（植物学专业论文）水分胁迫下假俭草脯氨酸累积的aba、ca2调节.pdf

中文摘要 脯氨酸作为一种渗透保护物质在植物对逆境胁迫的抗性中发挥着极其重要的 作用。假俭草( e r e m o c h l o ao p h i u r o i d e s ) 是暖季型的主要成坪草种，具有较强的 抗旱性而广泛栽培。本论文以五叶期假俭草幼苗为材料，研究了水分胁迫( 2 0 p e g 6 0 0 0 和自然脱水) 条件下脯氨酸累积的规律及其可能的合成途径，并探讨了 外源a b a 和c a c l 2 对脯氨基酸累积的影响，为提高草坪草的抗旱性奠定基础。 1 在2 0 p e g 6 0 0 0 处理五叶期假俭草幼苗根部，假俭草叶内脯氨酸含量明显增 加，至胁迫处理第1 6 小时达到最高值；叶器官增加脯氨酸量最高，茎次之，根增 加幅度较小。 2 z ：l1 - 吡咯啉- 5 - 羧酸合成酶( p 5 c s ) 和鸟氨酸6 氨基转移酶( 8 o a t ) 是脯氨酸生 物合成的关键酶。水分胁迫下，p 5 c s 活性持续下降，而o a t 的比活性不断升高。 脯氨酸含量的增加与o a t 活性增加呈正相关( r = o 9 6 ) 。表明在渗透胁迫下假俭 草的累积主要受o a t 的活性调节。 3 5 0 um o l la b a 浸根处理， 显著提高地上部分脯氨酸含量；喷施a b a7 天 后，地上部分脯氨酸含量高于对照1 9 倍。a b a 提高了p 5 c s 的活性，降低了o a t 的活性，表明o a t 和p 5 c s 对a b a 的响应机制不同。 4 5 0 u m o l l a t l a 处理假俭草3 天，s o d 活性略低于对照。处理5 6 天，s o d 活性明显高于对照。同工酶分析表明，a b a 影响s o d 活性，在处理1 2 小时后 酶谱带灰度低于对照。 5 2 m m o l l c a c l 2 对假俭草浸根处理，轻微增加水分胁迫脯氨酸含量，喷旆处理 明显提高了脯氨酸含量，提高了p 5 c s 和o a t 活性，降低了m d a 含量，处理5 天之后s o d 活性增强。v 关键词： 假俭晕水分胁脯氨影4 吡咯啉5 羧鑫合成酶鸟氨酸兄 氨基转氨酶超氧化物歧化酶脱落酸氯化钙 x v v t h er e g u l a t i o no f a b a 、c a 2 + o np r o l i n ea c c u m u l a t i o n i ne r e m o c h l o a o p h i u r o i d e s u n d e rw a t e rs t r e s s c a n d i d a t e ：y u g u a n g h u i a c a d e m i ca d v i s o r ：p r o f l i l i n g ，p r o f z e n g f u h u a p r o l i n e ，a sa no s m o l y t e ，p l a y sac r u c i a lr o l ei np l a n t sd u r i n ga d a p t i o nt ov a r i o u s t y p e so fe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s e r e m o c h l o ao p h i u r o i d e s i sam a i nw a r l n s e a s o n a l t u r f - f o r m i n gt u r f g r a s sd u et oi t ss t r o n gd r o u g h tr e s i s t a n c e t h ep a p e rm a i n l ys t u d i e d t h e p r o b a b l yp a t h w a y o f p r o l i n e a c c u m u l a t i o ni n f h e l e a f - s t a g es e e d l i n g s o f e r e m o c h l o ao p h i u r o i d e su n d e rw a t e rs t r e s sf 2 0 p e g 6 0 0 0t r e a t m e n ta n dn a t u r a l w a t e rl o s s ) ，e x p l o r e dt h ee f f e c to f e x o g e n o u sa b a a n dc a c l 2o n p r o l i n ea c c u m u l a t i o n ， a i m i n g t ol a yaf o u n d a t i o nt or a i s et h ed r o u g h tt o l e r a n c eo ft u r g r a s s o u rr e s u l t sw e r e s h o w e da sf o l l o w s ： 1 a f t e rt h et r e a t m e n to f2 0 p e g 6 0 0 0o nt h er o o t so fe r e m o c h l o ao p h i u r o i d e s s e e d l i n g s ，t h el e v e lo fp r o l i n ei nl e a v e sw a s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yt ot h eh i g h e s ti n1 6 h o u r s ；l e a v e sr a n k e dt h ef i r s ti nt h ea b i l i t yo fp r o l i n ea c c u m u l a t i o n ，s h o o t ss e c o n d a n dt h er o o t sr a n k e d3 2 1 p r y r r o l i n e 5 c a r b o x y l a t es y n t h e s t a s e ( p s c s ) a n d o r n i t h i n e 6 一a m i n o t r a n s f e r a s e ( o a t ) a r et h ek e ye n z y m e s o fp r o l i n eb i o s y n t h e s i s t h ea c t i v i t yo f p 5 c sw a sd e c r e a s e dc o n t i n u o u s l yu n d e rw a t e rs t r e s sf o r2 4 h o u r s ，w h e r e a st h ea c t i v i t y o fo a tw a si n c r e a s e dc o n s t a n t l y i ti s s u g g e s t e dt h a t t h ep r o l i n ea c c u m u l a t i o no f e r e m o c h l o ao p h i u r o i d e si s m a i n l yr e g u l a t e db y o a ta c t i v i t y ，g i v e nt h ec l o s e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e n t h ep r o l i n ec o n t e n ta n do a t a c t i v i t y ( t h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t i s0 9 们 3 t h ep r o l i n ec o n t e n tw a si n c r e a s e dr a p i d l ya f t e rs p r a y i n ga b a ( 5 0 um o l l ) o nt h e l e a v e so fe r e m o c h l o ao p h i u r o i d e s c o m p a r e dw i t ht h ec o t r o l ，t h ep r o l i n ec o n t e n tw a s m a r k e d l yh i g l l e r , a b o u t1 9t i m e sh i g h e rt h a nt h a to f t h el a t t e ra f t e r7d a y sw h e na b a w a s s p r a y e d m e a n w h i l e ，t h ea c t i v i t yo fp 5 c s w a si n c r e a s e db u tt h eo a t a c t i v i t yw a s d e c r e a s e d i ti si n d i c a t e dt h a tt h em e c h a n i s mo fp 5 c sa n do a t r e s p o n s i v et oa b a m i g h t b ed i f f e r e n t 4 t r e a t e dw i t ha b a , t h e a c t i v i t yo fs o d w a s s l i g h t l yl o w e r t h a nt h a to ft h ec o n t r o l f o r3d a y s a f t e r w a r d ，t h ea c t i v i t yo fs o dw a si n c r e a s e dh i g h c rt h a nt h a to ft h el a t t e r i s o e n z y m ea n a l y s i ss h o w e dt h a ta b a i n h i b i t e ds o d a c t i v i t ya f t e rs p r a y i n ga b a ( i n 1 2 h ) ，t h e 夸a yl e v e l o fs o d s p e c t r u m b a n dw a sl o w e rt h a nt h a to ft h ec o n t r 0 1 5 a f t e rs o a k i n gt h er o o t so fe r e m o c h l o ao p h i u r o i d e si n2 m m o l lc a c l 2 s o l u t i o n ， p r o l i n ec o n t e n tw a ss l i g h t l yi n c r e a s e d ；b u tt h ep r o l i n ec o n t e n ti nl e a v e ss p r a y e dw i t h c a c l 2w a sm a r k e d l yh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r 0 1 b o t hp 5 c sa n do a t a c t i v i t yw e r e i n c r e a s e d ，m d ac o n t e n tw a sd e c r e a s e d ，s o da c t i v i t yw a si n c r e a s e di n5d a y sa f t e r c a c l ，t r e a t m e n t k e y w o r d s ： e r e m o c h l o a o p h i u r o i d e s ； w a t e r s t r e s s ；p r o l i n e ；么 1 p r y r r o l i n e 5 c a r b o x y l a t e s y n t h e s t a s e ；o m i t h i n e 6 a m i n o t r a n s f e r a s e ；s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ；a b s c i s i ca c i d ；c a c l 2 a b a a c r a o a s a a _ p 册 b s a b i s c a t d t r e d t a f w g s a 缩略词表 a b s c i s i ca c i d 脱落酸 a c r y l a m i d e 丙烯酰胺 a c t i v e o x y g e n 活性氧 a s c o r b i ca c i d 抗坏血酸 a m m o n i n u m p e r o x o d i s u l f a t 过硫酸铵 a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e 腺苷三磷酸 b o v i n es e l l ma l b u m 牛血清蛋白 n ，n 7 一m e t h y l e n b i s - a c r y l a m i d en ，n 一甲叉双丙烯酰胺 c a t a l a s e 过氧化氢酶 d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 f r e s hw e i g h t 鲜重 g l u t a m i c - y s e m i a l d e h y d ey 谷氨酰半醛 g s a d h g l u t a m i c - y - s e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s ey - 谷氨酰半醛脱 氢酶 g sg l u t a m i n es y n t h e t a s e 谷氨酰胺合成酶 y g k y - g l u t a m a t e k i n a s e y 谷氨酸激酶 h 2 0 2 h y d r o g e np e r o x i d e 过氧化氢 h p l c h i g h - p r e s s u r ep e r f o r ml i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高压液相色谱 n k e t o - 6 - a m i n o v a l e r a t e a 一酮基6 氨基戊酸 i i l p l i p i dp e r o x i d a t i o n 脂质过氧化 m d am a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 n a d p hn i c o t i n a m i d ea d e n i n ei n u c l e o t i d e p h o s p h a t e ( r e d u c e d ) 还塌i 型 辅酶i i n b tn i t r o t e t r a z o l i u mb l u e 氯化硝基氮蓝四唑 1 0 2 s i n g l e to x y g e n 单线态氧 0 2 。 s u p e r o x i d er a d i c a l 超氧阴离子 。o h h y d r o x y lr a d i c a l 氢氧根离子 o a t o r n i t h i n e - 6 - a m i n o t r a n s f e r a s e 鸟氨酸6 氨基转移酶( 6 o a t ) q - o a t o m i t h i n e - q - a m i n o t r a n s f e r a s e 鸟氨酸q 氨基转移酶( q 0 a t ) p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n 磷酸盐缓冲溶液 p 2 c 么l p r y r r o l i n e 2 c a r b o x y l a t e , d1 - p f l ：e h n 林2 羧酸 p 2 c r 么1 - p y r r o l i n e 2 c a r b o x y l a t e r e d u c t a s ea 1 吡咯啉2 羧酸还原 酶 p 5 c 11 - p r y r r o l i n e 5 c a r b o x y l a t e d 1 吡咯啉5 羧酸 p 5 c s 么l p r y r r o l i n e 5 c a r b o x y l a t es y n t h e s t a s e 么1 吡咯啉5 羧酸合 成酶 p 5 c d h 么1 - p y r r o l i n e 一5 一c a r b o x y l a t ed e h y d r o g e n a s e 么1 吡咯啉5 羧酸 m 脱氢酶 p 5 c r 么1 - p y r r o l i n e 5 c a r b o x y l a t er e d u c t a s e 么1 - 吡咯啉一5 一羧酸还原 酶 p r o d hp r o l i n ed e h y d r o g e n a s e 脯氨酸脱氢酶 p e g p o l y e t h e n eg l y c o l 聚二乙醇 p m s f苯甲基磺酰氟 p v p pi n s o l u b l ep o l y v i n y l p y r r o l i d o n e不溶性聚乙烯吡咯烷酮 r p m s o d t b a t c a r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e每分钟转数 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧歧化酶 t h i o b a r b i t u r i ca c i d 硫代巴比妥酸 三氯乙酸 t e m e d t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ，n ，n - 四甲基乙二胺 t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 第一章文献综述 环境胁迫如干旱、土壤的高盐，是限制植物生长和作物产量的主要因素。植 物为适应渗透胁迫所采取的机制之一就是累积小分子可溶性物质，如脯氨酸和甜 菜碱等。二十世纪5 0 年代，k e m b l e 等人首次发现受早的多年生黑麦草叶片中有 游离脯氨酸累积现象。4 0 多年过去了，科研工作者对脯氨酸累积的现象进行了深 入研究。逐步揭示了水分胁迫下脯氨酸累积的分子机理及其累积的生理意义。在 渗透胁迫条件下，一些可溶性渗透物质，如脯氨酸、甜菜碱和糖醇等，可作为大 分子的渗透保护物质( d e l a u n e y 等，1 9 9 3 ) 。最近有关脯氨酸合成和代谢的研究表 明了脯氨酸具有多种功能，可作为一种迅速利用的能源、氮源和碳源( k a v i k i s h o r 等，1 9 9 5 ；p e n g 等，1 9 9 6 ；h u a 等1 9 9 7 ；z h a n g 等，1 9 9 7 ) 。此外，脯氨酸代谢 的中间产物具有诱导基因表达( i y e r 等，1 9 9 8 ) 和降低渗透胁迫所造成的氧伤害作 用( h o n g 等，2 0 0 0 ) ；盐胁迫条件下，脯氨酸有保护植物根部线粒体电子传递链复 合体i i 免受伤害的功能( h a m i l t o n1 1 1 等，2 0 0 1 ) ；最近的研究也指出脯氨酸代谢在 沟通c n 代谢和渗透胁迫的之间起重要作用( h e l l m 姗等，2 0 0 0 ) 。 1 脯氨酸累积的途径 渗透胁迫条件下，脯氨酸累积主要通过三种不同的途径实现，从头合成 ( v o e t b e r g 等，1 9 9 1 ) ；降解减少；特异性转运系统作用，实现“源”( 效应细胞等) “库”( 靶细胞等) 分配( r e n t s c h 等，1 9 9 6 ；s c h w a c k e 等，1 9 9 9 ) 。d e l a u n e y 等发 现，在渗透胁迫和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位，而在非胁迫条件及高氮条 件下鸟氨酸途径又居于主导地位。在植物中，谷氨酸通过两步连续的还原合成脯 氨酸，么1 一吡咯啉- 5 一羧酸( p 5 c ) 为中间产物( 图1 1 ) ；催化反应的酶为d 1 吡咯啉 - 5 一羧酸合成酶( p 5 c s ，e c2 7 2 1 1 1 2 1 4 ) 和4 1 吡咯啉5 羧酸还原酶( p 5 c r ， e c 1 5 1 2 ) 。在脯氨酸合成的鸟氨酸途径中，鸟氨酸在鸟氨酸6 一氨基转氨酶( 6 o a t ) 的作用下失去6 氨基，生成p 5 c ， 然后再还原成脯氨酸( d e l a u n e y 等， 1 9 9 3 ) 。但是在胁迫条件下，鸟氨酸途径仍然是一个值得探讨的问题( d e l a u n e v 等， 1 9 9 3 ；h e r v i e u 等，1 9 9 5 ) 。r o o s e n s 等以拟南芥为材料，发现在渗透胁迫下该途径 对脯氨酸的累积同样具有重要作用( r o o s e n s 等，1 9 9 8 ) 。 植物的脯氨酸合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫和细胞内脯氨酸浓度高 度调控的生理生化过程。谷氨酸途径发生在胞质中，但脯氨酸降解为p 5 c 却发生 在线粒体中，由脯氨酸脱氢酶催化( p r o d h ) ( k i y o s u e ，1 9 9 6 ) ，这种代谢的区域 化分布避免了物质的无效循环。大量的研究认为，p 5 c s 和p r o d h 是脯氨酸合成 和降解的关键酶。在正常情况下，脯氨酸作为一种反馈调节物质抑制了p 5 c s 的 基因而诱导了p r o d h 的基因表达( p e n g 等，1 9 9 6 ；k i y o s u e ，1 9 9 6 等1 。但在胁 迫条件下，p 5 c s 基因的表达活性增强，对p r o d h 基因的表达起抑制作用( d e l a u n e y 等，1 9 9 3 ；p e n g 等，1 9 9 6 ) 。 v e r s l u e s 等( v e r s l u e s 等，1 9 9 9 ) 以玉米根伸长区为材料，通过放射性同位素技 术证实，在低水势( - 1 6 0 m p a ) 条件下，【3 h 】g l u 参与脯氨酸的合成只占脯氨酸累 积的很少一部分： 1 4 c 0 m 合成脯氨酸的作用不明显。而用3 h 标记的脯氨酸的代 谢和利用并没有下降。因此推测脯氨酸代谢的速率和脯氨酸合成速率一样快。然 而在此条件下， 脯氨酸的吸收速率有所增加，表明脯氨酸转运速率的增强。 v e r s l u e s 认为低水势条件下，玉米( z e am a y sl ) 初生根伸长区脯氨酸含量迅速增加 是由脯氨酸向根尖的转运引起的。有较多的实验证据支持脯氨酸运输的观点。 g i r o u s s e 等发现水分胁迫下苜蓿( 。物物) 茎韧皮部汁液脯氨酸浓度增加了6 0 倍 ( g i r o u s s e 等，1 9 9 6 ) ；r e n t s c h 等发现脯氨酸转运酶基因的表达可以被脱水诱导， 而一般氨基酸透性酶基因的表达却受到抑制( r e n t s c h 等，1 9 9 6 ) ；另外，也有研究 发现水分胁迫下p 5 c r 基因的表达增强与拟南芥的维管组织具有相关性f h a r e 等， 1 9 9 6 ；h u a 等，1 9 9 7 ) 。 2 脯氨酸累积的机制 谷氨酸途径中脯氨酸合成酶基因已在不同的植物中得到阐i j ) ( d e l a u n e v 等， 1 9 9 3 ；y o s h i b a 等，1 9 9 5 ) 。编码合成的两个酶基因受到水分亏缺和盐害的正向调 节( h a r e 等，1 9 9 7 ；h a r e 等，1 9 9 9 ) 。拟南芥p 5 c s 由不同的基因编码，命名为a t p 5 c s l 和a t p 5 c s 2 ( z h a n g 等，1 9 9 7 ：s t r i z h o v 等，1 9 9 7 ) 。a t p 5 c s l 能在不同的组织中表 达，但正在分裂的细胞如果没有胁迫刺激却检测不到该基因的表达；迅速分裂的 拟南芥细胞e o ，a t p 5 c s 2 却唯一负责编码p 5 c s 的转录合成俗t f i z h o v 等，1 9 9 7 ) 。 在番茄的核基因组中，也发现有两个脯氨酸基因座：一个是特异性双功能p 5 c s 2 ( t o m p r 0 2 ) 基因座：另一个基因座为t o m p r o l ，该基因座明显编码一个多顺反子 m r n a ，指导y 一谷氨酸激酶ry g k ) 和y 一谷氨酰半醛脱氢酶( g s a d h ，又叫 y 一谷氨酰磷酸脱氢酶) 两种多肽的合成( g a r c i a r i o s 等，1 9 9 7 ) 。p 5 c s 是一种双 功能酶，具有y g k 和g s a d h 的活l 生( h u 等，1 9 9 2 ；s a v o u r e 等，1 9 9 5 ) ；在苜 蓿( m e d i c a g os a t i v a ) f g i n z b e r g 等，1 9 9 8 ) 和番茄( l y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u m ) ( g a r c i a r i o s 等，1 9 9 7 ) 同样也观察到p 5 c s 异构体的不同生理功能。 有几种机制控制脯氨酸的合成。在细菌( e s c h e r i c h i ac o f i ) 和酵母菌中，g k 和 g s a d h 是独立合成的多肽，由多肽形成异型二聚体( 6 个亚基) 。g k 受到合成产 物脯氨酸的反馈调节。植物和动物g k 和g s a d h 由双功能的p 5 c s 基因编码。 研究认为人的p 5 c s 活性受到鸟氨酸的反馈调节( h u 等，1 9 9 9 ) ，但植物的p 5 c s 却受到脯氨酸的变构调节( h u 等，1 9 9 2 ：z h a n g 等，1 9 9 5 ) 。离体实验表明脯氨酸 对豇豆反应体系中p 5 c s 活性的半抑制剂量为6 m m o l l ( h u 等，1 9 9 2 ) ，但渗透胁 迫下植物细胞中累积的脯氨酸浓度却高达1 2 9 m m o l l ( d e l a u n e y 等，1 9 9 3 ) ，这种 浓度足以完全抑制p 5 c s 酶的活性。有趣的是在胁迫条件下植物却能持续合成脯 氨酸并构建脯氨酸库。对这种现象的早期研究认为，胁迫条件下脯氨酸的累积可 能与p 5 c s 蛋白质构型的变化有关。研究人员在筛选细菌突变体时发现了一个能 累积脯氨酸的突变体，该突变体表现出较强的抗渗透胁迫。酶学分析表明该酶第 1 0 7 位的天冬氨酸被天冬酰氨代替，导致了该突变体脯氨酸不能抑制y g k 。 z h a n g 等发现豇豆( 1 4 a c o n i t i f o l i a ) p 5 c s 第1 2 8 位天冬氨酸是保守的，与反馈 抑制无关( z h a n g 等，1 9 9 5 ) ，从而排除了天冬氨酸被替换造成反馈抑制丧失的可 能性。运用定点突变技术，逐个替换p 5 c s 多肽第1 2 6 1 3 1 位的6 个氨基酸残基， 发现有两个残基对该酶的变构特性有不同程度的影响。1 2 9 位的苯丙氨酸被丙氨 酸替换( p 5 c s f l 2 9 a ) 产生的效果最明显。脯氨酸对p 5 c s 活性的半抑制剂量由野 生型的6 m m o l l 提高到突变型的9 6 0 m m o l l 。而丙氨酸替换1 2 6 位的天冬氨酸 ( p 5 c s d l 2 6 a ) ，产生的反馈抑制为中等水平，脯氨酸对酶活性的半抑制剂量为 8 6 m m o l l ( z h a n g 等，1 9 9 5 ) 。这表明修饰、变更不同的氨基酸残基，会不同程度 地改变p 5 c s 的反馈调节特性。这种定点突变是否会直接影响变构位点或导致了 蛋白质构型的变化，尚需证实。h o n g 等发现，除去反馈抑制的p 5 c s f l 2 9 a 突变 4 如鲻摄糠铝h辱61日v避簿牟章醐腻 龌t 笛u岍d)避隧硷钲辙iml蔷曾譬 蟹ol，v髓瓣倒蜒雄ih 钲镊醐蜮 避锰城舞。_【 镞唾蝌锰黛inl善曾营-i可矗鲁rol a v啦簿毒睾醐幅i。i链城竹 一啦o v 溢镁 l盛聩卵啮 譬口usdv避埔翟能辙imi蔷曾蔷l飞呐 髓草辑能城餐簿畎冒口量v鞋脯鼙链械 飞n 昌山ov避肾蝌键蘸搽城摊棰眺蕾凸【v叻ov避蛹鬻邋斗啦艟雄i-n ui。l卜v鞋耀链嚼雄l一 咯i醐畦i d。 锚黧ii善曾菩i_勺。u譬镊嵌氍vj笛； 髓援如错疆i坼i譬垂誉-tn。usd 琏匝蛊着车链城蟹霍堆霉靼淞恒_【匝 体与p 5 c s 转基因植物相比，无论在正常条件还是在胁迫条件下产生的脯氨酸都 增加了2 倍。因此认为p 5 c s 的反馈调节在胁迫条件下并没有完全消除( h o n g 等， 2 0 0 0 ) 。综上所述，胁迫条件下脯氨酸的合成不仅受p 5 c s 转录激活调节( h u 等， 1 9 9 2 ；z h a n g 等，1 9 9 7 ：g a r c i a r i o s 等，1 9 9 7 ) ， 而且也受到该途径终产物的反 馈调节。另外，p 5 c s 和脯氨酸脱氢酶( p r o d h ) 的交互增长在胁迫和胁迫恢复中 互相调节脯氨酸的累积( p e n g ，1 9 9 。在渗透胁迫下，野生型的p 5 c s 酶也许在脯 氨酸反馈作用的位点周围发生了构型的变化，从而导致其变构调节效应的部分丧 失。用这种“部分丧失”的假设就能够解释在胁迫条件下为什么植物累积的脯氨 酸即使达到了反馈调节的量还能继续构建脯氨酸库的原因。 3 脯氨酸降解的调节 在持续脱水和盐胁迫条件下关于脯氨酸累积的机制，一般认为是激活了脯氨 酸合成酶基因活性，抑制了脯氨酸降解基因的表达。相反，复水时累积的脯氨酸 水平降低是由于抑制脯氨酸合成而激活了脯氨酸降解。虽然从拟南芥等多种植物 中分离到p r o d h ( k j y o s u e 等，1 9 9 6 ；p e n g 等，1 9 9 6 ；v e r b r u g g e n 等，1 9 9 6 ) ，但 对脯氨酸降解分子机制的理解还比较肤浅。已知脯氨酸降解由两个线粒体酶催化 即脯氨酸脱氢酶( p r o d h ，e c1 5 9 9 8 ) 和p 5 c 脱氢酶( p 5 c d h ，e c l 5 1 1 2 ) 。 植物在n a c i 和p e g 介导的水分胁迫条件下，编码p r o d h 的m r n a 降低。这表 明脯氨酸的降解在转录水平上受到调节，并不只是p r o d h 的失活造成的 ( v e r b r u g g e n 等，1 9 9 6 ) 。在渗透胁迫解除的情况下，a t p r o d h 的转录水平迅速增 力n ( k i y o s u e 等，1 9 9 6 ；p e n g 等，1 9 9 6 ) 。p r o d h 的活性迅速增强。这种生理现象 的意义在于胁迫恢复过程中累积的脯氨酸可以作为迅速利用的碳源、氮源( h a r e 等，1 9 9 7 ) 。植物中编码p 5 c d h 的c d n a 克隆分离还没未见报导。 拟南芥水分胁迫的缓解或复水过程中，p r o d h 基因被迅速诱导并表达到很高 水平( k i y o s u e 等t1 9 9 6 ；p e n g 等t1 9 9 6 ；v e r b m g g e n 等，1 9 9 6 ) 。一般认为，p r o d h 是脯氨酸降解的限制酶。h e l l m a n n 等意外地发现脯氨酸的降解产物对植物具有毒 害作用( h e l l m a n n 等，2 0 0 0 ) 。因此，渗透胁迫条件下，虽然脯氨酸的累积对植物 具有非常重要的意义，但是在胁迫恢复期间对脯氨酸降解过程更需要精细调节， 否则脯氨酸降解对植物造成的毒害作用远甚于渗透胁迫造成的危害。这是一个有 5 待深入研究的有趣课题。 研究人员从脱水1 小时的拟南芥植物中克隆了e r d 的c d n a ，它编码的蛋白 质与酵母菌的p 唧基因和d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rs l u g g i s h - a 产物相似( k i y o s u e 等，1 9 9 6 ) 。它们的基因产物是p r o d h 的前体物。n a k a s h i m a 等证实，e r d 5 c d n a 的产物是线粒体的组分。e r d 5 和p u ”组成的融合基因能补偿酵母菌p u t l 的突 变体，能够使该突变体在以脯氨酸为氮源的培养基上生长。r n a 杂交分析表明， p r o d h 的基因转录在脱水1 0 小时后未能检测到，但在随后的复水过程中转录产 物又大量积累。生长在含脯氨酸的培养基上的植物该基因的转录水平显著提高。 该基因的启动子分析表明，p r o d h 在转录水平上受到脱水和复水的调节。同时发 现其启动子也受到发育信号的调节( n a k a s h i m a 等，1 9 9 8 ) 。 为鉴定与代谢调控有关的感知和信号传导途径，m a r t i n 等用马铃薯( s o 肠n u m t u b e r o s u m ) 的p a t a t i ni 启动子和g u s 报告基因组成融合基因，已成功转化到拟 南芥植株中表达( m a r t i n 等，1 9 9 7 ) 。p a t a t i ni 是块茎中的主要贮存蛋白，该基因启 动子既受碳水化合物的调节也受到氨基酸的调节( r o c h a s o s a 等，1 9 8 9 ) 。在拟南 芥转化植株中，p a l a t i ni 启动子主要在块茎中活化表达，同时也受到碳水化合物 和谷氨酰胺的正向调节。这说明在拟南芥和马铃薯中存在一种保守的调节途径， 特异性地用于库代谢所依赖的基因表达。经化学诱变的方法，已筛选到几个糖反 应降低型的突变体似r ) ( m a r t i n 等，1 9 9 7 ) 。在r s r l 1 突变体中，糖和脯氨酸都不 能诱导p a t a t i ni 启动子的表达，但该突变体对脯氨酸高度敏感。进一步研究表明， 是脯氨酸降解的中间产物p 5 c 造成了毒害作用。糖和脯氨酸对p a t a t i ni 启动子的 调节以及r s r l j 对脯氨酸的高度敏感性表明了c 小代谢和胁迫反应之间存在一 种新的联系。 a t r s r l 是信号级联的一个组分，它能应答脯氨酸降解激发的信号，导致 p a t a t i n 启动子的表达，从而进一步抑制p r o d h 的表达。这种反馈调节机制的存在， 保护了植物在水分胁迫缓解后脯氨酸降解的毒害效应。因此，脯氨酸降解也受到 另外途径的调节，即脯氨酸的降解作为一个胁迫恢复的信号，诱导p a t a t i n 启动子 和其它内源基因的表达( 通过a t r s r l ) ；另一方面，a t r s r l 同时作为一个负向 “调节器”调节p r o d h 的表达，阻止了过量脯氨酸降解造成的毒害。脚j j 突 6 变体缺失这种双重功能，从而使植物不能诱导p a t a t i ni 启动子，造成对脯氨酸高 度敏感。 4 根脯氨酸的代谢和功能 根尖是感知水分状况的最敏感部位，水分状况的亏缺往往最先由根部感知。 在此状况下，其生理反应可能与叶片和茎的生理反应不同。早在1 9 6 6 年，o a k s 证实玉米初生根根尖中碳源参入到脯氨酸中的速度很慢。他认为根尖中脯氨酸的 合成远远不能满足对脯氨酸的需要，因此脯氨酸必须转运到根尖才能有效地起到 渗透保护作用。v e r s l u e s 等的研究证实这一结论( v c r s l u e s 等，1 9 9 9 ) 。 在水分胁迫和盐胁迫下，一般认为脯氨酸的代谢受到抑制。s t e w a r t 用同位素 标记证明了在低水势下脯氨酸的氧化受到抑制。其他的研究报道认为低水势条件 下p r o d h m r n a 的表达量有所降低( y o s u e 等，1 9 9 6 ：v e r b r u g g e n 等，1 9 9 6 ) 。 v e r s l u e s 等发现低水势下根顶端脯氨酸代谢没有降低，这可能与实验材料的不同 有关。该研究人员发现，无论低水势还是高水势脯氨酸向谷氨酸的流向都超过谷 氨酸向脯氨酸的流向。这些结论与b a r n a r d 和o a k s 的结论一致。在高水势条件 下，b a m a r d 等发现切段为5 m m 长的玉米根尖，脯氨酸加速代谢，这表明脯氨酸 是作为能量来源加以利用。相对于高水势来说，脯氨酸代谢加速并不能说明在水 分胁迫下缺乏调控机制。因此推测，如果脯氨酸的代谢与脯氨酸的浓度成比例的 话，脯氨酸是不可能累积到如此高的水平。这表明，低水势下脯氨酸代谢的受抑 正好为脯氨酸向根尖的运输提供了库源。 2 0 世纪中后期，h a r e 等和k o h l 等认为在水分胁迫下，脯氨酸从“效应细胞， 转运到“靶细胞”是需要能量的过程( h a r e 等，1 9 9 7 ) 。输出脯氨酸的效应细胞，一 般是利用谷氨酸途径产生的n a d p + 为原料合成嘌呤核苷酸的细胞。初生根顶端 的生长区是一个需要高能量的组织，很有可能是脯氨酸输入的“靶组织”。k o h l 等描述了大豆根瘤类似的系统( k o h l 等，1 9 8 8 ) 。大豆根瘤中的氮是以嘌呤衍生物 的形式输出的。该学者认为，类菌体感染植物细胞后胞质中脯氨酸的合成过程中 产生的n a d p + 用于嘌呤的合成。然后植物胞质中的脯氨酸再转运到类菌体中，作 为能量来源用于氮的固定。有趣的是，在低水势下类菌体内脯氨酸脱氢酶( p m d h ) 的活性增加( k o h l 等，1 9 9 1 ) ，而其它组织中的p r o d h 活性或其m r n a 的表达受 到抑制f k i y o s u e 等，1 9 9 6 ；v e r b m g g e n 等，1 9 9 6 ；s u d h a k a r 等，1 9 9 3 ) 。已经证 明，类菌体内脯氨酸的代谢对植物的表现具有重要的意义。一些不能代谢脯氨酸 的菌株感染大豆植株后，产量明显低于感染了正常菌株的大豆植株( s t r a u b 等， 1 9 9 7 ) 。 综上所述，胁迫条件下p 5 c s 和p 5 c r 活性的增加与p r o d h 和p 5 c d h 活性的 下降( d e l a u n e y 等，1 9 9 3 ；p e n g 等，1 9 9 6 ) ，是一个问题的两个方面，它们的交互 调节从而影响脯氨酸的累积。此外，最近的研究也证明了干旱胁迫条件下，脯氨 酸运输对其累积的作用( g i r o u s s e 等，1 9 9 6 ；r e n t s c h 等，1 9 9 6 ；v e r s l u e s 等，1 9 9 9 ) 。 这表明，对于脯氨酸的累积来说，植物进化了一种协调其合成、代谢和转运的机 制。u e d a 等的研究，有力地支持了脯氨酸的转运机伟l j ( u e d a 等，2 0 0 1 ) 。u e d a 等 用差异显示的方法从盐胁迫的大麦( h o r d e u mv u l g a t e ) 根部克隆了一个编码脯氨 酸转运酶( h v p r o t ) 酗jc d n a 。两，脚d r 由2 1 6 1 个碱基对组成，内含一个编码4 5 0 氨基酸的开放阅读框。该氨基酸序列与水稻、拟南芥和番茄的脯氨酸转运酶的相 似性分别为6 5 7 、5 7 7 和4 2 0 。n o r t h e r n 杂交分析表明，根部h v p r o t 的转 录表达发生在2 0 0m m o l l n a c i 处理后的3 0 分钟，3 小时达到最高水平。但叶中 的转录水平很低，并且在盐胁迫期间转录水平也不增加。相比而言，p 5 c s 基因 的转录表达比h v p r o t 慢。用酵母菌的脯氨酸吸收突变体进行运输分析，表明了 h v p r o t 对l 厂脯氨酸有很高的亲和力( k m = 2 5 t m o l l ) 。h v p r o t 是发现的唯一一个 对l 脯氨酸具有高亲和力的运输酶。由于它的运输活性依赖于p h 梯度，因此认 为h v p r o t 是一种质子氨基酸同向运输酶。原位杂交分析表明，胁俨幻丁m r n a 在根冠细胞内强烈表达。h v p r o t 也许在脯氨酸紧急运向根尖部位起着重要的作 用m e d a 等，2 0 0 1 ) 。有关脯氨酸运输的调节，一种观点认为a b a 参与了脯氨酸 向根尖运输的调节( o b e r 等，1 9 9 4 ) 。此外，谷氨酰胺合成酶( g s ) 也在韧皮部脯 氨酸的运输中发挥重要作用( b r u g i 6 r e a ，1 9 9 9 )