酸钾缓冲液( k p b ， p h 6 4 ) 和2 0 0 z l 胶体几丁质( 1 0 m g m l ) ，3 7 c 反应1 h ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 m i n ； 西南大学硕士论文第三章材料与方法 将上清吸入另一新离心管中加入5 毗l 蜗牛酶，3 7 反应3 0m i n ；加入1 0 0 a l o 8 m o l l 的硼酸钠缓冲液( p h l o 2 ) ，沸水浴3 m i n ，冷却到室温后加入d m a b 3 m l 3 7 反应2 0 m i n ，测定吸光值( o d 5 4 0 ) ，实验重复三次。( 上述反应体系中，以沸水 浴3 0 m i n 后的样品代替待测样品为空白对照) 。几丁质酶活性单位定义为：在3 7 保温反应1 h ，释放l n m o lg i u n a c 所需的酶量为一个酶活单位。 3 2 1 6t c a 法沉淀蛋白 1 菌液1 0 ，( ) 0 0 】r p m ，离心5 m i n ，收集表达上清液； 2 取1 0 0 址l 上清液于离心管中，加入1 4 体积的1 0 0 t c a ，颠倒数次混匀； 3 样品置于冰浴中至少3 0 r a i n ； 4 1 , 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，可见棕黑色沉淀，倒掉上清液； 5 加入丙酮洗涤2 次沉淀后干燥； 6 加入2 0 5 0 t l l o a d i n gb u f f e r ，1 0 0 加热5 m i n ，溶液待电泳检测( 注意：如果蓝 色的l o a d i n gb u f f e r 变成黄色，说明存在t c a 残余，一般不会影响电泳结果) 。 硝南人学硕十论文第四章结果与分析 第四章结果与分析 41 几丁质酶基因克隆与结构分析 4 1 1 几丁质酶基因克隆 5 0 0 b p n h h n 1 2 b 。 l o b o ( b ) 固4 - 1 为几丁质酶基因多次扩增电泳结果 f i g4 - 1p c ra m p l i f i c a t i o n s o f c h i l i n a s e f r o m n o m u r a e ar i l e y i 儿丁质酶基因克隆分四阶段，第一阶段扩增得到长度为4 9 1 b p 的几丁质酶基 因片断，命名为n y c h i t ( m4 - 1 a 1 ；第二阶段为n y c h i t 片断3 侧翼序列延伸阶段， 得到长度1 4 9 5 b p 的几j 质酶基因片断，命名为c h i t - x l a ( 图4 - 1 一b ) ；第三阶段为 n y c h i t 片断5 侧翼序列延伸阶段，得到长度为5 8 5 b p 片断的几丁质酶基冈，命名 霍室查兰璺：兰三茎竺耋竺兰：坌丝 为c h i t s h a n gf 圈4 - 1 一c 1 ；最后阶段为全o r f 几丁质酶基因片断的获得命名为 c h i t s h a n g - i 涸4 - 1 一d 1 41 2 限制内切酶的选择 根据f a n g w ( 2 0 0 5 ) 实验结果显示7 种常用内切酶( h i n d l l l , x b a l ，s p e l ，s m a l ， e c o r v , d r a l 和s c a l ) 对球孢自僵苗基因组d n a 酶切效果较好的为其中四种，分 别是s m a l ，e c o r v , d r a l 和s c a l ，本实验选用这四种内切酶对莱氏野村菌基因组进 行完全酶切结果( 图4 - 2 ) 显示这四种内切酶酶切片断大小均合适，且效果比 较理想。 m24j6 图4 - 2 不同内切酶酶切莱氏野村蕾基因组洲 i m a r k c r l 5 ，2 - - 5 * 是e c o r v , d r a l ，s e a l ，s 忡i ，6 d n a f i g4 - 2 d i g e s t i o n o f n o m u r a e ar i 姆f g e n o m i c d n a b ys e v e r a lr e s t r i c t i o ne n z y m e s i m k c r l 5 ，2 - 5 d n a d i g h t e db y e - o r v , d r a i s e a l ，s _ w i t e s p c c f i v c l y , 6 d n a 4 13 莱氏野村菌c q 菌株几丁质酶基因及其结构 连接p c r 产物n y c h i t 、c h i t l 。s h a n g 、c h i t l s h a n g - 1 、c h i l l x i a 得到了长为2 7 5 6 b p 的片段( 图4 3 ) 其中含有一个几丁质酶基因的全长序列( 命名为c h i t l ，g e n b a n k 登录号为e u 7 9 5 7 1 1 ) 和c h i t l 基因的部分下游调控序列。采用n c b i 网站的 b l a s t x 程序，将曲以序列与g e n b b a n k 相比较，发现与其它昆虫病原真菌儿丁 质酶基因相似性很高，而且推测出了可能的o r f 区段。编码蛋白序列位于 7 7 1 5 8 7 ，分析发现其包古3 个内含子长度分别为1 1 ib r , 、6 8b p 、6 0b p ，分别 位于序列2 2 03 3 0 ；4 3 0 4 9 7 ：5 4 86 0 7 ，内含子含有典型的内古子边界序列 g t a g5 端非编码区长7 6b d ，3 端非编码区编码长1 1 6 9b p ，编码4 2 4 个氨基 酸的几丁质酶前体，用s i g n a l p 程序分析莱氏野村菌几丁质酶氨基酸序列表明， 该序列也存在信号肽及前肤序列，理论信号肽剪切位点在g l y ( 2 0 ) 与l e u ( 2 1 ) 之间( 图4 2 ) 。推测成熟肽分子量为4 40 k d a ，等电点为52 7 ( 预测网站为 h t l p ：u se x p a s y o r g t o o l s p r o t p a r a m h l m l ) 。 两南大学硕十论文 第四章结果与分析 c t t g cg 1 6 ( t ( 玎g t k a a ( ( ，g a 矗g g ( a c c c 舣a c a c a a g t ( a ( 舡c 棚 奠五( t 6 ( a a c g c 6 _ ( 。气。气g = 气g a g 越。 a t gt c t t c tt t ac t tg t tc c at c tt t gg c ac t cc t tc c ca c ct g c c a gg c a mssllv rslavvatwoa c c tc t cg g cc t tg c a a c ac c c 盯ct c gc c ct c c 枷c c cg c cm 姒a a gc c tg c t al【羔到 atpmsasnaai kra a g tg g t 融cg c c “ct c cg 玎n c 玎ca c ca 盯t g g t a c s c c t t t c s m g a e a g g t g g c a c a t g c a g t t g t c c c t t sgyaxs、， yrtxw c t c s t t a t t c a e t t g t c c t g g t t g l g g e a a t e s a g t s a e t a t g c t g t g t t g t l g s e l g e t t a c e m s t g c e c a g ge c aa t cl ：a cc c gc c a a a c giygrx 1 a cc a 气c c cq c cc a cc r rc c cc c c 卫c ac a ga i al ac 盯c 耵c t gn ct c a 玎cj j c y q padlpas q ls珏v lysfm 坶c t ac g ac c c c a c c c ca c c t g t s a g t t p a g t t g a e s t g t t t t a g a t g t t g t c s g t g t c t c g a g s c t c g a c c a g e t a a c t t c 囊l ka dgti t e s c a l tt a ct c tc c cc 盯a 盯弘cg c cc 盯a c ag a ca a gc a ct 盯c c a 埘c a ct 曩翻触 ysc dt yadtdkh ypnd c c t t g a t t t a g g g g t t t t g a e t p g c t g c a t a a t t a a t a t g a g a g g c g g a a c tt c a a cc a t c t tg c ca a ta 缸c t cl a r swndvgn xv y c 甜t 钳c t ca a g c a cmm 订cm a a aa a a g c aa a cc c ca a a 盯ca a a 吼a t g ccvk qf rllkkanrkmkvm t t g 瓢汀嗣曙c c cg g at g ea c g t g gt c a a c ca a c 。n c c ag c t g c tg c c1 c ga c g g c a lsiccwtwst x，paa asta g c cg c c c g ag c t a c cm g c ta a at c cg c gg t ca c t 玎c 盯g 从cg a ct g g c c am aar atfaksavtfmkdwcf c 篁rg g ca 耵c 盯 i cg a ct g g g a at a cc c cg c cc a cc 盯a c tc a cc c 了a c t 枷a r g dcidldwe ypaddt q atxm c 订c i tc l t c t cc 触g c ac t cc g ag c ce a ac 玎c a tc c a1 a cg c c 。c c ca a tm c c g vlll q vrae l da ya a xfa c c tc g th rc 盯t t c 玎gc 1 at c ga _ r tc c a g c cc e gc c tg g cc c tc 盯3 a ch ta “ pg y 珏fllsla apacpdxyk a 地c t cc a cm a c a c a gc 1 f tc o ca c ac 1 t 1 1 cg 盯c a ：rc t ca 气cc t cj 盯go c c1 a c klhfte lgt、ld珏vxlmay c a c 鄹盯g c cc ：c tt c ct o gc c ea c 斟ra c tc c cc tg a co c ca 缸c l a 弘tt c cc 文c d yacswexys c 珏 danv ysd t c ga g c 埘盯ca a cg c ca c gc c at t ca a ca c ag a cc 盯g c tc t c 埘g c t 砒c t c ssx lxatpfxtd d a 、- xay v a a cg g tg g 苫c ：玎e c gc c ta e ca a c 酆r rc t c c t to g t 盯cc c tg 玎i a tc g aa g at c a xcevpas kivlc玉lpvycrs t t cc a gc a a a c t c a tc c aa t t 泓a a ac c ct a ct 订g g tg 玎c c c 柳c c ca c c t c g f qq tdgigk pysgvgsgsw c a ca a cg c tc t ct g gc 。l t1 睛ta a a c c tc t t c c ca j 气ac c tc c t c c aa c tc t t g t a 1 a ：r encvwd y xalpkpc atvv y 翘cj k g t cc ( 了a a ac c tl 玎1 a ca o c 弘ze a tc c la g ca c ca a ac a ac t t 筐【at c c dsvakey ysydastklis t t tg a ca c cc c gg c c 盯gc t ca a gc a a a a eg t ca c ct a cc t t c a ag c ca 从g g am f dtpamvkekv tyl q cxcl c , g ag g ca g ca t cm t g gg a gc c at c t g c cc a cc g ca a ag g ct c a g a ct c cm 小 eg sfwasadrkcs ds l i c g ca c ca g c 醌mc c tc 玎e c tg g ac t e c a cg a ca c ca c ca a c 泓c kg a c 砒 ctslsalcg lddttxlldy c c t ；a it c ca 茂a1 a cc a ca a ca t ca a ga a gc a aa t gc c c z aa 矾a g g c c ca 】灌a ，c c c , c g pds ky dnlkk0ma t a c