（动物学专业论文）小鼠不同发育阶段nos、no、et和cgrp在脊髓脑的表达.pdf

摘要 y 8 8 2 7 6 3 摘要 近年朱，随着人们对中枢神经系统研究的不断深入，新发现的神 经递质和一些多肽活性物质在中枢神缀系统的袭达变化砖老年多发疾 病的影响正受到越来越多的关注，对它们的研究已经成为发育神经生 物学的前沿。已知一氧化氮、内皮索帮降锈素基因相关默与中枢神经 系统关系密切，且在多种老年常见疾病中都发生了较为明显的含量表 达变化。本文试通过实验探索此三种因子在中枢枣申经系统的含量与年 龄的关系，以期对它们在中枢神经系统发育过程中豹作用提供些基 础资料。 本文选用健廉瑟明种雌性小自鼠，分为三个年龄段：1 5 2 0d 、 9 0 9 5 d 、约2 7 0 d 。用n a d p d 缀织化学技术、g r i e s s 诘帮放射性免疫 分析三静检测手段分别对一氧化氮合酶( n o s ) 在各年龄段小鼠脊髓节 段的表达，一氧化氮豫硝酸盐( n 0 2 ) 、肉皮素( e t ) 与降钙素基因鞠关肽 ( c g r p ) 在各年龄段小鼠大脑组织的含最进行了实验研究。 1 遂过n a d p h d 组化技术处理分橱，撂出n o s 在小鼠发育过程 中脊髓各段的表达随着年龄的增长黑下降趋势，其中老年鼠的变亿最 为显著，说明在发育过程中n o 的合成也裔所变化，对予研究n o 在 中枢神经系统的袭达具蠢一定意义。 2 g r i e s s 法测定实验观察到，小鼠大脑组织中的n 0 2 。随着年龄变 化浓度墨现出先升焉降的总体趋势，推测在大脑维织的成熟发育和衰 老过程中，n o 起到了一定的作用。 ， 3 放射性免疫分析实验最示：小鼠大脑组织中的e t 随着年龄 交化浓度并无明显的变化趋势，有文献报道巍浆中e t 与n o 在正常生 理状态下维持动态平衡，可能是由于不圈年龄躲平餐浓度不阉造成的； c g r p 在小鼠大脑组织中的含量与年龄的增长壁负相关，并且在每 个年龄段的波动幅度不同，证明在发育过程中c g r p 的含量与年龄变 化有一定的相关性，提示c g r p 对发育产生影晌。 以上实验结果为阐明n o 、e t 、c g r p 在哺乳动物中枢神经系统表 摘要 达含量变化与发育阶段的关系，以及它们在哺乳动物中枢神经系统的 发育过程中的作用提供了一定的信息，也为中枢神经系统抗衰老的研 究提供了一些思路。 关键词：小白鼠大脑脊髓n o sn 0 2 。e tc g r p a b s t r a c t 1 1 1r e c e my c a r s ，w i t ht h es t u d yd e v e l o p m e n to ft h er e s e a r c ho nc e n t r a l n e r v o u ss y s t e m ，t h er e l a t i o n s h i po fs o m en e w f o 姗dn e l l r o 仃r m s m i t t e r sa 1 1 d l i v e p 0 1 y p e p t i d e si nt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m 谢t 1 1t h ed i s e a s e st h a tt h ea g e do r e n s u f 话rf 如mh a sb e e np a i dm o r ca t t e n t i o nt o t h er e s e a r c ho nt h e s em a t e r i a lh a s a h a d yb e c o m et h ef 如n to ft 1 1 ed e v e l o pn e u r o l o g y s o m er e s e a r c h e ss h o wt h a t n i t d co x i d e 、c n d o t h e l i i la n dt h ec a l c i t o 血g e i l e r e l a t e dp 印t i d eh a v ei n t i m a t e r e l a t i o n s h i pw i t hc e n 仃a ：ln e r v o u ss y s t e m s ，a n dt h e i rc o n t e n tc h a l l g e so b v i o u s l yi n t h ed i s e 嬲e st h a tt h ea g e do f 【e ns u f k r e d 疔o m t 1 l i st c x tt r i e si n v e s t i g a t i n gt h e r e l a t i o n s h i p b e t 、e c nt 1 1 ec o m e n t so fm em r e es u b s t a l l c e si nc e n 订a ln e r v o u s s y s t e m sa n da g e ，i no r d e rt os t i l d ym e i r m c t i o n t l l i sc x p e r i m e n ts e l e c t e dh e a l t h yf 锄a l em i c eo fm es p e c i e si n i n g ， w h i c hw e r ed i v i d e di n t ot 1 1 r e ea g es e g m e n t s ：1 5 2 0d ，9 0 一9 5d ，a b o u t2 7 0 d t h e c o n t e n to fn i t r o g e ns y t h a s e ( n o s ) 、n i t r o s y l ( n 0 2 。) 、e n d o t l l e l i i l t ) a 1 1 d c a l c i t 0 1 1 i ng e n e - r e l a t e dp 印t i d e ( c g i 冲) i nc e n 订a 1n e n 的u ss y s t e m so fe v e r ya g e g r o u pw a sm e a s u r e d b yn a d p h d i p h o r a s el l i s t o c h e m i c a ls t a i 山g 、t h e 僦e s s m e m o da i l dm d i o i i m n u n 0 1 0 9 i c a la n a l y s i s 1 nw a sf o l l l l dt l l a tt l l ec o i l t c m so f n o si ne v e r ys e g m e mo fs p i n a lc o r d d e s c e n d e d 、i t hm ed e v e l o p m e l l to fm o u s e ，e s p e c i a l l y1 0 wi nm ea g e dm o l l s e s s p i l l a ic o r d s t h er e s u l ts h o w sn l a tt l l ec 伽叩o s i t i o no fn 0w 鹊c h a l l 百n g t l l r o u g h o u tt l l ed e v e l o p m e ，a n di ti ss i 砸丘c a t i o nt or e s e a r c h 土h ee x p r e s s i o no f n oi i lt l l ec e n t r a ln e n r o u ss y s t e m 2 t h ee x p 枷m e n to fn 0 2 。s h o w e d ，m ec o n c e n t r a t i o n so fn 0 2 w i 1 i i lt h e c e r e b n l mt i s s u eo fm o u s ew e r er i s ei 1 1t h cu p g r o w ma i l dd e s c c n di n 血ea 舀n g i t w a ss p e c u l a t 酣t h a tt l l en ot o o ka 1 1i n l p o r t a n tp l a c ei nm ed e v e l 叩m e mo f c e r e b l l 肺 3 t h er a d i o i m m u n o l o 西c a la n a l y s i ss h o w e d ：t h cc o n c e n t r a t i o n so fe t d on o tc h a n g eo b v i o u s l y 谢n lt h ea g e ，s o m ea m c l e sm e n t i o n e dt 1 1 a te ta n dn 0 k e h o m e o s t a s i s 溉b l o o d 撖恤ec o u r s eo fn a m r e ，p e o b a b l yd u et o 如ed i f f 醯e n t c o n c e n t r a t i o n si nd i f f e r e n ta g eg r o u p t h ec g r pc o n t e n t h a si n v e r s e c o r r e l a t i o nw “hm ed e v e l o p m e n to fm o u s e ，趿dm er 柚g eo fu n d l l l a t i o nw a s d i f f e r e n ti nd i 撩鹏h ta g e 黟o u p s 1 lc a nb ec o n c l u d e dm a 主c g 难c o n t e n t sh a s s o m er e l a t i o n s h i pw i t ha g ea n di tm i g h ti n f l u e n c et h ed e v e l o p m e n to f b r a i n 髓l er e s 心sa b o v ea r eh e l p 蠡| 1t oc l a 矗母m ec o n n e c _ i o nb o t w e e nt h ec o n t e n 虹 o f n 0 ，e t ，o g r pa i l dt 1 1 ed e v e l o p m 蝴ts t a g eo f m a n h n a l c e n t r a ln e r u ss y s t e m ， o f 融s o m ei n f o 】强戳i o na b o u t 镪e 釉l c t i o no ft h e mi n 攮0d c v e l o p m e n to f m a lc 翎订a 1n e r v o u ss y s t c 】= n ，a n dp r o v i d eat h o u g h t w a yf o rt h e s e a r c ho f a n t i 。s e n e s c e e e 1 辽y w o r 鑫s ：m o 醢s e ；溉遗；s p i 翦麓c o r 文的s ；n 0 2 ；e 羊；c g 瓣 i v 曲阜师范大学硕士论文小鼠不同发育阶段n o s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓脑的表达 1 1 前言 第一章引言 随着生物学技术的不断成熟和完善，推动了神经生物学、发育生 物学等领域的研究的进展，其中，一氧化氮、内皮素以及降钙素基因相关 肽由于在血管、神经等病理过程中起到了重要的作用，因而国内外诸多病理 及药理研究中多有涉及。目前已经了解：一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 和 内皮素( c n d o t h e l i n ，e t ) 是体内重要的生物活性物质，它们可由血管及机 体多种组织类型的细胞合成分泌，广泛参与人体生理、病理、生长发育与衰 老死亡等一系列重要过程。降钙素基因相关肽( c a l c i t o n i ng e n e r e l a t e d p e p t i d e ，c g i o ) 为机体神经免疫调节的介导物质之一，它和内毒索与失血 性休克以及出血性脑血管病的发生和发展密切相关。 1 2 课题目的及意义 1 2 1 一氧化氮及一氧化氮合酶 n o 是体内的一种重要生理功能调节物质，可调节血管扩张和神经传导 等多种功能。尽管某些n o 的特殊功能已被确证，但是，人们对其神秘的生 物化学特性却仍知之甚少。目前的研究已证明，n o 有三种状态存在于生物 体系中，包括阳离子形式( n o + ) 、自由基形式( n o ) 和阴离子形式( n 0 ) 【1 】。对生物体系中n o 三种形式的不同性质和反应活性的深入研究，可以帮 助人们理解其神奇的生理功能。n o 是一种重要的生物信使分子，参与血流 调节、信号传导、免疫防御等多种生理及病理过程【2 1 。在哺乳动物中枢神经 系统中，n o 在神经传导、记忆等过程中起重要作用，但在病理情况下，高 浓度n o 对人体可以有益( 如抗菌、抗寄生虫和抗病毒) ，也可以有害。在 体内，过量的n o 具有神经毒性，可导致多种类型的神经元凋亡。在脑缺血 损伤以及早老性痴呆( a d ) 、帕金森氏症 d ) 、肌萎缩性侧索硬化症( a l s ) 、 曲章师范大学硕士论文小鼠不同发育阶段n o s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓脑曲勺表达 小脑退行性瘸变等神缎退行性疾病发生发展的过程中，均伴随特定种类的神 经细胞发生过度凋亡，而n 0 引起的神经细胞损伤可能韪这些疾病的病原因 素之一瞰n 。因此研究n o 在中枢神经系统发商过程中的表达有助于加深对 这楚疾癍瓣谈识，对磷究n 0 奁发弯秘衰老中的作簿吴煮重要翡毽论及实舔 意义。 由于n o 结构简单又极不稳定，因此其合成过程中所依赖的酶一氧 纯氮合酶( n i t r i c o x i d eg y i l m a g e ，n o s ) 成为研究一氧化氮的途径之一。目前 戆研究表爨，n 。s 就怒莜赖还爨整辖酶i 的黄递酶”2 】。 o 荔扩散且反应萑 强，生物半衰期中有5 8 左右。冀蔻体必l 糖氨酸( o 缸g ) ，寒端鹁硝黢骣 在n o s 催化下氧化，释放出n o ，并产生剐产物l 。瓜氨酸。反应依赖n o s 、 c a 2 + 和锊调蛋白，底物l m g 的类似物如甲基精氨酸和硝基酸精氨酸可竞争 蛙缝柿铡n o s 。缀成静n o 可被氯裔由基、血红蛋囱、氢醌迅速灭活。在有 氧条 牛下，n o 主要恧稳定熬代谢产物是n 0 2 。秘硝酸盐n 0 3 ”。 本论文拟通过研究小鼠发育过程中n o s 教脊髓器段表达的变化以及亚 硝酸盐n 0 2 。在脑组织中含量的变化探究n 0 在发育和衰老中的作用和意义。 1 2 2 蠹皮素 e t 是目前已知具有强烈的缩血管作用的活性多肽物质。e t 作为一种重 要的神经肽在体内发挥着广泛的生物学效应，同时也发现e t 参与了多种出 盘榷窝缺盘浚藤攒害酌形成。e t 是1 9 8 8 年由y 勰a 啦s a w a 明等扶培养沟猪 主动脉内皮缨腿上= 毒液中分离缝化获褥鳇多黩，由2 l 令氨基羧缝艨，鸯3 种异构体，e t 1 ，e t 一2 和e t _ 3 。e t _ 1 主要由血管内皮细胞产生和分泌，参 与廊管活性的调节，还可在戚管平滑肌细胞、心肌细胞表达；e t 2 主要在肠 遂表达；e t - 3 主簧在肺、中枢神经系统和肠道表达。其中，b t 一1 怒目前己 翘的最强懿缕矗管物震，其受钵广泛分毒予盘管震嚣盘譬区。生瑾获态下， e t 。l 在中枢神经系统的主要作用是：( 1 ) 血管调节；( 2 ) 神经调节。蕊者魄作 用机制较清楚，收缩血管的效应主要题通过作用于血管区内皮索a 型( e t a ) 受体。但是e i 神经调节的作用机制还不清楚。因j 酾开究e t 对在哺乳动物 2 曲阜师范大学硕土论文 小鼠不同发育阶段n 0 s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓脑的表达 发育过程中中枢神经系统含量变化，尤其是在衰老过程中e t 与一些疾病的 患病机率的关系具有重要的意义。 1 2 3 降钙素基因相关肽 c g r p 是心血管系统的一种重要的调节肽，具有强大的舒张血管作用， 能明显地舒张冠状血管，降低冠状血管阻力，降低血压，增加冠脉血流量， c g r p 是目前发现的一种最强的冠状动脉舒张剂。另外，c g r p 还有保护细 胞，正性肌力和变时作用，改善血流变学作用，促进心房肽释放，拮抗e t 和血管紧张素等作用。有研究表明，c g r p 在神经系统亦有分布，具有扩血 管作用和神经保护作用，因此c g r p 与部分脑血管病的关系密切。所以研究 c g r p 在发育过程中神经中枢的含量变化对于研究c g r p 和发育( 尤其是衰 老) 之间的关系有重要的意义。 综上所述，本论文试通过实验探讨一氧化氮( 合酶) 、内皮素以及降钙 素基因相关肽在小鼠神经中枢发育过程中的表达变化，探索这三类物质对哺 乳动物中枢神经系统发育尤其是衰老的影响。由于三种物质都与血管舒缩有 密切的关系，拟通过实验探究三者在中枢神经系统中的表达含量是否有相关 或协作关系。 1 3 国内外研究状况和进展 1 3 1 一氧化氮相关 1 n o 生物活性的发现： 1 9 8 0 年，美国科学家f u r c h a o u t 1 4 】在一项研究中发现了一种具有使血管 平滑肌松驰作用的小分子物质，后来被命名为血管内皮细胞舒张因子 ( 胁d o t l l e l i u m d 砸v e dr e l a x i n gf a c t o r ，e d r f ) 是一种不稳定的生物自由基。 后来e d r f 被确认为是n o 。1 9 8 7 年，p o l i n c r 等在观察e d r f 对血管平滑 3 蘸牵蜂箍麦学颈“扛诠文枣蘸夺趟蓑蠹除艘n o s 、n o 、日辍r p 矗鹭瓣，癌热袭这 腮努张终熙的同时，瘸化学方法测定了悫皮缨腿释赦的躲黢先n 0 ，并握葵 含黧，解释了其对瓶管平滑肮舒张的程度。g a i l l w a i 协6 晰究发现n 0 在脑内 发挥缨腿阕倥使的髂鼹，现已确定，n o 广泛地存在于中枢摊经系缭蠹。崔 正常情况下，中枢及阉围神经系统内的n 0 灌一种熊调节细胞功能的信息分 予( 1 7 l ，参与记忆形成、脑觑流协调、血脓羼障等。在某些瘸理条传下，n 0 是参与稻叠森病、缺斑损伤等疾病避程静嚣要物质。 。 2 。一氧化缀合酶的住用与分布： 1 9 8 9 年k n o w l c s 等渊飘鬣酌翁脑中分离崮一种酶，它能催讫精氨酸函 衄妨产生n o 。圈兢已经缒化和毙隆的n o s 有3 种类型【1 9 】：神经型 瀚s 0 爨o s ) ，主要存在予大赫皮层、海马、绞欷俸、下聂赫、孛藏和，j 、脑等 处；内皮型n o s ( e n o s ) ，主要存在于脑血铐内皮细胞和海玛的锥体细胞；供 萼爱n 蕊螽n 0 s ，主要分窃予垂曦纲麓，夺茨覆囊艟，星黧胶覆缨麓，盘管 内皮细胞和瓶管平滑肌细胞蒋。 3 n o 筠生物学 蕈麓旺 ( 1 ) 在心血管袭统中的作用：n o 在维持血管张力的憾定和调节血压的 稳定牲孛怒整重要撵薅。 ( 2 ) 在兔疫系统中的作用：研究结果表明，n d 可以产生于人体内多种 缨骢。囊当薄蠹疼毒豢或善凝照激滔荩囔缨藤褒多耢援鑫缨黪嚣重，麓产生大 量的诱导型n o s 和超氧化物阴离予自由基( 凹) ，从而台成大量的n o 釉 珏2 镪，这在杀偌天侵麓缨藿、真蓥答疆生携巍蘩癣缨照、褰瓿吴糖及在灸臻 损伤方面起糟十分煎鬻的作用。 在耪经系绫率黪箨褥：育关l 趣g 一酚途径在串抠耱经系统e n s ) 方黼的研究认为，n o 通过扩散，侬用于柏邻的周围神经元如突触前神经术 携黎爨状黢痰缨鼹，再激活鸟营酸坏纯酶( g e ) 默嚣提舞环鸟营羧三磷酸 ( c m 佃) 水平而产戋l 三生理散应。如n o 可诱导与举习、记忆有关的长时穰 增强浚直( 洳n g - t 辨t 鼹畦疵蕊，班p ) ，磐在其l 墨p 孛莛蓬蕊袋嫠矮。 连续刺激小脑的上行纤维和平行纤维w 引起平行纤维细胞的神经传婵 产生长时程瓣毒龌k 融争e n n d 带e s 蠡瀚，王3 秘，被诀必是夺脑运魂学嚣体系串 的一种机制，n o 参与了该机制。 4 曲阜师范大学硕士论文小鼠不同发育阶段n o s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓脑的表达 在外周神经系统也存在l - a r g n 0 途径。n o 被认为是非胆碱能、非 肾上腺素能神经的递质或介质，参与痛觉传入与感觉传递过程。 4 n o 与脑疾病的关系u j ： ( 1 ) n o 与癫痫：n o 可调节递质的释放，并受内源性谷氨酸和r - 氨基丁酸 ( g a b a ) 能系统的调节，在致癫和抗癫中起重要作用。癫痫的发生主要与兴 奋性神经递质的增加或抑制性神经递质减少，神经元膜兴奋增加或抑制性减 弱有关。产生过量的n o ，可能是致癫的一个重要机制。陆巍 2 1 等观察青霉 素对大鼠海马脑片致痫时n 0 释放的变化，发现n o 的产生与致痫因子青霉索 浓度有正相关系，痫波的发展程度与n o 浓度变化也是一致的，当用n o s 抑 制剂使n o 浓度降低时，脑片痫波亦减少。提示了n o 可能参与了致痫作用。 硝普钠能在体内释放出n o ，能抑制青霉素诱发的癫痫样波的发放，说明n o 在中枢神经系统内源性抗癫痫过程中起重要作用。 ( 2 ) n o 与帕金森病( p d ) ：近年研究认为，n o 可能参与了帕金森病( p d ) 的发生及黑质细胞的损伤作用。在人体或m p t p ( 1 一甲基一4 一苯基一l ，2 ，3 ，6 一四氢 吡啶) p d 的动物模型的研究中发现，m p t p 在单胺氧化酶( m a o b ) 作用下转 化成活性产物m p p + ，m p p + 被多巴胺受体选择性摄取积聚于线粒体中，引起 线粒体氧化磷酸化的崩解，导致钙离子内流，从而激活n n 0 s ，致使n o 的大 量产生。过量的n o 具有细胞毒性作用，导致d a 能神经元的死亡，致使d a 含量显著降低。m a n e w s 等 2 2 】应用r 1 n o s 和e n o s 基因敲除的变异小鼠分别注 入m p p + ，发现n n o s 基因敲除的变异小鼠黑质神经元变性减弱，而i n o s 基 因敲除的变异小鼠无变化。以上研究说明n o 参与了p d 的发生发展过程。 ( 3 ) n o 与脑缺血( 或脑缺血再灌注、脑梗死、脑中风等的疾病) ：n o 在脑 缺血的过程中具有双重作用：增加皮层供血，缩小脑梗塞的面积；n 0 可以与缺血产生的自由基协同作用，造成神经细胞损伤。 脑缺血仅2 3 m i i l 后，n o 便迅速增加，6 m 协达高峰。这主要是缺血超 早期脑血管内皮细胞产生的n o ，对脑有保护作用即增加脑侧枝循环，阻止 血小板聚集和白细胞粘附而对微血管的阻塞，改善脑微循环；n o 氧化产生 的亚硝基离子，对n m d a 受体亚硝基化，减轻兴奋毒素对神经细胞的损害。 但缺血超过6 h ，i n 0 s 在炎症细胞部位表达，产生大量n o ，则引起迟发性 5 藏晕辨藏夫拳殒士论支 枣鼠平鼹发霄除段n o s 、n o 、甄帮c g r 舅董帮髓，藏蕊表达 藏搂侮，如n o 与n 0 2 反感生成过氧化硝鏊产镌，发挥缨飕毒 乍飕。n 0 远 可戳弓 起蘸麓耗竭，损伤曲n a ，猩不葡条件下触发细胞稠亡或引起细胞坏 死。盎此可见，n o 在脑缺盘损伤中的作用是剥是髂取决予缺盘产生的时段 及国什么细胞产生。 5 ，圜内步 研究现状 莓内外对n 0 瀚研究黼痫理嚣多，n o 在中稻卒串经系统的表达绝大部分 都是与学习记一眨有关或者与损伤修复机苇g 肖关。有关n o 在发育过程中含爨 表达变诧这类文章较少觅。戮诧，通过实验探索n 0 在中枢粹经系统发育菟 其是褒老道摆中含数表达变化对于研究它在不同教育阶段的作用机制有熬 要静理论韵实载意义。 1 3 2 蠹受素禳美 1 嚣霉鹈发现窝生耪学捧鼹： 1 9 8 8 年y a n a g i s a w a 【”l 籀人从培养的猪上皮缁胞中分离纯化出一种缩m 警躲矮著溺定了其氮基酸枣鼹，嚣其来源，将英翕察必亵液索，落就是今天 人们所知的内皮素1 ( e n d o t l l l i 1 ，e t 一1 ) 。e t 作为一个心血管的明星分予 窝重器生麓渣缝多瓤，嚣繁鹚磷究不霞渗爱嫒鳃会藏、蔽落、蹲解、势夺、 功能和生理作用，简且对予e t 在心血管痰瘸中的黛要意义也有较为深入的 骚究。宅楚缝盘彗紧张素嚣嚣夔一个最重要麓活搜多默。隧蓑e 芏磷究戆深 入，广大学前致认为它是种作用长久的，内生的，能使j 舡管收缩的肽擞 褥装。瑟嚣薯受俸豹广泛分蠢提示豫罄曩是一静重簧靛惑盘黪、审褪襻经等 系统的调节物。 已懿班霄戡：l 、e t 一2 、e t 3 三穆受鍪，e t 酌受锌券爵努淹三穗照墼 1 2 3 】。e t 受体属g 蟹自偶联鼹体，分为e t a ，e t b 和e t c 兰种类型，e t b 弼 可分麓翻隐l 霹翻麓疆穗亚黧。e 欺受体对嚣攀一l 器e t 2 静袋窝宓强予e f r 3 ， 主癸在血管平滑肌细胞和心肌细胞裁达，此受体被激动可引起血管收缩和平 澄腿绷飕增羧。e 强受体对3 静e t 器梅俸翡亲翳方橱等，主要在懿管蠹痰 细臌高度表述。也在血管平滑肌缅胞中表达。e t b 鼹体被激动可引起血管舒 6 曲阜师范大学硕士论文小鼠不同发育阶段n o s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓，脑的表达 张也可引起血管收缩，血管内皮细胞的e t b t 受体激动，可通过诱导n o 和 前列环素( p g l 2 ) 的释放使血管舒张，血管平滑肌细胞的e t b 2 受体激动使血管 收缩；此外，e t b 受体还帮助e t 一1 从循环中清除。e t c 受体对e t 一3 有高亲 和力，不在人体组织表达。 e t 通常以极低浓度存在于机体，发挥正常生理作用。它是目前已知作 用最强( 其缩血管作用强度至少是血管紧张肽i i 的l o 倍) 、持效最久的缩血管 物质，其中又以e t 一1 活性为最强。e t 的缩血管效应主要与其激动血管平滑 肌细胞的e t a 和e t b 2 受体有关。 e t 1 对心脏主要显示强烈的正性肌力和正性频率作用 2 4 1 ，对血管效应 依赖于e t a 受体和e t b 受体介导血管舒缩效应的平衡，血管平滑肌细胞e t a 受体的激活导致血管收缩、血压升高，而内皮细胞和肾脏的e t b 受体的激活 导致血管舒张和尿钠排泄，使血压降低l z 。 免疫组织化学和原位杂交等技术证实在大鼠脑组织的神经细胞、神经胶 质细胞和内皮细胞均有e t 1 和e t 一3 的表达；在大脑皮层、小脑、海马、 脑干的神经细胞和星形胶质细胞均有e t 受体的表达。在体和离体实验均发 现低浓度的e t 1 可选择性的激动e t b l 受体，使脑血管扩张，高浓度的e t 1 可通过激动e t a 受体使脑血管产生强烈的、长时间的收缩。总体来说，e t 能够收缩脑血管、调节脑血流，具有神经调质和神经毒性作用【2 3 】。 近年来e t 受体拮抗剂的出现和临床应用，又为e t 的基础和临床研究 注入了新的活力。此外e t 还在肿瘤、呼吸系统、肾病、糖尿病、和心源性、 败血性、出血性休克等疾病中具有重要的病理生理意义。 2 e t 与脑疾病的关系： e t 与脑缺血：e t 可引起脑血管和脑微血管收缩，导致脑缺血。临床研 究发现，在缺血性脑损伤( 如急性脑梗死和短暂性脑缺血发作) 时，血中e t 水平增加【2 “。急性脑梗死病人血浆e t 水平明显高于对照组，升高程度与病 情轻重及其是否伴有高血压有关：中、重型与轻型比较，重型与中型比较， 伴高血压的脑梗死者与单纯脑梗死者比较，差异均非常显著( 2 7 l 。这提示急性 脑梗死的发生、发展及预后与e t 水平密切相关，监测e t 水平的变化对于 判断病情轻重及估计预后有重要意义。 7 夔阜师范大学硕士论文小惑苓露发骞蹬袋k o s 、辩o 、基t 秽c g r p 在脊髓继戆袁选 脑缺瓶后e t 含成、释放增加，引起强烈的血管收缩，使缺盥区血流摄 迸一步减少，形成恶性循环。e t 1 还能导致谷氨酸等兴奋骸神经通质释放增 加，发挥神经毒性作用【2 肌，参与了缺血性脑损伤的发生。商文献撒道，大脑 中动脉附i 疆核团微缀注射靴一l ，可造成局灶性脑缺盎，并随着e t - l 剂量的 增加，血流减少期延长，脑损伤加爨f 2 8 】。选择性e h 受体摧抗剂的神经保护 终粥珏霹迸一步证实了e t l 在脑缺赢损伤对的意义。 有文献表明【3 0 】，老年人脑供血不足是e b 于舒血管物质减少而缩血管物质 增多，使盘管收缩及舒张功能改变所致，怒造成脑内神经元逐年递藏的一个 重要因素。老年人的血管活性障碍与糖尿瘸病人有相似之处，是由于体内非 酶游基纯产物静生溅，谈肉皮细稳麓链损害、肉凌豢( e t 一1 ) 及o n 0 0 “增多， 最终导致氧化应激。降低e t 1 水平可改善神经退行性病变，提高老年人的 智力凌箍秘熏活葳曩。 3 国内外研究现状： 国痰癸霄关e t 戆簿 究很多，大都集中在瓣癯、病瑾方瑟，大都是裁用 放射免疫法分析检测e t 在舡浆中的浓度，e t 在组织匀浆尤其是中枢神经系 统缍织驾浆中静浓发交纯方嚣蕊文肇较少焱蜀。毽忿，逶过实验搽索e | r 在 中枢神经系统发育尤其是褒老过程中含量变化对了解它的作用机制有重要 意义。 1 3 。3 降镌素基戮提关默摆关 l 。c g r p 的发现及生物学功韪：。 c g r p 是1 9 8 3 年r o s e i l f c l 护1 l 镲应用分子生物学技术发现的一种生物活 性多默，由3 7 个氨基酸组成。人验c g r p 蠢a 秘两静分予髟式，荚氨基酸 的缎成和序捌基本栩同。c g r p 作为人类利用基因驻组技术发现的第一个活 性多肽，臭窍多荤孛生理功能，其药璎 乍用没受到广泛重视。c g r p 鄹其受体 在体内分布广泛，怒迄今为止已知最强的扩血管活性肽。莉关研究很多，内 容镪援c q 潆在神经系统的分布、扩血管佟用、神经保护传殿及其与部分膝 血管病的关系等。 8 藏晕师范夫学颁论文，l 、戴币霹发苒除段n o s 、辩o 、e t 霉拜c g r p 在瓣越，齄瑟袭这 有文献认为f 3 2 】，c g r p 可能通过特异性受体发挥作用。在下丘脑、中麟、 脑子、脊髓均发现有c g r p 的特异性结合位点。在脑膜脑血管平滑肌、内皮 细胞膜上均存在c g r p 受体。在心血管系统中c g 】押不仅念量高，而且其受 体分布遣缀广泛，心房、心室和血管均有c g r p 静特异性结合位点【3 3 j 。入体 内c g r p 受体分为和b 两型。c g r p 与受体结合后，激活腺营酸环化酶， 使缁施内c a 重p 升瓶。通过第二信使c 蝴p 的中介作用而敷挥c g r p 生物活 性。关于c g i 珀的受体，目前认为至少存在两类，分别称为c g r p l 和c g r p 2 受体p “，霄些研究试为也翁其谴c g r p 受体珏羹，但此结论尚待迸一步确 定删。 2 c 疆谤与麓疾病镌关系： ( 1 ) c g r p 与脑缺血( 或脑缺血再灌注、脑梗死、脑中风等的疾病) ：张天 穗 3 壤等 较海马浚蠢及再灌漉螽发瑷，e g r p 含羹与c a l ，c a 2 ，c a 3 鞠 c a 4 区凋亡细胞数量显著性正相关。认为脑缺血及褥灌流詹c g r p 增加虽肖 可黥增鸯l 鏖貘袁，毽氇霹巍魅发髯滚流臻伤兹发室，蔼导数神经元猿亡。零 义猫等1 37 】发现脑梗死( c i ) 患者c g r p 水平显著低于对照组，动态观察发现c i 发瘸2 蘧凌帮显著终繇，2 艇与4 7 d 进多簿 蔻，8 1 5 d 开始务离，毽仍 明鼹低于正常对照缀，1 5 d 厩逐渐升至正常水平。随c 【病情严重程度的增加， 盘c g 襄p 瘩平显著簿低，羹大嚣拣c l 爨c g r p 承平也甓湿低予小瑟莰c 组。因此c 鞭冲在脑缺血中所起的作用较为复杂，有待进一步研究。 ( 2 ) c 磷潆与藏囊压1 3 8 l ：毫盘逶a 蹬) 静发病撰蒜l 十分复杂。遥年来掰突 表明，一些多肽类物质通过自分泌、旁分泌或神经分泌作用，对血管张力怒 羞璧蚕的塌第终眉+ c g 础具套强大弱骜张蠹管、繇低矗承熬终弱。骚突发 现，自发性简血压大鼠( s h r ) 血浆中的c g 】押浓度仅为正常对照大鼠的1 3 ， 两崧下丘脑粒主动脉组织中c g r p 又鹞显离子对照大鼠；绘s 珏r 黪脉注射 c g r p 可使赢压明显下降。临床观察，e h 艨者的c g r p 水平明显低于正常 人，提示从菜些组织释放c g r p 减少，使血浆中c g 薹潆浓度降低，送可能怒 高瓶压的发病原因之一。c 嵇强舒张血管作用强大，可降低衄压，增强心肌 收缩力，使心排血量秘心、膝、肾等蓬要脏器血流量增加，对改善心腿缺虫、 抗心律失常也有重要影响；c g r p 怒内源性物质，可自身调节和灭活，其特 9 曲阜师范大学硕= l 论文 小鼠不同发育阶段n o s 、n ne t 和c g r p 祉脊髓脑的表达 异性强、效力高、副作用小，在治疗高血压、脑卒中、充血性心力衰竭、心 律失常等疾病将发挥重大作用。但对其应用安全剂量、范围、患者对c g r p 耐受性及远期疗效如何，均有待于进一步研究。 3 国内外研究现状： 国内外有关降钙素基因相关肽的研究比较先进，关于c g r p 在脊髓和脑 损伤中的报道相对较多。研究集中在病理方面，采用放射免疫分析法与中枢 神经发育结合起来研究的文章还未查见。因此，通过实验探索c g r p 在中枢 神经系统发育尤其是衰老过程中含量变化对于研究它的作用机制以及发育 衰老变化有一定的理论及实践意义。 1 3 4 三者相互作用关系 e t 一1 是至今发现的最强的内源性血管收缩因子，它通过与内皮素受体 ( e t r ) 结合而发挥其收缩血管的作用；而n o 作为一种内源性血管舒张因 子，它可激活平滑肌细胞内g c ，提高c g m p 水平而发挥舒血管作用，二者 之间的动态平衡作用于血管平滑肌细胞。也有实验表明c g r p 与n 0 的含量 也有一定的相关关系。但有关三者在发育过程中表达含量变化的文章还未查 见。 本论文从研究小白鼠三个年龄段一氧化氮( 合酶) 、内皮素以及降 钙素基因相关肽在中枢神经系统的表达和含量入手，探讨三种因子在小鼠 神经中枢发育过程中的表达变化，探索这三类物质在哺乳动物发育过程中神 经中枢的表达或含量变化对哺乳动物发育尤其是衰老的影响。 1 4 论文各部分的主要内容 对于哺乳动物神经系统发育的研究，是发育生物学的重要前沿。 n o 、e t 和c g r p 均为有关神经调节的三种重要因子。针对目前此类 研究存在的主要问题和发展方向，本论文着重对三种因子及一氧化氮 1 0 曲阜师范人学硕士论文 小鼠不同发育阶段n o s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓脑的表达 合酶在小鼠脑和脊髓的含量变化进行了实验和理论研究。 论文的第二章介绍n o s 阳性神经元在不同年龄段小鼠脊髓各段的表 达，并对n o s 阳性神经元的分布和数量作分析。第三章分别阐述了作者 对n o 、e t 和c g r p 在不同年龄阶段小鼠大脑组织中含量变化的研究 结果，主要是对小鼠不同发育阶段三种因子在大脑组织的含量进行实 验观测，并对它们的含量变化与年龄变化的关系进行分析。 曲阜师范大学硕一k 论文小鼠不同笈曹阶段n 0 s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓脑的表达 第二章n o s 在脊髓的表达 2 1 实验一：观察n o s 阳性神经元在不同年龄段小鼠脊髓各 段的分布 用n a d p h d 组织化学技术观察一氧化氮合酶( n o s ) 阳性神经元在 不同年龄段小鼠颈、胸、腰骶髓的分布。并比较其不同以及与年龄变化的关 系。 动物体内n o 生物合成的唯一途径是一氧化氮合酶( n o s ) 的酶促反应， 底物为l - 葙氨酸，需要n a d p h 与0 2 参与。已经证明神经系统中的一氧化 氮合酶就是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶( n a d p h 黄递酶， n a d p hd i a 口h o r a s b ，n o p ) ，因_ 斯简便易行的n a d p h d 组织化学法在n o s 分布的研究中被广泛应用。 2 1 1 实验材料 1 实验用小鼠 所有实验小鼠均为健康昆明种雌鼠，购自山东济宁鲁抗医药公司实验动 物中心和济宁医学院动物中心。实验时根据年龄把小白鼠分为3 组：即幼年 ( 离乳，1 5 - 2 0d ) 、成年( 9 0 9 5 d ) 、老年( 以丧失生育能力为准，约”o d ) 三个 年龄段，体重分别为1 3 1 8 9 、3 2 3 8 9 、5 2 6 6 9 。每组1 0 只。提前购买小 鼠，先饲喂一段时间，让其适应环境的改变，以防应激产生对n o s 阳性神经 元的影响。 2 实验场所与预备试验 本实验过程主要在生命科学学院发育生物学实验室、现代生物技术实验 室。进行正式课题研究实验之前，首先用小白鼠做预实验，分别采用不同实 验条件，以确定展佳实验条件。 饲养条件：小鼠的生活环境要求安静、清洁、自然光照：鼠盒保持干燥 卫生，定期打扫、消毒；饲料、饮水充足，要求保持营养物质的平衡稳定 卫生，定期打扫、消毒；饲料、饮水充足，要求保持营养物质的平衡稳定， 曲阜师范大学硕= 论文 小鼠不同发育阶段n o s 、n o 、e t 和c g r p 在脊髓憎的表达 并富有蛋白质，否则会影响其生长发育和抵抗疾病的能力，从而影响正常状 态下n o s 阳性神经元分布与n 0 s 的活性。 3 健康小鼠的确定标准 该标准基本采用施新猷( 2 0 0 0 ) 的介绍 40 1 。健康小鼠一般为体型正常，体 态丰满，腿部肌肉结实，运动迅速活泼有力。眼睛明亮而有精神，反应敏捷， 食欲旺盛，被毛浓密而有光泽，不蓬松粗乱，呼吸正常，天然孔腔无分泌物， 无畸形，眼、脸、脚、尾不肿胀或溃烂，粪便黑色呈粒状等。饲喂期间每天 坚持观察上述各项指标，发现异常立即剔除。 4 主要试剂和其它试验用品 多聚甲醛( 北京化学试剂公司) 蔗糖( 天津大茂化学仪器供应站) p b s ( 按实验要求配制) n a d p h d( r d c h ed i a 弘o s t i c sc o r p o r a t i o n ) n b t ( 上海前进试剂厂) t 打t o nx 一1 0 0 ( 上海化学试剂公司) 二甲基亚砜( 天津化学试剂一厂) 生理盐水( 按标准配制) 乙醚 酒精( 天津鑫达医药化工试剂有限公司) 二甲苯 中性树胶 载玻片 盖玻片 5 主要仪器设备 半自动恒冷切片机：( l e i c a c m l 8 5 0 型，g e 刚j 钋) m o t i c 显微摄像系统：( m o t i cd m a 2 0 0 b 型，c h 矾a ；m o t i ci m a g e s a d v a n c e d3 2 ，c h i n a ) 移液器( 法国g 几s o n 公司) 电热吹风机( 1 6 8 型，莱阳电器制造有限公司) 1 3 l l | l 辜蜷范大学疆：b 论文小簸不同发育瓣段n o s 、n o 、e 下黧鱼垦塑奎登壁塑垫茎鉴 h a i e r 冰箱( h r 一2 1 5 s 型，中国青岛) 电子天平( f a l 0 0 4 n 蛰，上海精密科学仪器有限公司) 电热恒温干燥筱( 1 0 1 2 型，上海实验仪器总厂) 隔水式电热恒溢培养藕( g n p 9 1 6 0 型，上海精宏试验设备有隈公司) 6 实验处理 首先准确记录实验用小自鼠年龄，按年龄组编号，然辩将实验小自群称 重，并观测其身体健康状况。 2 1 2 实验方法 1 实验动物处理 将实验，l 、藏嗣乙醚麻静，快速打并藤靛，暴露心薤，赘开静赫窑，蠲0 9 生理盐水( 4 ，3 0 m l 1 0 0 m 1 ) 经左心室快速灌流冲洗血管床至流出液体 变漏，磊雳4 端多豢荦醛磷骏缓跨液( 4 ，5 0 m 】一1 3 隗1 1 ) 灌注圈定约2 0 3 0 m i i l 。灌滋完毕立即剥离出脊髓组织，浸入相同韵固定液中后固定2 h 左右， 经爱霾定熬喾髓组织置于2 0 蔗糖辚酸缓渖滚( 蕾1 7 2 7 ，4 ) 孛4 浸歪缝织沉 底。 将实验惩枣羲熬脊髓缝缀，攮援分残三邦分：瑷莰，麓段，麟繇段，雄 各切片。 2 冰冻切片 将组织块取出，做冰冻连续切片( 横切) ，厚度为2 5 肛m ，间隔3 片取l 片，切片爱将其收入5 蔗糖滚。甥片对的激发多按巷l 在。l o ，1 5 沟宣。冷 冻过度，切片易碎，也易损伤刀口；冷冻不怒，亦不能成片。切片操作时，动 传裳轻敏、连贯、暴叛且迅速，贴片时要迅速轻撼。否则，可能搜嘲片卷藏 而兹法贴片戚贴片时出现重叠，影响显微观察效果。 3 染色程序 进行述原型辅酶1 i p h d ) 组织化学染色，染色程序如下： ( 1 ) 漂洗：o 1 m o l l 磷酸缓冲液h 7 ，4 ) 漂洗3 次，每次5 m 弧。 ( 2 ) 孵育：反应时，切片入孵育液中3 7 避光染甑，约6 0 1 2 0 m m 。孵育液 1 4 曲阜师范大学硕二l 论文小鼠不同发育