（特种经济动物饲养专业论文）桑树转基因受体系统的建立及遗传转化研究.pdf

四川农业大学博士学位论文 桑树转基因受体系统的建立及遗传转化研究 中文摘要 桑树( m o r u sl ) 属多年生双子叶木本植物，是我国重要的经济树种，其叶片是 家蚕( b o m b y xm o r il ) 的主要天然饲料。因此，人们以获取桑叶为主要栽培目的， 桑树也是蚕丝业可持续发展的重要物质基础。此外，桑树的药用价值近年来也已成为 新的研究热点。 桑树的转基因研究虽然起步较晚，但己探明桑树是农杆菌的易感树种。应用农杆 菌介导法和基因枪法已将外源基因导入桑树体内，并在其中表达。迄今为止，成功转 入桑树的外源基因多为抗性基因，如：抗菌肽基因、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因 等，其他有价值的基因尤其是具有特殊性状或高经济价值的基因转化研究较少。同时， 桑树转基因也存在着再生体系建立困难，基因型依赖性强，转化效率不高等问题。在 前人工作基础上，本研究从建立桑树高频再生体系入手。通过进一步优化遗传转化因 素，建立了农杆菌介导的新的完整遗传转化系统。并应用此遗传转化系统，成功地将 毛白杨生长素内运载体基因转入桑树，以期改善其经济性状。主要研究结果如下。 l 利用生物信息学软件和生物信息数据库资源，对前期克隆的毛白杨生长素内运 载体基因p t a u x l 及其编码的蛋白p t a u x l 进行了生物信息学分析。结果表明， p t a u x l 成熟肽编码区全长17 6 0b p ，该序列包含有一个14 3 1b p 的开放读码框架， 编码4 7 7 个氨基酸；p t a u x l 蛋白定位于细胞膜上，共有9 个强的跨膜区域；其二级 结构含有丰富的a 螺旋和大量的随机卷曲区域，仅有少量的1 3 折叠区域。同时发现存 在一个a a _ t r a r t s 保守结构域。p t a u x l 与1 2 个蛋白具有较高同源性。其中与p t x p t l a x l 的亲缘关系最近，同源性高达9 7 。 2 研究了新型植物生长调节剂噻重氮苯基脲( t h i d i a z u r o n ，简称t d z ) 对桑树不 同外植体愈伤组织诱导及不定芽分化的影响。结果表明，t d z 对桑树幼茎、叶柄和 子叶的愈伤组织诱导有极显著的影响。o 5 1 0m g 几的t d z 可以使幼茎、叶柄和子叶 提早2 3d 产生愈伤组织；在m s + t d z0 5m g l + n a a0 2m g l 培养基上，幼茎， 叶柄和子叶可获得9 1 6 1 0 0 的愈伤诱导率。t d z 对桑树外植体愈伤组织的诱导 四川农业大学博士学位论文 存在显著的基因型差异，在供试的4 个桑品种中，陕3 0 5 诱导效果最好，大1 0 最差。 对所获得的愈伤组织进行不定芽分化诱导，结果幼茎和叶柄的愈伤组织分化率不到 1 0 ，子叶的愈伤组织分化率也只有5 8 ，说明其诱导及分化条件尚需进一步探索。 3 采用正交试验设计法，探讨了培养基中t d z 含量、n a a 含量、叶位、叶龄及 品种对叶片愈伤组织诱导的影响，同时研究了b a ，i a a 及糖类对愈伤组织分化的影 响，筛选得到了桑树叶片愈伤组织诱导及不定芽分化的最佳条件。愈伤组织诱导：叶 龄为1 5 - 1 8d 的试管苗叶片，培养基为m s + t d z1 0m g l + n a a0 2m g f l ，果糖2 ，琼脂粉o 6 ，p h5 6 ；不定芽分化：培养基为m s + 6 b a 3 0m g l + i a a o 1m g l ， 果糖2 ，琼脂粉0 6 ，p h5 6 。在此条件下，陕3 0 5 叶片愈伤诱导率为9 3 8 ，不 定芽分化率可达1 0 0 ，平均分化芽数5 个成功建立了桑树叶片高频再生系统，此 系统再生频率可达到9 3 8 。抗生素敏感性测定表明，该系统完全可以用于遗传转化 研究。 4 通过对浸染农杆菌菌液的浓度、浸染时间、共培养时间、共培养基的口h 值和 共培养基中a s 的添加浓度等5 个影响桑树遗传转化效果的主要因素进行优化，得到 了桑树叶盘转化的最佳条件，建立了完整的桑树遗传转化体系。最适叶盘转化体系为： g v 3 1 0 1 浸染菌液浓度o d 6 0 0 为0 2 0 3 ，浸染时间l o 1 5m i n ，共培养时间2 3d ，共 培养基p h 值5 4 ，共培养后直接进行抗性筛选。 5 应用建立的桑树遗传转化系统对陕3 0 5 和大1 0 两个桑品种进行了毛白杨生长 素内运载体基因p t a u x l 遗传转化，结果在大量受体材料中筛选到了9 个株系的i o n 抗性苗，经p c r 鉴定、s o u t h e r nb l o t t i n g 和n o r t h e r nb l o t t i n g 检测，证明包括两个品种 的5 个株系已成功导入p 叫嘲基因，并且外源基因在m r n a 水平上进行了表达。 6 将毛白杨生长素内运载体基因p t a u x i 克隆于p e t - 2 8a ( + ) 表达载体，并在大 肠杆菌b l - 2 1 中诱导表达。利用纯化的p t a u x l 蛋白作为抗原，成功地制备了p t a u x l 的多克隆抗体。对转化植株幼叶总蛋白进行w e s t e m b l o t 分析，结果经s o u t h e r n 杂交 和n o r t h e m 杂交检测阳性的5 个转基因株系均有较强的杂交信号产生，表明桑树转毛 白杨生长素内运载体基因p t a u x i 获得了成功。 关键词：桑树；毛白杨生长素内运载体基因：遗传转化；再生体系；农杆菌介导法 四川农业大学博士学位论文 e s t a b l i s h i n gah i g h - e f f i c i e n tt i s s u ec u l t u r es y s t e m a n de x p l o r i n gg e n et r a n s f o r m a t i o ni nm u l b e r r y w a n g y a n w e n ( s p e c i a le c o n o m i ca n i m a lr e a r i n g ) d i r e c t e db ym uz h i m e i a b s t r a c t a sa ni m p o r t a n te c o n o m i ct r e es p e c i e si nc h i n a ，m u l b e r r ym o r u sl i sap e r e n n i a l w o o d yp l a n tw i t ht w i nc o t y l e d o na n di t s l e a fi st h em a i nn a t u r a lf o r a g ef o rs i l k w o r m b o m b y xm o r il t h e r e f o r et h em a i np u r p o s eo fm u l b e r r yc u l t i v a t i o ni sl e a fp r o d u c t i o na n d t h es u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n to fs i l ki n d u s t r yw i l lr e l yo nm u l b e r r ya si t s m a t e r i a lb a s e i n a d d i t i o n , t h em e d i c i n a lv a l u eo f m u l b e r r ya l s oh a sb e i n gt h eh o tr e s e a r c hs p o t sr e c e n t l y t h er e s e a r c ho fm u l b e r r yg e n et r a n s f o r m a t i o nw a ss t a r t e dr e l a t i v e l yl a t e ，b u ti t i s a l r e a d y k n o w nt h a t m u l b e r r y i ss e n s i t i v et o a g r o b a t e r i u m u s i n ga g r o b a t e r i u m t u m e f e c i e n s - m e d i a t e dm e t h o da n dg e n eg u nm e t h o d ，t h ef o r e i g ng e n ew a st r a n s f e r r e di n t o m u l b e r r ya n dt h eg e n ee x p r e s s i o ni ss u c c e s s f u l s of a r , m o s to f t h ef o r e i g ng e n e st r a n s f e r r e d i n t om u l b e r r ya r er e s i s t a n c eo n e s ，s u c ha sc e c r o p i ng e n ea n d o r y z a c y s t a t i ng e n e ，a n di ti s s h o r to ft h er e s e a r c ho nt r a n s f o r m a t i o no fo t h e rv a l u a b l eg e n e ，e s p e c i a l l yt h eg e n e sw i t h s p e c i a lp r o p e r t i e so rh i ：g he c o n o m i cv a l u e m e a n w h i l e ，t h e r ea r em a n yp r o b l e m si nm u l b e r r y g e n et r a n s f o r m a t i o n , s u c ha st h ed i f f i c u l tt oe s t a b l i s h i n gr e g e n e r a t i o ns y s t e m h i g hr e l i a b i l i t y o ng e n et y p e ，l o wt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y b a s e do nt h ew o r ko fp r e d e c e s s o r s ，t h i ss t u d y e s t a b l i s h e dt h en e wc o m p l e t e g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mu s i n ga g r o b a t e r i u m t u m e f e c i e n s - m e d i a t e dm e t h o d , t h r o u g ht h ee s t a b l i s h m e n to fm u l b e r r yh i g hf r e q u e n c y r e g e n e r a t i v es y s t e ma n dt h eo p t i m i z a t i o no f g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nf a c t o r s a n db ya p p l y i n g t h i s g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，t h ea u x i ni n f l u xc a r r i e rg e n eo fp o p u l u st o m e n t o s a p t a u x lw a st r a n s f e r r e di n t om u l b e r r ys u c c e s s f u l l yi nt h eh o p et o i m p r o v ei t se c o n o m i c p r o p e r t i e s t h em a i nr e s u l t sa l et h ef o l l o w i n g ： 1 u s i n gt h eb i o i n f o r m a t i c ss 0 1 a r ea n dd a t a b a s e ，a n a l y z e dt h eb i o i n f o r m a t i c so ft h e a u x i ni n f l u xc a r r i e rg e n ep t a u x ia n di t se n c o d e d p r o t e i no f p o p u l u st o m e n t o s a , w h i c hw a s c l o n e dp r e v i o u s l y n 抡r e s u l ts h o w nt h a tt h et o t a ll e n g t ho ft h ee n c o d e da r e ao fp t a u x i m a t u r ep e p t i d ei sl7 6 0b p 砸ss e q u e n c ei n c l u d e da no p e nr e a d i n gf r a m ew i t ht h el e n g t ho f l4 31b p ，e n c o d i n g4 7 7a m i n oa c i d ；p t a u x ll o c a t e do nt h ec e l lm e m b r a n e t h e r ea r et o t a l l y 9t r a n s - m e m b r a n ea r e a s ；i ni t ss e c o n di e v e ls t r u c t n r e , t h e r ei n c l u d ea b u n d a n ta l p h ah e l i xa n d 四川农业大学博士学位论文 r a n d o m l yc o i la r e a , b u to n l yf e wb e t as t r a n da r e a m e a n w h i l e ，a l la at r a i l s c o n s e r v e d d o m a i nw a sd i s c o v e r e d ah i g hc o n s a n g u i n i t yw a sf o u n df o rp t a u x la n d1 2p r o t e i n s a m o n gt h o s e 。t h ec l o s e s tr e l a t i o n s h i pi st op t p 也a x l ，w i t h t h ec o n s a n g u i n i t yl e v e lo f 9 7 2 t h ee f f e c to f t l l i d i a z u r o n ( t d zi ns h o r t ) t ot h ec a l l u si n d u c t i o no f d i f f e r e n te x p l a n t s o fm u l b e r r ya n dt ot h ed i f f e r e m i a t i o no fa d v e n t i t i o u sb u d w a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h et d zh a de x t r e m e l yr e m a r k a b l ee f f e c to nt h ec a l l u si n d u c t i o no ft h ey o u n gs t e m p e t i o l e a n dc o t y l e d o n o f m u l b e r r y t d z w i t h t h ec o n c e n t r a t i o n o f 0 5 - 1 0 m g l c a n m a k e t h e y o u n gs t e m , p e t i o l ea n dc o t y l e d o nt op r o d u c ec a l l u s2 - 3d a y se a r l i e r o nt h em e d i u mo f m s + t d z0 5m g l + n a a0 2m g l ，t h ec a l l u si n d u c t i o nr a t ei s9 1 6 - - 1 0 0 f o ry o u n gs t e m ， p e t i o l ea n dc o t y l e d o n t h e r e e x i s t sn o t a b l ed i f f e r e n c eo ft d zc a l l u si n d u c t i o na m o n g d i f f e r e n tg e n et y p e s a m o n gt h e4t e s t e dm u l b e r r yv a r i e t i e s ，t h eb e s ti n d u c t i o ne f f e c ti sf o r s h a n3 0 5a n dt h ew o r s to n ei sf o rd a1 0 t h er e s u l t so fa d v e n t i t i o u sb u dd i f f e r e n t i a t i o n i n d u c t i o nt ot h ec a l l u ss h o w e dt h a tt h er a t eo fd i f f e r e n t i a t i o no ft h ec a l l u sf o ry o u n gs t e m a n dp e t i o l ei sl e s st h a n1 0 a n dt h a tf o rc o t y l e d o ni s5 8 孤sm e a n st h a tf u r t h e rs t u d y s h o u l db ed o n et ot h ec o n d i t i o no fi n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n 3 u s i n go r t h o g o n a le x p e r i m e n td e s i g n i n g ，t h ee f f e c tt ot h el e a fc a l l u si n d u c t i o nf r o m t h et d za n dn a ac o n t e n ti nt h em e d i u m ，t h ep o s i t i o no fl e a f , t h ea g eo fl e a fa n dt h e v a r i e t i e sw a si n v e s t i g a t e d ，m e a n w h i l e ，t h ee f f e c tt od i f f e r e n t i a t i o no fc a l l u sf r o mb a ，i a a a n ds u g a rw a sa l s os t u d i e d t h r o u g hs e l e c t i o n , t h eb e s tc o n d i t i o nf o rt h ei n d u c t i o no fl e a f c a l l u sa n dt h ed i f f e r e n t i a t i o no fa d v e n t i t i o u sb u dw a sg o t t h eb e s tc o n d i t i o nf o rt h ec a l l u s i n d u c t i o ni s ，a g eo f t h em u l b e r r yc u l t u r e di nv i t r o ：1 5 1 8d ，m e d i u m ：m s + t d z1 0m g l + n a a0 2 m g l ，f i - u c t o s e ：2 ，a g a r ：o 6 ，p h ：5 6 ；a n d t h a tf o ra d v e n t i t i o u sb u d d i f f e r e n t i a t i o ni s ，m e d i u m ：m s + 6 - b a3 0m g l + i a ao 1m g l ，f r u c t o s e ：2 ，a g a r ：0 6 ， p h ：5 6 b a s e do nt h i sc o n d i t i o n , t h el e a fc a l l u si n d u c t i o nr a t ef o rs h a h3 0 5i s9 3 8 。t h e a d v e n t i t i o u sb u dd i f f e r e n t i a t i o nr a t ec a nb e1 0 0 ，t h ea v e r a g en u m b e ro f d i f f e r e n t i a t i o nb u d i s5 t h em u l b e r r yh i g h 丘e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y , a n di t s r e g e n e r a t i o n 丘e q u e n c yi s9 3 8 t h es e n s i t i v i t yt e s tt oa n t i b i o t i cs h o w e dt h a tt h i ss y s t e mi s r e a d yt ob eu s e di ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nr e s e a r c h 4 t h eb e s tc o n d i t i o nf o rm u l b e r r yl e a ft r a n s f o r m a t i o nw a sg o ta n dt h ec o m p l e t e m u l b e r r yg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e dt h r o u g ht h eo p t i m i z a t i o no f t h ef i v e m a i nf a c t o r sw h i c ha f f e c tt h em u l b e r r yg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nr e s u l t ：t h ec o n c e n t r a t i o no f t h ea g r o b a t e r i u ml i q u i d , t h et i m eo fi n f e c t i o n , t h et i m eo fc o - c u l t u r e ，p hv a l u eo fc o - c u l t u r e m e d i u m , t h ea d d i t i o nc o n c e n t r a t i o no fa si nc o - c u l t u r em e d i u m t h em o s ts u i t a b l el e a f t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a sg o t ：g v 3 1 0 1i n f e c t e dl i q u i dc o n c e n t r a t i o no d 6 0 0i s0 2 0 3 ， 婴业奎些查兰堡主兰堡丝苎 一一 i n f e c t i o nt i m ei s1 0 1 5 r a i n , c o c u l t u r et i m ei s2 - 3 d ，p hv a l u eo fc a ) 一c u l t u r em e d i u mi s5 4 ， a n dr e s i s t a n c es e l e c t i o nb ed o n ei m m e d i a t e l ya f t e rc o - c u l t u r e 5 a p p l y i n gt h ee s t a b l i s h e dm u l b e r r yg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mt op e r f o r mt h e g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fa u x i ni n f l u xc a r r i e rg e n ep t a u x l ，t ot h et w om u l b e r r yv a r i e t i e s ， s h a h3 0 5a n dd a1 0 a sar e s u r , 9k m - r e s i s t a n c es h o o t sw a ss e l e c t e da m o n gt h ea b u n d a n t r e c e i v e rm a t e r i a l a f t e rp c ri d e n t i f i c a t i o n , s o u t h e r nb l o t t i n g a n dn o r t h e r nb l o t t i n g h y b r i d i z a t i o n , i ti sp r o v e dt h a tt h ep t a u x ig e n ew a s t r a n s f e r r e di n t of i v es h o o t so ft h et w o v a r i e t i e ss u c c e s s f u l l ya n dt h ef o r e i g ng e n ew a se x p r e s s e do nm r n a l e v e l 6 t h ea u x i ni n f l u xc a r d e rg e n ep t a u x lw a sc l o n e di n t op e t - 2 8 “+ ) e x p r e s s i o n c a r r i e r , a n dw a si n d u c t e dt oe x p r e s s i o ni ne c o l ib l 一2 1 u s i n gt h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n t p t a u x lp r o t e i na sa n t i g e n , t h ep t a u x lp o l y c l o n a a n t i b o d yw a sp r o d u c e ds u c c e s s f u l l y t h r o u g hw e s t e r nb l o ta n a l y s i st ot h et o t a lp r o t e i no fy o u n gl e a fo ft h et r a n s f o r m e dp l a n t s ， a n dt h es o u t h e r na n dn o r t h e r nh y b r i d i z a t i o nt e s t , a l lt h ef i v ep o s i t i v ep l a n ts y s t e m sc a n p r o d u c es t r o n gh y b r i d i z a t i o ns i g n a l ，t h i sm e a nt h et r a n s f o r m a t i o no f t h ea u x i ni n f l u xc a r r i e r g e n ep t a u x lt om u l b e r r yw a s s u c c e s s f u l k e yw o r d s ：m u l b e r r y ；a u x i ni n f l u x c a r r i e rg e n eo fp o p u l u st o m e n l o s ap t a u x l ； g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ；r e g e n e r a t i o ns y s t e m ；a g r o b a t e r i u mt u m e f e c i e n s - m e d i a t e dm e t h o d 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 己力羔一一年孑月，日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名： 弘一占年3 只f 占b ， 疗5 年孑只6 b 殳孑六 彦兰 己勿矿 四川农业大学博士学位论文 第一部分文献综述 第一章生长素极性运输研究进展 生长素( a u x i n ) 是最早发现的植物激素，生长素生物学是试验植物研究最古老 的领域。c h a r l e sd a r w i n ( 1 8 8 0 ) i l 】进行了早期的生长素研究试验，观察推测有一种物 质调节植物芽伸长和对光向性的作用。d a r w i n 的试验是对c i e s i e l s k i ( 1 8 7 2 ) t z l 研究 检测根向地性弯曲试验的延伸。1 9 3 4 年k i j g l 等人从燕麦胚芽鞘中分离纯化出刺激生 长的物质，经鉴定为吲哚乙酸( i a a ) 。生长素是植物生长所必需的，作为关键的植 物激素，生长素调节植物的许多进程，如对光和重力的反应、根和芽的构造、器官的 模式、液泡的发育和生长等脚。 i a a 不仅分布在高等植物体内，而且在细菌、真菌、藻类中也有i a a 存在。i a a 在高等植物体内分布很广，根、茎、叶、花、果实、种子及胚芽鞘中都有分布，但大 多集中在生长旺盛的部位。如胚芽鞘、幼嫩的种子和果实，芽与根尖的分生组织、形 成层、受精后的子房等( 4 1 。 自二十世纪3 0 年代起，生长素具有极性运输( p o l a ra u x i nt r a n s p o r t ) 的特性( 即 生长素在茎中向基部运输而在根中向顶部运输的现象) 陆续被实验所证实口i 。天然生 长素( i a a ) 和人工合成生长素( 如2 ，4 d 和n a a 等) 在植物体内也均表现出极性 运输 6 1 。在目前已知的植物激素中，只有生长素具有极性运输的特性。因此，人们很 自然地把植物的极性发育、分化、生长等生理现象与生长素的极性运输联系在一起， 例如植物的顶端优势现象、维管组织的发生以及向性生长等【7 i 。 早期对生长素极性运输的研究主要采取外源施加极性运输抑制剂的方法，如萘基 酞氨酸( n p a ) 、三碘苯甲酸( t i b a ) 等。近年来，通过对生长素极性运输突变体的 研究，进一步发现了极性运输与花的发育嘲、胚胎的形态建成以及维管的分化1 9 1 等现 象之间的联系。尤其是从极性运输突变体中克隆的一些生长素转运载体基因，从分子 水平上为生长素极性运输的化学渗透偶联学说提供了新的证据 t o t s l 。这些基因的克隆 为我们利用基因工程调控生长素的极性运输提供了基础。通过构建组织特异表达的载 体转化植物，从而改变特定器官的生长素极性运输水平，有望对生长素的极性运输与 植物的生长发育提供更深入的了解1 7 1 。 四川农业大学博士学位论文 1 生长素极性运输的生理特点 生长素的极性运输( p o l a ra u x i nt r a n s p o r t ) 是生长素所特有的一类从细胞到另一 细胞的运输，是一个需要消耗能量的逆生长素浓度梯度的运输过程。 1 9 2 8 年，荷兰科学家w e n t 建立了经典的生长素极性运输检测分析方法。向植物 组织的一端供应生长素( i a a ) ，然后在另一端用琼脂块收集激素。结果发现外加的 生长素在茎组织中只能从形态学的顶端运向基部，而与重力的作用无关i “l 。后来，应 用放射性同位素示踪等方法证实了生长素在植物茎中由上至下的运输1 1 7 1 q 。现代分子 生物学研究表明，生长素也通过茎端分生组织和新形成的叶原基细胞侧部表皮细胞向 端部移动1 1 9 l 。在根部生长素也存在明显的自上而下和自下而上的运输渠道。自上而下 的生长素运输发生在根中柱组织中，而自下而上的运输则是通过侧面和根冠的表皮组 织实现的p , 7 o - 2 ”。 上述研究表明，在大多数植物组织中，生长素的极性运输仅局限于某些特定的细 胞。目前可以明确的有：在维管组织中存在着一股从茎端到根尖的生长素极性运输主 流，在双子叶植物的茎中极性运输主要是通过围绕维管束的已经延伸的薄壁细胞进行 的。在根的不同组织中存在着两种截然不同的运输，在中柱细胞中由根基向根尖的向 顶式运输和在表皮细胞中由根尖向根基的向基式运输【”。 除极性运输外，生长素还可以在植物的维管系统中运输。例如，对成熟的叶片施 加的外源生长素可以像光合作用的产物一样通过韧皮部运输，然后转移到极性运输系 统。此外，有研究表明生长素还可以通过木质部的蒸腾流向上运输。在这些维管系统 中，生长素的运输与其他营养物质的运输并没有区别”。 生长素极性运输的方向取决于生长素运输载体( 蛋白) 的分布；而生长素极性运 输的速度则明显低于维管系统中的运输速度。 2 生长素极性运输的机制 2 1 生长素极性运输的化学渗透偶联学说 对于生长素极性运输的机理人们曾提出过许多不同的假说。其中以r u b e r y 和 s h e l d r a k e ( 1 9 7 4 ) 及r a v e n ( 1 9 7 5 ) 分别独立提出的化学渗透偶联学说较普遍为大家 所接受，并不断得n t 完善和补充。r u b e r y 和s h e l d r a k e 发现了生长素的极性运输需 2 四川农业大学博士学位论文 要载体介导；r u b e r y 则提出细胞内外的p h 和电势差对生长素极性运输具有决定作用。 生长素极性运输的化学渗透偶联学说由此形成【1 7 l 。该学说提出后，仅需稍加修改便可 解释许多生长素极性运输相关的生理现象，因而得到了普遍的认同。 现已知i a a 可以有三种不同的途径通过细胞质膜：( 1 ) 以自由扩散的方式从细 胞壁进入细胞质；( 2 ) 通过内运载体( i n f l u xc a r r i e r ) 的帮助进入细胞；( 3 ) 通过外 运载体( e f f l u xc a r r i e r ) 的帮助从细胞质进入细胞壁。生长素及其类似物可以使第二 条运输途径达到饱和。而生长素的运输抑制剂如n p a 和t i b a 等只能特异性地抑制 第三条运输途径，但不影响i a a 进入细胞的第一条和第二条途径1 2 ”。 生长素极性运输的化学渗透偶联学说的基本观点是：在酸性的细胞壁中，生长素 以弱酸的形式经载体协同运输的方式进入细胞；一旦进入中性的细胞质，生长素主要 以离子的形式存在并在细胞中大量积累；离子形式的生长素通过分布于细胞基部的离 子载体顺浓度梯度输出细胞，正是由于输出载体在细胞中的极性分布决定了生长素的 极性运输；生长素极性运输所需的能量是由跨膜质子电位提供的川。 根据这一假说，细胞质膜内外的p h 不同。膜外细胞壁中的p h 约为5 ，内部细 胞质中的p h 为7 。在细胞壁中，i a a 离子与旷质子结合形成了i a a h 分子。该分子 与i a a 。离子相比具有较强的亲脂性，因而更容易经过被动扩散通过细胞的双层脂膜 进入细胞。第二条途径，即通过载体( 内运载体) 的帮助，i a a 离子与两个h + 质子 以共同运输的方式进入细胞。由此可见，i a a 可以通过上述两种方式进入细胞。但二 者相比，途径二占主导地位，自由扩散的作用是微不足道的。在p h 较高的脂膜内部， 即细胞质中i a a h 分子重新离解形成i a a 。和h + 。i a a 离子难于通过脂膜，因而逐渐 在细胞中积累。这样，由于细胞质膜内外的p h 梯度，使得i a a 能够不断地进入细胞 质中。实验证明，以这两种途径进入细胞质中的i a a 可积累高达1 0 1 0 0 倍。与p h 梯度相伴随的是电化学梯度。细胞质膜外部相对于内部呈正电性。位于质膜上的由 a t p 驱动的质子泵不断地将细胞内部的质子送出膜外，以维持膜内外的p h 梯度和电 化学梯度。膜两侧的p h 梯度和电化学梯度驱动着细胞对i a a 的吸收和积累。随着细 胞质中i 从。离子浓度的增加，细胞中的i a a 可以通过极性分布于细胞质膜底部特异 的i a a 载体蛋白( 外运载体) 运出膜外。在膜外，i a 又可通过途径一和二进入下 一个细胞。如此循环，使i a a 极性运输得以持续不断地进行。 生长素极性运输的模型见图1 1 。 四川i 农业大学博士学位论文 图1 - 1生长素极性运输模式图 f i gi - ip o l a ra u x i nt r a n s p o r t 2 2 生长素极性运输的载体 生长素在植体内的正确分布是控制生长发育的决定因素之一。生长素以极性运输 的方式从细胞移向另一细胞。生长素极性运输是由内运载体和外运载体共同控制的 【1 5 1 2 2 1 生长素内运载体a u x l 从拟南芥中克隆的a u x i 基因为生长素极性运输的化学渗透偶联学说提供了第一 个分子证据。拟南芥a u x l 突变体根的生长对生长素的敏感性下降，并丧失根的向地 性反应。通过t - d n a 标签法，b e n n e t t 等( 1 9 9 6 ) 叫1 从拟南芥基因组中分离到了a u x l 基因。序列分析表明该基因编码的产物具有多个穿膜伸展螺旋。同源性比较的结果表 明该蛋白与植物中的氨基酸通透酶( p e r m e a s e ) 同源，暗示a u x l 蛋白可能亦具有运 输氨基酸类似物的能力。由于i a a 在结构上与色氨酸类似，因而a u x l 蛋白可能具 有运输生长素的能力。从运输机理来看，植物氨基酸通透酶与生长素的内运载体具有 共同的运输方式，即通过质子驱动的协同运输。因此a u x l 蛋白很可能作为内运载 体参与了生长素的吸收。原位杂交结果表明a u x i 基因在控制根的向地性反应的根尖 组织中表达，并且主要在根的表皮细胞中表达，这表明a u x l 蛋白可能参与了生长 素从根尖向根基的运输。 因此，认为a u x l 是生长素的内运载体。这一推测的证据还包括a u x l 突变体幼 苗对生长素的敏感性与传递体的稳定性有关，a u x l 对2 , 4 d 和i a a 的内向运输有阻 抗作用，但对n a a 不敏感，而n a a 可恢复突变体幼苗的向地反应等。 4 四川农业大学博士学位论文 生长素内运载体调节生长素的极性运输被认为是生长素长距离运输的唯一机制。 生长素长距离运输而仅在局部组织和细胞诱导基因表达，是植物形态建成的重要机制 1 2 3 1 。拟南芥生长素透过酶a u x l 定位于根尖，表明i a a 韧皮部基向运输途径的存在。 s w a m pe t a l ( 2 0 0 4 ) z q 对拟南芥a u x l 结构与功能的最新研究表明，a u x i 定位 于细胞膜，含有1 1 个跨膜区域，有力地支持了上述观点。 2 2 2 生长素外运载体p i n l 利用免疫组织化学方法，j a c o b s 和g i l b e r t ( 1 9 8 3 ) 首次在豌豆的茎细胞膜上发现 了一类极性分布的膜成分。该成分的单克隆抗体可影响n p a 与之结合。由于n p a