（动物遗传育种与繁殖专业论文）斑马鱼zotu蛋白在卵子发生和胚胎发育早期的表达.pdf

l i i l lli ii l l l t l l l l l l l l1 1 1 1 1 1 1 i i i l y 1812 5 7 0 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 函 如需保密，解密时间 2 一q 7 年月即日久 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：岳哦金 时间：1 1 年f 月孑日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和 电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 糊槲娩嗣金 椭名：墨缆 签名日期：a 舶 年f 月f 了日签名日期：a 1 年 f 月，孑日 斑马鱼z - 0 t u 蛋自在卵子发生和胚胎发育早期的表达 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 前言1 1 1 斑马鱼的特性、配子发生及胚胎发育1 1 1 1 斑马鱼的生物学特性1 1 1 2 斑马鱼的配子发生2 1 1 3 斑马鱼的受精作用一3 1 1 4 斑马鱼的胚胎发育4 1 2 去泛素化酶( d u b s ) 的研究进展6 1 2 1d u b s 是u p p 的重要组分7 1 2 2d u b s 的分类9 1 2 3d u b s 的生物学功能及研究中存在的问题1 0 1 3o t u 基因的研究现状1 1 1 3 1o t u r e l a t e d 蛋白酶家族的研究进展”1 1 1 3 2 果蝇o t u 基因的研究现状1 2 1 3 3z - o t u 基因的研究进展”1 4 2 本研究的目的意义1 8 3 材料和方法1 9 3 1 试验材料1 9 3 1 1 实验动物的来源和饲养1 9 3 1 2 菌株1 9 3 1 3 工具酶、试剂盒和主要试剂“1 9 3 1 4 主要溶液一1 9 3 1 5 细菌培养基一2 0 3 1 6i n o u e 法制备超级感受态细胞所需溶液2 0 3 1 7 小量碱法提取质粒d n a 所需试剂2 1 3 1 8 主要仪器设备”2 1 3 2 试验方法2 1 3 2 1 试验技术路线”2 1 3 2 2 表达载体的构建2 2 3 2 3 重组蛋白g s t - o t u l 引物设计和p c r 扩增2 3 3 2 4p c r 产物纯化2 4 3 2 5i n o u e 法制备超级感受态细胞2 4 3 2 6 目的片段及表达载体的双酶切处理2 5 3 2 7 连接反应2 5 i 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 3 2 8 转化”2 5 3 2 9 重组质粒检测2 5 3 2 1 0 诱导蛋白表达”2 6 3 2 1 1 表达蛋白s d s p a g e 电泳2 6 3 2 1 2 表达蛋白的纯化2 7 3 2 1 3 多克隆抗体a n t i z o t u 的制备2 7 3 2 1 4 双向琼脂扩散实验检测抗体的效价”2 8 3 2 1 5 卵巢组织免疫组织化学2 8 3 2 1 6 胚胎整体荧光免疫组织化学3 0 4 结果3 1 4 1 重组表达载体的构建”3 1 4 1 1p c r 扩增目的片段3 1 4 1 2p g e x 6 p 1 载体质粒检测3 1 4 1 3 重组质粒的检测3 2 4 2 融合蛋白诱导表达及融合蛋白的提取3 4 4 2 1 融合蛋白的诱导表达结果3 4 4 2 2 融合蛋白的提取3 4 4 3 双向免疫扩散试验3 5 4 4 免疫组化染色”3 5 4 4 1z o t u 蛋白在卵子发生过程中的表达模式3 5 4 4 2z o t u 蛋白在胚胎发育早期的表达3 6 5 讨论3 9 5 1 表达片段的确定”3 9 5 2 表达引物的设计3 9 5 3 双酶切3 9 5 4 诱导条件的优化一4 0 5 5 抗原的制备4 0 5 6 抗体效价的检测4 0 5 7z o t u 蛋白在斑马鱼发育过程中的作用4 1 5 7 1z o t u 蛋白在斑马鱼卵子发生中的作用4 1 5 7 2z o t u 蛋白在斑马鱼胚胎早期发育中的作用4 2 6 小结z 1 4 6 1 本研究获得的结果及创新点一4 4 6 2 本研究的不足之处和下一步值得研究的工作4 4 参考文献”4 5 致谢5 2 斑马鱼z - o t i j 蛋白在卵子发生和胚胎发育早期的表达 摘要 斑马鱼( d a n i or e d o ) 是脊椎动物发育生物学和遗传学研究的重要模式动物，其 卵子发生及早期胚胎发育过程的调控机制已经引起越来越多研究者们的高度重视。 最近的研究表明，泛素蛋白酶体途径( u b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a t h w a y , u p p ) 参与了 哺乳动物卵子发生和早期胚胎发育过程的许多重要事件，如卵母细胞生发泡破裂、 第一极体的排放、m i i 阻滞的维持和克服等。u p p 途径是真核生物细胞内一种高效 的蛋白质降解途径，能够参与体内许多重要的生物学功能，包括细胞周期、胚胎发 育、生长控制、凋亡、神经元退化等，其表达异常可以引发许多疾病。去泛素化酶 ( d e u b i q i t i n a t i n ge n z y m e s ，d u b s ) 是u p p 的重要组分，具有调控u p p 的重要作用。 目前，在斑马鱼中还未见任何有关d u b 的报道。 我们研究的斑马鱼o t u 基因( 简称z o t u ，下同) 编码的蛋白可能具有d u b s 活 性，它具有一个典型的o t u 保守框，属于o t u 1 i k e 半胱氨酸蛋白酶家族的成员。z - o t u 不仅是一个斑马鱼卵巢特异表达的基因，而且还是一个卵子发生早期和胚胎发育早 期特异表达的基因。在早期卵母细胞( 卵原细胞或刚分化的卵母细胞、i i i l 期卵母 细胞) 中，z - o t um r n a 有表达且表达量呈现出递减的趋势；在期卵母细胞和成 熟的卵子( v 期卵母细胞) 中几乎检测不到该基因的表达；z - o t um r n a 在合子期到 囊胚早期胚胎的胚盘细胞中表达，而在囊胚晚期之后直到5 d p f ( 不包括5 d p f ) 的胚 胎中检测不到表达。生物信息学分析结果显示z - o t u 是一个核蛋白，其4 9 1 5 1 4 氨 基酸区域存在一个长2 4 个氨基酸的跨膜区域，预测结果还显示该蛋白的n 端位于 膜外，没有明显的信号肽区域，表明其是一个非分泌蛋白。 为了进一步分析z o t u 蛋白的功能，本文设计了特异性引物并采用p c r 扩增 了该基因的o t u 保守域( 简称o t u l ) ，将该片段插入p g e x 6 p 1 载体后，与g s t 标 签蛋白融合后转化到大肠杆菌b l 2 1 中。构建好的融合表达质粒经p c r 、酶切检测 和测序鉴定后，用i p t g 诱导并进行s d s p a g e 电泳，得到一个与预期目的蛋白分 子量( 4 2 k d a ) 相符的条带。将原核表达的融合蛋白纯化后免疫新西兰兔，获得多 克隆抗体a n t i z o t u ，并利用该抗体对斑马鱼卵巢和胚胎进行免疫组织化学检测。 斑马鱼卵巢免疫组化检测结果显示，在卵母细胞初级生长期( i 期) ，z o t u 蛋 白定位于生发泡( g 内，而在细胞质中未检测到该蛋白的表达；在s t a g e l i 期和 t 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 s t a g e l i i 期的卵母细胞中，z o t u 蛋白开始向细胞质迁移，主要分布在生发泡周围、 细胞质中和细胞膜上，在卵黄和皮层小泡中几乎检测不到该蛋白的表达；在s t a g e l v 期卵母细胞中，z o t u 蛋白主要集中在生发泡的近植物端，在随后的发育中伴随着 生发泡一起向未来的动物极迁移。整体荧光免疫组织化学检测结果显示z o t u 蛋白 的分布在斑马鱼胚胎发育早期随发育阶段的不同而发生变化：卵母细胞受精后， z o t u 蛋白位于细胞质中，并伴随着胞质流动；随着胚胎的进一步发育，z o t u 均 匀的分布在卵裂后的各个细胞中，但是在中囊胚转换之后，z o t u 蛋白主要分布在 体节形成的部位。在斑马鱼胚胎发育早期，z o t u 蛋白的表达量也随发育阶段的不 同而发生变化：z o t u 蛋白在3 0 外包期的表达量明显低于在1 0 0 0 细胞期的表达 量；当胚胎发育到体节期时，z o t u 蛋白的表达量继续降低，到1 3 体节后已检测 不到z o t u 蛋白。上述结果表明，z o t u 蛋白在斑马鱼卵子发生、受精和胚胎发 育早期可能有着非常重要的生物学功能。 根据本研究及以前的研究，我们分析并比较了z o t u 基因的m r n a 和蛋白的分 布，结果表明二者的时空表达有一定差异：m r n a 仅在卵子发生早期表达，卵母细 胞受精后才重新开始表达，而其蛋白在卵子发生过程中均表达；在卵子发生过程中， m r n a 分布于细胞质中，而蛋白质先分布于细胞核中，然后向细胞质迁移，接着又 向g v 集中。 关键词：斑马鱼；去泛素化酶；z - o t u 蛋白；o t u 保守框；免疫组织化学； 卵子发生：胚胎发育 斑马鱼z - 0 t u 蛋白在卵子发生和胚胎发育早期的表达 a b s t r a c r z e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) i sa ni m p o r t a n tm o d e lf o rr e s e a r c ho fv e r t e b r a t eo n d e v e l o p m e n t a lb i o l o g ya n dg e n e t i c s ，a n dm o r ea n d m o r er e s e a r c h e r sp a y a t t e n t i o nt ot h e r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f z e b r a f i s hg e r mc e l lo o g e n e s i sa n de a r l ye m b r y o g e n e s i s r e c e n t l 5a f e ws t u d ys h o w e dt h a tu b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a t h w a y ( u p p ) i si n v o l v e di n n u m e r o u si m p o r t a n tb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gm a m m a l i a n o o g e n e s i sa n de a r l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ，s u c ha sg e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w n ( g v b d ) o fo o c y t e ，t h e e x t r u s i o no f p o l a rb o d y ，t h ep r e v e n t i o na n db r e a k t h r o u g ho fm e i o t i cp r o g r e s s i o n t omh s t a g ea n ds oo n t h eu p p i sa ne f f i c i e n tp a t h w a yf o rp r o t e i nd e g r a d a t i o ni nt h ev e r t e b r a t e c e l la n di n v o l v e di nn u m e r o u si m p o r t a n tb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gc e l lc y c l e s ， e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ，g r o w t hc o n t r o l ，a p o p t o s i sa n dn e u r o d e g e n e r a t i o na n d s oo n t h e a b n o r m a l i t i e so ft h eu p p m a yc a u s em a n yd i s e a s e s d e u b i q i t i n a t i n ge n z y m e s ( d u b s ) i s o n eo ft h ei m p o r t a n tc o m p o n e n te l e m e n to fu p pa n dp l a yi m p o r t a n tr o l e si nr e g u l a t i n g t h eu p ea tp r e s e n t ，t h e r ew a sn oa n yr e p o r ta b o u td u b si nz e b r a f i s h o u rr e s e a r c hs h o w e dt h a tt h et r a n s l a t i o np r o d u c to fz e b r a f i s hz - o t ug e n em a y b eh a v e t h ea c t i v i t yo fd u b ，b e c a u s et h ep r e d i c t e dp r o t e i nc o n t a i n so n e t y p i c a lo t ud o m a i na n di s o n em e m b e ro fo t u - l i k ec y s t e i n ep r o t e i n a s ef a m i l y t h ez - o t uw a sag e n es p e c i a l l y e x p r e s s e di nz e b r a f i s ho v a r ya n di nt h ee a r l ys t a g e so fo o g e n e s i sa n de m b r y o g e n e s i s i n e a r l yo o c y t e ( t h eo o g o n i u mo ro o c y t et h a th a sj u s te n t e r e di n t om e i o t i cp h a s ea n ds t a g ei - i i i o o c y t e ) ，t h e z - o t um r n aw a se x p r e s s e da n di t s e x p r e s s i o nl e v e lw a sg r a d u a l l y d e c r e a s e d ；n os i g n i f i c a n ts i g n a lw a so b s e r v e di ns t a g ei va n ds t a g evo o c y t e ；z o t u m r n aw a sa l s op r i m a r i l ye x p r e s s e di ne m b r y of r o mz y g o t ep e r i o dt oe a r l y - b l a s t u l a s t a g ew h i l ei tw a sd i s a p p e a r e df r o ml a t e b l a s t u l as t a g et o5 d p f ( n o ti n c l u d e5 d p f ) 。t h e a n a l y s i so fb i o i n f o r m a t i o n i n d i c a t e dt h a tt h ez - o t uw a san u c l e a rp r o t e i nw h i c h c o n t a i n i n gat r a n s m e m b r a n er e g i o nl o c a t e di nt h er e g i o no f 4 9 1 5 1 4a m i n oa c i d s ，a n di t s n t e r m i n a lw a se x i s t e do u t s i d eo ft h en u c l e a rm e m b r a n e ；z - o t uh a sn os i g n a lp e p t i d e a n dm a yb ean o n s e c r e t e dp r o t e i n i no r d e rt of u r t h e ri n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no fz o t up r o t e i n ，t h es p e c i f i cp r i m e r s w e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yt h ed n a s e q u e n c e ( o t u l ) o fo t ud o m a i nu s i n gp c r t h e nt h e o t u lf r a g m e n tw a si n s e r t e di n t o p g e x - 6 p - 1v e c t o ra n dt h el i g a t e dp r o d u c t sw e r e t r a n s f o r m e di n t ot h eb l 2 1o fe c o l i t h ec o d i n gr e g i o no fc o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n t p l a s m i dp g e x 一6 p - 1 一o t u lw a sv e r i f i e db yp e ra m p l i f i c a t i o n ，d i g e s t i o no fr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s ea n dd n a s e q u e n c i n g ，t h e nw e o b t a i n e dt h ec o r r e c tr e c o m b i n a n t p l a s m i df o r p r o c a r y o t i ce x p r e s s i o n a f t e ri n d u c t i o nb yi p t ga n dc h e c k e dw i t hs d s - p a g e ，w e t n 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 o b t a i n e dan e wa b o u t4 2 k dp r o t e i nb a n da n di t ss i z ew a ss a m et ot h ee x p e c t e dp r o t e i n b a n d t h ep r o t e i ng a i n e db yp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nw a s p u r i f i e da n dt h e nw a si n j e c t e di n r a b b i t st oo b t a i nt h e p o l y c l o n a la n t i b o d y a n t i z o t u ，w h i c hw a su s e d f o r i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi nz e b r a f i s ho v a r ya n de m b r y o t h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r a lr e s u l t so fz e b r a f i s ho v a r ys h o w e dt h a tz o t up r o t e i n w a sl o c a t e di ng e r m i n a lv e s i c l e ( g v ) i nt h ep r i m a r yg r o w t hp h a s e ( s t a g ed ，w h i l ei tw a s n o td e t e c t e di n c y t o p l a s m ；i nt h es t a g ei ia n dt h es t a g ei i io o c y t e ，z o t up r o t e i n m i g r a t e dt ot h ec y t o p l a s ma n dm a i n l yd i s t r i b u t e di nt h ep e r i n u c l e a r , c y t o p l a s ma n d c e l l u l a rm e m b r a n e ，b u ti td i dn o tp r e s e n ti ne g gy o l ka n dc o r t i c a la l v e o l u s ；a tl a s t ，z o t u p r o t e i nm a i n l yc o n c e n t r a t e da tn e a rv e g e t a t i v ep o l eo fg v , a n dm i g r a t e dw i t hg vt ot h e f u t u r ea n i m a lp o l ed u r i n gt h ef o l l o w i n gd e v e l o p m e n t t h er e s u l t so fw h o l em o u n tf l u o r e s c e n c ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi n d i c a t e dt h a tt h e d i s t r i b u t i o no fz o t up r o t e i nw a sc h a n g e di nz e b r a f i s he m b r y oo fe a r l yd e v e l o p m e n t a l s t a g e s a f t e rf e r t i l i z a t i o n ，z - o t up r o t e i nw a sl o c a t e di nc y t o p l a s ma n df l o w e dw i t h c y t o p l a s m ；w i t ht h ef u r t h e rd e v e l o p m e n to fe m b r y o ，z - o t uw a su n i f o r m l yd i s t r i b u t e di n e v e r yc e l ld u r i n gc l e a v a g ep e r i o d ，b u tw a sm a i n l yl o c a t e di nr e g i o nw h e r ef o r m i n gs o m i t e a f t e rm i d b l a s t u l at r a n s i t i o n ( m b t ) t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fz o t up r o t e i nw a sa l s o v a r i e di nz e b r a f i s he m b r y oo fe a r l yd e v e l o p m e n t a ls t a g e t h ep o s i t i v es i g n a lo fz o t u p r o t e i ni n3 0 e p i b o l ys t a g eo b v i o u s l yw e a kt h a nt h a ti n1 0 0 0c e l ls t a g e ；t h ee x p r e s s i o n l e v e lo fz - o t u p r o t e i nw a sg r a d u a l l yd e c r e a s e dd u r i n gt h es e g m e n t a t i o np e r i o d ，b u ti t w a sn o tp r e s e n ta f t e r1 3 一s o m i t es t a g e t h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fz o t ui n z e b r a f i s h o o c y t ea n de m b r y oo fe a r l yd e v e l o p m e n t a ls t a g e ss u g g e s t e dt h a tz o t up r o t e i ni s r e q u i r e di nt h em e i o s i so fo o c y t e ，f e r t i l i z a t i o na n de a r l ys t a g e so fe m b r y o g e n e s i s w ea n a l y z e da n dc o m p a r e dt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fm r n a a n dp r o t e i no fz - o t u g e n e ，t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h e r ee x i s t e ds o m ed i f f e r e n c ei ns p a t i o t e m p o r a le x p r e s s i o n b e t w e e nt h et w o ：z 。o t um r n a o n l ye x p r e s s e dd u r i n gt h ee a r l yd e v e l o p m e n t a ls t a g eo f z e b r a f i s he m b r y o ，a n di t a p p e a ra g a i na f t e rf e r t i l i z a t i o n ，w h i l et h ep r o t e i no fz o t u m a i n t a i n e de x p r e s s i o nd u r i n gt h ew h o l es t a g e so fz e b r a f i s h o o g e n e s i s ；d u r i n gt h ep r o c e s s o fo o g e n e s i s ，t h ez - o t um r n ad i s t r i b u t e di nc y t o p l a s m ，b u tz o t up r o t e i nf i r s te x i s t e di n n u c l e a r , t h e nm i g r a t e dt oc y t o p l a s m ，a tl a s ti tc o n c e n t r a t ea tt h ep e r i p h e r yo f g v 。 k e yw o r d s ：z e b r a f i s h ；d e u b i q i t i n a t i n ge n z y m e s ；z - o t up r o t e i n ；o t ud o m a i n ； i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ； o o g e n e s i s ；e m b r y o g e n e s i s i v 斑马鱼z - o t i j 蛋白在卵子发生和胚胎发育早期的表达 1 前言 1 1 斑马鱼的特性、配子发生及胚胎发育 1 1 1 斑马鱼的生物学特性 斑马鱼是常见的热带鱼，属鲤科短担尼鱼属，原产于南亚，由于其身上有斑马 样的条纹，得名斑马鱼( 如图1 1 所示) 。 图1 1 斑马鱼的基本形态特征 ( 引自h t t p ：z f i n o r g c g i - b i n w e b d r i v e r ? m i v a l - - - a a - z d b _ h o m e a p g ) f i g 1 1t h eb a s i cm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e ro fz e b r a f i s h ( f r o mh t t p ：z f i n o r g c g i - b i n w e b d r i v e r ? m i v a l = a a - z d b _ h o m e a p g ) 斑马鱼雄鱼体修长，鳍大，体色偏黄，臀鳍呈棕黄色，条纹显著；雌鱼鱼体较 肥大，体色较淡，偏蓝，臀鳍呈淡黄色，怀卵期鱼腹膨大明显。值得注意的是，斑 马鱼繁殖时应隔离鱼和卵，因为它们最喜欢自食其卵。繁殖时可按雌雄鱼1 ：2 的比 例放入繁殖缸内，一般头天晚上放入，第二天上午或中午就可以受精产卵。 斑马鱼是一种理想的发育生物学和遗传学研究的模式动物。除具有鱼类所共有 的特点，如产卵量大、体外受精、胚胎体外并同步发育外，还具有下述优点： ( 1 ) 胚胎完全透明，在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细胞，而且发 育阶段的胚胎死亡( 死于致死突变或化学处理等) 能够被及时观察到。因此，可以通 过一些技术和荧光染色获得胚胎发育图( k a e t h n e ra n ds t u e r m e r , 1 9 9 2 ) ，此外还可以 在后期胚胎上实施细胞及组织移植技术( h o ，1 9 9 2 ) 、全胚组织标本制作技术( w i l s o n e ta 1 ，1 9 9 0 ) 和全胚原位杂交技术( j o w e t ta n dl e t t i c e ，1 9 9 4 ) 等。 ( 2 ) 心血管、血液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相应系统有许多 共同特点，因此可以建立组织或器官有缺陷的突变体，长时间保存，这可以为发育 遗传学研究提供极为有利条件。 ( 3 ) 性成熟期短( 3 个月) 且产卵时间可以调控：胚胎发育非常迅速( 从受精到 孵出约3 d ) ，胚胎在体外1 天的发育程度就相当于人类胚胎3 个月的发育水平；胚 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 胎组成比较简单，细胞数目也比其他物种少。 此外，斑马鱼体型小( 成体仅3 - - 4 c m 长) ，子代数量多，培育要求低，易于养殖， 便于开展大规模研究。 1 1 2 斑马鱼的配子发生 同脊椎动物一样，斑马鱼配子发生包括卵子发生( o o g e n e s i s ) 和精子发生 ( s p e r m a t o g e n e s i s ) ，二者均要经过增殖期、生长期和减数分裂期。在配子发生过程 中，二倍体的原始生殖细胞( p g c s ，p r i m i t i v eg e r mc e l l s ) 要通过减数分裂和分化 才能转化成单倍体的卵或精子：一个初级精母细胞经过两次成熟分裂形成4 个精细 胞，后者经过进一步的分化才能形成能够运动、体积非常小的精子；一个初级卵母 细胞只能产生一个成熟的卵子和两个极体，卵细胞体积相当大，并且是不可游动的。 尽管精子和卵子的体积不同，但它们为子代提供的核d n a 是等量的，即各提供一 套基因组；不过由于卵细胞的体积大，子代细胞的细胞质结构和细胞质d n a 都是 由卵细胞提供的。 1 1 2 1 斑马鱼卵子发生的基本特征 斑马鱼卵子发生过程中，卵母细胞的发育是不同步的( s e l m a ne ta 1 1 9 9 3 ) 。 在卵子发生早期，核内许多小核仁开始富集，其数目在接下来的时期中可以达至u 1 5 0 0 个，它们分布在核的外围和靠近内部核膜( h i s a o k aa n df i r l i t ，1 9 6 2 ；b a u m e i s t e r , 1 9 7 6 ) 。斑马鱼卵子发生过程一般分为5 个时期( s t a g ei v ) ，各个时期的基本特征 ( p e l e g r i ，2 0 0 3 ) 如下： 原始卵泡生长阶段( s t a g ei ) ，卵母细胞是一个没有卵黄的圆球体( 图1 2 a ) ，为 细胞质包围着的生发泡( g e r m i n a lv e s i c l e ，g v ) 。其染色体去浓缩并出现灯刷状表型， 此时d n a 高度延伸，形成一个具有典型形态学上包含r n a 和蛋白质的侧环。染色体 的这一构型被认为有利于母源性基因的转录激活，其出现与斑马鱼卵母细胞中r n a 的高速合成是一致的( b a u m e i s t e r , 1 9 7 3 ) 。根据核质比例还可以将这一时期分为s t a g e 认和s t a g ei b 两个时期。 皮层小泡期( s t a g ei i ) ，这一时期的标志是皮层小泡( 包含有蛋白质和糖类的滤 泡) 的出现，推测滤泡可能由卵母细胞本身产生。此阶段卵母细胞富集了大量蛋白 质和油脂( 图1 2 b ) ，这对于卵子激活和胚胎发育非常重要。这些结构在卵母细胞皮 层逐渐富集，最后在卵子激活之前通过胞外分泌释放出来( b e c k e ra n dh a r t ，1 9 9 6 ； 1 9 9 9 ) 。 卵黄生成期( s t a g ei i i ) 的卵母细胞中，卵黄| j 体蛋白和油脂继续富集( 图1 2c ) 。 卵黄蛋白的主要组分一卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ) ，由肝脏产生后通过卵母细胞的内 吞作用获得，然后进行蛋白水解分离，最后保存在卵母细胞中( w a l l a c e ，1 9 8 5 ) ，将 作为胚胎发育中所必需的营养补充。 卵母细胞的生长结束于成熟期( s t a g e i v ) ，其特征是卵母细胞核或g v 迁移到未 来胚胎动物极，核膜最后破裂以及第二次减数分裂中期的减数分裂阻滞( 图1 2 d ) 。 2 斑马鱼z - o t u 蛋白在卵子发生和胚胎发育早期的表达 成熟的卵母细胞被排出并运送到输卵管， s t a g e l s t a g ei i 成为能够受精的卵母细胞( s t a g ev ) 。 s t a g e s t a g e l 可 图1 2 斑马鱼卵子发生中的卵母细胞( h s i a oa n dt s a i ，2 0 0 3 ) f i g1 2t h eo o c y t e sd u r i n gz e b r a f i s ho o g e n e s i s ( h s i a oa n dt s a i ，2 0 0 3 ) 1 1 2 2 斑马鱼的精子发生 斑马鱼的精子发生开始于雄性生殖干细胞精原细胞( s p e r m a t o g o n i a ) 的有丝 分裂，雄性中的精原细胞的有丝分裂在成年后是持续发生的，因而能够不断产生大 量的精细胞。 在斑马鱼同一个精小叶中，精子发生是同步的，一个精小叶中仅仅包含精原细 胞或精母细胞或精子细胞( 如图1 3 ) 。随着精子细胞的成熟，精小叶相连的组织边 缘破裂，形成大面积的与输精管相连的成熟精子( b a u e ra n dg o e t z ，2 0 0 1 ) ( 如图1 3 a 和b 所示) 。 一气 i 一 + 愁委鬻 图1 3 斑马鱼精巢的组织学结构( b a u e ra n dg o e t z ，2 0 0 1 ) a ：斑马鱼精巢( 4 0 x ) 。b ：斑马鱼精巢( 6 0 x ) 。s g ，精原细胞；s c ，精母细胞； s t ，精细胞；s ，精子。 f i g1 3t h eh i s t o l o g i cs t r u c t u r eo f z e b r a f i s ht e s t i s ( b a u e ra n dg o e t z ，2 0 0 1 ) a ：z e b r a f i s ht e s t i s ( 4 0 x ) b ：z e b r a f i s ht e s t i s ( 6 0 x ) s g , s p e r m i o g o n i u m ； s c ，s p e r m a t o c y t e ；s t , s p e r m a t o o n ；s ，s p e r m 1 1 3 斑马鱼的受精作用 受精( f e r t i l i z a t i o n ) 是两性生殖细