（运动人体科学专业论文）不同时间中等强度运动对大鼠肝细胞凋亡的影响.pdf

摘要 目的：本研究通过比较不同时间中等强度运动后大鼠肝细胞凋亡、肝组 织糖原含量、n 0 含量及b c 卜2 与b a x 的表达，旨在探讨大鼠肝细胞凋亡与不 同时间中等强度运动之间的关系。 方法：将3 0 只1 0 周龄健康雄性s d 大鼠随机分为5 组，每组6 只：对 照组( c o n t r 0 1 ，c 不进行运动) ；中等强度运动组：运动2 0 m i n 组( t w e n t y m i n u t e se x e r c i s e ，t m e ) ；运动1 h 组( 0 n eh o u re x e r c i s e ，0 h e ) ；运动2 h 组( t w oh o u r se x e r c i s e ，t h e ) ；力竭运动组( e x h a u s t i n ge x e r c i s e ，e e ) 。 运动组2 4 只大鼠依据b e d f o r d 建立的大鼠运动模型方案进行运动：跑台坡 度为1 0 。，速度为1 9 3m m i n q ( 相当于7 6 v 0 。) 。按实验设计，所有大鼠 均在实施腹腔麻醉术后断头处死取肝脏组织，一部分肝组织用以测定大鼠肝 糖原含量和n 0 含量，另一部分制备肝组织石蜡切片，用以检测大鼠肝凋亡 细胞和b c l 一2 、b a x 的表达。 结果：( 1 ) 肝组织切片进行h e 染色显示，对照组和运动2 0 m i n 组大鼠 肝细胞结构完整，肝索清楚，核大，呈圆形；运动1 h 、2 h 组大鼠的肝细胞 结构逐渐变化，至力竭后可见大鼠肝细胞明显肿胀，间隙明显增大，核变小， 不规则，可见肝小叶轮廓改变等变化。 ( 2 ) t u n e l 染色切片显示，大鼠运动时间增加，肝凋亡细胞的阳染颗 粒逐渐增多。统计结果显示，对照组、运动2 0 m i n 、1 h 组间比较，肝细胞a i 均无统计学意义( p 0 0 5 ) ；运动2 h 、力竭组和对照组比较，具有高度显著 性差异( p 0 0 1 ) ；运动组间的运动1 h 、2 h 、力竭运动组之间两两比较存在 显著性差异( p 0 0 5 ) ；其余运动组与对照组比较均有高度显著性差异( p 0 0 5 ) ， 其余运动组间两两比较均具有高度显著性差异( p 0 0 5 ) ；运动2 h 、力竭组和对照组大鼠比较，均具有高度 显著性差异( p 0 0 1 ) ；运动组间1 h 、2 h 及力竭运动组大鼠之间两两比较， n 0 含量下降的差异均具有显著性( p 0 0 5 ) ，运动1 h 、力竭组间大鼠n 0 含 量差异高度显著( p 0 0 5 ) ；运动2 h 、力竭组和对照组比较，均具有高度显著性差异( p 0 0 1 ) ；运动组间的运动l h 、2 h 、力竭运动组之间两两比较均具有高度显 著性差异( p 0 0 5 ) ， 力竭运动组与其它组b a x b c l 一2 值比较，差异均具有显著性( p 0 0 5 ) 。 ( 6 ) 大鼠肝细胞凋亡指数与肝糖原含量、n 0 含量、b c 卜2 及b a x 的相 关性显示，肝细胞凋亡与肝糖原、n 0 含量之间均存在高度负相关( p o 0 1 ) ， 与b c 卜2 、b a x 的表达及b c 卜2 b a x 值之间均存在高度正相关( p o 0 5 ) c o n v e r s e l y ，a m o n gt h e e x e r c i s eg r o u p s ，t h e r ew a sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 )：w h e nc o m p a r e dt h er e s te x e r c i s eg r o u p sw i t ht h e c g r o u p ， w ec o u l d f o u n dt h e r ew a sa s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) w h e nt h er a t so ft h e0 h e ，t h ea n de eg r o u p sw e r e c o m p a r e dw i t he a c ho t h e r ，t h ed i f f e r e n c eo fn 0c o n t e n t sd r o p p i n gw a s r e m a r k a b l e ，t h ed i f f e r e n c eo fn oc o n t e n tb e t w e e nt h e0 h ea n de eg r o u d w a sh i g h l yr e m a r k a b l e ( p 0 0 5 ) t h e r ew a s a l s on oh i g h l ys i g n i f i c a n tm e a n i n ga m o n gt h ee x e r c i s eg r o u p s ( t h e 0 h e ，t h ea n de eg r o u p ) ( p 0 0 5 )。t h e r ew a sa s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew h e nt h ee eg r o u pw a sc o m p a r e dw i t ht h eo t h e r g r o u p si nb a x b c l 2v a l u e ( 6 ) t h er e l a t i o n sb e t w e e nh e p a t o c y t ea p o p t o s i sa n dt h e s ei t e m s s h o w e dt h a tt h e r ew a sah i g h l ys i g n i f i c a n tn e g a t i v ec o r r e l a t i o n b e t w e e na ia n dg l y c o g e n ，n 0c o n t e n ta n dah i g h l ys i g n i f i c a n tp o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e na 工a n db c l 一2 ，b a x ( p 0 0 1 ) c o n c l u s i o n ：( 1 ) 工th a d n o s i g n i f i c a n te f f e c t o nh e p a t o c y t e a p o p t o s i so fr a t sa f t e r2 0 m i no r1 hm i d d l ei n t e n s i t y e x e r c i s e ( 2 ) 2 hm i d d l ei n t e n s i t ye x e r c i s em a yc a u s eh e p a t o c y t ea p o p t o s l s o fr a t s ，a n dt h ea p o p t o t i cw a sm o r eo b v i o u sw h e nt h e ye x e r c i s e dt o e x h a u s t ( 3 ) t h eg l y c o g e na n dn o c o n t e n th a dn e g a t i v er e l a t i v i t yw i t h h e p a t o c y t ea p o p t o s i so fr a t s ( 4 ) b c l 2a n db a xp a r t i c i p a t e di nr e g u l a t i n gt h eh y p a t o c y t e s a p o p t o s i s ，a n dt h eb a l a n c er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et w o w e r ei m p o r t a n t f a c t o r si ft h e yw o u l dm a i n t a i no ri n d u c ea p o p t o s is k e yw o r d s ： e x e r c i s et i m e ， h e p a t o c y t e ， a p o p t o s i s ， 9 1 y c o g e n ，n 0 ， b c l 一2 。 b a x v 不同时间中等强度运动对人鼠肝细胞凋亡的影响 1 前言 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ，又称程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l l d e a t h ，p c d ) 。它是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程 序，有序的走向消亡的过程。细胞凋亡是保证多细胞生物个体正常发 育和维持正常生理过程中不可缺少的部分。当组织细胞凋亡异常( 过 高或过低) 时，可导致各种疾病的发生。有学者认为过多的肝细胞凋 亡实际上可能引起了炎症和坏死，有些凋亡的肝细胞可能引发活动旺 盛的嗜中性白细胞急剧增多，这可导致大量氧化原子团和蛋白水解酶 的释放，从而杀死成百上千的肝细胞n 3 ，因此阻止细胞凋亡可能是一 个新的控制炎症的途径。 目前有研究发现，增加实验对象或动物肝糖原含量能减轻肝细 胞一系列坏死性改变瞳1 ；汤礼军、田伏洲等的实验也表明，肝糖原含 量越高的肝组织，肝实质细胞凋亡数量越少1 。肝糖原是运动中能量 供应的重要储备物质，但运动过程中伴随着肝糖原的消耗，尤其运 动中肝脏长时间处于低糖原状态时对肝细胞凋亡是否有影响不是十 分清楚。 2 0 世纪8 0 年代，已有许多学者研究一氧化氮( n i t r i c0 x i d e ，n o ) 诱导细胞凋亡，但确切机制尚不清楚，最近有资料报道n 0 介导的细 胞凋亡可能与改变线粒体功能，调节b c 卜2 、b a x 、p 5 3 及p 2 1 等基因 的表达有关h 5 | ，但有关运动过程中n 0 的变化与肝细胞凋亡关系的报 道不多见，本课题对其作进一步研究则具有一定的意义。 b c l 2 ( bc e l l1 y m p h o m a 1 e u k e m i a2 ) 矛b a x ( b c l 2a s s o c i s t e d x ) 均为细胞凋亡的调控基因，在细胞凋亡发生中起重要作用。b c 卜2 主要存在于线粒体外膜的胞浆面，在内质网和核膜上也有分布，且具 有抑制多种因素诱导的细胞凋亡。b a x 常表达于易凋亡的细胞内并具 有促凋亡作用阳1 。b a x b c 卜2 比值是评价细胞凋亡的有用指标，即细 胞的凋亡或存活与它们表达的比例息息相关口1 ，如b c 卜2 相对于b a x 表达更多时促进细胞存活，反之促进细胞凋亡。有资料报道，肝细胞 的凋亡均伴随这两者表达水平的改变。1 0 1 。 硕士学位论文 近年来，有研究发现运动中肝细胞凋亡实际造成了肝损伤，并且 与运动强度1 列和运动时间有关n 叫密切相关。本课题采用不同时间 中等强度运动的大鼠运动模型，通过检测肝细胞凋亡及肝糖原含量、 n 0 含量、b c 卜2 、b a x 的表达，探讨肝细胞凋亡与不同时间中等强度 运动的关系，为进一步研究运动对人体肝细胞凋亡的影响提供一定的 实验基础。 不同时间中等强度运动对人鼠肝细胞凋亡的影响 2 实验对象与方法 2 1 实验对象与运动模型 2 1 1 实验对象及分组 1 0 周龄健康雄性s d ( s p r a g u ed a w l e y ) 大鼠3 0 只( 实验前均未 进行过运动) ，体重2 1 9 8 7 1 3 4 9 9 ，由中南大学湘雅医学院动物学 部提供，为i i 级实验动物。所有动物按国家标准啮齿类动物饲料分笼 饲养，每笼6 只，自由饮食。室温控制在2 2 2 4 之间，相对湿度为 4 5 一5 5 ，自然光照。 3 0 只大鼠随机分为五组，每组6 只( 参见图2 1 ) 。 对照组中等强度运动组 j 不作运动运动2 0 m i n 组运动1 h 组运动2 h 组力竭运动组 ( c ，n = 6 ) ( t m e ，n = 6 )( 0 h e ，n = 6 )( t h e ，n = 6 )( e e ，n = 6 ) 图2 1 大鼠分组情况 f i 9 2 1 t h eg r o u p so fr a t s 2 1 2 运动方案 实验中3 0 只大鼠均进行三天的适应性跑台运动( 速度为 1 0 m m i n ，时间为2 0 m i n ，坡度为0 。) ，休息两天后进行正式实验。 正式实验时，对照组大鼠不作跑台运动，运动组2 4 只大鼠依据 b e d f o r d 建立的大鼠运动模型方案进行运动n4 | ：跑台坡度为1 0 。，速 度为1 9 3m m i n l ( 相当于7 6 v 0 。一) 。运动时使用小木棍刺激大鼠 尾部，必要时采用一定的声音刺激或电刺激，使大鼠保持在跑道前 1 3 处，以保证运动强度。 2 1 3 力竭标准 运动后期，大鼠跑的动作较运动前期明显吃力，未能坚持原跑速， 跑的姿势由开始时的蹬地跑变为半卧位跑，腹部与跑道时有接触，甚 至为卧位跑，到运动末期，大鼠先后滞留跑道后1 3 处达3 次以上， 各种刺激驱赶均无效，停跑后体征表现为呼吸急促，神情倦怠，腹卧 硕士学位论文 位，对刺激反应迟钝，捕捉时，逃避反应较运动前减弱n 引。 2 2 实验仪器与试剂 2 2 1 主要仪器 ( 1 ) 全自动数显立式高压蒸汽灭菌器上海博迅医疗器械公司 ( 2 ) 8 2 0 轮转组织切片机美国a 0 公司 ( 3 ) 0 l y m p u sb x 5 2 显微照相图像采集系统日本奥林巴斯株式会社 ( 4 ) u v 一9 2 0 0 紫外可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司 ( 5 ) a e 2 6 0 s 电子分析天平梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 ( 6 ) s h h w 2 1 6 0 0 型三用电热恒温水箱天津市莱斯特仪器有限公司 ( 7 ) h h b s t 一1 a 型恒温培养箱长沙医疗器械公司 ( 8 ) t g l 一1 6 c 台式高速离心机湖南星科科学仪器设备有限公司 ( 9 ) s k 一1 快速混匀器江苏中大仪器厂 ( 1 0 ) p t 动物电动跑台浙江杭州立泰科技有限公司 ( 1 1 ) f j 一2 0 0 高速分散匀质机上海标本模型厂制造 ( 1 2 ) s 2 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂 ( 1 3 ) 微量移液器浙江华威医疗器械有限公司 ( 1 4 ) 恒温磁力搅拌器金坛医疗设备厂 ( 1 5 ) 普通高压锅浙江爱仕达 2 2 2 主要试剂 ( 1 ) t u n e l 标记细胞凋亡试剂盒：北京中杉金桥生物工程有限公司 ( 2 ) b c 卜2 、b a x 鼠单抗工g g ( i 抗) ：美国s a n t ac r u z 公司 ( 3 ) s a p 一9 1 0 2 工作液( i i 抗) ：北京中杉金桥生物工程有限公司 ( 4 ) 肝糖原测定试剂盒：南京建成生物工程有限公司 ( 5 ) n 0 测定试剂盒：南京建成生物工程有限公司 ( 6 ) 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程有限公司 ( 7 ) d a b 染色剂：北京中杉金桥生物工程有限公司 ( 8 ) 苏木素和伊红染色剂：中南大学湘雅医学院组胚实验室馈赠 ( 9 ) 树脂：中南大学湘雅医学院组胚实验室馈赠 ( 1 0 ) 多聚赖氨酸北京中杉金桥生物： 程有限公司 ( 1 1 ) t b s 液、枸橼酸盐组织抗原修复液： 北京中杉金桥生物工程有限公司 不同时间中等强度运动对人鼠肝细胞凋亡的影响 ( 1 2 ) 甲醇，无水乙醇，9 5 乙醇，甲醇，冰醋酸，3 0 h ：0 ：，二甲苯， 磷酸氢二钠，氯化钠，磷酸二氢钾，多聚甲醛，浓硫酸等产白上海化 学试剂厂和湖南师范大学化学试剂厂；生理盐水产自湖南科伦制药。 2 3 标本制备 实验中3 0 只大鼠均在运动后即刻实施腹腔麻醉术后断头处死， 仰卧位固定于手术台上，剪开腹壁，小心切取肝脏左侧叶组织( 除边 沿部分) 。 2 3 1 肝糖原测定的样本制备 取新鲜组织用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，准确称取其重( 样本 重量：7 8 3 2 9 5 6 m g ) 后，按样本重量( m g ) 碱液体积( ) 比为 1 ：3 一起加入试管中，沸水浴煮2 0 m i n ，流水冷却，然后再以肝脏重 量的9 6 倍加蒸馏水( “1 ) 将糖原水解液进一步制备成糖原检测液待 测。 2 3 2 肝脏蛋白含量测定的样本制备 取新鲜组织用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，准确称取其重量( 样 本重量：5 1 3 7 1 0 9 3 m g ) ，按重量体积比1 ：9 加冰生理盐水制备成 1 0 的组织匀浆，2 0 0 0 转m i n l 离心1 0 m i n ，然后取上清再用生理盐 水按1 ：9 稀释成1 ，待测。 2 3 3n 0 含量测定的样本制备 取新鲜组织用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，准确称取其重量( 样 本重量：2 1 3 4 2 1 0 6 1 m g ) ，按重量体积比为1 ：9 加冰生理盐水制 备成1 0 的组织匀浆，然后1 0 0 0 转m i n l 离心5 m i n ，取上清待测。 2 3 4 切片组织制备：新鲜组织按照长宽高为5 m m 、3 m 、5 m m 的标准 取样，置于4 的多聚甲醛磷酸缓冲液( o 1 m ，p h = 7 4 ) 中固定1 2 1 3 h 后进行常规石蜡包埋，旋转切片机连续切片，每张厚5um ，6 0 0 c 烘 烤2 3 h 后置于4 冰箱保存待测。 2 4 指标测定 2 4 1 生化指标的测定 2 4 1 1 肝糖原含量 采用葸酮比色法测定大鼠肝糖原的含量。待测糖原和标准葡萄糖 溶液在浓硫酸的作用下可脱水生成糖衍生物，后者再与葸酮作用形成 硕士学位论文 蓝色化合物，然后将待测糖原液和标准葡萄糖溶液进行比色定量。通 过分光光度计以6 2 0 n m 波长，1 c m 光径测定吸光度值可计算出肝糖原 的含量。具体操作按照试剂盒说明书进行，计算公式为： 糖原含量( m g g 1 ) = ( 测定管吸光度标准管吸光度1 ) 标准 管含量( 0 0 1 m g ) 样本测试前稀释倍数1 0 1 1 1 。1 2 4 1 2 肝脏蛋白含量的测定 采用考马斯亮兰法测定肝组织蛋白含量。蛋白质分子具有一n h 。+ 基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白质标准液或样品中时， 考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白质一n h 。+ 结合，使溶液变为蓝色，通 过分管光度计以5 9 5 n m ，1 c m 光径测定吸光度值可计算出蛋白含量。 具体操作按照试剂盒说明书进行，计算公式为： 蛋白含量( g l 。) = ( 测定管吸光度标准管吸光度。1 ) 标准管浓度 2 4 1 3n o 含量的测定 采用硝酸还原酶法测定肝脏内n o 的含量。n o 化学性质活泼，在 体内代谢很快转为n 0 一：和n o 一。，而n 0 一：又进一步转化为n 0 一。，本法利 用硝酸还原酶特异性将n 0 一。还原为n 0 一：，以显色深浅测定其浓度的高 低。通过分光光度计以5 5 0 n m ，0 5 c m 光径测定吸光度值可计算出n 0 的含量。具体操作按照试剂盒说明书进行，计算公式为： n 0 含量( 啪o l g p r o t l 8 ) 一( 测定管吸光度一空白管吸光度) ( 标 准管吸光度一空白管吸光度) 一标准品浓度( 2 0 m 0 1 l 。1 ) 样本的 蛋白含量。1 ( g p r o t l - 1 ) 注：+ ：m 0 1 g p r o t 一1 为微摩尔克蛋白一1 2 4 2 细胞凋亡检测 2 4 2 1h e 染色 组织切片常规脱蜡水化后用h e 染色法进行染色，胞核染成蓝色， 胞质染成红色，光镜下观察肝细胞的整体结构。染色操作过程如下： ( 1 ) 常规脱腊水化，双蒸水浸洗5 m i n ； ( 2 ) 苏木素染色1 0 15 m in ，双蒸水浸洗5 m i n 3 次； ( 3 ) 盐酸酒精分色1 0 2 0 m i n ，双蒸水浸洗5 m i n ； ( 4 ) 伊红染色3 m i n ； ( 5 ) 梯度酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片、镜检。 不同时间中等强度运动对大鼠肝细胞凋亡的影响 2 4 2 2 原位细胞凋亡检测 检测细胞凋亡的方法有数种。细胞凋亡过程中核酸内切酶的活化 导致核d n a 被裂解成寡核苷酸大小的片段，从而产生双链、低分子量 的d n a 片段和高分子量的单链d n a 断端( 缺口) ，这些d n a 链缺口可 利用d n a 聚合酶和末端脱氧核糖核酸转移酶( t d t ) 用来标记d n a 链 断裂端的核酸，这种应用t d t 进行的末端反应又称为脱氧核糖核苷酸 末端转移酶介导的缺口末端标记技术( t e r m i n a 卜d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s em e d i a t e dn i c ke n d1 a b e l i n g ，t u n e l ) 。按原位细且包凋 亡检测试剂盒( i ns i t uc e l ld e a t hd e t e c t i o nk i t ，p o d ) 说明书 操作，其操作步骤如下： ( 1 ) 常规脱蜡水化，双蒸水浸洗3 m i n 2 次，p b s 洗5 m i n 2 次； ( 2 ) 抗原修复：用0 1 mp h 6 0 的枸橼酸盐缓冲液进行高压抗原修复， 自然降温后，p b s 浸洗5 m i n 5 次； ( 3 ) 内源性过氧化物酶的阻断：新鲜配制3 h ：0 ：甲醇溶液( 8 0 甲醇 9 0 m l + 3 0 h ：0 。1 0 m 1 ) 滴加在切片上，室温静置2 0 m i n ，以阻断内源性 过氧化物酶的活性，p b s 浸洗5 m i n 5 次； ( 4 ) 标记：每片滴加5 0ul 的t u n e l 反应混合溶液，在湿盒中3 7 孵育6 0 m i n ，p b s 浸洗5 m i n 5 次； ( 5 ) 信号转化和分析：每片加入5 0 u 1 转化剂一p o d ，在湿盒中3 7 孵育6 0 m i n ，p b s 浸洗5 m i n 5 次； ( 6 ) 显色：d a b 显色5 1 0 m i n ，显微镜下掌握染色程度，自来水洗 1 0 m i n ： ( 7 ) 复染：苏木素复染2 m i n ，盐酸酒精分色，自来水水洗1 0 一1 5 m i n ； ( 8 ) 梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。 阴性对照：经过修复和阻断的切片加入5 0ul 仅含有核苷酸混 合液的反应液代替t u n e l 反应混合物，标记步骤以下同上。 阳性对照：经过修复和阻断的切片用细球菌的核酸酶或d n a s e i 使之产生d n a 链缺口，标记步骤以下同上。 2 4 3b cl _ 2 、b a x 表达的测定：免疫组织化学法 利用特异性一级抗体与肝脏组织中b c 卜2 、b a x 抗原结合，一抗 再与生物素标记的第二级抗体结合，生物素标记的二抗，再通过生物 硕士学位论文 素与抗生素蛋白的亲和力使生物素标记的第二级抗体与抗生素蛋白一 生物素一过氧化物复合体结合，d a b 使生成的抗原抗体复合物染成棕 黄色或棕褐色。具体步骤如下： ( 1 ) 常规脱蜡水化，双蒸水洗2 次3 m i n ，p b s 洗2 次5 m i n ； ( 2 ) 抗原修复：用0 1 mp h 6 0 的枸橼酸盐缓冲液进行高压抗原修复， 自然降温后，p b s 洗5 次5 m i n ； ( 3 ) 内源性过氧化物酶的阻断：新鲜配制3 h ：0 ：甲醇溶液( 8 0 甲醇 9 0 m 1 + 3 0 h ：o ：1 0 m 1 ) 滴加在切片上，室温静置2 0 m i n ，以阻断内源性 过氧化物酶的活性，p b s 洗5 次5 m i n ； ( 4 ) i 抗标记：每片滴加i 抗工作液( i 抗：p b s = 1 ：5 0 ) 5 0ul ，4 冰箱过夜。 ( 5 ) 复温：3 7 湿盒中复温4 5 6 0 m i n ，p b s 洗5 次5 m i n ； ( 6 ) i i 抗标记：每片滴加生物素化的i i 抗4 0 5 0pl ，湿盒中3 7 孵 育6 0 m i n ，p b s 洗5 次5 m i n ； ( 7 ) 显色：d a b 显色5 一1 0 m i n ，显微镜下掌握染色程度，自来水洗 1 0 m i n ： ( 8 ) 复染：苏木精复染2 m i n ，盐酸酒精分色，自来水洗1 0 1 5 m i n ； ( 9 ) 梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。 阴性对照：以p b s 缓冲液代替i 抗，其余步骤同上。 阳性对照：以其公司提供的已知阳性的b c 卜2 、b a x 扁桃体组织 切片同法制作阳性对照片。 2 4 4 结果判定 所有切片均采用0 l y m p u sb x 5 2 显微照相图像采集系统进行拍片， 以s i m p l ep c i 显微图像分析软件进行分析。 2 4 4 1 原位细胞凋亡 在普通光学显微镜下观察，阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色 或棕褐色着染，部分胞浆也可因胞核d n a 碎片溢出而呈阳性着染；正 常细胞核和阴性对照细胞核被苏木素复染成蓝色，核相对较大，形态 大小致。可根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞：( 1 ) 单个 散在分布；( 2 ) 具有凋亡的核形态；( 3 ) 周围无炎症反应。对于缺乏 凋亡核形态的阳性细胞，除非染色强度与背景有鲜明对比，且呈单个 不同时间中等强度运动对火鼠肝细胞凋亡的影响 分布，否则不认为是凋亡细胞。光学显微镜( 4 0 0 ) 下每张切片随 机观察6 个视野，每个视野至少5 0 0 个细胞水平。以s i m p l ep c i 显 微图像分析软件测试每1 0 0 个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，计算平 均凋亡细胞数，即凋亡指数( a p o p t o s i si n d e x ，a i ) ，此外每组发生 了肝细胞凋亡的大鼠占组内总只数的百分比用凋亡发生率( ) 表示。 2 4 4 2b c1 2 、b a x 的表达 此两种蛋白的表达产物呈棕黄色或棕褐色颗粒状，位于胞浆，偶 见胞膜( 或) 核膜，细胞核被苏木素复染成蓝色。在光学显微镜( 4 0 0 ) 下每张切片随机观察6 个视野，以s i m p l ep c i 图像分析软件测 试阳性细胞表达所占面积和阳性灰度以及所测细胞的平均灰度。 b c 卜2 h 和b a x 的表达用阳性单位( p o s i t i v eu n i t ，p u ) 表示。计算 公式为：p u = l 平均灰度一阳性灰度| ( 卜( 阳性面积总面积。1 ) 2 5 6 ) 1 0 0 16 | 。 2 5 质量控制 实验中所用玻璃仪器先全部用洗涤液刷洗后，用重铬酸钾洗液浸 泡2 4 小时以上，清水冲洗后，再用蒸馏水润洗3 次。 免疫组织化学法测定b c 卜2 和b a x 的主要实验步骤的掌握：一 抗浓度：同一组肝组织切片分别以一抗p b s 比为1 ：2 0 ，1 ：5 0 ，1 ：l o o ， 1 ：2 0 0 不同浓度的工作液孵育，观察染色结果直到找出最佳浓度； 二抗孵育时间：同一组肝组织切片在滴加二抗后的孵育时间分别以 3 0 m i n ，4 5 m i n ，6 0 m i n ，找出最佳二抗的孵育时间；高压抗原修复 时间：同一组肝组织切片放置于高压锅内修复时间分别为：2 m i n ， 5 m i n ，8 m i n ，找出最佳高压修复时间；d a b 染色时在显微镜下观察 染色情况，控制染色时间，以避免背景着色或着色太浅。在当次免疫 组化实验过程中，仅改变一种实验步骤以便找出其最佳实验条件，其 它操作步骤均不能改变。 本次实验中各指标都是及时测定，每份样品测两次( 除检测细胞 凋亡的t u n e l 实验) ，相对误差必须小于2 0 ，否则重测，且每次测 试所需试剂须新鲜配制。 运动时使用声音刺激及小木棍刺激大鼠尾部，必要时采用一定的 电刺激，使动物保持在跑道前1 3 处，以保证运动强度。 硕士学位论文 2 6 统计学分析 所有实验数据均应用s p s s l l 0 统计软件包进行分析，以平均数 标准差( j s ) 表示( 凋亡发生率除外) ，采用单侧t 检验和双侧 相关性分析，在满足方差齐性要求时，使用l s d 法 ( l e a s t s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，最小显著差值法) 和s n k 法 ( s t u d e n t n e u m a n k e u l s ) 进行多重比较，若不满足方差齐性要求，则 采用d u n n e t t st 3 方法进行多重比较，p 0 0 5 ) ；运动2 h 、 力竭组与对照组比较，具有高度显著性差异( p 0 0 1 ) ；运动组间的 运动1 h 、2 h 、力竭组之间两两比较存在高度显著性差异( p o 0 5 ) ，b u ta m o n gt h e l a s tt h r e e e x e r c i s eg r o u p s ， t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t( p 0 0 1 ) 注：+ 代表o h e 组分别与c 、t m e 两组比较，。p 0 0 5 ， p 0 0 1 8 代表t h e 组分别与c 、t m e 两组比较，8 p 0 0 5 ，删p o 0 1 代表e e 组分别与c 、t m e 两组比较， p 0 0 5 ，p 0 0 1 代表t h e 组与o h e 组比较， p o 0 5 ，66 p o 0 1 口代表e e 组与o h e 组比较， 口p 0 0 5 ，u u p o 0 1 。代表e e 组与t h e 组比较， 。p o 0 5 ，。p 0 0 5 ) ；其余运动组与对照组 比较均有高度显著性差异( p 0 0 5 ) ，其余运动组问两两 1 2 比较均具有高度显著性差异( p o 0 5 ) ，b u ta m o n gt h e l a s tt h r e e e x e r c i s eg r o u p s ， t h ed i f f e r e n c eh a das t a t i s t i c sm e a n i n g ( p 0 0 5 ) ；运动2 h 、力竭组分别和对照组比较，具有高度显著性差异( p 0 0 1 ) ；运动组间运动1 h 、2 h 及力竭组间两两比较，大鼠肝组织 n 0 含量下降的差异均具有显著性( p 0 0 5 ) ，运动1 h 和力竭组间大 鼠肝组织n 0 含量差异高度显著( p 0 0