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酚酸类化合物化学发光分析法的研究 摘要 对流动注射化学发光分析法的研究现状和最新进展进行了综述。系统介 绍了化学发光试剂和化学发光体系的新进展以及它们在生物、化学、医学、 食品、环境等领域中的分析应用。化学发光分析法以其灵敏度高、操作简单、 线性范围宽、所用仪器廉价等优点而越来越多的受到重视j 自前，分析科学 家仍致力寻找新的化学发光体系和扩展现有化学发光体系在有机物分析中的 应用研究。 本论文研究了螋耋焦劬单宁酸、水杨酸等对一些丝堂星光体系的增 强作用。在此基础上，首次建立了一系列测定单宁酸、水杨酸等的化学发光 增强分析法，扩展了化学发光体系的研究范围，为酚酸类物质的分析开辟了 一条新的途径。具体工作如下： 一、根据单宁酸对鲁米诺羽q 一n 2 + 化学发光体系的增强作用，对反应 条件进行优化，建立了单宁酸的流动注射化学发光分析法。陔法测定单宁酸 的线性范围为3 x 1 0 4 5 x 1 0 。m o l l ，检出限为9 x 1 0 4m o l l 。用于中药五倍 子中单宁酸的测定，结果令人满意。 二、经过进一步实验发现单宁酸对c 0 2 + 催化的鲁米诺h 2 0 ，化学发光体 系也有很强的增敏效应。f 优化反应条件，基于鲁米诺一 l 0 2 一c 0 2 + 化学发光体 系建立了单宁酸的另一种流动注射化学发光增强分析法。该法线性范围为 7 1 0 一3 1 0 m o l l ，检出限为2 1 0 4m o l l 。并测定了中药五倍子、啤酒 花及啤酒中单宁酸的含量，将其结果与光度法进行了对比，结果满意；同时 对其发光机理进行了初步探讨。 三、发现在酸性介质中c e 4 + 与表面活性剂吐温2 0 反应产生弱的化学发 光，水杨酸、磺基水杨酸、2 ，4 二羟基苯甲酸、间苯三酚对该体系具有很强 的增敏作用。通过流路的选择及其它反应条件的优化，首次建立了水杨酸等 的流动注射化学发光分析法。舷法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简单等 优点，测定水杨酸、磺基水杨酸、2 , 4 二羟基苯甲酸、间苯三酚的线性范围 和检出限分别为：4 0 x l o 一一1 1 x 1 0 4 咖l 、1 4 x 1 0 4g m l ；l , o x l o 一8 x 1 0 4 g m l 、7 5 x l o g m 1 ：1 2 x 1 0 4 6 2 x 1 0 g m 1 、1 2 x 1 0 4g m l ；6 3 x 1 0 1 o x l o 。g m l ：6 3 x l o g m 1 。本法用于杀菌药液中水杨酸含量的测定，结果 令人满意。，j i i d e t e r m i n a t i o no f p h e n o l i ca c i d sb y u s eo fe n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e a b s t r a c t t h er e c e n td e v e l o p m e n to fc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) a n a l y s i si sr e v i e w e d t h e c ld e t e c t i o nf o r i n o r g a n i c o r g a n i c a n d b i o l o g i c a l l yi m p o r t a n tc o m p o u n d s i n b i o l o g i c a la n d m e d i c a ls t u d i e s ，f o o di n d u s t r y , e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r , e t c i sd e s c r i b e d t h es t a t eo ft h ea r ta n df u t u r et r e n d sa r ed i s c u s s e d i ti sf i g u r e do u tt h a to n l yl i m i t e d a n a l y t e sc a b b ed e t e r m i n e db e c a u s eo f r e l a t i v e l yl e s sc ls y s t e m p h e n o l i ca c i da r eb i o l o g i c a l l ya n de n v i r o n m e n t a l l yi m p o r t a n tc o m p o u n d s t h e a i mo ft h ed i s s e r t a t i o ni st of i n dn e wc lr e a c t i o n sa n dt oe x t e n dt h ea p p l i c a t i o no f p r e s e n tr e a c t i o n s f o rt h ed e t e r m i n a t i o n o f p h e n o l i ca c i d s an o v e lf l o wi j e e t i o nm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft a n n i ca c i db a s e do nt h e e n h a n c e m e n tb yt a n n i ca c i do fc h e m i l u m i n e s c e n tr e a c t i o no fl u m i n o l - k i o d m n 2 + s y s t e m i s d e v e l o p e d t h e l i n e a rr a n g e i s3 x 1 0 4 5 x 1 0 4 m o l l a n d t h e d e t e c t i o n l i m i t i s 9 x i 0 。m o l 1 t h em e t h o dh a sb e e na p p l i e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to f t a n n i ca c i di n c h i n e s e g a l lw i t l ls a 6 s f a c t o r y r e s u l t s f u r t h e r m o r e ，t a n n i ca c i dw a sa l s of o u n dt oe n h a n c ec h e m i l u m i n e s c e n c eo ft h e l u m i m 0 1 - h 2 0 2r e a c t i o nc a t a l y z e db yc 0 2 + b yo p t i m i z i n gt h er e a c t i o nc o n d i t i o n s ，a f i ac h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o df o rt l l ed e t e r m i n a t i o no ft a n n i ca c i dw a se s t a b l i s h e d t h ei m e a rr a n g eo f t h em e t h o di s7 x 1 0 4 3 x 1 0 - 6 m o l l ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s 2 x 1 0 9m o l 1 as a t i s f i e dr e s u l tw a so b t a i n e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft a l m i ca c i di n c h i n e s e g a l l ，h o pp e l l e t sa n d b e e r s i tw a sf o u n dt h a ts u r f a c a n tt w e e n 2 0r e a c t e dw i t hc e ( i v ) i n h z s 0 4 m e d i u mt o g e n e r a t ew e a k c h e m i l u m i n e s c e n c e t h ee f f e c to f v a r i o u sa c i d i cm e d i a , s u r f a c t a n t sa n d s o m e o r g a n i cc o m p o u n d s o nc lr e a c t i o nw e r es t u d i e d t h es p e t r ao f t h ec lr e a c t i o n w e r em e a s u r e d a n a l y t i c a lp o t e n t i a lo f t h ec lr e a c t i o nw a se x p l o i t e d s a l i c y l i ca c i d ， s u l f u r o s a l i c y l i ca c i d ，2 ，4 - d i h y d r o x yb e n z o i ca c i d ，a n dp h l o r o g l u c i n o lw e r e d e t e c t a b l e b yu s i n gt h ee n h a n c e m e n tb y t h e s ec o m p o u n d so f t h ec lr e a c t i o n 谢t l lt h ed e t e c t i o n l i m i t so f l 4 x 1 0 4 e g m i 、7 5 x 1 0 4 9 m i 、1 2 x 1 0 一g m l 、6 3 x 1 0 4 9 m 1 r e s p e c t i v e l y a f l o w i n j e c t i o np r o c e d u r e w a s d e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f s a l i c y l i c a c i di n b a c t e r i c i d a ls o l u t i o n i i i 致谢 本论文工作是在崔华教授的指导下进行的。崔老师严谨求实的治学态度、开 创性的思维、精益求精的工作作风，引导我在科研路上探索前进。正是她的悉心 指导，使我克服许多困难，完成论文。她对我的严格要求和启发，必将使我终生 受益，首先向崔老师表示衷心的谢意。 衷心感谢林祥钦教授对论文工作的悉心指导。林老师博才多学、治学严谨， 献身科学的崇高精神，是我学习的榜样。 感谢赵化章、施丽君两位老师在实验过程中提供的方便和协助。 感谢韩鹤友老师在论文撰写期间给予的帮助，使我深受启迪。 衷心感谢孙玉刚博士在我论文完成期间，给予的莫大帮助和鼓励。感谢李风 同学在实验和生活上的无私帮助和关心。李应会、邹桂征同学以及其他同学的大 力支持和帮助，在此一并致谢。 最后，我要感谢我的父母，在他们的教育和支持下，使我能在求学的道路上 努力向前。 感谢我的亲人王有刚对我继续求学的理解、支持以及他对我无微不至的关 怀，使我倍增了学习的信心和决心。 李世风 2 0 0 1 2 2 4 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 第一章综述 1 1 引言 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 是由高能量、不放热、不作电功或其它功 的化学反应所释放的能量，激发体系中某种化学物质分子而产生的次级光发射。 由于化学发光分析不使用任何光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声， 大大提高了信噪比，因而，化学发光分析法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设 备简单等优点。与流动注射分析f f t a ) 技术的结合，发展了配备微机系统、自动 进样、储存记录的流动注射化学发光仪，大大加快了化学发光分析的速度，并使 之易于实现自动化。目前化学发光分析法成为分析科学中一个十分活跃的研究热 点。本文对化学发光分析的应用研究现状进行了综述。 1 2 重要的化学发光试剂 研究和应用最早的化学发光体系，以有机物作为发光剂的情况较多，如目前 研究较为成熟的有鲁米诺、光泽精、洛粉碱、过氧化草酸酯等，它们的发光效率 较高，现已广泛用于多种金属和非金属无机离子及有机物的分析。 1 2 1 鲁米诺( 1 u m i n 0 1 ) 鲁米诺( 3 一氨基邻苯二甲酰肼) 是使用最早、最多、最广泛的化学发光试剂之 一，许多化合物的分析都是采用鲁米诺发光体系，在碱性条件下它能被许多氧化 剂( 例如h ：o ：、0 2 、k 1 0 4 、k 2 s 2 0 s 等) 氧化而发出蓝色的光，发光反应的量子产率 介于0 0 1 0 0 5 之间0 1 ，在水介质中，最大发射波长为4 2 5 n m t ”。许多金属离子、 金属配合物等能催化这一发光反应，使反应速度和发光强度大大提高。这一发光 反应用于至少3 0 多种金属离子的测定p 1 。最近人们合成了一些新的衍生物，庄惠 生等 4 1 研究了异硫氰酸异鲁米诺的电致化学发光性质及反应机理，申金山等对 鲁米诺碘化学发光体系及分析应用作了评述。 1 2 2 光泽精( 1 u c i g e n i n ) 和吖啶醣( a e r i d i n i u me s t e r ) 光泽精是使用较早的一种发光试剂，现在仍用于化学发光分析。在碱性条件 下，被氧化而发出波长为4 7 0 h m 的光 6 1 ，它的发光效率也较高，只是氧化产物n 一 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 甲基吖啶酮难溶于水，常沉积在反应器壁上，为此，常加入表面活性剂如c t a b 使之增活。例如用光泽精发光体系测定金属离子1 7 1 ，抗坏血酸嘲以及碱性磷酸酶 等【9 i 。6 0 年代以半个光泽精分子独自合成了一组吖啶酯，它亦是一种很好的发光 试剂，其量子产率 1 ，反应非常快，9 0 的发光在1 - 1 0 s 内完成。 1 2 3 过氧化草酸盐类( p e r o x a l a t e ) 6 0 年代开始报道了一类新的发光体系，即含草酸基团的衍生物，其典型化合 物有双( 2 ，4 一二硝基苯基) 草酸酯( t c p o ) 。k w a k m a n 1 0 l 等对液相色谱过氧化草酸 酯化学发光检测作了评述。和田光弘i “1 对l ，1 一草酰二咪唑作为发光剂在p o c l 中的应用作了评述。j o n s s o n 等m 1 研究了杂环化合物在p o - c l 中的催化作用。最 近b a r n e t t 等【嘲设计合成了草酰双三氟甲基磺酰基亚胺基一双苯基4 _ 4 ，一二磺酸及 2 ，2 ，- 草酰双三氟甲基磺酰基亚胺基一双乙苯基- 4 - 4 ”一二磺酸两种新的草酰胺用于 水溶性过氧草酸酯发光体系；它们具有较强的反应活性，几乎没有背景发光，具 有较好的水溶性；采用罗丹明b 对其分析性能进行了评价，其检出限可达l x l 0 5 x 1 0 m o l l ，他们对该化合物的非磺酸化物也进行了研究，其检出限可达9 x 1 0 4 5 1 0 m 0 1 l 。 1 2 4 钉( i d 的联吡啶( b i p y ) 及邻菲咯啉h e n ) 配合物 r u o o i p y ) 3 2 + 是一种被广泛研究和应用的化合物【1 4 】，它的化学发光于1 9 6 6 年被 l y t l e 等叫1 发现，1 9 7 2 年b a r d 等【1 6 】发现了它的电致化学发光。其化学发光及电致 化学发光应用逐渐增多；r u ( p h e n ) 3 ：+ 同r u ( b i p y ) 3 2 + 一样也可用作化学发光试剂， g e r a r d 等【1 5 1 对此进行了比较。何治柯等用r u ( b i p y ) 3 2 + 及r u ( p h e n ) 3 2 + 化学发光法在 酸性介质中测定草酸、酒石酸【1 9 删及5 种羟基酸口1 1 等，其化学发光机理也已有报 道 2 0 , 2 1 1 。 1 2 5 其它发光试剂 除了上述几类主要的化学发光试剂外，还有芳基咪唑类如洛粉碱 2 2 , 2 3 1 ，多元 酚类如联苯三酚，在h ：o ：存在下产生发光】。四( n 一烷基氨基) 一乙烯类化合物 也会产生化学发光1 ，常见的有四一( n 二二甲基氨基) 一乙烯，它在潮湿空气中爆 炸，产生明亮的化学发光。此外，硅氧烯、对氯苯基溴化镁、联苯酰基过氧化物、 金刚烷l ，2 一二氧杂环丁烷以及过氧化二甲基吲哚等，文献2 3 】均有介绍。最近， m a 等瞄i 研究了杯芳烃( c a l i x a r e n e ) 衍生物的光谱特性，合成了3 种衍生物，对 一( 2 ，3 一二氢一1 ，4 一酞嗪二酮一5 一偶氮) 杯 n 芳烃，n = 4 ，6 或8 。其特点是水溶性好， 象鲁米诺一样，在催化剂存在下，与氧化剂反应发光，可用于测定h 2 0 ：。 2 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 1 3 分析应用研究现状 1 3 1 无机物的化学发光分析 许多无机离子对化学发光反应具有很好的催化作用，有些无机离子对某些化 学发光反应具有增强作用，因而用化学发光对其进行测定得到广泛的应用。采用 的分析手段以流动注射为主，或与其它技术联用，其中以毛细管电泳( c e ) 与化 学发光联用产生的c e c l 最引人注意。程介克等【2 6 1 基于过渡金属在碱性条件下 催化l u m i n o l h 2 0 2 发光体系，利用c e - c l 法分离测定了c o ( r d 、c u ( u ) 、m n ( 1 1 1 等五种金属，对c o ( t d 的检出限达5 0 1 0 。1 3 t 0 0 1 1 ，比目前报道的最灵敏的结果低 2 个数量级。他们【2 7 】还对c r ( m ) 和z n ( i i ) 进行了分析，检出限分别可达1 5 a m o l 和 2 f m o l 。化学发光分析为毛细管电泳提供了一种新兴的、高灵敏的检测手段。 张帆等【2 8 】发现了一个新的、简单的、高灵敏度和高选择性的无机物化学发光 体系：当m n 0 4 一注入n a 2 c 0 3 - k o h 混合液时，会有强的化学发光产生，但没有 n a 2 c o ，的情况下，几乎没有化学发光；而且由于特定的反应，共存的阳离子不 会干扰测定。基于此，他们建立了高锰酸钾_ n a 2 c o a - k o h 体系，可高选择性地 测定铝矿中的锰，检出限达o 1 p p b 。 王伦、朱长青等用乳化剂o p 一铁( i d h ：0 2 体系【2 9 】，使铁的检出限达7 6 1 0 4 m o l l ；用8 羟基喹啉氮氧化物一钴( ) 一过氧化氢( 碱性) 体系 3 0 1 ，测定痕量钴；用 a s ( i i i ) 一罗丹明b c e ( i v ) 体系【”】测定了碘离子：用c e o v ) 一罗丹明b 体系实现了 痕量n 0 2 的测定p 2 l ；用k m n o 一双乙酰体系【3 3 】测定了m n ( i d ，使锰的检出限达 6 o 1 0 s m o i l l 。 方国桢f 3 4 1 建立的以茜素紫作镍的新发光试剂，且不经分离，连续测镍和钴，用 表面活性剂c t m a b 增敏，可测至o 1 n g l ；杜小忍等研究的c o ( 1 ，1 0 一 p h c n ) 3 2 + - k 1 0 4 - 鲁米诺体系1 测定c o ( i d ；朱智甲等还利用胶束增敏一光泽精一f c ( i i ) 体系o ”测定痕量铁；申金山等以t i 一c r ( i i i ) 一一鲁米诺体系t 3 1 建立了铊( i ) 的分 析法：周延秀等基于邻菲咯啉对k i o 。一鲁米诺一f c ( i i ) 化学发光体系的增敏作 用，建立了水体中总铁的反相流动注射化学发光检测法。 x i a o 等利用b r - 增强作用，基于l u m i n o l h 2 0 2 体系，建立了c r o n ) 的测定 方法，检出限可达n g 级；何治柯实验小组基于q u c r c e i r i n - h 2 0 2 - k o h 体系，利 用p b o ：柱在线氧化c r ( i i i ) 为c r ( i v ) ，实现了c r ( i v ) 和c r ( t i i ) 的同时测定，并用 于环境水样中c r ( i v ) 和c r ( i i i ) 含量的分析h “。高祥雯【4 1 1 利用t u m i n o t - h ：0 2 - c 蝌i i ) 体系化学发光测定了尿液中的痕量铬：贾予江等【4 2 】报道了a g ( d 催化o - p h c n 和 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 k f e ( c n ) 6 的配位体取代反应与鲁米诺一c u ( c n ) 4 z 的化学发光反应偶合测定痕量银 的方法：章竹君等h 州1 基于无机偶合反应，建立了痕量钒及水体和食品中痕量n o ， 的化学发光测定法；罗庆尧等1 4 5 , 4 6 1 用丙酮增敏一吐温4 0 化学发光体系测定痕量锇 ( ) ：吐温8 0 - a u ( i i i 卜k o h 体系，无须任何氧化剂，即可测定金，方法且具有好 的选择性；吕九如等 4 7 1 首次建立了利用k m n 0 4 一无机还原剂化学发光体系测定无 机物( 铁) 的化学发光分析法，检出限达1 0 o g m l 。除了催化增敏作用外，还有利 用诱导及置换反应间接测定某些离子，如s b ( i i ) 、f e ( i i ) 、g a ( i i i ) 等1 4 “9 , 5 0 。y a n g 等采用0 3 将n o 氧化为激发态n 0 2 测定n o t ”】；吴风武等 5 2 1 采用 r u ( p h e r l ) 3 z + - s 0 3 z - s 2 0 8 2 - 化学发光体系分析s 0 3 z 及s 0 2 ；l i l l 等采用 n a 2 c 0 3 - n a h c 0 3 一c u 2 + 体系测定s 0 3 2 1 5 3 1 ；k 1 0 4 k 2 c 0 3 体系测定了h 2 0 21 s 4 1 ，均取 得满意结果。m i k u s k a 等瞰1 根据酸性介质中硝酸盐与h 2 0 ：反应生成亚硝酸钠，再 在碱性介质中与鲁米诺产生化学发光反应，从而测定了超低浓度的亚硝酸盐； n o g u c k i 等【靳1 用嘌呤、磷酸化酶与磷酸反应测h 2 0 2 ，通过测定h 2 0 ：间接测定水 中的磷酸盐；i k e b u k u r o 等利用硫化物氧化酶氧化氰化物与硫代硫酸盐反应产 生硫化物，又在硫化物氧化酶的存在下产生硫酸盐和h 2 0 ，产生的h 2 0 ，与鲁米 诺和过氧化酶产生化学发光，从而间接测定氰化物；l u 等啪】贝0 是将鲁米诺和c u 2 + 做成c n - 的传感器，根据c l l ( o h ) ：与c n - 反应产生化学发光间接测定c n - 。 1 3 2 有机化合物的分析 a )氨基酸的分析 氨基酸的分析通常采用液相色谱分离，柱前或柱后衍生，紫外或荧光检测法 来分析，化学发光法亦常被采用。章竹君等印1 建立了用配合溶解c u ( o h ) ，柱，f i a 发光分析技术测定了可与c u 2 + 配合的数十种氨基酸，其灵敏度比c u 2 + 抑制发光灵 敏度高1 0 1 5 0 倍，检出限达p m o l 级，并将方法与h p l c 联用，高灵敏度地测定 了血清、尿、啤酒中的1 4 种氨基酸唧】。 a b d u l r a h m a na 【6 l 】利用无发光效应的c e ( i v ) 一h z s o 体系，建立了色氨酸的 分析法检出限为0 1 1 t g m l ：a l a d d i nm 等m 2 1 通过固定赖氨酸氧化酶，实现了鸟氨 酸和赖氨酸的顺序测定；l i n 等【6 3 1 发现在碱性条件下，c u ( n ) 催化过氧化氢分解会 产生弱的发光行为，加入氨基酸，该发光强度会大大增强，而且在n a 2 c 0 ，介质 中，增强比例更大，基于此建立了色氨酸和苯丙氨酸的分析法。封满良等利用 固定化酶的化学发光体系测定d - 丙氨酸，检出限为1 s x l 0 8 9 m l ；s k o t t y 等【6 ”用 丹磺酰氯先将氨基酸衍生化，然后用h p l c 分离，用r u ( b i p y ) 3 2 + 电致化学发光来 测定6 种氨基酸，并将r u c o i p y ) 3 2 * 加在流动相中与通常的柱后反应相比，其发光 4 ， 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 强度更高：也可用r u ( b i p y ) 3 2 + 体系化学发光分析法直接测定氨基酸，如脯氨酸、 天冬氨酸，其检出限可分别达2 0 p m o l 和5 0 p m o l 【删；z h a o 等利用喹啉一c e ( i v ) 体系，测定了巯丙酰甘氨酸；c h e n 等【酏】基于氨基酸对光泽精h ，o ，一c e ( 1 l i ) ) 龇 反应的抑制作用，结合流动注射技术和h p l c 测定了1 6 种氨基酸。 b )有机酸的分析 i s h i d a 等呻】将铲酮酸类化合物与4 ，5 一氨基邻苯二甲酰肼在酸性条件下反应然 后在碱性条件下被h 2 0 ：氧化产生化学发光，检出限在4 - - 5 0 f r a o l 之间；p e r e z ? 0 1 将 f e ( i i ) - 草酸配合物光解得到f e ( i i ) ，催化鲁米诺一过氧化氢化学发光反应，此法线 性范围为0 1 1 0 0 “m o l l ；k i s h i d a 等【7 1 1 提出了一种测定病人尿液中苯丙酮酸的方 法，先在碱性条件下将苯丙酮酸氧化成1 ，2 - 二氧杂环丁烷化合物，然后裂解产生 化学发光。此法灵敏度高，选择性好，不必前处理，可直接用于尿中苯丙酮酸的 分析测定。何治柯等m 1 依据抗坏血酸和酒石酸在r u ( b i p y ) 3 2 * - - c e ( i v ) 化学发光体系 中不同的反应速度，利用时间分辨，建立了两酸的同时测定法；段更利等【7 ”将荧 光试剂衍生化后的脂肪酸用肿l c 分离，化学发光检测分析脂肪酸。在 t c p o h 2 0 2 - 咪唑化学发光体系的最佳条件下，测得脂肪酸c i 6 、c 。、c 2 0 的检出 限分别为1 2 、1 8 、4 4 f i - n o l 。 对于酚酸等多酚类有机物的化学发光分析，本实验小组做了较为详细的探 讨。最初研究了多酚类化合物绿原酸、芸香苷等对鲁米诺诱导的化学发光体系的 抑制作用，据此首次建立了一系列测定绿原酸、单宁酸、芸香苷等的化学发光抑 制分析法以及同时测定多酚类化合物的高效液相色谱化学发光抑制检测法 7 4 7 7 】。 扩展了鲁米诺化学发光体系的应用范围，为多酚类物质的分析开辟了一条新的途 径。最近，我们又用电致化学发光法( e c l ) 对多酚类物质进行了分析研究和应用， 建立了焦性没食子酸、没食子酸、绿原酸等的电致化学发光抑制分析法 ? a - a 1 】，它 们的检出限可达1 0 - g m o l 1 ( 表1 1 ) 。 c )有机碱的分析 张四纯等p 1 基于新合成的噻唑类亚胺希夫碱n ( 2 四氢苯并噻唑) - 2 一羟基苯甲 亚胺对c e t + _ s 0 3 2 - 反应产生的微弱化学发光的增敏作用，建立了化学发光法测定 噻唑类亚胺希夫碱的方法；李建国等观察到雷氏盐对生物碱的沉淀作用，会导 致鲁米诺h ，0 2 - 雷氏盐体系化学发光强度降低，基于此建立了儿茶酚胺类生物碱 的分析法：将酶固定化柱与f i a 联用，让试样注入后经固定化酶反应器，被测组 分产生h ，o ，用荧光检测，测定了老鼠脑组织中的乙酰胆碱和胆碱1 9 7 1 ( 表1 2 ) 。 d )药物的分析 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 随着药物分析的不断发展，它不但要求分析结果准确可靠，而且要求分析方 法简单快速，尤其是对痕量和微量药物分析，流动注射化学发光法显得更为重要。 在药物分析领域中，经典的鲁米诺、光泽精体系，c e 0 v ) 一s o s 2 体系、砌血q 体系以及r u ( b i p y ) 3 2 + 体系都得到广泛的应用。鲁米诺发光体系在药物分析中的应 用主要有以下几种类型：( 1 ) 利用金属离子及金属离子化合物的催化或抑制进行直 接或间接检测，如硝普钠( s n p ) f 1 叫：( 2 ) 消耗型化学发光传感器的制备。章竹君小 组将鲁米诺等试剂固定在离子交换树脂上，研制成发光流动注射型传感器，并用 于v c 的测定【1 0 ”。( 3 ) e d w 盯s 等【1 0 2 1 将三肽异鲁米诺衍生物固定在亲和支持体，利 用蛋白酶对衍生物分解作用释放异鲁米诺，再利用化学发光检测异鲁米诺，从而 测定蛋白酶。与鲁米诺一样，在碱性介质中，h ：o ：氧化光泽精，裂解生成激活态， 发出蓝绿色的光，它的发光效率也较高。许多有机物对光泽精与h ：o ：的化学发 光反应有催化或抑制作用，据此提出了测定卡那霉素f 1 0 3 1 等的f i c l 分析法。在 酸性介质中，c e ( i v ) 氧化s 0 ，2 产生化学发光，此发光体系可被许多有机化合物所 增敏，在此基础上建立了测定增敏剂如盐酸环丙沙星【1 0 5 l 、皮质类固醇n 0 6 i 等的f i c l 分析法( 表1 3 1 。 e )其它有机化合物的分析 生物分子、有机物对鲁米诺化学发光的增强或抑制，d n a 1 2 4 1 、白蛋白u 2 5 i 、 葡萄糖”2 6 i 等对鲁米诺化学发光的增强作用，由此建立了各自的检测方法。 e v m i r i d i s 等【1 2 7 1 详细研究了m n o ( - 、1 0 + - 、0 c i 、c e o v ) 及h 2 0 2 等5 种氧化剂氧 化焦性没食子酸的发光特性及动力学影响，给出了测定氧化剂的分析参数及测定 焦性没食子酸的分析参数。t o w m s h e n d 等【1 2 8 1 研究了以甲酸为辅助还原剂，某些 含氮亲核试剂的氧化发光，如苯肼、肟、羟胺在罗丹明b k m n o 。体系中的氧化 发光。他们还研究了2 , 4 二硝基苯肼的化学发光特性【i 冽，并将其用于测定羰基化 合物呻0 】以及脂氧合酶对亚油酸的变质的影响。其它有机化合物的化学发光分析见 表1 4 。 1 3 3 生物物质的分析 酶及抗原、抗体等生物活体物质的化学发光分析的报道逐年增多，文献| 2 2 1 在 这方面作了详细的介绍。王鹏等f l ”i 对近年来免疫电化学发光作了评价。o l s s o n 等将酶的化学发光原理与免疫反应结合起来，建立了发光免疫分析法【1 4 ”。与放射 免疫分析法相比，它具有安全无污染，标记物稳定，快速灵敏等优点。其主要缺 点是发光持续时间短，因而对仪器及操作条件提出了很高的要求。近年来，人们 中国科学技术大学硕士学位论文第一章综述 通过在发光体中引入增强剂，形成增强发光酶免疫分析( e n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c ee n z y m ei l n l y i u n o s s a y ) 。最常见的体系有：a ) 增强辣根过氧化物 酶( h r p ) 免疫分析。英国w o l f s o n 研究室发现了一系列的化合物能够增强h r p 催 化鲁米诺化学发光，且发光信号稳定。a m e s s h a m 于8 0 年代末开始应用这一成果， 推出a m e d i t e 增强发光酶标系统。所用的增强剂有荧光素、噻唑、对碘苯酚等， 对碘苯酚增强化学发光测定h r p 及其标记物，灵敏度很高，检出限可达2 3 a m o l 管m 1 1 。张文艳等【1 4 2 1 发现了四苯基硼酸钠对辣根过氧化物酶( m ) 催化鲁米诺氧化 发光具有增强作用，以此测定了班冲；”增强化学发光碱性磷酸酶免疫分析。 b r o n s t e i 等合成并研究了具有1 ，2 一二氧杂环丁烷为基本结构的新化学发光酶底物 3 - ( 2 一螺旋金刚烷) 4 - 甲氧基4 一( 3 ”一磷氧酰苯基) 一1 2 一氧杂环丁烷( a m p p d ) 。它 可被碱性磷酸酶激活产生化学发光，牛血清白蛋白( b s a ) 能增强a m p p d 的发光， 碱性磷酸酶的检出限可达1 0 。o l l 。“n 等嘲以磷酸皮质醇2 l 为基质，在c t a b 存在下光泽精化学发光流动注射测定碱性磷酸酶。c ) 增强化学发光黄嘌呤酶免疫 分析。b a r e t 和f e r t t 1 “1 将黄嘌呤氧化酶引入免疫分析可得很高的灵敏度，检出 限可达3 a m o l 。其标记物长期稳定，1 0 r a i n 与2 4 h 的发光强度相同。b r o w n 等【1 4 8 用苯氯取代吖啶酯作为葡萄糖氧化酶活性的长寿命的发光指示剂检测促甲状腺激 素仃s d 。f o r e s t 等f 1 拍】将r u ( b i p y ) a 2 + 作为电致化学发光标记物用在b e o h r i n g e r m a n n h e i m e t e c s y s2 0 1 0 免疫分析仪上，并作了评价。表1 4 列出了一些化学发光 法在生物及免疫分析中的应用。 生化免疫分析中的化学发光分析应用，除具有发光分析的高灵敏度、分析快 速外，还具有特异性强、无放射性、毒性低、稳定性良好等优点。其线性范围宽， 应用范围广，为临床诊断及科研提供了一种超微量的非同位素检测手段。其发展 趋势在于合成新的发光标记物，优化标记技术及分析方法，为生命科学的发展提 供种先进的检测手段。 1 4 未来的发展趋势和本论文研究课题的提出 9 0 年代以来，化学发光分析法的发展呈现以下三个特点：一是发光体系研究 活跃；二是联用技术多样；三是应用范围广泛。化学发光作为一种分析方法已有 几十年的历史，是最灵敏的检测方法之一，其检测限可达f r a o l ，有的甚至可达到 a t t o m o l 级。对于定量的化学发光和生物发光检测，流动注射是一种非常有效的 多功能的样品处理技术，特别是采用固定试剂可以对样品进行在线分析。但化学 发光分析法的选择性问题仍是化学分析工作者要解决的关键问题之一。现代分析 中国科学技术大学硕士学位论文第一章综述 仪的设计对自动化程度的要求越来越高，所以发展流动注射微机控制系统联用的 化学发光分析仪器具有广泛的前景。为拓宽其应用范围，克服其选择性差的弱点， 达到灵敏、准确的分析目的，可以与其它技术结合，如与高效液相色谱联用，作 为高灵敏度检测器；高效毛细管电泳的引入，使分析法的灵敏度和选择性得到完 美的结合，化学发光分析法更是成为痕量甚至超痕量物质的最理想的检测手段之 一。近几年，此法已广泛使用在各个分析领域中。化学发光法具有仪器简单、操 作方便、分析快速灵敏等优点，可以预见化学发光分析在食品、环境及生物医学 等领域有着非常广阔的应用前景。特别是将化学发光分析与生化、免疫分析相结 合，为其在生物、医学领域的应用开拓了更广阔的应用前景。目前分析科学家致 力合成和寻找新的化学发光体系，并对其分析的潜力进行研究。与此同时，扩展 现有化学发光体系在有机物分析中的应用研究也是目前重要的趋势之一。基于 此，本论文在实验室前期研究工作的基础上，从化学发光增强现象以及新的化学 发光体系的研究人手，对酚酸类物质的化学发光增强行为进行了细致的探讨，并 将其应用于实践。 中国科学技术大学硕士学位论文第一章综述 表1 1有机酸的分析 被测物体系线性范围检出限文献 抗坏血酸 i h ( b i p ”3 2 + - c e ( i v ) 5 2 x 1 0 s 1 7 x 1 0 4 m4 8 x 1 0 8 m7 2 酒石酸 1 4 x 1 0 4 1 4 1 0 4 m8 4 1 0 7 m 绿原酸l u m i n o l _ k 3 f e ( c n ) 6l x l 0 4 - l x l 0 5 9 m 1 5 2 x 1 0 4 e c r r d 7 4 单宁酸l u m i n o l - h 2 0 2 一c u 2 + 7 x 1 0 。8 l 1 旷m9 x 1 0 - 9 l v l7 5 r u t i n l u m i n 0 1 一k 3 f e ( c n ) 62 x 1 0 4 8 x l 酽咖l6 7 x 1 0 4 9 r r d 7 7 p r o g a l l o ll u m i n o l - k c l ( o h 一) 7 x 1 0 。8 l 1 0 4 m1 6 x 1 0 s m 7 8 c a t e c h o l l u m i n o l - k c l ( o h - ) 5 1 0 4 l 1 0 4 m1 2 x 1 0 s m 7 9 c h l o r o g e n i c 1 x 1 0 4 - 5 x 1 0 。5 m5 2 x 1 0 9 m a c i d p r o t o c a t e c h u i c5 x 1 0 。8 1 1 0 4 m2 1 1 0 8 m a c i d t a n n i ca c i d l u m i n o l - k c l ( o h - ) 5 x 1 0 4 1 x 1 0 4 m2 o x l 0 4 m 8 0 g a l l i ca c i d l u m i n o l - k c l ( o h - ) 3 1 0 l l x l 0 4 m1 8 x 1 0 8 m 8 1 葡萄糖酸r u c o i p y ) j 2 + - c e ( i v ) 7 6 x 1 0 。k 1 5 x l o 5 m1 5 x 1 0 4 m 8 2 一0 p r o g a l l o lk 1 0 4 - k o h - k 2 c 0 3 5 x l o 9 - 1 x l o 7 m 0 1 l5 lo - 9 m 8 3 c t - t h i o g l y c e r o l l x l 0 4 1 x 1 0 6 m o l l1 1 0 。8 m 没食子酸k m n o ,o 2 5 2 5 9 t m o l 0 8 6 b m o l 8 4 抗坏血酸r u c o i p y ) 3 2 + - c e ( i v )o 0 3 4 2 6 n o l 1 1 6 n m 0 1 18 5 尿酸l u m i n o l k 7 c u ( 1 0 6 ) 22 x 1 0 s l x l 0 4 9 m l7 2 x 1 0 4 咖l 8 6 一k o h o 卜酮酸氨基吡嗪 5 0 i t m o l2 4 p m o l 8 7 叶酸k m n 0 4 ( f ) 一甲醛 l x l 0 7 1 x 1 0 5 m o l l2 4 1 0 8 m 8 8 水杨酸c t a b 一铽一水杨酸 0 0 2 7 2 7 5 m g l 7 r t g l 8 9 二氟水杨酸 一e d t a o 0 2 1 - 2 5 o m g l 6 g l 9 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 表1 2有机碱的分析 被测物体系线性范围检出限文献 奎宁 c e ( i v ) 一s 2 。4 x 1 0 一l x l 0 4 9 m ll x l 0 4 9 m l 9 0 奎宁定i x l 0 l x l 0 。咖14 x 1 0 4 9 m l 辛可宁 l x l 0 4 8 1 0 4 9 m l6 x 1 0 1 7 9 m i 奎宁c o ( i i i ) + h 2 s o , o 0 l 1 0 0 1 t g m l3 3 x 1 0 4 9 w a 9 1 可待因k m n o , - h + ( p p a ) 5 l l x l 0 2 m o l l9 2 可待因r u c o i p y ) 3 2 + + c e ( i v ) 5 x 1 0 - 7 1 1 0 。3 m o i l9 3 噻唑亚胺c e ( i v ) + s 0 3 2 。 5 x 1 0 4 l x l 0 4 m o l l9 4 希夫碱 多巴胺鲁米诺一i - 2 0 2l x l 0 4 l x l 0 。g l4 r l g l 9 5 肾上腺素 4 x 1 0 5 2 x 1 0 3 9 l2 0 1 a g l 异丙肾上腺素 4 x 1 0 5 2 x 1 0 3 9 l2 0 1 a g l 吗啡 h p l c l x l 0 + 1 3 9 l 9 6 可待因k m n o 。一多聚磷酸l x l 0 + 9 9 l 0 3 单乙酰胆碱 l x l 0 “g l 海洛