（作物遗传育种专业论文）根癌农杆菌介导BG2基因遗传转化花生的研究.pdf

莱阳农学院硕士学位论文 摘要 根癌农杆菌介导b g 。基因转化花生的研究 摘要 花生是重要的油料兼经济作物，真菌病害是花生的主要病害，导致其产量和 品质严重下降。单纯依靠常规育种方法很难选育出对真菌病害高抗的品种。而利 用遗传转化将外源基因导入花生栽培种则应具有一定的可行性。本研究首先对花 生组织培养植株再生方法进行研究，建立了胚小叶高效再生体系，然后利用遗传 转化体系，通过衣杆菌介导法，将b 一1 ，3 葡聚糖酶基因转入花生品种花育2 2 ， 以提高花生抗病性。主要研究结果如下： l 彳1 用8 个花生品种对花生组织培养进行研究，结果表明：( 1 ) 基因型对再 生率有很大影响，不同花生品种的愈伤组织形成和不定芽发生有明显的差异。( 2 ) 花生外植体对花生组织培养的植株再生具有很大影响，胚小叶的芽诱导率明显高 于子叶、胚轴、胚根等其它外植体。( 3 ) 胚小叶的叶龄对不定芽诱导有很大影响， 萌发5 、6 天的种子的胚小叶有利于诱导不定芽的形成，其中萌发6 d 的胚小叶最 高，芽诱导率为9 1 3 。( 4 ) 以花生胚小叶作为外植体用于组织培养离体再生， 具有取材简单，来源丰富，再生率高的优点，可将其用于农杆菌介导的基固转化。 ( 5 ) 不同培养基对不定芽的伸长有很大影响，试验发现，添加4m g 仃。b a p 的培 养基，芽伸长比较明显，添加i o m g l b a p 的培养基中芽丛生明显。 2 确定了k m 的选择压，芽诱导培养基中添加k m 最低浓度为5 0 m g ，l 可有 效抑制非转化愈伤组织的形成或芽再生。添加5 0 0 m lc b 可有效抑制衣杆菌 l b a 4 4 0 4 的生长，且对花生外植体的再生无显著影响。 3 ，对农杆菌介导遗传转化的适宜条件进行研究，结果表明：( 1 ) 预培养3 天的花生胚小叶外植体最适宜进行基因转化。( 2 ) 菌液浓度对转化率影响较大， 以o d 。，= o 1 为最好。( 3 ) 适宜侵染时间为1 0 1 5 m jn ，转化率较高。( 4 ) 农杆菌 共培养时间3 d ，转化率较高。( 5 ) 种子萌发后6 d 的胚小叶为受体转化效果最 好。 4 将d l ，3 一葡聚糖酶基因转入花生栽培品种。 利用优化的遗传转化体系， 以萌发6 d 的花生品种花育2 2 的胚小叶为外植体，经农杆菌l b a 4 4 0 4 侵染，k m 筛选和标记基因p c r 检测，得到目的基因转化植株。 5 确立了衣杆菌介导途径进行花生遗传转化的技术规程：选用花生品种白 沙l o l 6 或花育2 2 的成熟饱满的种子。经表面消毒后，接种于催芽培养基上， 取萌发6 d 的胚小叶，接种于m s b 5 + 6 o m lb a p + 1 om ln a a 培养基上预培 莱农学院硕士学位论文l ：i 要 养3 d 。用活化的农杆菌重悬浮菌液( o d = 0 4 ) 浸染l o 一15 m j n ，共培养3 d ，经 7 0 0 m lc b 浸泡冲洗后， 转接到 m s b 5 + 6 o m g l b a p + 1 o m g l n a a + 5 0 k m + 5 0 0 c b 筛选培养基上继续培养。3 w 后，将带抗性芽点的愈伤转接 到m s b 5 + 1 0 m lb a p + 5 0 k m + 5 0 0 c b 的再生筛选培养基上诱导丛生芽。2 w 后将 丛生芽转接到m s b 5 + l o m lb a p + 5 0 k 埘+ 5 0 0 c b 的培养基上促进芽的伸长，每 2 w 继代一次。当芽伸长到3 4 c m ，转到m s b 5 + 0 5 m l n a a + 5 0 k m + 5 0 0 c b 培养 基中诱导生根。 关键词：花生( 爿忉9 9 p ) ；再生体系；根癌衣杆菌；遗传转化；d l ，3 葡聚糖酶基因( b g ：) 型圈丛堂堕堡：! 望：焦堡塞 垒堡! ! 堡垒笪! s t u d ie ；so fg e n e t i c7 i _ r a n s f o 啪a t i o no fb g 2g e n ei n t o p e a n u t ( 4 r 以c 矗括矗胗0 _ g 口p 口l ) m e d i a t e d b y 彳g m 6 以c f e r i “，船f “，押l 可白c 把门s a b s t r a c t p e a n u t ( 一埘c 括j 卯o g n e dl ) l sa ni m p o n a n lo i la n dc o r n m e r c i a lc r o p ，b u tf u g ld i s e a s ei si t sm a m p 】a n cd l s e a s e ，w h i c hs e r i o u s l yf e d u c e si 1 5y i e l da n dq u a l i t yi ti sd i m c u nt oso l v em j sp r o b l e mb yl r a d 砸o n a j b r e e d i n gm e t h o d ，b u t1 lc o u l dp o s s i b l yb es o l v e db yt r a n s f o r n l i n ga n l i _ f u g a lg e n ei op e a n u tc u l t i v a r s i nt h i s p a p e lt 1 1 ee 壤c i e n tp l a n tr e g e n e m i o ns y s t e n lo fp e a n u tt i s s u ec u l “l r ew a se s t a b j i s h e d w n hi h i ss y s f e m ， b 一1 ，3 一g l u c n a s eg e n er n e d i a t e db y 爿r “，”电加c f p sw a si n t r o d u c e di n t op e a n u tc u l t i v a r sh u a y un o 2 2 t h e r e s u l c sw e r es h o w e da sb e l o 砒 1t h et i s s u ec u l t u r ea n de 历c i e n tp l a n tr e g e n e r a “o no fp e a n u tw e r es t u d i e db yu s i “g8g e n o t y p e s ： ( t h ef e q u e n c i e so fa d v e n t i t i o u ss h o o tf o m l a t i o nw e r ed i f k r e n td u et oc h ee 。p l a n tt y p e s ，t h ey o u n g l e a n e t s w e r eo b v i o u s l ys u p e r i o r t oe p j c o t y l ，h y p o c o t y l sa n dc o t y l e d o n ( 2 ) t h e 丘e q u e n c i e s o f a d v e n t i i i o u s s h o o if o r n l a t i o nw e r ed i 舵r e n td u et oi e a a e ta g e s ，5 6 dy o u n gl e a n e t sa r ep r o p i t i o u st ol n d u c ea d v e n “e i o u s s h o o tf o r m a t i 叽( 3 ) t h ec o n c e n l r a i i o no fn a aa n db a pa d d e dt oi n d u c t i o nm e d i u mi n n u e n c e dm e f r e q u e n c yo f a d v e 埘t l o u ss h o o tf o r m a t i o n ( 4 ) t h ey o u n gi e a n e t sr e g e n e r a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e d 2 r p s e a r c ho ns e l e c t i o na m i b i o c i cs h o w s ：t h ef e l t r a t i o nm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i l h5 0m g lk m ， c a ne f h c i c n t l yi n h i b i tc a l l u sf 0 皿a t i o na n ds h o o t sr e g e n e r a t l o nf r o mi e a n e t smp e a n u t t h eb a c l e n a ls t r a i n m e d i u ns u p p l e m e m e dw i t h5 0 0m lc bc a ne m c i e n t l yi n h i b i lt e s i e d b a c t e 八a 1s t r a i n s ，l b a 4 4 0 4 铲o w i n g a n di t se 宅c to n 丘e q u e n c yo f m u l l i p l eb u d sf o 咖a t i o nf 吣m1 e a n e t sd o e sn o ts h o ws t r o n gd i f k r e n c e 3s t u d y o n i n n u e n c m g f a c t o f so f p e a n u t g e n e l l c t r a n s f o 啪a t i o n ：( 1 ) p r e c u i t i v a t l o n f 。r3 d i ss u i i a b l e f o rt r a n s f o n n a t i o n( 2 ) d i f r e r e n c eo f b a c t e r i a lc o n c e n t r a t l o na f r e c t e df k q u e n c yo f g e n e t i ct r a n s f o m l a t i o n ， s u i t a b l eb a c t e r l a lc o n c e n t r a t i o nw a so d 6 f = o 4( 3 ) s u l t a b l ei n f e c t i o nt i 眦w a s1 0 m i n 一1 5 m i n ( 4 ) c o n i l t j v a t i o nf o r3 di ss u j t a b l ef o rt r a n s f o m a t l o n ( 5 ) y o u n 2l e a n e t so f6 da r ef a v o r a b l ef o r t t 口1 1 s f o n n a t i o n 4 b l ，3 一o l u c n a s eg c n em e d i a t e db ya t u m e f a c i e n sw a si n t r o d u c e di n t op e a n u tc u l “v a lh u a y u n 0 2 2p c ra n a l y s i sc o n f i n n e dt h ei n t e g r a t i o no f b g 2g e n ei n i ot h eg e n o m eo f t r a n s g e n i cp l a n i s 5t h et e c l m i c a l 5 p e c m c a t i o n l n p e a n u tg e n e t i c t r a n s r o m a t l o nm e d i a t e d b y 爿g 阳胁c 地r ，n m 珊可a c 据，站w a se s t a b l i s h e d ：s i xd a y sa g eo fy o u n gl e a n e t so fp e a n u tc u l t i v a r sh u a y un o 2 2w e r e p r e c u l t l l r e di nm s b 5 + 10m g ，ln a a + 6 om g lb a pf o r3 d t h ep r e c u l t u r e de l p l a n l sw e r ei n f e c t e d b y 爿g m 6 c 把r i “， m m 咖c 把门5l b a 4 4 0 4 ( 0 d 6 0 0 = o 4 0 ) f o r1 0 1 5m i n a f t e rb e j n gc o - i n c u b a t e d3 d ，a n d s o a k e di n7 0 0 m e ，lc bs o l u t i o nf o rs e v e r a lm l nt ok i l l 月g m b n c f e r f “m 1 e 向c 汜h s ，e x p l a n t sw e 托 t m n s f e r r e dt os e l e c t i v em e d i u mm s b 5 + lom g l n a a + 60m g 几b a + 5 0 n l g lk m + 5 0 0m g 厂lc ba n e r s e l e c t l v e l vc u l t l l r e d3 w 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油料作物和经济作物之一，在世界植物油资源中占第四位，约占世界油料作物的1 4 。 在世界上与人类生活攸关的栽培植物中，按其重要性来说，花生排列第十三位 ( m a n g e l s d o rf 等，1 9 6 1 ) 。 花生是我国单产、总产和出口创汇最高的油料作物和重要经济作物，我国是世界上 花生产量最高、消费量和贸易量最大的国家。花生是我国净出口的大宗油料作物之一， 是我国主要油料作物和经济作物，栽培面积仅次于油菜，占油料作物总面积的1 4 ，占 总产量的4 0 ( 孙大容，1 9 9 8 ) 。山东省是我国生产花生最多的省份，花生在山东农业 和人民生活中居重要地位。 花生根据品种的不同，从种植到收获，其生长周期为4 、5 个月左右，其用途十分 广泛。花生籽仁中含有高达4 5 5 5 的脂肪和2 7 3 0 的植物蛋白( 王树安，1 9 9 9 ) ， 居各作物之冠，具有很高的营养价值。花生油稍具坚果仁( 核桃仁) 香味，油中游离脂 肪酸含量仪为o ，0 2 o 6 ，较棉籽油、菜籽油等其它植物油具有气味清香、滋味纯正 等特点，= 诈且富含不饱和脂肪酸、维生素e 等保健因子，是人们最喜爱的食用油之一。 花生的蛋白质含量高于猪肉，营养价值与动物蛋白相当，不含胆固醇和乳糖，赖氨酸含 量比粮食制品高3 5 倍，能促进儿重脑细胞发育，同时富含增强成人汜忆力的谷氨酸、 天门冬氨酸。在美国，它作为人的主要食品，占有独特的位置。在其他国家花生作为食 ，i 和蛋白质来源的地位也在日益提高。 花生可以加工成花生粉、组织蛋白、分离蛋白和浓缩蛋白。花生粉和各种蛋白又可 用来制作面包、面条、饼干及其他糕点等的添加剂，以改善食品品质并增强风味：作为 食品添加剂，既可提高食品营养价值，还可以制造人造奶、人造肉等。花生饼粕含有5 0 左右的蛋白质，高于其他饼粕，且无毒性和异味，是食品加工的优质原料和农牧业中牲 畜和水产养殖的优质饲料。花生的其他副产品综合利用途径也很多，在工业上，花生果 壳可以制成板材、胶粘剂、酱油以及活性炭、糠醛、醋酸、醋石等化工原料。在医药上， 红皮花生的种皮( 红衣) 是一种中药，有很好的l j 二血作用，可制成“止f f f l 宁”和降低血压 莱阳农学院硕十学位论文苫 的药品。因此，花生是继大豆之后，又一个新兴食品工业原料。 总之，花生不仅是一种优良的油料作物，而且是一种优质的营养作物。它还在改造 人类食品结构，提高人民生活水平方面，具有重要的作用。可见，进一步发展我国花生 生产具有非常重要的意义。 1 2 花生转基因研究的意义 经过多年的努力，常规育种手段培育了大量花生新品种，极大地推动了花生生产的 发展。然而，传统的育种方法杂交、杂交后代性状的分离和对表现型后代选择，实现 对基因型的改良，但由于不甚了解遗传背景，环境效应较易掩盖基因效应，因而对目 标性状的选择费时费力，很难达到预期结果。其次，传统育种方法不宜打破基因连锁， 优良农艺性状与不良农艺性状的连锁使得将一个优良的农艺性状固定到一个栽培品种 中去十分困难，往往需要很长时问。再者，传统育种方法受种间杂交的限制，难以克 服远缘杂交不亲和性和不育性。这些问题，限制了杂交育种途径选育高产、优质、抗 逆性强或特用花生新品种工作的高效性( 周桂元，1 9 9 9 ) 。 体细胞杂交法作为克服花生属种间杂交不亲和性及利用花生属野生种质资源的一 种方法，在目前还只是处在一个探索阶段，成功获得花生与其野生种之间的体细胞杂 种，从目前的研究情况看还存在着较大困难，还需要做大量工作。 克服上述问题的另一种方法是遗传转化法：近年来花生遗传转化研究的发展为育 种开辟了一条新途径。分子生物学的发展和植物转基因技术的应用，使人为将有益目 的基因定向转移到农作物中以提高其抗性、改良其品质成为可能，也为花生的品种改 良捉供了有效手段。 j i 幽一哳擎是人们利用现代分子生物学理论与技术，按照预先设计的蓝图，从不同生 物中分离或人工合成的外源基因在体外进行酶切和连接，对决定生物遗传性状的d n a 进行构建、修饰和改造，构成重组d n a 分子，然后导入受体细胞，使新的基因在受体 细胞内整合、表达，并能通过无性或有性生殖过程，将外源基因遗传给后代，由此获得 的基因改良作物称为转基因作物( g e n e t i c a l l y m o d m e dc r o pg m c 或t r a n s g e n i cc m p ) 。 1 9 8 4 年，h e r r e r a e s 行e l l a 等首次利用农杆菌t i 质粒把外源基因导入烟草获得成 功。随后，水稻( t 0 r i v a m a 等，1 9 8 8 ；s h i n l a m o t o 等，1 9 8 9 ) 、小麦( v a s i l 等，1 9 9 1 ； c a o 等，1 9 9 2 ) 、玉米( g r i m s l e y 等1 9 8 7 ；k o z i e l 等，1 9 9 3 ) ；大豆( h i l l c h e e 等，1 9 8 8 ) 等重要农作物转基因也相继获得成功。i s a a a 年度报告指出，自1 9 9 6 年转基因植物首 次商品化以来，全球转基因植物种植面积从当初的6 国1 7 0 万公顷增加到2 0 0 5 年的2 1 国9 0 0 0 万公顷。2 0 0 5 年全球有2 1 个国家的大约8 5 0 万农民种植了2 2 2 亿英亩的基因 柴m & 学院硕十学位论文h u 再 工程农作物，与2 0 0 4 年相比，提高了1 1 。转基因植物严j j k 将成为2 l 世纪的经济增 长点，预计全球生物技术作物市场将从2 0 0 5 年的5 25 亿美元增长为2 0 0 6 年的5 5 亿美 元。转基因农作物之所以能够获得如此迅速的发展，是因为它能够为人类解决人口增长 与耕地面积减少提供一条新途径，能够为降低农业生产成本，提高农业生产效率增加 农民收入，满足粮食需求，保障食品安全等提供有效手段。目前，大面积种植的转基因 农作物主要集中在大豆、玉米、棉花、油菜等作物上。但基因工程技术作为一种新的育 种方法与常规技术结合己极大地促进作物遗传育种的效率。 花生作为一种世界性经济作物和油料作物，其遗传转化研究比较薄弱，花生被认为 是较难转化的作物之一( 闫新甫，2 0 0 3 ) 。近年来，研究人员一直致力于花生遗传转化 体系的建立和优化，并取得了定进展。已利用农杆菌介导法，基因抢轰击导入法，电 激法和p e g 介导法等将外源基因转入花生，获得了转基因植株，但仍然存在着再生和 转化率低、受品种基因型的限制等难题。因此，进一步深入研究影响花生组织培养的诸 多因素，优化和完善花生组织培养体系，建立高效、稳定的花生遗传转化系统，对利用 基因工程的方法提高花生的抗病、抗虫能力和改良花生的品质具有重要的实践意义和理 论价值。 2 花生转基因研究进展 2 1 花生组织培养 花生组织培养对花生品种改良、遗传转化、种质保存和抗性突变体的筛选等具有重 要意义。建立花生外植体的高效再生体系，也是遗传转化在花生育种上成功应用的必要 条什之。 近r 术，花生组织培养的研究越来越系统化，分别利用不同的外植体，通过不同 n 1l i j - 小途杼捩得了再生植株。 笫一，通过胚胎发生的再生途径。h a z m 等报道阱含3 m l2 ，4 一d 的m s 培养基， 诱导3 6 m m 的未成熟种胚直接形成体胚，每个外植体形成8 1 5 个体胚，而n a a 没有诱导效果，b a k e r 等报道2 0 m g l2 ，4 一d 效果最好，随浓度的提高，胚性愈伤形 成比例下降，光和暗培养对体胚形成效率没有影响，但对体胚性状影响很大。光照条 件下形成的体胚粗糙，木质化，难以分离；暗培养形成的体胚光滑，易于分离。未成 熟种胚取材受季节限制，且刚出土的荚果和胚不易消毒，胚性愈伤长期保存易出现变 异等缺点。所以b a k e r ，c h e n g a 】r a y a n 等分别以成熟种子为材料建立通过体胚发生再生植 株的体系。c h e n g a i r a y a n 等以胚小叶为外植体，在添加2 0 m g l 的2 ，4 一d 的m s 培养 柴m 农学院硕十学位论文l j u 鬲 基上诱导胚性愈伤组织，转到添加3 m g l 2 ，4 一d 的m s 培养基上2 0 d 内有9 0 的愈 伤产生体胚，但其植株再生率为2 4 7 ；b a k e r 等人用种胚作外植体诱导胚性愈伤和体 胚，在添加1 3 6 u m2 ，4 一d 和0 9 3 u mk t 的m s 培养基上、暗培养，6 7 的外植体产 生体胚：“v i n g s t o n e 等为进一步完善诱导条件，在添加5 m lp i c l o r 砌的m s 培养基 上暗培养6 周，珍珠豆型品种g a j a h 每个种胚平均产生6 3 个体胚，普通型品种n c 一7 平均产生1 4 3 个体胚，并应用渗透剂干燥处理，使得体胚萌发长出枝条百分率提高到 6 0 ：c h e n g a l r a y a n 等人用添加2 ，4 d 的m s 诱导培养基，转移到添加8 9 u m b a p 和 1 4 u mk i n 或添加2 2 7 u mt d z的m s 培养基上，使体胚的植株再生率分别提高到8 6 和9 2 。另外，o z i a s a k i n s ( 1 9 8 9 ) ：d u r h a m & p a 兀_ o t t ( 1 9 9 2 ) 以花生未成熟胚为外植体、 h a z r ae ta 1 ( 1 9 8 9 ) 以花生胚轴为外植体、b a k e r & w e t z s t e i n ( 1 9 9 2 ) 以花生小叶为外植体， 均通过体胚发生获得了再生植株；b a k e re ta i ( 1 9 9 4 1 以花生未成胚轴和子叶为外植体， 系统研究了光周期和培养基的组成对体胚发生的影响；，m h a s k e 等( 1 9 9 8 ) 研究了a b a 对体胚发生的影响：c m b a k e r 等( 1 9 9 8 ) 系统研究了小叶的叶龄和培养基对体胚发生 的影响。翟桢等( 1 9 9 3 ) 及徐平丽等( 2 0 0 0 ) 利用花生幼胚培养诱导体细胞胚胎发生 进而获得了再生植株。董金铎等( 1 9 8 9 ) 、夏连胜等( 1 9 9 0 ) 、徐平丽等( 1 9 9 9 ) 、晏立 英等( 2 0 0 0 ) 、周蓉等( 1 9 9 9 ，2 0 0 1 ) 及张书标等( 1 9 9 8 ，2 0 0 1 ) 分别通过胚轴培养、 胚根培养、子叶培养、幼叶培养等诱导胚状体形成、愈伤组织形成及植株再生也已经 陆续获得成功。 第二：以幼i 叶或胚小叶为外植体，通过器官发生的再生途径。方小平等( 1 9 9 6 ) 以 鄂化p q 、中仡四号等三个品种的4 天幼叶为外植体，应用“n g s t o n e 方法，外植体愈 伤纰钐怫i 芽诱导率提高到8 6 一1 0 0 ，外植体产芽数在5 个以上；m c k e m l y 等以花生品 干l | f 1 0 r 画a n t8 天苗龄幼叶为外植体，比较了l 、3 、5 、1 0 的b a 浓度，得出添加5 m l b a p 和1 m g ln a a 的m s 培养基最优，9 0 以上的外植体长出愈伤组织，其中3 8 长出芽点，转至添加5 m l b a p 的m s 培养基上，8 4 长出枝条，供试2 0 个品种再生 效率差异明显；e a p e n 等( 1 9 9 3 ) 以1 0 一1 2 d 的幼叶叶盘为外植体，在添加1 0 u mb a p 和o 5 u mi a a 的m s 培养基上，约1 3 外植体长出枝条，平均每个外植长出7 个； l i n g s t o n e 等( 1 9 9 5 ) 已成熟种子胚小叶为外植体，在添加3 m l b a p 和l m g l n 从 的m s 培养基上培养6 周，供试两品种分别为3 0 和6 0 外植体长出愈伤和芽点，转 到添加5 m g l b a p 的在分化培养基上，有助于芽点伸长；方小平等人( 1 9 9 6 ) 在实验 中发现，在添加1 m l n a a 和3 m l b a p 的m s 培养基上，小叶经2 l 天培养形成带 绿色芽点的愈伤，转至添加5 m 卫l 的m s 培养基上，有利于芽点的伸长，且在培养基 中添加5 0 0 m g l 羧苄青霉素和l m l a g n 0 3 ，不但能有效抑制愈伤组织褐化坏死，且 莱阳农学院硕士学位论文 h u 再 对芽分化也有一定的促进作用；张书标等( 1 9 9 8 ) 用花生幼苗叶节为外植体，诱导产 生大量的丛生芽。庄东红等( 2 0 0 0 ) 从萌发9 d 的花生幼叶上切取中段做外植体芽诱 导率为7 8 9 ；陈出强等( 2 0 0 0 ) 以花生成熟胚培养成的无菌苗叶节为外植体，在高 浓度的6 b a 的培养基中先诱导丛生芽，然后将诱导丛生芽转至新丛生芽诱导培养基 中，诱导率为9 8 7 ；庄振宏等( 2 0 0 1 ) 以4 d 龄的泉花1 0 号花生小叶为外植体，7 5 以上的小叶为外植体长芽点。周敏等( 2 0 0 2 ) 研究了谷氨酰胺和硝酸银对花生幼叶芽 诱导的促进作用，得知两者同时添加时的效果最明显，芽诱导率提高到9 0 2 ，并能 有效防治褐变。林荣双等( 2 0 0 3 ) 以花生实生苗幼叶为外植体，研究了t d z 对不定芽 和体胚的诱导，并作了组织观察。m c l e n t l ye ta l ( 1 9 9 0 ，1 9 9 1 ) ；c h e n ge ta 1 ( 1 9 9 2 ) 分别以 花生子叶、小叶、叶柄、上胚轴为外植体，通过器官发生的途径，分别获得了再生植 株。 花生作为一种大粒豆科植物，通过组织培养再生植株存在很多困难。尽管近年来 有关的研究报道日益增多，通过器官发生和体细胞胚发生途径均已获得再生植株，但 多数试验集中在诱导体胚或不定芽阶段，并且仍存在植株再生频率低、体细胞胚畸形 等困扰：晏立英】等( 2 0 0 0 ) 报道，花生的再生与其基因型关系密切。为了将生物技术 方法成功应用于花生育种工作，还必须对多种基因型进行研究，建立多个品种的高频率 干i ! f 株阿生体系，为花生的遗传转化工作在花生育种上的应用奠定基础。 需要指出的是，以花生的幼芽、胚芽、胚轴、叶节、茎节等存在分生组织的部位 作外植体诱导不定芽发生，可甩于基因工程中建立植株再生体系，所以，为使遗传转 化在花生育种上的应用成为可能，必须首先探索出一套适合遗传转化的花生组织培养 的有效植株再生体系。 2 2 花生遗传转化研究进展 细胞遗传转化是指利用重组d n a 技术、细胞组织培养技术、外源基因导入技术等， 将外源j i 导入植物的基因组中，使之在受体细胞中表达，获得转基因植物的技术。遗 f 0 转化投术使人们能够按照意愿定向的改良作物种性，克服传统育种方法的不足之处， 为育种开辟了一条新途径。从开始仅利用细菌、病毒的基因逐渐发展到直接从高等植物 中分离调控生长、发育、代谢的基因，随着植物组织培养、原生质体培养技术、目的基因 的分离及载体的构建和遗传转化技术的完善和发展，将有用的基因导入植物细胞中，并 再生出转基因植株已经在多种作物育种中成为现实。花生的组织培养开展得较早，遗传 转化在花生育种上应用起步却较晚，但近几年来国内外花生遗传转化的研究发展很快。 莱| j l ：| 农学院硕二k 学位论文 j 高 22 1 基因枪介导转化法 1 9 9 3 年，o z i a s 、a k i n s 等以未成熟种子子叶和胚为外植体诱导胚性愈伤，通过基因 枪轰击，将含潮霉素抗性基因( p h 6 0 2 ) 和g u s 基因( p r t g 9 g u s ) 质粒导入愈伤组织， s i n g s i t 等通过基因枪转化胚性愈伤，获得1 1 9 株转基因植株。“v i n g s t o n e 和b i r c h 用分 别用含报告基因( 1 u c 或u i d a ) 和筛选基因( p h y g r ) 的质粒包裹钨粉，轰击成熟种胚为外植 体诱导的胚性愈伤，获得转化再生植株。约有5 0 的转化系同时获得报告和筛选基因表 达，s o u t h e m 分子杂交证实外源基因己整合进t l 代的转化花生基因组。 c 1 e m e n t e 等人以成熟种胚小叶为外植体，用基因枪转化后，通过卡那霉素筛选获得 稳定转化的愈伤组织，但未能获得再生植株。l i v i n g s t o n e 等人用胚小叶为外植体，在基因 枪轰击后，每个外植体检测到数百个瞬间表达的细胞，在无筛选情况下，少数稳定的表 达可以保持到8 周。目前尚未见应用基因枪转化，通过器官发生再生转化植株成功的报 道。 b r a r 用基因枪轰击成熟种胚顶端分生组织。除去子叶后的种胚，除去胚小叶露出顶端 生长点，经基因枪用包被含g u s 、b a r 利番茄斑萎病毒外源基因的金粉轰击，外植体直 接伸长出枝条。通过g u s 活性检测筛选转化枝条。结果说明，供试的f 1 0 r u i u l e r 和 f 1 0 r i 西a j l t 两个品种，嵌合的转化枝条分别为8 8 和6 4 ，g u s 活性全株均匀表达的分 别为2 一3 和o 6 。分别获得8 和3 个转基因植株。s o u t h e m 分子杂交证实外源基因 已整合到t o 和t 1 代转基因花生植株。 2 22 电击穿孔法 它是利用高压脉冲将植物细胞膜击穿而把外源d n a 直接导入原生质体的方法。 “z ( 1 9 9 5 ) 用电击穿孔法将外源d n a 导入野生种和栽培种花生的原生质体，原生质体 的转化率高达5 ，以后研究获得了转病毒外壳蛋白基因和g u s 基因的推断转化体植 株，采用胚轴组织为受体，通过电穿孔法亦获得了抗潮霉素的再生苗。 2 2 3 微注射法和花粉管通道法 花粉管通道法是将外源d n a 直接注入受体细胞。申馥玉等( 1 9 9 0 ) 以爿g 肠6 m 加为 d n a 供体，用自制的玻璃微量注射器在开花盛期将d n a 注入萼管基部，在后代发现了 一些性状变异。山东花生所( 1 9 9 5 ) 利用微注射法，通过花生花萼管将野生花生一苦肠6 m 招 的总d n a 、小牛胸腺d n a ，酪蛋白基因导入花生栽培种，获得了具有变异性状的后代。 庄东红等通过花粉管通道法将耐盐基因m t l d 成功导入优良栽培花生品种“汕油5 2 3 ” 中。对转化花生t o 、t l 和t 2 代进行了p c r 及s o u m e m 杂交分析，结果表明经花粉管通 道介导转化的m t l d 基因已整合进花生基因组中，并已初步获得稳定遗传。梁炫强等( 1 9 9 5 ) 通过花粉管微注射法将高抗锈病野生花爿阳幽括譬m 6 细和红色种皮的狮油4 号的总 6 莱椒学院硕一l 一学位论文h l j 茜 d n a 导入栽培种自肉仔和粤油1 1 6 中，引起种衣颜色抗病性等性状的变异。此法的优 点是将目的基因直接导入花生植株中，不需组织培养外植体作为受体操作简单，不需贵 重仪器，一般实验室都能实施，因此，国内采用此法进行遗传转化的较多。缺点是获得 的转基因植株多是嵌合体，后代很难稳定遗传，随着世代的递增目的基因有可能丢失； 转化体的鉴定也较困难，工作量大。 2 24 农杆菌介导法 在众多的转基因植物中，8 0 以上是由农杆菌介导转化的双子叶植物。与其它转化 方法相比，农杆菌介导法具有操作简便、费用低廉、遗传稳定、可插人外源基因片段大、 外源基因插人一般为单拷贝或低拷贝，可直接用于不同植物组织进行基因转移等优点最 具发展潜力。花生是我国乃至世界重要的油料和经济作物，又是农杆菌的天然宿主之一， 但花生的遗传转化研究起步较晚，9 0 年代初期始见关干农杆菌对花生浸染力的报道。随 着花生植株再生技术的进步和成熟，农杆菌介导的遗传转化研究逐步受到国内外花生研 究者们的重视。 同多数豆科植物作物一样，花生的遗传转化技术难度大，与一些重要粮食作物和经 济作物相比起步较慢。纵观农杆菌转化花生的研究历程，可将农杆菌介导的花生遗传转 化分为三大阶段。 第一阶段是证明了农杆菌能侵染花生。d o n g 等( 1 9 9 0 ) 、l a c o r t e 等( 1 9 9 1 ) 和m c k e n t l y 等人( 1 9 9 5 ) 分别报道了不同农杆菌菌株对花生的侵染力( 致瘤能力) 。 第二阶段是获得转化细胞( 组织) 但未能获得转基因植株。f r a n k l i n 等( 1 9 9 3 ) 用 花生下胚轴为外植体，与农杆菌菌株e h a l o l 、l b a 4 4 0 4 和a s r l 共培养，经卡那霉素 筛选获得花e 条纹病毒c p 转基因的愈伤组织，但未能得到转基因植株。 第i 阶段是获得转基因植株，并有分子杂交证据。e 印e n 和g e o r g e 于1 9 9 4 年首次 撤逝通过农杆菌l b 4 4 0 4 转化9 一l o d 苗龄幼叶获得抗卡那霉素和g u s 活性阳性的转基 机株，经分子检测外源基因已整合到花生基因组。c h e n g 等( 1 9 9 6 ；1 9 9 7 ) 以l o d 苗 龄幼叶为外植体，与农杆菌r h a l0 1 ( p b i l 2 1 1 共培养2 d ，获得5 个独立的转化系，并得 到了t l 和t 2 代种子，对t 2 植株的g u s 活性检测表明，g u s 基因表达呈不分离或3 ：1 分离。我国方小平等用a g l ，菌株侵染鄂花4 号4 d 苗龄嫩叶，经卡那霉素筛选和g u s 组织化学检钡6 获得7 株g u s 阳性植株( 转化率2 ) ，在温室内开花结实，获得t 1 代种 子。对t 一t 3 后代分析表明g u s 以l ：1 和3 ：1 比例分离，随着世代增加，3 ：1 分离 比例增加，t 3 代可选择到g u s 基因纯合植株。徐平丽等通过农杆菌l b a 4 4 0 4 侵染4 d 左右的胚轴获得具有一定抗虫性的转c p t i ( 豇豆胰蛋白酶抑制剂) 基因植株，部分植 株经p c r 和s o _ l l _ ( h e mb l o t 检测为阳性。 身芝阳农学院坝士! 产位论文 小j 舌 3 本研究的目的和意义 真菌病害是花生的主要病害，导致其产量和品质严重下降。发生比较严重的有枯萎 病、黑胫病、赤星病黄曲霉等。花生的这些病害是影响花生高产品质的重要因素，如果 这些病害蔓延的话，会造成产量严重减产。减产量可达2 0 一3 0 ，甚至导致整个田地绝 产无收。例如：近年来，花生枯萎病在山东省发病较严重( 欧善生，2 0 0 3 ) ，据2 0 0 0 年 在山东省莒南县调查，发病率占总播种面积的6 5 以上。发病地块病株率达1 0 一5 0 。 平均减产荚果4 5 0 9 0 0 k h m 2 。而高温、高湿及后期常遇干旱等气候因素，使得黄曲霉 病、青枯病等花生病害在南方影响严重，其中花生黄曲霉病害对花生及其制品的危害由 于直接影响到人畜的健康而显得尤为严重，已引起国际广泛关注。因此，搞好花生真菌 病害的防治对花生生产量具有十分重要的意义。单纯依靠常规育种方法很难选育出对真 菌病害高抗的品种。而利用遗传转化将外源基因导入花生栽培种则应具有一定的可行 性。 b 一1 ，3 一葡聚糖酶是一种p r - 蛋白( p a t l l o g e n s i s _ r e l a t e d p r o t e i n s ，p r ) ，是植物受到 病原菌侵染后，细胞发生程序性死亡的同时，自身释放出胞液中储存的有害物质中的一 种。b 一1 ，3 一葡聚糖在植物中的含量非常低，但在真菌细胞壁中却普遍存在，葡聚糖酶 可抑制真菌的生长，通过降解真菌细胞壁的主要组分b 一葡聚糖使真菌菌丝体顶端的细 胞壁逐渐变薄，从而导致菌丝体顶端膨胀、破碎，最终死亡。b o l l e r 及o t s u c e a 等利用 葡聚糖酶基因对植物进行了转化，转基因植株对黑胫病、赤星病、根腐病及其他病菌均 有一定抗性。因此通过基因工程方法把抗病基因导入花生栽培种，获得抗病品种是可行 的。 目前花生转化工作中仍存在农杆菌介导转化和再生效率低，重复性差等问题，且 不同花生品种对农杆菌侵染的敏感性不同，因此，仍需进一步完善转化体系和优化转 化方法，提高转化效率和实用性。 本论文首先以部分国内花生栽培品种为材料，开展了花生组织培养及植株再生的研 究，分析基因型在花生组织培养中的效应，同时选取适宜的花生外植体，建立完善的植 株再生体系。然后以此再生体系为基础进行基因转化研究。本研究使用带有抗真菌b 一1 ， 3 葡聚糖酶基因( b g 2 ) 的根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 转化花生胚小叶，得到了抗k m 的再生 花生植株，部分经p c r 检测呈阳性。并对预培养时间、侵染时间、不同菌液浓度( 0 d 6 0 0 值) 、共培养时间等因素进行了研究，优化转化系统，以期为今后花生有效基因转化及 创造花生新种质奠定基础。 莱阳农。引垸硕t 学位论又材料与方法 1 花生再生体系的优化 材料与方法 1 1 供试材料 试验材料为花2 0 一1 、白沙10 1 6 、鲁花l l 、花育2 0 、花育2 2 、山农8 1 8 、8 8 2 3 、