（果树学专业论文）脱落酸结合蛋白ABAR受体功能的鉴定.pdf

摘要 之前我们实验室从蚕豆( h c i a f a b a ) 中纯化到a b a 结合蛋白，发现它可能参与了a b a 诱导 的气孔响应，将其假定为a b a 受体a b a r ( p u t a t i v ea b s c i s i c _ a c i dr e c e p t o r ) ，根据a b a r 的序列 信息克隆到相应的c d n a 片段序列( 基因登录号：d q 3 7 6 0 8 1 ) ，这段序列编码推定的镁螯合酶h 亚基( c h l h ) c 端大约7 7 0 个氨基酸。在酵母中表达拟南芥a b a r c h l h 基因c d n a ，表达并 纯化得到的a b a r c h l h 蛋白能够特异结合a b a 。所以我们在拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 中 进一步研究了a b a r c h l h 介导a b a 信号的功能。 利用拟南芥中的a b a r c h l h 基因c d n a 序列片段，构建反义( a n t i s e n s e ) 和r n a i ( r n a i n t e r f e r e n c e ) 抑制基因表达载体，然后转化拟南芥。目的在于通过降低a b a r 蛋白的表达，从而 研究a b a r 基因的生理功能。筛选得到的阳性植株中有个别株系叶片的叶绿素含量降低，多数株 系同野生型叶绿索含量相近。转基因植株中p r o t o 和m g p r o t o 含量降低，但内源a b a 含量没有变 化。转基因植株在种子萌发、幼苗生长和气孔实验中，表现出对a b a 不敏感。抗旱实验以及离 体叶片失水实验结果表明，转基因植株对失水和干旱胁迫较野生型敏感。进一步的生理学研究结 果表明，a b a r c h l h 特异介导a b a 信号转导而不参与其它激素信号转导过程。 为了证明a b a r c h l h 的受体功能独立于叶绿素合成和质体核之间信号转导功能，我们对 叶绿素合成路径中的叶绿素酸酯氧舍酶( c a o ) 突变体( c h l 2 ) 和质体核信号转导解偶联( g u n ， g e n o m e su n c o u p l e d ) 突变体( h y l g u n 2 ，h y 2 g u n 3 ，g u n 4 ，g u n s ) a b a 响应表现型进行了研究。结果 表明这些突变体植株中a b a r c h l h 表达量没有发生变化，虽然多数突变体中叶绿素含量有所降 低，但都对a b a 处理没有脱敏的表现型。由此证明a b a r c h l t t 受体功能独立于叶绿素合成以 及质体一核信号转导路径。c c h 是a b a r c h l h 基因单核苷酸突变体，也是一个g u n 突变体，与 g u n 5 突变体有相同的袁型，但它对a b a 不敏感，而且a b a r c h l h 的表达量降低。由此进一步 证实了，反义和r n a i 抑制删基因表达所导致的植物对a b a 脱敏的表现型是可靠的。 在拟南芥野生型植株的微粒体组分和可溶性蛋白组分中均有a b a r c h l h 蛋白存在，而且这 种蛋白在花、角果、叶片、根、茎以及正在萌发的种子当中均有表达。a b a r c h l h 在不同器官 中的转录水平基本是相当的。 以上实验结果为a b a r 的a b a 受体功能提供了可靠的遗传学证据。& b a r 的遍在性表达显 示它可以在植株整体水平上介导a b a 信号。 关键词：脱落酸，结合蛋白，受体，功能鉴定 v a b s t r a c t w ep r e v i o u s l yr e p o s e da na b a - s p e c i f i c - b i n d i n gp r o t e i np u r i f i e df r o mb r o a db e a n ( v i c i af a b a ) l e a v e s ，a n df o u n dt h a tt h i sp r o t e i nw a sp o t e n t i a l l yi n v o l o v e di na b a i n d u c e ds t o m a t as i g n a l i n g s ow e d e s i g n a t e di ta b a r ( f o rp u t a t i v ea b s c i s i ca c i dr e c e p t o r ) w ei s o l a t e dac d n af r a g m e n t ( g e n b a n k a c c e s s i o n ：d q 3 7 6 0 8 1 ) f r o mb r o a db e a nl e a v e sa c c o r d i n gt ot h es e q u e n c i n gi n f o r m a t i o no ft h ep u r i f i e d a b a r w h i c he n c o d e st h ec - t e r m i n a lh a l fo fa b o u t7 7 0a m i n oa c i d so fp u t a t i v ehs u b u n i t ( c h l h ) o f t h e m a g n e s i u m - p r o t o p o r p h y r i n i x c h e l a t a s e ( m g - c h e l a t a s e ) w ee x p r e s s e d t h e a r a b i d o p s i s a b a r c h l he d n ai nay e a s ts y s t e ma n da f f i n i t y - p u r i f i e dt h ea b a r c h l hp r o t e i nf r o mt h ey e a s t e x t r a c t s t h ep u r i f i e da b a r c h l hs p e c i f i c a l l yb i n d sa b a ，g ow ef u r t h e ra n a l y z e df u n c t i o n so f a b a r c h l ha c t i n gi nm e d i a t i n ga b as i g n a l i n gi n a r a b i d o p s i st h a l i a n a t oe x p l o r et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so fa b a r c h l h ，w eg e n e r a t e dt h ea r a b i d o p s i st r a n s g e n i c a n t i s e u s ea n dr n a il i n e s c h l o r o p h y l lc o n t e n t si nt h em o s tt r a n s g e n i cl i n e sw e r es u b s t a n t i a l l yt h es a f f l e a st h o s ei nt h ew i l dt y p e p l a n t s ，b u t p r o t oa n dm g p r o t oc o n t e n t so f 订a u s g e n i cl i n e sd e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y e n d o g e n o u sa b ac o n t e n t so ft r a n s g e n i cl i n e sw e r et h es a m ea st h o s ei nt h ew i l dt y p e p l a n t s t h ep l a n t su n d e r - e x p r e s s i n ga b a rv i a r n a ia n da n t i s e n s es h o w e dt h e s i g n i f i c a n t a b a - i n s e n s i t i v ep h e n o t y p e si ns e e dg e r m i n a t i o n ，p o s t - g e r m i n a t i o ng r o w t h ，a b a - i n d u c e dp r o m o t i o no f s t o m a t a lc l o s u r ea n di n h i b i t i o no fs t o m a t a lo p e n i n g t h et r a n s g e n i cp l a n t sw e r em o ms e n s i t i v et o d e h y d r a t i o na n dd r o u g h ts t r e s st h a nt h ew i l dt y p ep l a n t s t h e s er e s u l t sr e v e a l e dt h a ta b a rm e d i a t e d a b as i g n a l i n g f u r t h e rs t u d i e ss h o w e dt h a ta b a rt o o kp a r ti ns i g n a lt r a n s d u c t i n no fo t h e rp l a n t h o r m o n e si n c l u d i n go fa u x i n ，c y t o k i n i n ，e t h y l e n e ，b r a s s i n o s t e r o i da n dg i b b e r e l l i n t of u r t h e rc l a r i f yi n t e r r e l a t i o n sa m o n ga b a r c h l h m e d i a t i n ga b as i g n a l i n g , c m o r o p h y l ls y n t h e s i s a n dp l a s t i d - t o - n u c l e u ss i g n a lt r a n s d u c t i o n ，as e r i e so fm u t a n t sw e r e a s s a y e d ，w h i c hw e r ed e f e c t i v ee i t h e r i nc h l o r o p h y l lm e t a b o l i s ms u c ha sc h l - 2o ri np l a s t i ds i g n a l i n gi n c l u d i n go fh y l g u n 2 ，h y 2 g u n 3 ，g u n 4 ， g u n 5 t h e s em u t a n t sh a v er e d u c e dc h l o r o p h y l lc o n t e n t se x c e p tf o rg u n 5p o s s e s s i n ga p p a r e n t l yt h es a m e a m o u n to fc h l o r o p h y l la st h a to fi t sw i l d t y p eb a c k g r o u n d i m p o r t a n t l y , t h e s em u t a n t sh a v ec o m p a r a b l e l e v e l so fa b a r c h l hp r o t e i nt ot h o s eo ft h e i rb a c k g r o u n dw i l d t y p ep l a n t sa n dd i dn o th a v et h e a b a - i n s e n s i t i v ep h e n o t y p e si ng e r m i n a t i o n ，s e e d l i n gg r o w t ha n da b a - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r ea n d i n h i b i t i o no fs t o m a t a lo p e n i n g c c hi sa l s oag u nm u t a n ta n da l l e l eo fg u n 5b u tw i t has i n g l en u c l e o t i d e s u b s t i t u t i o na td i f f e r e n ts i t e i th a st h el o w e s tl e v e lo ft o t a lc h l o r o p h y l l ，r e d u c e dl e v e lo fa b a r c h l h p r o t e i na n dt h ea b a - i n s e n s i t i v ep h e n o t y p e s t h e s er e s u l t sp r o v e dt h a ta b a r - m e d i a t e da b a s i g n a l i n g i sad i s t i n c tp r o c e s sa n da b a - r e s p o n s i v ep h e n o t y p e so ft r a n s g e n i c p l a n t sw e r er e l i a b l ea n ds p e c i f i c a r a b i d o p s i sa b a r c h l hi sau b i q u i t o u sp r o t e i ne x p r e s s e di nf l o w e r s ，g r e e ns i l i q u e s ，l e a v e s ，t o o l s ， s t e m sa n dg e r m i n a t i n gs e e d s ，s u g g e s t i n gt h a ti tm a y p e r c e i v ea b as i g n a li nw h o l ep l a n tl e v e l t a k e n v i t o g e t h e r ，w ep r o v i d ec o m p e l l i n ge v i d e n c et h a ta b a r c h l hi sa na b ar e c e p t o rp e r c e i v i n ga b a s 噜n a li ns e e dd e v e l o p m e n t ，e a r l ys e e d l i n gg r o w t h ，s t o m a t a lm o v e m e n ta n dp l a n td r o u g h tt o l e r a n c e k e yw o r d s ：a b s c i s i ca c i d ，b i n d i n gp m t e i n ，r e c e p t o r , f u n c t i o n a li d e n t i f i c a t i o n v 缩略语表 英文缩写英文名称 6 - b a 6 - b e n z y la m i n o p u r i n e a b a a b s c i s i ca c i d a c c 1 - a m i n o c y e l o l ：n o p a n e 1 c a r b o x y l i ea c i d b c i p 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一l n d o l y l - p h o s p h a t e b h t d i b u t y lh y d r o x y - t o l u e n e b rb r a s s i n o s t e r o i d b s ab o v i n es e l l i ma l b u m i n c t a b c e t y l t d m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e d t rd i t h i o t h r e i t o l g a 3 g i b b e m l l i ca c i d g h c o n a t e6 - p6 - p h o s p h o g l u c o n a t ed e h y d r o g e u a s e g s tg l u t a t m o n es - t r a n s f e r a s e s h e p e s n - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) i p e r a z i n e - n - 3 - p r o p a n e s u l f o n i ca c i d i p t g l s o p r o p y l t h i o - b - d - g a l a c t o s i d e m e s 2 一( n - m o r p h o l i n ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d m g p r o t om g - p r o t o p o r p h y r i ni x m o p s 3 - m - m o r p h o l i n o ) - p r o p a n e s u l f o n i ca c i d n a a n s p h t h y l a c e t i ca c i d n b t n i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e p m s f p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e p r o t o p r o t o p o r p h y r i ni x r a c er a n d o ma m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p tp c r s d s - p a g es d s p o l y - a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t e m e d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e “s 2 - a m i n o - 2 ( h y d r o x y m e t h y l ) 一1 ，3 - p r o p a n e d i o l 中文名称 6 苄基腺嘌呤 脱落酸 1 氨基环丙烷1 羧酸 5 一溴4 氯- 3 吲哚磷酸甲苯胺蓝 3 ，5 二叔丁基对羟基甲苯 油菜素内酯 牛血清白蛋白 十六烷基三乙基溴化铵 焦碳酸二乙脂 二甲基亚砜 二硫苏糖醇 赤霉酸 6 - 磷酸葡糖酸脱氢酶 谷胱甘肽s 一转移酶 n 一( 2 - 羟基) 哌嗪n - 3 - 丙磺酸 异丙基硫代_ b d - 半乳糖苷 2 吗啉代乙基磺酸 镁卟啉 3 一心一吗啉代) - 2 强基丙磺酸 奈乙酸 氯化硝基四氮唑蓝 苯甲基磺酰氟 原卟啉i x c d n a 末端快速扩增 反转录p c r s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 、 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：工小豸 时间：耐年月旷日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) i 研究生签名：五小芍 时间：如年月，日 导师签名： 弘么鸭 时间么年乡月i j 一日 第一章文献综述 1 1 脱落酸( a b a ) 研究进展 脱落酸( a b a ) 是植物体内合成的一类植物激素，它在植物生长和发育的很多方面都起到重 要的作用。a b a u 司- 调控种子成熟和萌发过程，包括种子干旱抗性、休眠以及贮藏蛋白合成( r o c k a n dq u a t r a n o ，1 9 9 5 ；l e u n ga n dg i r a u d a t ，1 9 9 8 ；f i n k e l s t e i na n dr o c k ，2 0 0 2 ) ；a b a 可以调节植物对环 境胁迫的适应性，作为中间信号介导水分胁迫相关的胁迫响应，引起干旱诱导的气孔关闭( l e u n g a n dg i r a n d a t ，1 9 9 8 ；h i m m e l b a c he ta 1 ，2 0 0 3 ) ；此外，a b a 还可以调控果实发育( c o o m b e ，1 9 7 6 ； c o o m b e ，1 9 9 2 ) ，对于刺激果实中糖份积累、改良果实的产量和品质等果实生理方面起到重要作 用( b e r a t e l1 9 8 3 ；y a m a k ia n da s a k u r a ，1 9 9 1 ；o f o s u - a n i me t 以，1 9 9 6 ) 。在过去的十几年中，a b a 信号转导过程被，“泛研究( g k a u d a te ta 1 ，1 9 9 2 ，1 9 9 4 ；l e u n ge ta 1 ，1 9 9 4 ，1 9 9 7 ；m e y e re ta 1 ，1 9 9 4 ； b e r t a u c h ee ta 1 ，1 9 9 6 ；c u r l e re ta 1 ，1 9 9 6 ；l n g r a ma n db a r r e l s ，1 9 9 6 ；m e d o ta n dg i r a u d a t ，1 9 9 7 ； f i n k e l s t e i ne ta 1 ，1 9 9 8 ；l e u n ga n dg i r a n d a t ，1 9 9 8 ；l e u b ee ta 1 ，1 9 9 8 ；r o d r i g u e ze ta 1 ，1 9 9 8 a ，1 9 9 8 b ； s h e e n ，1 9 9 8 ；g o s t i e t a l ，1 9 9 9 ；l ie t a l ，2 0 0 0 ) ，国内外对a b a 的研究主要集中在三个方面：一是以 寻找a b a 受体为目的的受体研究；二是研究a b a x 植物抗逆基因表达、调控的研究；三是a b a 信号转导通路中的细胞内中间信使。 1 1 1 脱落酸( a b a ) 受体的研究进展 受体是指在细胞膜上或细胞内能首先与信号分子( 激素、药物等) 相互作用的蛋白质分子。 它具有三个级联的功能：( 1 ) 对信号分子进行识别并与之结合；( 2 ) 将信号向细胞内下游转导； ( 3 ) 产生相应的生物效应。从受体与信号分子配体结合的角度来看，它还具有以下几个特征：( 1 ) 高亲和力和低容量；( 2 ) 可饱和性和可逆性；( 3 ) 专一性。即有一定的立体选择性。 植物通过a b a 信号分子感知逆境，并进行自身适应性调整的过程分为两步：一是a b a 信号 分子的产生，即在有关组织中合成a b a ，并将其运到效应部位；二是效应部位细胞对a b a 信号 的响应进而诱导抗逆性。作为植物激素信号，a b a 首先应该通过胞内或者胞外的特异位点( 受 体) 而被细胞感知( m i c h a e l a n d v a l e f i a ，1 9 9 3 ；g i r a u d a t e t a l ，1 9 9 4 ；l c u n ga n d g k a u d a t ，1 9 9 8 ) ，然 后址认受体复合物激活胞内信使，将a b a 信号传递到靶酶或靶基因，产生短期或长期的生理效 应( g i r a u d a te t a l ，1 9 9 4 ；c u r l e r e t a l ，1 9 9 6 ；m e r l o ta n d g i r a u d a t ，1 9 9 7 ；l e u n ga n d g i r a u d a t ，1 9 9 8 ；l i e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在a b a 诱导的一系列反应过程中，a b a 受体蛋白对a b a 信号的识别过程是关键 的一步( m i c h a e la n dv a l e r i a ，1 9 9 3 ；g i r a u d a te ta 1 ，1 9 9 4 ；l e u n ga n dg i r a u d a t ，1 9 9 8 ) 。如果a b a 受 体蛋白功能出现障碍，细胞a b a 信号不能进行有效的识别，即使a b a 数量增加，也不会产生相 应的生理效应；相反，a b a 受体蛋白数量的增加或对a b a 信号亲和力的增强，可极大的增强细 胞对a b a 的敏感性，使植物在低浓度的a b af 及时地或较早地获得对干旱的抗性。可以说， a b a 受体识别过程控制着植物抗逆性的形成，a b a 受体蛋白是调控植物抗逆性的关键的功能蛋 白。因此，a b a 受体研究t 作的开展，对于人们了解a b a 的作用机制，进而人为地调控植物对 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 环境的适应能力，意义重大。 国内外通常采用以下两种方法筛选a b a 受体：一是通过筛选突变体，定位基因，克隆基因； 二是利用生化方法，分离a b a 结合蛋白，克隆基因，鉴定其受体性质。但是迄今为j ，并没有 筛选到a b a 突变体植株，推测或许由于a b a 受体突变是致死的，或者由于a b a 受体的多元化， 导致单一受体突变体难以表现出来，所以研究a b a 受体的方法就集中在通过a b a 结合蛋白进一 步鉴定其是否为受体。因此一系列的方法被用于检测并鉴定a b a 结合位点( 或a b a 结合蛋白) ， 并将其作为假想的a b a 受体进一步研究其对a b a 信号的感知( z h a n g e l a l ，2 0 0 1 ) 。 1 1 1 1 脱落酸( a 卧) 结合蛋白的研究进展 a b a 结合蛋白的研究始7 0 年代，h o r t o n ( 1 9 7 1 ) 和m i n b o r r o w ( 1 9 7 4 ) 最早认为a b a 在气 孔反应上其作用位点可能位于质膜上，h o c k i n g 等( 1 9 7 8 ) 首次利用放射配基结合分析法证明蚕 豆叶片亚细胞组分中存在a b a 的特异结合活性，随后h o r a b e r g 和w e f l e r ( 1 9 8 4 ) 用蚕豆保卫细 胞原生质体为材料，证明保卫细胞质膜存在高亲和的蛋白质结合位点，并计算出每哪2 保卫细胞 原生质体质膜有2 0 0 0 多个a b a 结合位点。 遗憾的是自从1 9 8 4 年以后，有关a b a 结合蛋白的研究在相当长的时间内没有突出进展。近 年来随着a b a 生理功能的揭示，人们对a b a 结合蛋白的研究又出现了一个新的高潮。v e l i e v ( 1 9 9 1 ) 用放射免疫法证明小麦茎切段胞质部分存在着能与a b a 高亲和结合的蛋白质；c h e n 等 ( 1 9 9 2 ) 用放射配基结合法分析水稻幼叶粗膜组分发现了与a b a 高亲和力的结合蛋白，其反应 平衡常数为2 6 6 1 0 m o l l ；c h e n 和z h u ( 1 9 9 6 ) 在玉米根中也发现存在有a b a 结合位点；p e d r o n 等( 1 9 9 8 ) 将a b a 偶联到载体蛋白上，并利用这些亲和探针检测和纯化a b a 结合蛋白，发现在 拟南芥叶片微粒体组分中存在a b a 结合蛋白，并且定位在质膜组分中：z h a n g 等( 1 9 9 9 ，2 0 0 1 ) 在葡萄和苹果果实中发现a b a 结台蛋白，并且研究了a b a 结合蛋白在果实中的性质及分布情况， 苹果果实的微粒体组分和可溶蛋向组分中均可以检测到a b a 结合蛋白。这些结果对于研究a b a 结合蛋白的性质提供了许多有价值的线索，但是一直没有纯化到a b a 结合蛋白和克隆到a b a 受 体基因的相关报道，长期的实验经验说明，通过遗传学的方法很难得到a b a 受体，因而纯化a b a 结合蛋白成为分离a b a 受体进而研究a b a 信号感知机制的关键步骤。 2 0 0 2 年，7 a a n g 等( 2 0 0 2 ) 通过亲和层析的方法首次从蚕豆( h e i a 如b a ) 叶片下表皮中纯化 得到7 a b a 结合蛋白，通过s d s 凝胶电泳、等电聚焦电泳以及双向电泳等手段确定纯化蛩a b a 结 台蛋白为单一蛋白，分子量为4 2 k d ，等电点为4 8 6 。i 玄x a b a 结合蛋白具有可饱和性、可逆性和高 亲和性等特性，几乎满足其作为a b a 受体的所有基本要求( v e n i s ，1 9 8 5 ) ，但要确定其受体功能 还有待丁i 克隆4 2 - k d 蛋白的基因序列并进行进一步的生理功能研究。r a z e m 等( 2 0 0 4 ) 纯化到受 a b a 诱导的并在大麦糊粉层中表达的5 2 - k d 蛋白a b a p l ，并克隆n a b a p l 的基因序列( g e n b a n k t m a c c e s s i o nn u m b e ra f l 2 7 3 8 8 、。 1 1 1 2 脱落酸( a b a ) 受体的发现 2 2 0 0 6 年，r a g e m 等( 2 0 0 6 ) 根据其在2 0 0 4 年纯化到的a b a 结合蛋白a b a p l 的序列信息 ( r a z e me ta 1 ，2 0 0 4 ) ，发现其氨基酸序列与拟南芥中调控花期的f c a 氨基酸序列相似，f c a 作 中国农业大学博上学位论文 第一章文献综述 为核r n a 结合蛋白已经被公认的功能是通过阻i p f l c ( 一种抑制开花的m a d s 转录因子) m r n a 积累从而促进开花，但是还没有研究表明f c a 具有结合a b a 的特性。r a z e m 等( 2 0 0 6 ) 证实 f c a 同a b a 有很高的亲和性，并且作为受体参与了r n a 代谢及花期的调控。这表明植物中a b a 受体以及信号转导机制具有复杂性和多样性的特点( r a z e me t a l ，2 0 0 6 ) 。 但是已经鉴定的a b a 受体f c a 只参与了对花期的调控，参与调控种子成熟、萌发、萌发后 生长、气孔运动以及植株对干旱响应等功能的a b a 受体仍然是未知的。 1 1 2 脱落酸( a b a ) 信号转导的研究 1 1 2 1a b a 调节气孔运动以及气孔中a b a 的信号转导机制 两个保卫细胞首尾连接形成气孔，气孔开、关是保卫细胞渗透收缩或膨胀的结果。在水分胁 迫下，细胞内、外a b a 的增加，是降低膨压导致气孔关闭的激发因素。与其他组织不同，成熟 的保卫细胞间没有胞间连丝。这一特点为研究a b a 积累、信号传导及其他生理效应，提供了有 利的单细胞系统。 现有证据表明，保卫细胞至少有两类a b a 感知位点( h a r t u n g ，1 9 8 3 ：h a l l o u i ne ta l 2 0 0 2 ： z h a n g e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。一类位于质膜上( a n d e r s o ne ta 1 ，1 9 9 4 ：z h a n ge t a l ，2 0 0 1 ) ，一类位于细胞内 部。a b a 是一种兼性分子，能否通过质膜取决于所带电荷，质子化形成a b a h 容易通过质膜。 鸭趾草保卫细胞在p h8 0 和p h5 0 。外施a b a 都能诱导气孔关闭，但是在p h8 0 时a b a 不易 通过质膜，所以表明质膜外侧存在a b a 受体。另外低p h 下外施a b a 效果更明显，间接说明细 胞内也有a b a 受体。更直接的证据是，向鸭趾单细胞内注射束缚a b a ，控制其在细胞内释放， 导致气孔关闭。还有实验证明，在胞外功m a b a 存在时，气孔没有关闭，向细胞内微注射a b a 后，导致气孔关闭，表明细胞内存在a b a 感知位点。这两种推测的a b a 结合位点可能是产生 a b a 诱导气孔关闭和a b a 抑制气孔开放两条途径分离的原冈( h i m m e l b a c he t a l 2 0 0 3 ) 。 在气孔保卫细胞中，a b a 和其受体结合后，通过质膜上和细胞内的信号传导途径，引起细 胞的一些生理、生化反应。a b a 在保卫细胞中的快速效应存在两种信号传导途径即：依赖c a 2 + 信号传导途径和不依赖c a 2 + 信号传导途径。在依赖c 一信号传导途径中，保卫细胞对a b a 的最 初反应之是胞内 c a “ 增加( g r a b o va n db l a t t ，1 9 9 8 ) ，有证据表明i p 3 ( n o s i t o l1 , 4 ，5t r i s p h o s p h a t e ) 和，或c a d p r ( c y c l i ca d pf i b o s e ) 介导c a “从钙库进入细胞。以鸭趾草为材料，利用荧光法测定 保卫细胞内c a “浓度变化，发现使用a b a 后，胞内 c a 2 + 瞬时升高，随后又恢复正常水平， 并且 c a 2 + 升高发生在气孔关闭之前。c a 2 + 螫合剂e g t a 和c 一离子通道抑制剂处理，抑制胞 内c a “浓度升高，均能减弱a b a 对气孔运动的影响。将束缚的l p 3 导入保卫细胞，通过光激活使 l p 3 释放，发现随着l i p 3 的增加， c a 2 + 会迅速增加，同时气孔关闭。直接导入c a 2 + 当胞内 c a 2 + 达到6 0 0 r i m 时，也能促进气孔关闭。还有报道发现l p 3 可抑制向内的k + 离子通道，g 蛋白激活 剂也能抑制向内的k + 离子通道。并伴有 c 一 的升高。同时也有很多证据表明，在某种生理条 件f ，a b a 诱导气孔关闭，并没有伴随 c a 2 + 的变化。鸭趾草在1 0 1 7 c 时，导入a b a 引起 气孔关闭，没有发现c a 2 + 的变化，只有在2 5 ( 2 以上时a b a 处理引起的气孔关闭，才伴随 c a 2 + 的增加，表明有不依赖于c a “的信号转途径存在。最近有报道，认为蛋白质的可逆磷酸化参于这 3 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 一过程，并提纯得到了几种信号传导蛋白因子。a a p k 是a b a 激活的不依赖c a “的丝氨酸一苏 氨酸蛋白激酶，仅在保卫细胞表达。a a p k 只被a b a 激活，其生理作崩是控制气孔反应。现在 a a p k 基因己被克隆，把4 3 位赖氨酸变为丙氨酸，基因转移到其它保卫细胞，导致气孔对a b a 不敏感，并且质膜离子通道没有被活化。近来在a b i l 、a b i 2 突变体中，发现有少数例子对a b a 敏感，进一步研究表明a a p k 在a b l l 、a b l 2 不能介导气孔关闭时发挥了作用，这也说明a a p k 同蛋白磷酸酶2 c 在不同的途径调控气孔反应( m u r a t a e t a l ，2 0 0 1 ) 。 a b a 导致气孔关闭是诱导k + 、c l 。离子流动造成的( f a i r l e y g r e n o ta n d a s s m a n n ，1 9 9 3 ) 。k + 、 c 1 _ 从液泡流到胞质，再从胞质内流到保卫细胞的外部。现有的证据可推断：胞内受体调节液泡上 离子通道，胞外受体调节质膜上的离子通道。对液泡膜上的离子通道的研究还不多，现在大多数 研究集中于细胞膜离子通道。脱落酸可抑制内向钾离子通道，阻止胞外k + 进入保卫细胞，同时脱 落酸处理会引起质膜去极化。去极化与两种类型的阴离子通道有关，一是反应快的r 一型阴离子通 道，二是反应较慢的s 一型阴离子通道，它们均存在于保卫细胞并维持阴离子外流。其s 一型阴离子 通道能被脱落酸激活。虽然反应较慢，但可使细胞长时期保持去极化状态，而去极化是k + 外流的动 力，它能激活外向k + 离子通道，使胞内k + 离子浓度下降( s c h w a r t ze t a l 。1 9 9 5 ) 。阴离子通道抑制剂 能逆转脱落酸诱导的气孔关闭，进一步表明阴离子通道参与脱落酸对气孔的调节( s c h w a r t ze t 以， 1 9 9 4 ) ，而脱落酸对阴离子通道的调节与蛋白磷酸化和脱磷酸化有关。a r m s 舡o n g 等( 1 9 9 5 ) 和 h e y 等( 1 9 9 7 ) 应用抑制剂的实验结果也表明，k - 2 5 2 a 能干扰脱落酸对离子通道和气孔的调节及 对m r n a 的诱导。h e y 等( 1 9 9 7 ) 报道，蛋白激酶抑制齐j ( k - 2 5 2 a ) 、蛋白磷酸酶1 2 a 抑制剂 ( o k a d a i e a c i d ) 蛋白磷酸酶2 b 抑制剂( c y c l o s p o i n a ) 制脱落酸诱导的基因表达，蛋白激酶激活 剂( p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ) 、k - 2 5 2 a 和c y c l o s p o i n a 抑制脱落酸诱导的气孔关闭，o k a d a i c a c i d 则强化脱落酸对气孔的调节，这说明在脱落酸诱导基因表达和诱导气孔关闭过程中，蛋白激酶和 蛋白磷酸酶同时存在，但具体酶并不完全相同。 1 1 2 2a s a 信号转导路径中的胞内信使 c a “是很多激素信号转导过程中的胞内信使，在a b a 响应过程中，c a “可以被次级信使例 如c a d p r 、i p 3 或h 2 0 2 ( s c h r o e d e re la 1 ，2 0 0 1 ) 激活，保卫细胞中a b a 响应通常会伴随着 c a 2 + 瞬时升高和降低( 图1 - 1 ) ，即c a 2 + 的摆动性，构成对响应的基本的调节子( h i m m e l b a c h e t 口t 2 0 0 3 ) 。 磷脂类分子作为胞内信使参与了a b a 响应( 图1 - 1 ) ，例如a b a 信号转导中磷脂酶c ( p l c ) ( s a n c h e za n dc h u a ，2 0 0 1 ) 和磷脂酶d ( p l d ) 的活化分别产生了i p 3 和磷脂酸( 队) 次级信使 ( h a l l o u i n e t a l ，2 0 0 2 ：r i t c h i ee t a l ，2 0 0 2 ) ，在转基因烟草中研究表明降低保卫细胞中p l c 的表 达可以削弱a b a 诱导气孔关闭和抑制气孔开放的作用( h u n t 酣a 1 2 0 0 3 ) ， 另外，胞内p h 和氧化还原状态也作为关键因素参与了a b a 信号转导( h i m m e l b a e he 以， 2 0 0 3 ) 。保卫细胞内内源a b a 诱导的气孔关闭过程中发现有h 2 0 2 和n o ，而且这两种次级信使是 同病原体以及胞质c a “浓度增加相结合的。药理学研究发现c a d p r 和c g m p 对于通过n o 介导 的a b a 诱导的响应是必需的，表明n o 在胞质c a 2 + 浓度上游起作用。a b l l 和a b l 2 是对氧还状 态敏感的两种蛋白磷酸酶，h z o z 可以通过氧化其重要的半胱氧酸残基而使其失活。 4 1 1 2 3 默信号调节子 圈1 - 1 保卫细帕中枷信号转导示意田( h i r a mi b e , c h 时a l ，2 0 0