（物理化学专业论文）磁性高分子纳米粒子在蛋白吸附中的应用.pdf

论文题目：磁性高分子纳米粒子在蛋白吸附中的应用 学科专业：物理化学 学位申请人：朱晨华 指导教师姓名：沈鹤柏 摘要 传统的生物分离技术由于其生产周期长、产品收率低、分离纯化成本高，一 直阻碍了生物产品的应用和开发。高分子磁性微球作为一种新兴的分离纯化技 术，正受到人们的日益关注和重视。将高分子壳聚糖和磁性纳米粒子结合制备壳 聚糖磁性微球，具有重要的学术意义和应用价值。壳聚糖磁性微球因其表面具有 与生物活性物质反应的活性羟基和氨基，可被广泛用于生物活性物质的载体，同 时又因其具有磁性，在外加磁场作用下能快速分离，使原来昂贵、低效的分离技 术变为低廉、高效。在许多生物技术和医学研究中如细胞分离、蛋白质纯化、核 酸分离、靶向药物、免疫检测、固定化酶等方面展现出广阔而诱人的应用前景。 本论文主要取得了以下结果： ( 1 ) 利用共沉淀法制备具有超顺磁性的纳米粒子，研究了体系p h 值、温度及 陈化时间对最终得到粒子形貌及性质的影响，优化了反应的条件。对最终得到的 粒子的晶型、饱和磁化强度、形貌进行表征。制备的f c 2 0 3 粒子粒径在1 5 衄左 右，y f e 2 0 3 晶体，饱和磁化强度为4 5 锄u g ，并且粒子成型情况良好。并且探 讨了保存体系对超顺磁性纳米粒子分散性的影响。 ( 2 ) 采用以石蜡为油相，s p 觚8 0 及储e e n 8 0 为乳化剂，壳聚糖醋酸超顺磁性纳 米粒子为水相，调节比例，制得了反相微乳液，以戊二醛为交联剂，将超顺磁性 纳米粒子交联在壳聚糖粒子中。研究了反应时间、壳聚糖用量、交联剂用量等因 素，对实验条件进行优化，采用透射显微镜、红外光谱、震动样品磁强计及激光 力度分析仪等对纳米粒子进行表征，得到了粒径在4 0 n m 左右、分散性良好、具 有一定磁响应的纳米微球。 ( 3 ) 以牛血清白蛋白( b s a ) 为模型蛋白，在磷酸缓冲溶液中，以碳亚二 胺为催化剂，研究了壳聚糖包裹的磁性纳米粒子对蛋白的固载性能。使用原子力 显微镜( a f m ) ，紫外分光光度计( u v ) 聚丙烯酰氨凝胶电泳( s d s p a g e ) 对 结果进行表征磁性壳聚糖粒子对b s a 的吸附大致符合l a n g m u i r 吸附模型，2 9 8 k v 时饱和吸附量约为2 5 0 m g 昏1 ，吸附常数为0 0 0 7l m g 1 。 关键词：超顺磁性纳米壳聚糖微乳液牛血清白蛋白 论文类型：应用基础 s u 场卵t ：t h ea p p l i 姐h 佃o fm em a 驴e 廿cp o l y m e r 舳n o p a n i d ei np r o t e i n a b s o r p h o n m a j 凹：p h y s i 明lc h e m i s t r y c a n d i d a t e ：z h uc h e n h u a d i 心c t e db y ：s h e nh e b a i a b s t r a c t 1 1 h ed c v e l o p m e n t 觚da p p l i c a t i o n so f b i o l o g i c a lp 硎u c t sw c r es c r i o u s l yh i n d e r e d b yt h | ec 0 n v e n t i o n a lp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yf o r 瓶1 0 n 哥p 丽o d ，l o we 伍c i e n c y ，勰d l l i g hc o s t m a 印e t i cm i c r 0 s p h c r c ，勰an e wk i n d0 fp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g y ，f o fi t s q u ic ：k n e 蹒，h 蕊b e 9 0 t e nm 0 托锄dm o r ca t t e n t i o ne f i c i e n c y 孤de c o n o m y d e c a d 锶 c h i t o s 锄m a 萨e t i cm i c r o s p h e r c sh a v ea t t r 砌e dc o n s i d e a b l ea t e n t i o n 嬲t h e yd i s p l a y v e 巧i m p o n 锄ts i 萨i f i c 觚c c 弛dv a l u c i nt h c 0 陀t j c a l 锄da p p l i c a t i 勰p c c t s w l i i i s t ， 0 w i n gt ot h em a g n e t i s mo ft h em i c r o s p h e r e s p a m t i o ne f ! f j 【c i e n c yi si n c r e a s e di nt h e p r e s e n c eo f0 u t e rm a g n e t i c 舭l 也w m c hl e a d st 0a c h i c v e ac h e a p 锄dc o n v e i l i e n t p a m t i o ni nm 觚y 弱p e c t s i th 舔ab r o a d 翘d 、o n d e r i n ga p p l 触i o l l0 f p m t i o n t e c h n o l o g yb a s e d m a 萨e t i c 谢e ri nb i 0 似：h n o l o g y 觚dm e d i c a l 础s e a r c h 辄c h 勰 c e u p a r a t i o n ，p r o t e i np u r i 丘c a 虹，咖c l e i ci s o l a t i o n t a r g c ：t e dm e d i c i n e ，c 北y m e i 玎加砒i l i z a t i ，i n l m u n o l o g i c a ld c t e c t i o n 1 1 l i sp a p e rm a i n l yi n c l u d 骼t 、o 弱p e c t s 弱f 0 u o w s ： ( 1 ) p r c p a t h es u p e r a r a m a 驴e t i cn 觚0 p a n i d e sb yc 0 p r a c i p i t a t i 佃跏d y t h ee i j f e c t o ft h ep h ，l e m p e 咖r e 锄d 咖gt i m e t h em o 叩h o l o g y 觚dp r o p e n i c so ft h c n 锄o p a n i c l e s ，觚do p t i n l i z et h c a d i o nc o n d i t i o n s n ec r ) ，s t a lp h a 靶弛dt h e m o 平h o l o g yo ft h en 卸o p a n i d e sa r cc h a r a c t e r i z e d a n ds t u d y o nt h ee 虢c to ft h e s t o r a g es y s t e m 册t h ed i s p e 琏i b i l i t y0 ft h es u p c r a r 锄a 萨e t i cn 姐叩a n i c l 鼯 ( 2 ) p r e p 眦t h em a g n c t i cc h i t 0 锄n 强0 p a n i d 锶( f c 2 0 3 一c s ) 1 ki n i 啪锄u l s i o n i 王l c l u d c sl i q u i dp a r 碰n 勰t h eo i lp h a ，s p 她8 0 趾d 柳e 明8 0 鹤t h ee m u l s i f i e r 觚d m e 咖t o s a n - a c c t i ca c i d l u t i o n 嬲t h ew a t e rp h a g l u t a r a l d c h y d ei st h ec r o s s l i m 【i n g a g e n ts t u d y t h ee f f j e c t0 fr c a c t i o nt i i i l e ，c h i t o s a n 觚dc r o s s l i n ga g e n to nt h em a 掣l c t i c c h i t o s 蛆n 柚o p a n i d e s t r 姐s m i s s i o ne l e c t m ni n i c r o s c o p y ( t e m ) ，f o u 血rt 啪s f 0 珊 i n 胁e ds p e c t r o p h o t o m e t r y ( 兀- 玎r ) 锄dv i b r a t i n gs p e c i m 铋m a 印e t o m e t e r ( v s m ) v l i d s l w e r c 髑e dt 0c h a r a c t e r i z et h en 卸o p a n i c l 鼯t h em e a nd i 锄e t e ro ft h ep a n i c l e s w 弱a _ b o u t4 0 眦w i t hf a 、，o r a b l ed i s p c r s i b n i t y 觚d9 0 0 dm a 弘e t i cr c s p o n s e ，n l eb o v i m ma l b u m i n ( b s a ) w 弱c 0 肌e c t e do n t 0n l es u r f 舀c co ft h cm a 弘e t i c n a n o p a r t i c l e sw i t ht h cc 棚i i m i d ch y d r o c h l 嘶d e 呷c ) 弱t h ea 幽a t o r m p r o d u c t sw e r et h 锄c h 撇r i z c db ya t o m i cf 0 r c em i c r o s c o p e ( a 蹦) 卸du l t r a v i o l c t s p c c t r o m e t c r ( u v ) ：n er e s u l t ss h o w e dt l l a tt h en 柚o p a n i c 凇h a da9 0 i d d a d s o r b a b i l i t yo f t h eb s 八n e i t h e 册a d s o 叩t i o nd a t a0 ft h em a 印e t i cc h i t o s 锄 m i c r o s p h e 砖s0 b e y e dt h el a n g m u i rm o d e l ，w i t ham a 】【i m u ma d s o r p t i o nc a p a c i t yo f 2 5 0m g 9 1 觚d 姐a d s 唧t i o ne q u i l i b r i u mc o n s t 觚to f0 0 0 7l m 菩1 1 n h es t a b i l i t yo f t h ep a n i d 鹤- b s ac 0 m p 叭m di np b sw i t hd i 蠡眙r e n tp hw 弱“s t t l d i e d s d s - p o l y a c r ) ，l 锄i d cg c le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) s h o w e dt h a tb s a w 猫 d e s o m e df 如mm a g n e t i cp a n i c l e su n d e ra l l 【a l i n ec o n d i t i o n k e yw o r d s ：如p e m m m a 印e t i c n 觚o p a n i c l c c h i t o s 觚 m i 锄e m u l s i o n ； b o v i n es e n l ma l b u m i n 上海师范大学硕士学位论文论文独创性声明 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声 明并表示了谢意。 作者签名：聋晷争日期：妇尸j 谣 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后 遵守此规定。 储签名：棚导师签名：睁概啸 上海师范大学硕士学位论文第一章 第一章文献综述 第一节研究意义 生物技术产业的高速发展离不开生物分离技术的贡献。在生物产品的成本 中，分离和纯化过程的成本约占5 0 9 0 。人们将物理和化学分离纯化原理与生 物技术产品特性相结合，开发了一系列生化分离技术、材料和设备，如根据萃取 技术原理发展而成的双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取和凝胶萃取等技术， 克服了有机溶剂直接与生物分子接触而易发生变性作用的缺点。根据膜分离原理 发展的反渗透、纳滤、超滤、微滤、电渗析和液膜分离等技术，具有无相变、无 p h 变化等特点。然而，萃取分离是一种初步的分离纯化技术，选择性不高，膜分 离的选择性低，且分离过程中膜易受到污染。亲和色谱技术也有其不足之处，表 现在料液处理量小、间歇式操作、不适合处理含有悬浮固体颗粒的料液等。基于 生物特异性结合反应的亲和色谱等技术，具有特有的高选择性，在生物分子的分 离中得到了广泛的应用【1 一q 。， 基于磁性载体的生物分离技术是以偶联有亲和配基或离子交换基团的磁性 载体为运载工具，对无磁性的目标生物分子进行负载，在外磁场的作用下加以分 离，经过清洗、解吸等操作，从原始生物分子体系中直接分离出目标生物分子的 分离技术。和传统的生物分离技术相比，磁性生物分离技术具有操作简便、分离 迅速的特点。其最大优点就是可以直接处理含有细胞碎片等固体悬浮颗粒的原料 液，而不需任何预处理过程。实际上，这也是当有固体悬浮颗粒存在时，有效回 收分离载体的唯一有效方法【5 川。 为了提高磁性纳米粒子的生物相容性和稳定性，将其应用于生物医学领域，常 用一些具有良好的生物相容性和生物可降解性的天然高分子或合成高分子对磁 性纳米粒子进行表面修饰。磁性纳米材料是纳米材料的另一个重要门类，除了在 物理、化学方面具有纳米材料的介观等特性外，还具有其特殊的磁性能力介观 磁性，因而导致它奇特的应用如在细胞标记和分离、蛋白质纯化、靶向药物、固 定化酶、核酸分离和纯化、生物检测、磁共振成像等领域展现出广阔的应用前景。 阻9 】 本章对高分子磁性材料的制备及其在生物技术和生物医学研究领域的应用 进行综合叙述。 第一章上海师范大学硕士学位论文 第二节磁性高分子微球的研究进展 一、磁性高分子微球的结构和性质 磁性高分子微球的结构与其制备方法有关，一般有三种类型。即：核壳型、 壳核型和壳核壳型。 o 长竞奠壳一篁曩凳冀一麦穗 参一再匀哮材辩i 一v 磁性树辩 核壳型是由磁性材料组成核，高分子材料组成壳层；壳核型是由高分子材料 为核，磁性材料料为壳层，壳核壳型结构的外层和内层为高分子材料，中间为 磁性材料。其中磁性材料指具有导向性的磁性的金属氧化物，通常的无机磁性材 料主要包括铁、钴、镍、锰分离及其合金、氧化物和稀土金属永磁材料等，高分 子则是具有亲和性的、携带有多种反应性功能基的天然高分子，如壳聚糖、纤维 素、琼脂、淀粉、乳清蛋白、牛血清白蛋白和磷脂等，及合成高分子材料如聚丙 烯酞胺、聚丙烯酸、聚苯乙烯和聚乙二醇等。磁性高分子微球由于其特有的磁性 性质，具有在外加磁场下进行可控运动的特点，从而使其在生物活性物质的富集、 药物运输和定向治疗等方面具有巨大的应用潜力。由于壳层为具有多种功能基的 高分子，这种粒子还可通过表面改性，在其表面修饰上多种反应性功能基团 ( 如：o h ，c o o h ，c o h ，n h 2 ，s h 等) ，利用功能化磁性纳米粒子的表面配体与受 体之间的特异相互作用来实现对靶向生物目标的快速分离。目前，磁分离方法已 广泛地用于细胞、蛋白质、核酸和酶等多种生物物质的分离与纯化【1 0 1 1 l 。 高分子磁性微球纳米粒子处在原子簇与宏观物质交界的过渡区域，是一种典 型的介观系统。纳米粒子由于其尺度与特质的的许多特征长度，主要有以下特性 1 ) 表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随着粒径变小而急剧 增大，表面原子的晶体场环境和结合能与内部原子的不同，具有很大的化学活性， 其表面能大大增加。球形颗粒的比表面积( 表面积体积= 3 r ) 与半径成反比， 随着颗粒直径变小，比表面积将会显著增加。 2 上海师范大学硕士学位论文第一章 表一超微颗粒表面原子所占比例( 0 0 ) 与颗粒直径关系 颗粒直径姗 151 01 0 0 原子总数个 3 0 41 0 3 31 0 4 3。1 0 6 表面原子所占比例 9 94 02 0 2 可见对于直径大于1 0 0 衄的颗粒，表面效应可以忽略不计。当尺寸小于1 0 0 玎m 时，其表面原子所占的比例急剧增长，这时的表面效应将不容忽略。当颗粒直径 降到1 n m 时，表面原子数比例将达到9 9 以上，原子几乎全部集中到纳米粒子表 面。由于纳米粒子的表面原子数增多以及表面原子配位数不足和高的表面能，使 这些原子易与其他原子相结合而稳定下来，故有很高的化学活性。 2 ) 体积效应是由于超细微粒包含的原子数减少使带电能级加大，从而使物质的 一些物理性质因能级间歇的不连续而发生异常。 上述两种效应可具体表现为比表面激增，微球官能团密度及选择性吸附能力 变大，达到吸附平衡的时间大大缩短，粒子的稳定性大大提高。 3 ) 磁效应：具有磁性可使生物高分子微球在外加磁场作用下方便地进行分离和 磁导向。当磁性f e 2 0 3 晶体直径小于3 0 n m 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强 磁性，没有磁场时磁性很快消失，从而使生物高分子微球能够在磁场中不被永久 磁化。 4 ) 生物相容性：磁性微球在生物工程，特别是在生物医学工程中应用时，有一个 重要方面就是要有生物相容性。多数生物高分子如多聚糖、蛋白质类具有良好的 生物相容性。它们在人体内安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫原性， 这种性质在靶向药物中尤其重要【1 2 1 。 5 ) 功能基特性：生物高分子有多种反应活性功能基团，如o h c o o h n h 2 ， 可连接具有生物活性的物质，如免疫蛋白，生物酶等。 二、磁性高分子微球的制备、 制备高分子磁性微球的方法可分( 1 ) 先制备磁性纳米粒子，然后在对其进 行表面修饰，制备核壳型的磁性高分子微球如包埋法、聚合法( 2 ) 首先制得致 密或多孔聚合物微球，此微球含有可结合铁、钻、镍、锰等金属离子的基团，随 后依靠高分子在金属盐溶液中的溶胀以及功能基团与金属离子的作用来制备磁 性高分子微球，如活化溶涨法。 3 第一章上海师范大学硕士学位论文 1 磁性纳米粒子的制备 在磁性纳米粒子的选择及制备过程中，要充分考虑到作为磁核的粒子的磁性 强弱、粒径大小及表面性能等特点。综合细胞毒性、稳定性【1 3 1 及磁化强度各方面 的因素，虽然氧化铁的比饱和磁化强度较低，但是由于其良好的氧化稳性和较低 的毒性，常被用来选作磁性高分子微球中的磁核，在许多领域具有非常好的应用 前景。目前，用得最多的氧化铁是f e 3 0 4 和f c 2 仿。 磁性纳米粒子的制备方法有物理法、生物法以及化学法。物理法最主要以 机械球磨为代表，但是由于得到的粒子粒径分布较宽，时间较长，不适用于生 物医用方面。生物法与物理法相比，生物法制得的纳米粒子体现出更明显的优 势，尤其是生物相容性方面。而且磁性纳米粒子广泛存在于各种生物体如细菌 5 0 0 0 埘、高压 ( 2 0 m p a ) 以及极高的冷却速率等极端条件促使氧化、还原、分解和水解等反应 得进行来制备纳米粒子瞄2 4 1 。尽管超声花絮法操作简便，但由于其是非均相反 应方法，粒子的成核和生长过程受活性物种的生成和扩散等因素的影响，因此 该方法在纳米粒子的尺寸和形貌控制方面仍有待于进一步提高。本实验室在磁 性纳米粒子的制备方面采用的是经典的化学共沉淀法。 2 磁性高分子微球的制备 一 1 ) 包埋法 共混包埋法是研究制备磁性高分子微球最早的一类方法，该方法是将磁性粒 子分散于天然或合成的高分子溶液中，并通过雾化、沉积、蒸发等物理手段制备 得到具有磁响应性、具有一定粒径范围的磁性微球。包埋法主要通过范德华力、 氢键、配位键或共价键等作用，使得高分子链缠绕在磁性颗粒表面，形成聚合物 包被，得到磁性微球嘲。 d e l 【l 【e r l 2 6 l 将磁性粒子悬浮于聚乙烯亚胺( p e l ) 溶液中，通过过滤，干燥处理 6 上海师范大学硕士学位论文 第一章 得到外包p e i 的磁性微球。c u y p e r 等【2 7 1 用卵磷脂包埋纳米磁性粒子，制得磁性脂 质体微球，g u m 等1 2 8 1 将磁性粒子与牛血清清蛋白和棉籽油进行超声处理，然后 加热至1 0 5 1 5 0 ，得到外包牛血清清蛋白的磁性微球。 2 ) 聚合法 单体聚合法是在无机纳米粒子和单体存在下，加入引发剂、稳定剂等聚合而 成的核壳结构复合微球。该法得到的高分子微球磁响应性强、粒径均一、粒子 表面有丰富的活性功能团。主要方法有悬浮聚合【2 9 1 、分散聚合、乳液聚合【雏3 n 、 微乳液聚合等，采用不同的聚合方法，可制备不同粒径的磁性微球。 悬浮聚合是通过将磁性粒子直接分散于含有聚合物单体、稳定剂、引发剂等 的混合体系中进行聚合反应。磁性物质均匀地分布于复合微球。阳承利等以甲基 丙烯酸甲酯( m m a ) 为聚合单体，二乙烯苯( d ) 为交联剂，过氧化苯甲酰( b p o ) 为引发剂，聚乙烯醇( p v a ) 为稳定剂，采用喷流式悬浮聚合法制备了磁性聚甲基 丙烯酸甲酯( p m m a ) 微球。粒子大小比较均匀，在1 0 u m 左右。但是由于在反应过 程中，经常采用机械搅拌的方法将液滴进行分散，因而得到的粒子粒径一般在 2 0 0 l l m 【3 2 】以上，在生化研究领域的应用十分有限。， 超声波和分散剂是减小单体和液滴尺寸的有效手段。通过在悬浮聚合前期在 反应体系中引入分散剂和超声波预处理分散单休，使单体形成微小的液滴，以便 在聚合反应中得到微米级的微球。万惠文等【绷l 利用磁粉、s t ，d v b 为原料，p 、，a 为分散剂，采用悬浮聚合法和超声波技术相结合，合成粒径为1 u m 左右的微球。 乳液聚合法是将磁性粒子分散到含有聚合物的溶剂中进行聚合反应。通常以 磁性粒子为活性中心进行聚合。s o l e 【3 7 l 在分散有磁性粒子的水相体系中乳化单 体，得到稳定的乳化体系，然后应用聚合得到了胶体尺寸的疏水磁性高分子微球。 邱广明掣鲳3 9 1 利用乳液聚合法，制备出单分散的亚微米级磁性微球，研究了分 散介质、单体、种子粒子及p h 调节剂等因素对聚合行为和磁性微球影响。并且 对乳液聚合法进行了改进，采用先吸附后溶胀的方法，在磁性微粒表面形成良好 的聚合环境，得到了单分散性好，又具有良好机械稳定性和耐酸性的磁性高分子 微球。 微乳液和反相胶束法是利用水、油和表面活性剂三元体系形成的微乳液或 反相胶束最为反应场所制备纳米粒子的方法。表面活性剂一方面可以有效地阻 7 第一章上海师范大学硕士学位论文 止纳米粒子的聚集和进一步生长，从而实现对纳米尺寸的有效控制：另一方面 可以为粒子提供可溶解性或可分散性。用这种方法制备的粒子在粒子的尺寸分 布及其形貌控制方面体现出了一定的优势，但所得到的粒子往往在结晶度和磁 响应性等方面还有待于提高，这主要是由于这一制备方法所采用的反应温度比 较低而造成的。d r c s c o 【删等利用反相微乳液聚合法，合成了甲基丙烯酸、羟甲 基丙烯酸包裹的水溶性磁性微球，通过调节单体浓度、水表面活性剂的比例， 得到的微球粒径为8 0 3 2 0 姗。d a n i e l l 4 1 l 将f c 3 0 4 ( d = 1 咖啪) 用烃油处理，在乳 化剂存在下进行乳液聚合，得到粒径小于1 0 0 n m 的聚苯乙烯磁性微球。 3 ) 活化溶胀法 该方法通常是先将用种子聚合等技术制备的单分散大孔聚苯乙烯高分子微 球进行孔内外磺化( s 0 3 ) 或硝化( n 0 2 ) 处理以使其具有亲水性界面f 一然后浸泡于 铁盐水溶液中，使聚合物微球在铁盐溶液中溶胀、渗透，在适当的反应条件下升 高p h 值，使超顺磁性f e 3 0 4 或y f e 2 0 3 在孔内合成，渗透和转化步骤可重复进行直 到合适的磁含量，最后选用一种含活性功能基团的单体对微球进行溶胀、聚合、 包被，使微球孔道封闭，表面功能化，在适当的温度和p h 值下，用铁盐在网状 聚苯乙烯微粒的内部沉淀出铁氧粒子，得到粒径较小磁性微球【4 2 州。 总之，制备磁性壳聚糖微球的方法多种多样，而效果则可以概括为以下几个 方面：( 1 ) 调解和改变粒子的溶解和可分散性；( 2 ) 为粒子提供表面功能性；( 3 ) 赋予磁性粒子特殊的物理化学性质；( 4 ) 提高粒子的稳定性和抗氧化性及其胶体 溶液的稳定性。制备高分子磁性粒子具有重要的科学意义和实际应用价值，在今 后相当长的一段时间内它将是磁性纳米材料研究领域的热点和难点问题之一。本 实验中，制备了壳聚糖包裹的磁性纳米粒子，其效果可以归结为以下几点( 1 ) 可 以屏蔽磁性纳米之间的偶极相互作用，阻止粒子发生团聚；( 2 ) 具有优良的生物 相容性、亲水性以及非常好的稳定性；( 3 ) 壳聚糖分子中自带的活性氨基和羟基 为其在生物医学中的应用提供了重要保障。 第三节磁性高分子微球在生物医学中的应用 磁性载体在生物医学和生物技术的许多领域都得到了广泛的应用并展现出 广阔的应用前景，具体体现在蛋白质和核酸的分离和纯化、靶向药物、固定化酶、 细胞分离和标记、磁共振成像( m r d 等多个方面。 8 上海师范大学硕士学位论文第一章 一、蛋白质和核酸的分离和纯化 蛋白质和核酸的分离是生物技术中一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还 没有一种成熟和完善的可以把任一组分从复杂生物混合体系中分离出来的方法。 对d n a 而言，通常采用的分离手段包括超速离心和电泳，电泳方法中可分为琼 脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。虽然电泳的方法在碱基对少 于1 k b p 的短链d n a 的分析和分离方面已经取得了巨大的成功，但对于碱基对大 于1 k b p 的长链d n a ，传统的电泳的方法就显得无能为力了。传统的蛋白质分离 方法一般是通过改变p h 值、温度、离子强度等因素来达到分离的目的，分离过 程繁杂且损失大。以磁性微球为固相介质对蛋白质纯化是一项新兴的蛋白质分离 技术，它是通过对磁性微球表面改性，共价结合能被目标蛋白质识别和可逆结合 的配基，然后对目标蛋白质进行分离f 4 5 4 刀。 磁性载体用于蛋白质分离主要是基于亲和分离的原理，即在磁性载体上固定 和目标蛋白具有特异性结合作用的亲和配基，经过亲和吸附、清洗、解吸和磁场 分离等操作，从原料液中直接分离出目标产物。磁性分离的特点主要有以下几方 面：( 1 ) 在没有外磁场的存在下，具有超顺磁性的纳米粒子的磁流体表现出非常 低的粘度( 2 ) 在外磁场作用下所形成的磁柱之间的距离可根据器件内的通道尺 寸和磁性颗粒的浓度在非常大的范围内进行调节。与传统分离方法相比，蛋白质 的磁性分离技术具有快速、高纯、高收率等优点。 二、 靶向制药 、 为了提高药物的效用，减少其毒副作用，靶向药物正成为当今的热门研究 课题。所谓靶向药物就是利用药物载体的p h 敏感、热敏感、磁性等特点，在外 部环境的作用下，对病变组织实现定向给药。磁性颗粒是当前药物载体的研究热 点之一，原因之就是因为它可以改变药物的体内分布，实现药物体内的靶向性。 通过靶向施药，一方面提高了病变不为的药物浓度、增强了疗效，另一方面降低 了非靶向部位的药物作用，减轻了药物的毒副反应。 。 张阳德等人开展了用磁性纳米颗粒治疗肝癌的研究。结果表明，磁性阿霉 素白蛋白纳米粒子具有高效的磁靶向性，在大鼠移植肝肿瘤中聚集明显增加，而 且对种植性肿瘤有很好的疗效。 磁性微球作为给药载体，具有以下有点：1 药物随着载体被吸附到靶区周 9 第一章上海师范大学硕士学位论文 围，是靶区很快达到所需的浓度，而在其他部位分布量相应减少，因此可以降低 给药剂量；2 要去绝大部分在局部作用，相对减少了药物对人体正常组织的副作 用，特别是降低对肝、肾等系统的损害；3 加速产生药效，提高疗效。 三、固定化酶 磁性载体固定化酶具有以下优点：( 1 ) 有利于固定化酶从反应体系中分离和回 收，操作简单，降低成本；( 2 ) 磁性载体固载酶放入磁场稳定的流化床反应器中， 可以减少连续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作；( 3 ) 利用外部磁场可 以控制磁性载体固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高酶 的催化效率；( 4 ) 可以改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性等；( 5 ) 若将多种酶 结合在载体上，还可进行多酶反应。酶一般通过物理吸附或共价结合的方式固定 在磁性载体的表面或孔道阿厂文献中也有将酶直接固定在f e 3 0 4 纳米颗粒表面睁一 报道【4 冽。一般来说，和游离酶相比，固定化酶的活性会有所降低，但稳定性显 著增强。目前己研究过的磁性载体固定化酶有：纤维素酶、转化酵素、乳糖酶、 脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、葡糖氧化酶、葡糖淀粉酶、胰蛋白酶、尿激酶、脱氧核 糖核酸酶、乙醇脱氢酶、木瓜蛋白酶等【徭5 羽。 四、细胞分离 将磁性纳米粒子用于细胞分离的方法称为细胞磁免疫分离方法。大量的磁免 疫分离都是基于磁性纳米粒子或微球表面的抗体与细胞抗原之间的相互作用来 实现细胞的快速分离的。免疫磁性微球与细胞的结合可以采取两种方法：直接法 和间接法【5 1 1 。直接法就是将偶联有抗体的磁性纳米粒子或微球加入待分离的细 胞混合体系中，经过孵育使靶向细胞与磁性粒子表面的抗体识别形成稳定的复合 体，然后在外磁场作用下实现被识别细胞与其它细胞的分离。间接法是先将适量 的生物素化( b i o t i n y l a t e d ) 的抗体加入到细胞混合体系中，过滤除去大部分未被偶 联的抗体，在通过磁性纳米粒子或微球表面的二抗或链霉亲和素( s 仃c p t a v i d i l l ) 与结合在细胞表面的抗体之间相互作用后形成稳定的复合体，最后经外磁场作用 实现细胞的分离。细胞磁性分离技术的优点主要体现在以下几个方面：( 1 ) 磁性载 体与细胞的识别过程基本上可以保证不破坏被识别细胞的形态，同时也不影响非 识别细胞；( 2 ) 分离纯度可高达9 5 9 9 9 ；( 3 ) 不影响细胞的功能和活性， 经磁性分离的细胞存活率可以达到9 0 以上；( 4 ) 分离操作方便、快捷。同时 1 0 上海师范大学硕士学位论文第一章 用磁性纳米粒子在细胞分离方面还有其它几个优势：首先，较小的尺寸可以避免 与细胞发生识别作用后对细胞产生机械应力( m e c h a i l i c a ls t r c s s ) ；其次，可以缩 短孵育时间，加快分离流程；再次，磁性纳米粒子在磁场中可形成稳定的胶体分 散体系，不会发生粒子的聚集和沉淀；最后，具有生物相容性的磁性纳米粒子不 影响细胞的功能和发育。 五、在临床磁共振成像中的应用 磁共振成像技术【6 2 侧由于可以用来对生物内脏器官和软组织进行无损的快 速检测，已经成为诊断软组织病变尤其是检测肿瘤的最为有效的临床诊断方法 之一。磁共振成像是以人体在核磁共振过程中所散发的电磁波以及与这些电磁 波有关的参数，如质子密度、驰豫时间等作为成像参数进行成像。临床应用的 磁共振成像一般是对组织中的氢核( 质子) 进行的，改变人体组织中的质子密 度是非常困难的，同时也是非常危险的。因此，临床m r i 检查往往通过使用含 有磁性的物质作为造影剂来改变组织的核磁共振参数( 水质子的驰豫时间t 1 和 t 2 ) ，从而改变组织的核磁共振信号对比度和软组织图象的分辨率，分辨出微小 病灶和区分那些t l 、t 2 驰豫时间与正常组织相仿的病灶直至鉴定人体内器官功 能的变化。目前，我国医学界把m 造影剂分为三类，即顺磁性物质、铁磁性 物质以及超顺磁性物质。其中，铁磁性物质具有较高的磁化率，对t 1 几乎不影 响但却能使t 2 显著地降低，而且每次所需要的浓度远远低于顺磁性物质，因而 受到广泛的关注。 ，。 超顺磁性氧化铁纳米粒子在体内的分布具有明显的特异性。这主要是由于人 体的网状内皮系统具有十分丰富的吞噬细胞，这些吞噬细胞是人体细胞免疫系统 的组成部分，当超顺磁性氧化铁纳米粒子通过静脉注射进入人体后，与血浆蛋白 结合，并在调理素作用下被网状内皮系统识别，吞噬细胞就会把超顺磁性氧化铁 纳米粒子作为异物而摄取，从而使超顺磁性氧化铁集中在网状内皮系统丰富的组 织和器宫中。所以超顺磁性氧化铁是一种网状内皮系统对比剂，可用于肝、脾、 淋巴结、骨髓等富含网状内皮细胞的组织和器官的磁响应( m r ) 增强。吞噬细胞 吞噬超顺磁性氧化铁纳米粒子使相应区域信号减低，而肿瘤组织因不含正常的吞 噬细胞而保持信号不变超顺磁性氧化铁也具有一定的毒性。铁是人体内的正常成 分，但如果人体内铁的含量太大时，就会有中毒现象。超顺磁性氧化铁的毒副作 第一章上海师范大学硕士学位论文 用主要来自于铁含量的多少。但从目前临床应用上看，超顺磁性氧化铁的临床应 用剂量都远小于其最低中毒剂量。超顺磁性氧化铁在常规的临床剂量之下，如果 缓慢注射给药，副作用是非常小的。 第四节壳聚糖的结构性质 壳聚糖( c l u t o s 觚，简称c s ) 是迄今发现的唯一的碱性多糖，也是一种可生物 降解的多糖大分子，是近年来应用研究比较活跃的药剂辅料。它广泛存在于甲壳 类动物体内的甲壳素的脱乙酰基产物，又称脱乙酰基甲壳质，可溶性甲壳质，化 学名为聚( 1 ，4 ) 2 氨基一2 脱氧b d 葡聚糖。纯净壳聚糖为白色或灰白色，半透 明的片状固体。具有良好的生物相容性、血液相容性、可降解性、吸湿性和成膜 性，且壳聚糖及其分解产物无毒副作用，可作为缓释制剂的阻滞剂，壳聚糖还具 有抗菌消炎、促进伤日愈合等作厨。壳聚糖不溶于碱溶液，可溶于低浓度无机酸 或某些有机酸。溶于稀酸时呈粘稠状，在稀酸中壳聚糖的b 1 ，4 糖苷键会慢慢水解， 生成低分子壳聚糖。在溶液中壳聚糖是带正电荷多聚电解质，具有很强的吸附性， 壳聚糖的溶解性与脱乙酞度、分子量、粘度有关。脱乙酞度越高，分子量越小， 越易溶于水：分子量越大，粘度越大。应用于药物负载中，壳聚糖微球包封药物 后具有控制药物释放；延长药物疗效；降低药物的毒副作用；提高疏水性药物对细 胞膜的通透性：提高药物的稳定性和改变给药途径，还可大大加强微球的靶向给 药能力。 图为壳聚糖的结构式 壳聚糖分子结构中含有游离氨基和轻基，因此反应活性和溶解性均比甲壳素 强，它是甲壳素最重要和应用最广泛的衍生物。壳聚糖活性表现如下： 1 壳聚糖分子中的活性n h ：可酸化成盐类，导入羧基官能团，取代合成侧链 铵盐、混合醚、聚氧乙烯醚等，制备具有水溶性、醇溶性、有机溶剂溶解性、表 面活性以及纤维性等各种衍生物； 2 壳聚糖分子中o h 和n h 2 具有配位鳌合功能； 1 2 上海师范大学硕士学位论文第一章 3 壳聚糖分子中o h 和n h 2 均可与交联剂进行交联接枝改性成网状聚合物，其 交联产物不易溶解，性质较稳定 目前，日本、美国等国已经将甲壳素壳聚糖应用到生物等多领域上，并有 商品化产品，如植物活化剂、生物反应器、固定化酶的载体以及膜的分离材料等。 。 第五节表征手段及实验方法 一、电泳e l e 咖p h o r e s i s ， 电泳就是把某些物质放在一个可以游泳的地方( 某种基质) ，然后在这个泳 池的两端加上电压，让这种物质在里面游起来，以达到某种实验或应用目的。利 用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1 9 3 7 年瑞 典学者a w k 蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的 3 种球蛋白，创建了电泳技术。在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用 下，单位时间内移动的距离( 即迁移率) 为常数，是该带电粒子的物化特征性常 数。不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电 场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电 场的电压与电泳时间成正比。 按分离原理的不同，电泳分为4 类：移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电 泳和等速电泳。 ( 一) 移动界面电泳是将被分离的离子( 如阴离子) 混合物置于电泳槽的一端( 如 负极) ，在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒 子向另一极( 正极) 移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速 度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全 分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。 ( 二) 区带电泳是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位 置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动， 分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸 和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。 ( 三) 等电聚焦电泳是将两性电解质加入盛有p h 梯度缓冲液的电泳槽中，当其处 在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等 电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电 荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置， 第一章上海师范大学硕士学位论文 形成一个个清晰的区带，分辨率极高。 ( 四) 等速电泳是在样品中加有领先离子( 其迁移率比所有被分离离子的大) 和终 末离子( 其迁移率比所有被分离离子的小) ，样品加在领先离子和终末离子之间， 在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分 离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由 于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的，且因 “自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。 应用较为广阔的有琼脂糖凝聚胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝 胶具有化学性质不活泼，在范围较大的p h 、温度和离子强度的条件下稳定，以 及透明等优点。并且，聚丙烯酰胺容易制各成孔径范围很宽的凝胶以适应不同大 小蛋白质分子的分级分藤 本实验采用了s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳。s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( s d s n 蝎e ) ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净 电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污 剂十二烷基磺酸钠i 啪d o d e c y l 鲫l f a t e ，简称s d s ) ，在过量s d s 和巯基试剂( 通 常为2 巯基乙醇或二巯酥糖醇) 存在的条件下加热变性时，大多数多肽以一恒定 量的比值结合s d s ，结果它们大体上具有相同的电荷密度，则蛋白质分子的电泳 迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在适宜孔率的聚丙烯 酰胺凝胶电泳中，按多肽分子的大小泳动。因此可以利用s d s n 惦e 测定蛋白 质分子量。 二、偶联剂 磁性载体可通过表面的功能基团和生物分子( 如酶、蛋白质、核酸等) 及亲和 配基偶联用于生物医学领域。生物分子和亲和配基在磁性载体上的固定化通常可 通过物理吸附和共价结合两种方式来实现。物理吸附的特点是简单方便，但在使 用过程中容易脱落。共价结合具有结合牢固的优点，但在结合的过程中应注意生 物分子活性的保持，因此共价结合中常在磁性载体和配基之间插入一个适当长度 的“空间臂”( s p a c c r ) 来减少空间位阻作用而引起的活性损失。偶联效果会受到偶 联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度 和离子强度、p h 以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。通常 是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合。 1 4 上海师范大学硕士学位论文 第一章 磁性载体表面的功能基团如羟基、氨基、羧基等均要经过预先活化后才能进 行偶联。常用的活化方法有溴化氰法、戊二醛法、碳二亚胺法等。其中最常使用 的功能基团是氨基和羧基。这主要是因为相对于其它基团，羧基和氨基具有以下 优点：( 1 ) 两种功能基非常稳定( 2 ) 蛋白质分子含有末端羧基和氨基，因此能确保 蛋白质能够偶联到带有梭基和氨基载体的表面。 一般是由生物分子上的活性基团决定偶联合成的方法，常用的方法如下。 ( 一) 羧基( c o o 两半抗原分子偶联 1 碳亚二胺法。碳二亚胺( e d c ) 使羟基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的 羧基先与e d c 反应生成一个中间物，然后再与蛋白质上的氨基反应，形成 半抗原与蛋白质的结合物。 2 混合酸酐法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，形成混 合酸酐的中间体，再与蛋白质的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物。 ( 二) 氨基( n h 2 ) 半抗原分子偶联 1 戊二醛双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形 成s c l l i l j f 键(