（植物学专业论文）百合花粉管中类细胞质力蛋白中间链的研究.pdf

摘要 细胞质力蛋白在动物和低等植物细胞中不仅参与细胞内细胞器和靶分子等的运输。还参与高 尔基体等细胞器的组装和定位。近来的研究表明在高等植物细胞中存在细胞质力蛋白的重链和轻 链。但力蛋白中间链在高等植物细胞中还未见报道。 通过s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹发现抗鸡脑细胞质力蛋白中间链单克隆抗体在 百合花粉及花粉管丙酮粉中6 7k d a 处有免疫交叉反应。 免疫荧光标记及激光共聚焦扫描显微镜观察发现，类细胞质力蛋白中间链在百合花粉管中存 在于颗粒状细胞器上；免疫荧光双标及激光共聚焦扫描显微镜观察发现，百合花粉管中类细胞质 力蛋白中间链和微管存在部分共分布。对分离纯化的百合花粉及花粉管中高尔基体组分进行 s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹发现，抗鸡脑细胞质力蛋白中间链单克隆抗体在6 7k d a 处 有较强的免疫交叉反应：进而通过免疫金标结合电子显微镜观察发现，大多数类细胞质力蛋白中 间链存在于高尔基体附近的囊泡膜上；统计结果表明类细胞质力蛋白中间链在顺面和反面高尔 基体附近囊泡膜上的分布机率大致相等。 用b f a 处理百合花粉管后，通过免疫荧光标记及激光共聚焦扫描显微镜观察发现类细胞质力 蛋白中间链对b f a 不敏感；同样的处理发现类红膜肽对b f a 敏感。 以上的结果表明类细胞质力蛋白中间链存在于百合花粉及花粉管中，并且在百合花粉管中顺 面和反面高尔基体附近的囊泡膜上均有分布。 关键词：细胞质力蛋白中间链，力蛋白复合体，高尔基体，花粉管川百合 a b s t r a c t i na n i m a la n dl o w e rp l a n tc e l l s ，c y t o p l a s m i cd y n e i ni n v o l v e di nn o to n l yt r a f f i c k i n go fs u b c e l l u l a r o r g a n e l l e sa n dt a r g e tm o l e c u l e s ，b u t a l s o o r g a n i z i n ga n dp o s i t i o n i n go fo r g a n d i e s s u c ha sg o l g i a p p a r a t u s r e c e n ts t u d i e sh a v ei n d i c a t e d t h ee x i s t e n c eo fd y n e i nh e a v yc h a i na n dl i g h tc h a i ni nh i g h e r p l a n t s ，b u tn o d a t aa b o u td y n e i ni n t e r m e d i a t ec h a i ni nh i g h e rp l a n t sh a v eb e e nr e p o r t e d b ys d s p a g ea n di m m u n e - b l o t t i n g ，w ef o u n dt h a t am o n o c l o n a la n t i b o d yo fa n t i - c h i c kb r a i n c y t o p l a s m i cd y n e i n i n t e r m e d i a t ec h a i na n t i b o d yc o u l dr e a c tw i t hc y t o p l a s m i cd y n e i ni n t e r m e d i a t e c h a i n 1 i k ep r o t e i na t6 7k d ai nl i l yp o l l e n u n d e rc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p ya f t e ri m m u n o f l u r e s c e n c el a b e l i n g ，w ef o u n dt h a tt h e d y n e i n i n t e r m e d i a t ec h a i n - l i k e p r o t e i na p p e a r e dp u n c t a t e d a n dw a sc o l o c a l i z a t i o n p a r t l y w i t h m i c r o t u b u l e si nc y t o p l a s mo fl i l yp o l l e nt u b e b ys d s p a g ea n di m m u n e b l o t t i n g ，t h em o n o c l o n a l a n t i b o d yo f a n t i c h i c kb r a i nc y t o p l a s m i cd y n e i ni n t e r m e d i a t ec h a i nc o u l dr e c o g n i z et h e6 7k d ap r o t e i n i np u r i f i e d g o l g ia p p a r a t u sf r a c t i o n f r o m l i l yp o l l e n s u b s e q u e n t l yb yi m m u n e - g o l dl a b e l i n g a n d t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ，w ef o u n dt h a tt h e d y n e i ni n t e r m e d i a t ec h a i n l i k ep r o t e i nb o u n d m a i n l yt o t h em e m b r a n e so fg o l g i - a s s o c i a t e dv e s i c l e s s t a t i s t i c s a n a l y s i s o fd y n e i ni n t e r m e d i a t e c h a i n - l i k ep r o t e i no ng o l g i - a s s o c i a t e dv e s c i l e ss h o w e dt h en e a r l ye q u a lc h a n c eo f d i s t r i b u t i o no ne i t h e r c i s o rt r a n s - g o l g i - a s s o c i a t e dv e s c i l e s a 舶rt r e a t m e n tw i t hb f a i m m u n o f l u r e s c e n c el a b e l i n ga n dc o n f o c a | l a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y i n d i c a t e dt h a tt h ec y t o p l a s m i cd y n e i ni n t e r m e d i a t ec h a i n l i k ep r o t e i ni nl i l yp o l l e nt u b ew a si n s e n s i t i v e t ob f a t r e a t i n g , b u ts p e c t r i n l i k ep r o t e i nw a s s e n s i t i v et oi tu n d e rt h es a m ec o n d i t i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ec y t o p l a s m i cd y n e i ni n t e r m e d i a t ec h a i n - l i k e p r o t e i ne x i s t s i n l i l y p o l l e n ，a n di td i s t r i b u t e sm a i n l yo ne i t h e rc i s - a n d t r a n s - g o l g i a s s o c i a t e dv e s c i l e s k e yw o r d s ：c y t o p l a s m i cd y n e i ni n t e r m e d i a t ec h a i n ，d y n e i nc o m p l e x ，g o l g ia p p a r a t u s ，p o l l e nt u b e ， l i l i u md a v i d i id u c h 独创性声明 y 6 5 9 167 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：重、丑闺 时间： a p ，4 年6 月。f 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 6 - ，1 研究生签名：立，卫到f - i n ：知4 年6 月f 日 导师签铷身弧时陬押斗年6 月3 ，闩 缩写表 a r f l a d p 一曲o s y l a t i o nf a c t o r1 a r p l a c t i n - r e l a t e dp r o t e i n1 b c i p 5 - b r o m o - - 4 - e h l o r o 3 一i n k o l y lp h o s p h a t e b f ab r e f e l d i na b s a b o v i n es e r u ma l b u m i n c d c y t o p l a s m i cd y n e i n d h c d y n e i nh e a v yc h a i n f i t c f l u o r e s c a i n i s o t h i o c y a n a t e g e f g t p - e x c h a n g ef a c t o r s l i c l i g h ti n t e r m e d i a t ec h a i n l c l i g h tc h a i n n c n i t r o c e l l u l o s e n b t n i t r ob l u et e t r a z o l i u m p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p b s p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n p i p e s p i p e r a z i n e - n ，n - b i s ( 2 - e t h a n e s u l f o n i ca c i d ) s d s s o d i u m d o d e y ls u l f a t e t r i s e t r l h y d r o x y m e t h y la r n i n o m e t h a n e v 腺苷二磷酸核糖基化因子l 肌动蛋白相关蛋白1 5 溴- 4 - 氯一3 一吲哚磷酸盐 布雷菲尔德菌素 牛血清清蛋白 细胞质力蛋白 力蛋白重链 异硫氰酸荧光素 鸟苷三磷酸交换因子 轻中间链 轻链 硝化纤维素 氮蓝四唑 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 哌嗪一氮氨双( 2 一乙磺酸) 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷 第一章文献综述 1 1 力蛋白概述 力蛋白最初是在鞭毛轴丝中作为a t p 酶鉴定出来的( g i b b o n s & r o n e ，1 9 6 5 ) 。2 0 年后从脑组 织中把细胞质力蛋白分离出来并确定细胞质力蛋白是马达分子担负着沿微管负极方向的运输 ( p a s c h a l v a l l e e 1 9 8 7 ) 。 力蛋白大致上分为三类：轴丝内臂力蛋白、轴丝外臂力蛋白和细胞质力蛋白。轴丝内外臂力 蛋白存在于鞭毛和纤毛轴丝中的外周双联体微管上，通过二者的协同作用产生特殊的鞭毛波从而 推动细胞移动( m i t c h e l l ，1 9 9 4 ；w i t m a n ，1 9 9 4 ) 。细胞质力蛋白位于细胞质内，它又可细分为两类： 细胞质力蛋白i ( c d i ) 和细胞质力蛋白2 ( c d 2 ) ，前者含有细胞质力蛋白重链i ( d h c l ) 。是最早发 现的经典的细胞质力蛋白( p a s c h a la n dv a l l e e ，1 9 8 7 ) 。它参与细胞内一系列运动过程例如有丝分 裂，商尔基形态的维持以及膜囊泡和其它细胞内颗粒的运输等( h o l z b a u re ta 1 1 9 9 4 ) ；后者含有 细胞质力蛋白重链2 ，是近几年发现的较小的细胞质力蛋白，由重链2 ( d h c 2 ) 和轻中问链3 ( l i c 3 或d 2 l i c ，约3 3 k d a ) 组成。主要存在于低等真核生物的鞭毛和纤毛中以及脊椎动物细胞的高尔 基体上，分别参与鞭毛和纤毛组装所需物质的运输以及高尔基体的定位( g i b b o n se ta 1 1 9 9 4 ： v a i s b e r ge ta l ，1 9 9 6 ；p a z o u re ta l ，1 9 9 9 ；p o r t e re ta l ，1 9 9 9 ；w i k se ta l ，2 0 0 0 ；m i k a m iae ta l ，2 0 0 2 ) 。 在形态学上，轴丝力蛋白和细胞质力蛋白是相似的都是一个巨大的分子马达复合体( 约 1 - - 2 m d a ) 。由i 一3 个重链多肽( 4 7 1 - - 5 4 0k d a ) ，一定数揖的中间链( 5 7 1 4 0k d a ) 和轻链( 6 2 2 k d a ) 组成( 见图1 i ) 。 i i ll - l 一般的两头型力蛋白结构模型并标出常见的结构和功能位点区域( k i n 昏2 0 0 0 ) f i g u r e l _ l m o d e lo f a g e n c r i c t w o h e a d e d d y n c i np a r t i c l e i n d i c a t i n g t h e g o n e m i i o c a t i b no f v a r i o u ss t r u c i u r a ia n d f u n c t i o n a ld o m a i n s ( k i n g , , 2 0 0 0 ) 1 1 1 力蛋白重链 力蛋自重链即力蛋白的马达单何如l 鳘| 1 所示，其n 端区域( 约1 6 0 k d a ) 形成一杆状结构 与其它的重链和力蛋白的其它成分相连接。其c 端序列( 约3 5 0k d a ) 划构成一球状头部，该结 构包括一个高度保守的中央片段区即4 个核苷酸结合结构域( b i n d i n gm o t i f ) ( p l - - p 4 ) 其中p l 是a t p 永解位点。力蛋白的微管结含区被认为是位于从球状头部突出来的细杆状结构的顶部( g e e e la i 1 9 9 7 ；k o o n c e 。1 9 9 7 ) 。此细杆状结构是由其c 端p 4 环的两个卷曲螺旋( c o i l e dc o i l ) 以反向 平行方式排列形成的。 目前在兔、老鼠、盘基网柄菌、曲霉和酵母中的研究表明只存在一个细胞质力蛋白重链基因 ( k o o n c ee ta 1 ，1 9 9 2 ：m i k a m ie ta l ，1 9 9 3 ；x i a n ge ta i ，1 9 9 4 ；l ie t a l ，1 9 9 3 ；e s c h e | e t a l ，1 9 9 3 ) ，但每 个生物体却有多个轴丝力蛋白重链基因。g i b b o n s 等人通过用能与重链最保守区段相匹配的序列 作为探针对力蛋白进行筛选，分别在海胆、草履虫、农藻和果蝇中筛选出了许多e d n a 序列 ( g i b b o n se la l ，1 9 9 4 ；a s a ie la l ，1 9 9 4 ；w i l k e r s o ne la l ，1 9 9 4 ；r a s m u s s o ne ta l ，1 9 9 4 ) 。对衣藻进行传 统的遗传分析。鉴定出了大量有关鞭毛功能的遗传位点，这些位点突变则影响了鞭毛的活动能力。 其中鞭毛力蛋白的、p 和7 重链分别定位在o d a l l 、o d a 4 和0 d a 2 上( s a k a k i b a r a t e ea l ，1 9 9 1 ；k a m i y a , 1 9 8 8 ；w i l k e r s o ne t a l 1 9 9 4 ) 。许多生物体组织器官中存在着多个力蛋白重链基因，并表达了许多 力蛋白重链的异形体( r e v i e w e di na s a i ，1 9 9 6 ) 。在轴丝力蛋白中，现在普遍认为轴丝是由约1 2 个 重链异形体特异组合产生不同的推动力来形成纤毛的振动波( r e v i e w e di na s a ia n db r o k a w , 1 9 9 3 ； b r o k a w , 1 9 9 4 ) 。同样在细胞质力蛋白中也存在着许多力蛋白重链的异形体，比如在h e l a 细胞和兔 的精巢中分别发现了3 个和4 个不同的重链异形体( v a i s b e r ge la 1 1 9 9 6 ；c r i s w e l a n da s a i 1 9 9 8 ) 。 现在研究最多的是细胞质力蛋白重链l ( d c h l ) 。其次是细胞质力蛋白重链2 ( d c h 2 ) 。细胞质力 蛋白重链l 是在细胞质中表达的经典力蛋白重链它不仅参与细胞内动粒、内体、溶酶体和病毒 等的运输，还参与高尔基体与溶酶体的核用定位及有丝分裂纺锤体的纽装和定向( r e v i e w e di n h i r o k a w a , 1 9 9 8 ) 。细胞质力蚩白重链2 现已在一些细胞和组织中发现( v a i s b e r g e t a l ，1 9 9 6 ； c f i s w e l la n da s a i ，1 9 9 8 ) 。在具纤毛的上皮细胞和不具纤毛的哺乳动物细胞中，此重链分别存在于 顶端的细胞质中( c r i s w e l le ta 1 1 9 9 6 ) 和商尔基体上( v a i s b e r ge la l ，1 9 9 6 ) 。在衣藻莆lc a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s 中细胞质力蛋白重链2 分别参与鞭毛和纤毛组装所需物质的运输( p a z o u re ta l ，1 9 9 9 ： p o r t e re la l ，1 9 9 9 ；w i k se ta l ，2 0 0 0 ：1 。 1 1 2 力蛋白中间链 1 9 7 9 年b e l l 等人从海胆中鉴定出了三种力蛋白中问链：1 2 2 、9 0 和7 6k d a ( b e l le ta i 1 9 7 9 ) ， 随后在许多生物体中发现了外臂力蛋白、内臂力蛋白和细胞质力蛋白中间链的各种多肽f p f i s t e r e la l ，1 9 8 2 ；g a t t ie ta l ，1 9 8 9 ；p a s c h a le la l ，1 9 8 7 b ；c o l l i n s & v a l l e e ，1 9 8 9 ) 。1 9 8 6 年w i l l i a m s 等川单允 隆抗体作探针对衣藻的表达文库进行筛选得到了农藻力蚩向中间链7 0 k 叫l c 7 0 】的基f ( 1 绗克隆 ( w i l l i a m se t a l ，1 9 8 6 ) 。1 9 9 2 年针对延伸的氮基酸序列设计的寡核茁酸探针，筛选得刘了兔的细胞 质力蛋白中问链7 4k d a 多肽的e d n a 序列( p a s c h a le la 1 1 9 9 2 ) 。 通过对衣藻力蛋白中间链( 7 0 和7 8k d a ) 与兔的细胞质力蛋向中间链( 7 4k d a ) 进行同源性 比较。发现存在2 3 9 的同一性和4 7 5 的相似性( p a s c h a lc ta l ，1 9 9 2 ) ，并且其相似性部分均位于 序列c 端，茹n 端都存在很犬的差异。 哺乳动物中有两个力蛋白中间链基因g e n e l 和g e n e 2 ( v a u g h a n e la l ，1 9 9 5 ) 。每个基因在蛋 白质n 端相似部位存在着两个选择性的剪切位点，其五种剪切产物m r n a 分别源于g e n e l a ， g e n e l b g e n e 2 a ，g e n e 2 b ，g e n e 2 c ( p f i s t e re l a l ，1 9 9 6 ) 。由于同一个力蛋白中间链的异形体具有相 似的分子量，因此只有双相电泳才能将它们分辨出来( d i l l m a nj f , 1 9 9 4 ) a 研究发现在中间链碳端的保守序列区含有六个w d ( 即色氨酸和天冬氨酸) 区域，这使得中间链成 为w d r e p e a t 蛋自家族的一员( w i l k c r s o nc g ，1 9 9 5 ) 。这些区域形成一个b 螺旋结构，可能参与 一些对力蛋白复合体很重要的蛋白质互作( n e e re j ，1 9 9 4 ；s m i t ht f , 1 9 9 9 ) ，比如与力蛋白重链的 连接等( p a s c h a le la l ，1 9 9 2 ) 。相反，中间链n 端的可变区域则可能提供其功能上的特异性。这一 区域可能参与将内臂力蛋白和外臂力蛋白特异地连接到轴丝结构中外周双联微管a _ 纤维的不同 位点上也可能参与将细胞质力蛋白有选择性地连接到膜质细胞器或动粒上( h o l z b a u re l fe ta l ， 1 9 9 4 ) 。另外研究还发现力蛋白中间链在不同的细胞系、不同的组织，甚至在不同的发育时期都有 着不同的表达形式( v a u g h a nk t 1 9 9 5 ；p f i s t e rk k1 9 9 6 ；p f i s t e rk k ，1 9 9 6 ) 。 1 1 3 力蛋白轻链 相对重链和中间链而言，人们对轻链的了解还较少。在力蛋白复合体的底部并和中间链相连 的至少有三类轻链蛋白家族：高度保守的轻链8 ( l c 8 ) 蛋白家族、t c t e x l t c t e x 2 蛋自家族和 r o a d b l o c k l c 7 蛋白家族。 1 1 3 1 轻链8 ( l c 8 ) 蛋自家族 轻链8 蛋白最初是在衣藻中作为外臂力蛋白的一个组成部分被鉴定山来的( p i p e m oe la l ， 1 9 7 9 ；p f i s t e r e t a l 。1 9 8 2 ) 。对轻链8 蛋白进行分子克隆以及对源于哺乳动物、线虫和植物的“表达 序列标签s t ) 数据库进行检测发现了一组极为保守的蛋白质序列这些序列与衣藻轻链8 蛋白 有着9 3 的序列同一性( k i n ge la l ，】9 9 5 ) 。随后的生化研究表明轻链8 蛋白不仅是脑中细胞质力 蛋白的组成成份，同时也是肌球蛋白v ( m y o s i n v ) 的一个组成成份( k i n g e ta l ，1 9 9 6 ：b e n a s h s k ie ta l 1 9 9 7 ) 。通过酵母戏杂交系统筛选得到了另外一些与轻链8 蛋白赢接相连的蛋白，这些蛋白包括神 经元的一氧化氮合成酶( 即n n o s 在这里轻链8 蛋白也被称为p i n ) ( j a f f r c y e la l ，1 9 9 6 ；l i a n g e t a l ， 1 9 9 9 ；r o d r i g u e z - c r e s p o e t a l ，1 9 9 8 ) 、i k b a 蛋白( 即病毒侵染莆睃症反应中细胞转录因子n f k b r e l 的阻抑蛋白) ( c r e p i e u x e la l ，1 9 9 7 ；p a s c h a l e la l ，1 9 9 7 ) 、b c l 2 家族成员的b i m 蛋白( 即细胞程序化 死亡的启动因子) ( p u t h a l a k a t he ta l ，1 9 9 9 ；d a ye la l ，2 0 0 4 ) 、聚蝇中b i c o i dm r n a 的定位蛋白s w a i t o w ( s c h n o r r e r , 2 0 0 0 ) 以及突触后的支架蚩自g k a p ( n a i s b i t t e l a l ，2 0 0 0 ) 。从上述文献中可知。在这5 种蛋白中- l c 8 与一氧化氮合成酶、i k b a 蛋白、b i m 出向和s w a l l o w 蛋白连接并执行其功能的同 时也是作为力蛋白复合体一个组成成份而存在：而与g k a p 益白连接的同时则是作为肌球蛋白 v 复合体一个组成成份而存在轻链8 蛋白的这些不人相荚却义非常重要的功能进一步解葶i ；了 土垦查垩奎兰罂圭茎竺兰兰。，。，。，。，。，。，。，。耋三尘二。：；! 辇堡 此序列高度保守性的意义，这很类似丁另一个极为保守的蛋白一钙调素( c a l m o d u l i n ) ( b e n a s h s k i ， 1 9 9 7 ) 。现在轻链8 蛋白( 也叫p i n ) 在溶液中的三维结构已被解析出米( t o c h i o e ta l ，1 9 9 8 ) ，并且轻 链8 蛋白上与其目标分子相结合的一个保守的绡构域【( 1 ( r ) x t q t 】已被鉴定出来( k e v i n e ta l ， 2 0 0 1 ) 。 i 1 3 2 t c t e x l t c t e x 2 蛋白家族 除了重链、中阃链和轻链8 外。每个力蛋白都还包括一个或多个t c t e x l t c t e x 2 蛋白家族的成 员。t c t e x i 和t c t e x 2 蛋白最初是在老鼠睾丸中被认为是参与1 7 号染色体各种形式之间的传输被 鉴定出来的。( l a d e r e ta l ，1 9 8 9 ；h u we ta l ，1 9 9 5 ) 。随后t c t e x l 蛋白在细胞质力蛋白和农藻外臂力 蛋向中被发瑚i , ( k i n g e ta l , ，1 9 9 6 ；h a r r i s o m ，1 9 9 8 ) ，以及t c t e x 2 的同源蛋自在外臂力蛋白中被发现 ( p a t e f 4 i n g e ta l ，1 9 9 7 ) 。通过数据库比对、搜索发现了这个家族的另外一些成员( 包括r p 3 蛋白) 也 都是细胞质力蛋白的组成成伤| ( k i n g , 1 9 9 8 ) 。 几个独立的实验均表明t c t e x l 蛋白能特异地将目标分子连到力蛋白复合体上( t a ie ta l ，1 9 9 9 ； n a g a n o , 。1 9 9 8 ) , 。比如在脊椎动物的光受体中，t c t e x l 蛋白与视紫红, 暖( r h o d o p s i n ) 的c 端尾部直接 相连i ( t a i ，1 9 9 9 ) 。还有一些文章报道t e l e x l 和它的同源蛋白r p 3 在胎儿和成年期大脑中有差别地 表达( k a i ，1 9 9 7 ；r o u x ，1 9 9 4 ) ，在人中t c t e x i 基因定位或靠近视锥营养障碍1 型位置( w a t a n a b e , 1 9 9 6 ) 。 1 1 3 3r o a d b l o c k l c 7 蛋自家族 r o a d b l o c k l c 7 轻链蛋白家族是最近在果蝇和衣藻外臂力蛋白皿c 7 ) 中发现的( b o w m a ne ta l ， 1 9 9 9 ) 而且对果蝇中的类似多肤( 即r o a d b l o c k ) 进行突变导致轴丝中的运输和有丝分裂上的缺 l j f j 。有趣的是r o a d b l o c k l c 7 蛋白家族也包括一个额外的果蝇蛋白b i t h o r a x i o d ( b x d ) , b x d 基因是同 源异形的b i t h o r a x 复合体的一部分( h p s h i t 五1 9 8 7 ) 。 1 2 高尔基体上力蛋白的研究 高尔基体是一个高度动态的细胞器，它接受米自山质网新合成的蛋白质，对其进行修饰和筛 选，从内质网新合成的蛋白质首先被处于内质网一高尔基过渡区的中间膜层( e r g o l g i i n t e r m e d i a t ec o m p a r t m e n t 简称e r g i c ) 所接受并聚集于此随扁这些蛋白经过顺面高尔基体，高 尔基中间叠层到反面高尔l 网( t g n ) 。在这个过程中许多蛋白质特异地驻留在某一个中间囊池或 返回到内质网t 从反面高尔基网分离出去的蛋白质被选择性地装入某种囊泡并被运输到质膜或各 种胞山体上。高尔基体的这一系列活动主要依赖由微管网络、肌动蛋自一红膜肽网络以及中间纤 维网络组成的复杂的细胞骨架基质米维持，介导这些丝状体系和高尔基体膜互作的则是各种分子 马达家族在过去的儿年里发现与高尔基体相连接的马达蛋白有细胞质力蛋白、动蛋白和肌球蛋 白家族【a l l a nv je ta k 2 0 0 2 ) 。 4 1 , 2 1 高尔基体与力蛋白的关系 在动物细胞中早已发现高尔基体的定位与组装均依赖于微管。微管的解聚可导致高尔基体破 碎并逐渐分散到整个细胞中( t h y b e r gj & m o s k a l e w s k ise la l ，1 9 9 9 ) ：每个残留的商尔基体碎块虽 然是由堆积的囊池组成( h o w c e t a l ，1 9 8 9 ) ，但还是有功能的，仍能进行膜物质的运输( r o g a l i s k i ae t a i 1 9 8 4 ) 。一旦微管能重新聚合，分散的高尔基体碎块即“微型堆积体”( m i n i s t a c k s ) 就会沿 着微管朝微管组织中心移动。微管组织中心既是微管负端之所在，也是微管聚合过程中成核反应 之所在( h o w c e l “，1 9 8 9 ) 。一旦位于细胞的中央微管的马达分子则推动膜管从一个“微型堆 积体”到另一个“微型堆积体”，结果就将它们连成一体，形成一个经典的“高尔基带”( g o l g lr i b b o n ) ( c o o p e rm se la t ，1 9 9 0 ) 。 但高尔基体的位置是如 可维持的呢? 其主要的作用因子可能是微管的一个马达细胞质力 蛋白i ( c d i ) ( s u s a l k ase ta l ，2 0 0 0 ；k i n gs ，2 0 0 0 ) 。已有不少文献报道了细胞质力蛋白1 的重链、 中间链和轻链均与高尔基体结构和功能的维持有关：通过生化方法，免疫荧光标记结合免疫印迹 发现在培养的脊椎动物细胞( x t c 细胞) 中，细胞质力蛋白重链i ( d h c l ) 存在于高尔基体和中间膜 层上：并且在微管解聚和b f a 处理下。重链1 仍分别结合于分散的高尔基堆积体膜周和b f a 诱 导的高尔基一内质网的膜管上；而且当用p 5 0 d y n a m i t i n 超量表达时会导致重链i 从分散的高尔 基堆积体膜周上脱落下来( r o g h ice ta l ，1 9 9 9 ) 。同样的方法在肠上皮细胞中发现细胞质力蛋白重 链l 和细胞质力蛋白中间链存在于反面高尔基体( t g n ) 和高尔基体附近的囊泡膜上，并与高尔基 体上囊泡出芽有关( k a r lr fe ta l ，1 9 9 4 ) 。t a i 等人在n r k 成纤维细胞中发现细胞质力蛋白1 的一 种轻链t c t e x - 1 位于顺面高尔基体和中间膜层上并且b f a 处理能使t e t e x - 1 分散到细胞质中( t a i a w e t a l 1 9 9 8 ) 。 与微管解聚后的现象一样，抑制细胞质力蛋白i 的功能也会导致高尔基体分散到细胞质中 ( b u r k h a r d tje ta t ，1 9 9 7 ；h a r a d aae ta t ，1 9 9 8 ；r c ，曲ice ta l ，1 9 9 9 ) ：还观察到细胞质力蛋白1 推动刚 从内质网合成的物质向高尔基体的运输( b u r k h a r d tje la l ，1 9 9 7 ；p r c s l e y i f 吼a t 1 9 9 7 ；s l e p h e n sd j e ta l ，2 0 0 2 ) ，表明这个运输体系对商尔基体在微管组织中心的定位确实有作用。 细胞质力蛋白1 正常功能的发挥依赖于一个附属蛋白复合体d y n a c t i n 。现已确定 d y n a c t i n 含有1 0 个亚基：p 1 5 酽“、p 6 2 、d y n a m i t i n ( p 5 0 ) 、肌动蛋白相关蛋白i ( a r e , 1 ) 、肌动蛋 白、肌动蛋白封端蛋白p 皿基、p 2 7 和p 2 4 ，其化学计精比为l ：1 ：1 ：4 ：9 ：1 ：1 ：1 ：1 ：1 ( s c b r o e r t ae t a l 1 9 9 6 ；h i r o k a w a n ，1 9 9 8 ) 。d y n a c t i n 能将力蛋白连接剑日标分子上并能提高力蛋白的活性，破坏二 者之间的连接将会使细胞质力蛋白的功能丧失( k i n gs & s c h r o e r t ，1 9 9 9 ) 。但也有例外的，比如实 验发现细胞质力蛋白本身通过轻链和轻中间链直接与日标分子连接或转运目标分子( t a ia w e t a 1 1 9 9 0 ；y o u n g ae la l ，2 0 0 0 ) 。现己知道：d y n a c t i n 的弧基p 1 5 0 g 。“与细胞质力蛋白中间链特异连 接( v a u g h a nk te ta l ，1 9 9 5 ) 并且这种连接受磷酸化调柑( v a u g h a np se ta t ，2 0 0 1 ) 。在d y n a e t i n 的 另一端，肌动蛋f i 相关蛋白l ( a r p l ) 通过与高尔基体特异的p l i i 红膜肽的鱼作丽与高尔基体连接 ( h o l l e r a ne ae ta t ，1 9 9 6 ；d e v a r a i a np s ，1 9 9 7 ；s t a n k e w i c hme ta 1 1 9 9 8 ；h o l l e r a ne ae ta l ，2 0 0 1 ) 。有 文献报道a r p i 位丁顺面高尔基体上( f o u q u e tj k ，2 0 0 0 ) 也发现了红膜肽d i i i 上的两个a r p i 结 台位点( h o l i e r a ne t a t ，2 0 0 1 ) 。当对d y n a c t i n 弧基d y n a m i l i n t p 5 0 超馘表达时导致了细胞质力蛋白 1 从其目标物上脱落下来( r o g h ic & a l l a nv 1 9 9 9 ；e c h e v e r r ic je le l ，1 9 9 6 ) d y n a m i t i n 的超量表达 j l 乎可以破坏所有细胞质力蛋白1 的功能，但在高尔基体上的例外( b u r k h a r dje ta l ，1 9 9 7 ； e c h e v e r r i c je ta 1 1 9 9 6 ：v a l e t t i ce ta l ，1 9 9 9 ) 。这就提i 出了一个问题：是否有高尔基体特异的细胞 质力蛋白l 和d y n a c t i n 的存在? 因为细胞质力蛋白l 有多个弧基组成每个亚基都不只一种存在 形式在那么多的组合中很可能存在儿个高尔基体特异的细胞质力蛋白1 复合体。 高尔基体膜骨架自b e c k 等人( b e c k ，1 9 9 4 ) 提出后就成了细胞生物学家们研究的热点。由上 述可知，细胞质力蛋白的中间链、d y n a c t i n 的m 5 0 g 1 n e d 和肌动蛋白相关蛋白i ( a r p l ) _ 弧基以及高 尔基体上特异1 3 i i i 红膜肽之间存在着关联；再加上高尔基体上锚蛋白的发现并证明在高尔基体 上锚蛋白是与红膜肽结合在一起的( d e v a r a j a n 。1 9 9 6 ) 。根据这h o l l e r a n 提出了一个高尔基体膜 骨架的假设模型：即细胞质力蛋白可能通过d y n a c t i n 与红膜肽相连而连接在高尔基体囊泡膜上， 他们认为d y n a c t i n 通过其上的a r p i 与高尔基体上的红膜肽相连，而红膜肽通过锚蛋白与高尔基 体囊泡上的跨膜蛋白相连，从而把高尔基体囊泡连接在细胞质力蛋白上，使之得以沿微管骨架运 动( h o l l e r a n 1 9 9 6 ) 。( 见酗1 2 ) 田卜2 高尔基体膜骨架参与力蛋白推动囊泡运输模式图( h i r o k a m a , 1 9 9 9 ) f i g u r e l - 2 m o d e lo f g o l g i m e m b m n es k e l e t o n t a k i n gp a r t i nv e s i c l e s t r a f f i c k i n g d r i v e nb y d y n e i n ( h i r o k a w a , 1 9 9 8 ) 另一方面，l o r m 等人提 d l t 高尔基体膜骨架的网络假说( d em a t t e i s a n dm o “o w 。1 9 9 8 ：l o r r a a n dh u t t n e g1 9 9 9 ) 。他l f , l i ：i j 由肌动蛋白( a c t i n ) ，锚蛋i ；l ( a n k y r i n ) ，红膜肽( s p e e t r i n ) 和其它蛋白( 如 g o l g i n s ) 等构成高尔基体膜骨架网络，且该网络对g 蛋白和磷酸肌醇( p h o s p h o r i n o s i t i d e ) 的调控是敏 感的。由此形成了两个不同的高尔基体膜骨架结构，一个称为限制型( r e s t r i c t i v cm e s h ) ，一个称为 恻( p e r m i s s i v em e s h ) 。在限制珊，囊泡不能进入，田此不能利高尔基体膜融合；在接受型， 受g 蛋白和磷酸肌醇的调控：网络由于去装配和巫新分布，使得囊泡和高尔基体膜融台；商尔基 体膜骨架从限制型到接受型局部变化不仅使囊泡在离尔基体形成面融台也是成熟面处囊泡形成 机制；膜骨架通过限制高尔基体腔室的人小，对腔室产生压力当网络局部去装配或重新排列时， 是膜出芽的推动力量。( 她图1 - 3 1 6 圈l - 3 高尔基体膜骨架的网络假说模式图( l 0 r r a a n dh u t t n e r , 1 9 9 9 ) f i g u r e l 一3 m e s h m o d e lo f g o l g i m e m b r a n es k c l e t o n ( l o r r aa n d h u t t n e r , 1 9 9 9 ) 既然d y n e i n ( 力蛋白) - d y n a c t i n 复合体与高尔基体相连并参与推动从高尔基体出芽囊泡的运 输。那么这种复合体与高尔基体囊泡的连接有辅助因子参与吗? 其是如何调控的呢? 1 9 9 9 年，有 实验证明存在一种不依赖c o p l 衣被蛋白复合体的从高尔基体到内质网的运输途径。该途径不受 a r f l 调控而受另一种g 蛋白r a b 6 蛋白的调控。当向h e l a 细胞注入c o p l 衣被蛋白抗体或表 达a r f l 突变体时，类凝集素分子e r g i c 5 3 和k d e l 受体的高尔基体到内质网的运输受阻，而 s h i g a 毒素类s h i g a 毒素i 或高