（麻醉学专业论文）高压氧对神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为学及nos系统的影响.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要一3 二、英文缩略语6 三、论文 币f 言”1 日l j 舌” 材料与方法一8 结果1 3 讨论2 0 结论2 6 四、本研究创新性的自我评价2 7 五、参考文献2 8 六、附录 综述3 0 在学期间科研成绩3 8 致谢3 9 个人简介4 0 中文论著摘要 高压氧对神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为学及n o s 系 统的影响 目的 神经病理性疼痛是当中枢或外周神经受损及机体组织受炎症刺激时出现的慢 性疼痛，是多因素参与的复杂过程。当外周神经损伤后，多种免疫因子如i l 1 p 、 t n f 0 【等引起免疫反应是维持神经病理性疼痛的基础之- - 1 。高压氧( h b o ) 具 有增强抗氧化酶活性、加速自由基的清除、提高血氧含量、改善微循环的作用， 对损伤的神经组织有修复和保护作用，在临床上已广泛应用，因此我们有理由假 设高压氧对神经病理性疼痛是有效的。本研究拟观察高压氧对神经病理性疼痛的 疼痛行为学影响，明确高压氧治疗神经病理性疼痛的有效性，并进一步通过n o s 各个亚型表达水平的变化探讨其作用机制。 方法 4 0 只雄性s p r a g u e - d a w l e y 大鼠，体重为3 0 0 9 + 2 0 9 ，随机平均分为五组：即 空白对照组( c 组) 、假手术组( s 组) 、坐骨神经慢性缩窄手术组( c c i 组) 、高 压氧预处理组( p r e h 组) 与高压氧干预组( p o s t h 组) ，对其疼痛行为学进行比 较。其中假手术组单纯暴露坐骨神经，p r e h 组及p o s t h 组分别在术前及术后1 2 h 实施高压氧治疗。各组大鼠均于行坐骨神经慢性缩窄( c c i ) 术前1d 和术后第1 ， 3 ，7 ，1 4 ，2 1 ，2 8 d 上午9 点 - - 1 1 点进行一般疼痛行为学观察，机械痛阈和热痛阈 的测定。术后第2 8 天应用免疫组化方法观察大鼠脊髓各个n o s 亚型表达水平。 结果 坐骨神经慢性缩窄术后动物表现为大鼠体重增长缓慢，手术结扎侧患足足趾 并拢背屈、外翻，成防御姿势，不负重，患足行走无力，运动时明显跛行，膝关节着地， 右足掌悬空或拖行；术后2 周左右患肢出现明显肌肉萎缩，患肢足底轻触刺激时， 大鼠常将其迅速抬起并放入口中舔吮，然后在空中不停地甩动损伤侧后肢。相对术 前比，c c i 组、p r e 。h 组和p o s t h 组术后体重降低( 尸 o 0 5 ) 。疼痛行为学结果： c c i 组、p r e h 组和p o s t h 组的机械性缩足反射阈值m w t 和热缩足反射潜伏 期t w l 值在各观察点都较c 组及s 组显著降低( 尸 0 0 5 ) ，且c c i 组降低的非 。常显著，即坐骨神经结扎引起了机械性及温度的异常痛觉。 p r e h 组的机械性缩 足反射阈值m w t 和热缩足反射潜伏期t w l 值在各观察点显著高于c c i 组 ( 尸 0 0 5 ) ，表明高压氧对神经病理性疼痛有一定预防作用。p o s t h 组的机械 性缩足反射阈值m w t 和热缩足反射潜伏期t w l 值在1 d 到3 w 显著高于c c i 组 ( 氏o 0 5 ) ，表明高压氧对神经病理性疼痛有一定治疗作用。 神经病理性疼痛大鼠脊髓中n n o s 、i n o s 阳性细胞数目在c c i 后表达均增加， e n o s 阳性细胞数目在c c i 术后变化不显著。n n o s 及i n o s 阳性细胞结果：o c c i 组、p r e h 组和p o s t h 组的n n o s 、i n o s 阳性细胞数目较s 组显著增加( 氏o 0 5 ) ， 且c c i 组增加的非常显著，即坐骨神经结扎引起了n o s 表达的变化。( g ) p r e h 组 的n n o s 、i n o s 阳性细胞数目显著低于c c i 组( 尸 0 0 5 ) ，表明高压氧可通过影 响n o s 系统对神经病理性疼痛起到一定预防作用。p o s t h 组的n n o s 、i n o s 阳性细胞数目显著低于c c i 组( 氏0 0 5 ) ，表明高压氧可通过影响n o s 系统对神 经病理性疼痛起到一定治疗作用。 结论 1 、一定条件和方案的高压氧对神经病理性疼痛有良好的镇痛效果。 2 、坐骨神经慢性缩窄术可引起大鼠n o n o s 系统介导n n o s 、i n o s 及e n o s 含量变化，导致神经病理性疼痛的产生。高压氧可以通过调节n o s 各亚型的表达 达到减轻神经病理性疼痛的作用。 关键词 神经病理性疼痛；高压氧； n o s 2 英文论著摘要 t h ee f f e c t so f h y p e r b a r i co x y g e no nn e u r o p a t h o i o g i c p a i ni nc c i r a t sa n dt h ec h a n g e so fn o s s y s t e m o b i e c t i v e n e u r o p a t h o l o g i cp a i ni sac h r o n i cu n c o m f o r t a b l ef e e l i n gw h e n t h es e n i o rc e m e ro r p e r i p h e r a l n e r v e ss t i m u l a t e db yi n f l a m m a t i o n i ti sap r o c e s si n f l u e n c e db ym a n y f a c t o r s w h e nt h ep e r i p h e r a ln e r v e si n j u r y , m a n yi m m u n ef a c t o r ss u c ha si l 一1b ，t n f a ， 甜讲1 e a dt oi m m u n er e a c t i o n s a n dt h e s er e a c t i o n sa r et h eb a s i ce l e m e n t st om a i n t a i n t h en e u r o p a t h o l o g i cp a i n h y p e r b a r i co x y g e n ( h b o ) i sw i d e l yu s e di nc l i n i c a lf i e l d s i ti sc h a r a c t e r e db y e n h a n c i n gt h ea c t i v i t yo fa n t i o x i d a n t ，a c c e l e r a t i n gt h ee l i m i n a t i o no ff r e er a d i c a l ， e n h a n c i n gt h eb l o o do x y g e nc o m e m ，i m p r o v i n gt h em i c r o c i r c u l a t i o n ，r e p a i r i n ga n d p r o t e c t i n gt h ei n j u r e dn e r v et i s s u e s ow eh a v es t r o n ge v i d e n c e st os u p p o s et h ee f f i c a c y o fh b oo nn e u r o p a t h o l o g i cp a i n s ot h i ss t u d yw a si n i t i a t e dt oe v a l u a t et h ee f f i c a c yo fh y p e r b a r i co x y g e n ( h b o ) t r e a t m e n to nn e u r o p a t h o l o g i cp a i ni nc h r o n i cc o n s t r i c t i v ei n j u r y ( c c i ) r a t sa n dm a k e t h ev a l i d i t yo fh b oo nn e u r o p a t h o l o g i cp a i nm o r ec l e a r a n dw ew i l le x p l o r et h e m e c h a n i s mo fn e u r o p a t h o l o g i cp a i nt h r o u g ht h ec h a n g e so f n o ss y s t e m m e t h o d s f o r t yh e a l t h ym a l es p r a g u e d a w l e yr a t s ( w e i g h t3 0 0 士2 0 9 ) w e r er a n d o m l y d e v i d e di n t of i v e g r o u p s ( n = 8i ne a c hg r o u p ) ：c o n t r o lg r o u p ( cg r o u p ) ；s h a mg r o u p ( s g r o u p ) ；c h r o n i cc o n s t r i c t i v ei n j u r yg r o u p ( c c ig r o u p ) ；p r e c o n d i t i o n i n gw i t hh b o g r o u p ( p r e hg r o u p ) ；i n t e r f e r ew i t hh b og r o u p ( p o s t hg r o u p ) i tw a sd e s i g n e dt o e v a l u a t et h ee f f i c a c yo fh y p e r b a r i co x y g e n ( h b o ) t r e a t m e n to nn e u r o p a t h o l o g i cp a i ni n c h r o n i cc o n s t r i c t i v ei n j u r y ( c c i ) r a t s a n dt h es h a mg r o u po n l ye x p o s e dt h es c i a t i c n e r v ew i t h o mc o n s t r i c t i o n p r e hg r o u pa n dp o s t hg r o u pc a r r yo u th b ot r e a t m e n t12 h o u r sb e f o r eo ra f t e rt h es u r g e 巧d i f f e r e n t l y m e c h a n i c a lt h r e s h o l d sa n dr a d i o g e n i ch e a t p a i nt h r e s h o l d sw e r em e a s u r e da t9 a m 1 1a mo nt h ed a y1p r e o p e r a t i v ea n do nt h e 3 d a y1 ，3 ，7 ，1 4 ，2 1 ，2 8p o s t o p e r a t i v eo na l l r a t s a l lr a t sw e r ek i l l e do nt h ed a y2 8 p o s t o p e r a t i v ea n d t h es p i n a lc o r df r o ml 4t ol 6w a sd i s s e c t e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o n o fn o su s i n gt h ei m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d r e s u l t s a l lc c ir a t sw e i g h tg r o w t hb e c o m es l o wa f t e ro p e r a t i o n a n dt h ec o n s t r i c t i v ef o o t b e n t s ，v a l g u s ，p r e s e n t sd e f e n s i v ep o s i t i o na n dc a n ts u p p o r tt h ew h o l eb o d y t h e yl i m p w h e nw a l k i n ga n dk n e e lo nk n e e t h er i g h tf o o tw a l k sw i t hs h u f f l i n gg a i t t h e c o n s t r i c t i v el i m bp r e s e n t sm u s c u l a rd y s t r o p h yo nt h e2w e e k sa f t e ro p e r a t i o n w h e n s t i m u l a t i n gt h et h e n a rl i g h t l y , r a t sr a i s e ，l i pa n ds w i t c ht h e i rf e e t t h eb o d yw e i g h to f c c ig r o u p ，p r e hg r o u p ，p o s t hg r o u pd e c r e a s ec o m p a r e dw i t hp r e o p e r a t i v e t h e e t h o l o g i c a lp a i nr e s u l t s ：a l lt h em e c h a n i c a lw i t h d r a wt h r e s h o l d ( m w t )a n d t h e r m a lw i t h d r a w a ll a t e n c y ( t w l ) p o i n t so fc c ig r o u p ，p r e - hg r o u p ，p o s t - hg r o u p a r el o w e rt h a ncg r o u p ，sg r o u p ( p 0 0 5 ) i td e m o n s t r a t e st h a tt h el i g a t i o no ft h e s c i a t i cn e r v ec a nc a u s ea b n o r m a lm e c h a n i c a la n dt h e r m a lp a i n ；a l lt h em w ta n d t w l p o i n t so fp r e hg r o u pa r eh i g h e rt h a nc c ig r o u p ( p 0 0 5 ) i td e m o n s t r a t e sh b o c a l lp r e v e n tt h en e u r o p a t h o l o g i cp a i ni ns o m ed e g r e e t h em w ta n dt w lp o i n t s f r o m1 d a yt o 3 w e e k so fp o s t - hg r o u pa r eh i g h e rt h a nc c ig r o u p ( p 0 0 5 ) i t d e m o n s t r a t e sh b oc a nt r e a tt h en e u r o p a t h o l o g i cp a i ni ns o m ed e g r e e t h ep o s i t i v ec e l l so fn n o s ，i n o si nt h es p i n a lc o r do fn e u r o p a t h o l o g i cp a i nr a t s i n c r e a s ea f t e rc c it r e a t m e n t b u tt h ep o s i t i v ec e l l so fe n o sd o n tc h a n g eo b v i o u s l y d u r i n gt h ew h o l ep e r i o d o t h ep o s i t i v ec e l l so f n n o s ，i n o si nc c ig r o u p ，p r e - h g r o u p ，p o s t hg r o u pi n c r e a s eo b v i o u s l yc o m p a r e d 谢t l lsg r o u p ( p 0 0 5 ) , e s p e c i a l l yt h e c c ig r o u p i td e m o n s t r a t e st h a tt h es c i a t i cn e r v el i g a t i o nc a u s et h ec h a n g eo fn o s s y s t e m t h ep o s i t i v ec e l l so fn n o s ，i n o si np r e - hg r o u pa r ef e w e rt h a nc c i g r o u p ( p 0 0 5 ) i td e m o n s t r a t e st h a th b om a yp r e v e n tt h en e u r o p a t h o l o g i cp a i n t h r o u g hc h a n g i n gn o ss y s t e m t h ep o s i t i v ec e l l so fn n o s ，i n o si np o s t hg r o u p a r ef e w e rt h a nc c ig r o u p ( p 9 0 ，加压速率为0 0 1 2 5 m p a m i n ，加压至 0 2 5 m p a ，在高压氧状态下停留6 0 m i n ，其间用纯氧通气1 0 m i n 。停留毕，以3 0 r a i n 匀速减至常压。其它组亦置于舱内，模拟除压力、氧浓度外的类同实验组的其他 处理过程和环境条件。 1 0 5 、试剂配制 ( 1 ) o 01m o l lp b s 配方( p h 7 4 ) ：0 2 m o l ln a 2 h p 0 481m l ；0 2 m o l ln a h 2 p 0 4 1 9 m l ；n a c l1 8 9 ；加蒸馏水至2 0 0 0 m l 。 ( 2 ) 4 多聚甲醛： 称取4 0 9 多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入5 0 0 - - 8 0 0 m lo 1 m o l l 磷酸缓冲液 ( p h o s p h a t eb u f f e r ，p b ) ，加热至6 0 。c 左右，持续搅拌( 或磁力搅拌) 使粉末完 全溶解，通常需滴加少许n a o h 才能使溶液清亮，最后补足o 1 m o l l 的磷酸缓冲 液于1 0 0 0 m l ，充分混匀。 6 、取材 用1 戊巴比妥钠4 0m g k g 腹腔注射麻醉，开胸经左心室插管至升主动脉， 灌注0 9 的生理盐水至流出液不含红色，然后灌注含4 多聚甲醛的o 1 m o l l 磷 酸盐缓冲液( p h 7 4 ) 固定，取动物l 4 l 6 腰段脊髓浸泡在4 多聚甲醛中待用。 三、观察指标 1 、一般情况观察 动物术后单笼饲养，以免互相打斗。各组大鼠均于术前1 d 及术后1 d 、2 d 、 3 d 、7 d 、1 4 d 、2 1 d 、2 8 d 上午9 时1 1 时观察体位、走路姿态、有无自噬行为、 后肢持重等并测定术前1 d 及术后3 d 的体重，观察体重变化情况。 2 、行为学的测定 各组大鼠均于术前1 d ( 1 d ) 及术后1 d 、2 d 、3 d 、7 d 、1 4 d 、2 1 d 、2 8 d 上午9 时1 1 时测定。以y o n f r e y 纤维测定机械性缩足反射阈值( m w t ) 和热辐射法测定 大鼠热缩足反射潜伏期( t w l ) 以评价大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏。每次测 量均先测定机械性缩足反射阈值，再测定热缩足反射潜伏期。实验前5 d 每日将大 鼠置于实验观察箱3 0 m i n 使之适应。室温保持在( 2 4 士o 5 ) o c 。 机械痛阈的测定：将一铁丝网为底部平台置于3 0 c m 高的架子上，将待测大 鼠置于其上，待大鼠适应安静后，实验者手持v o n f r e y 纤维( i i t ci n c ，美国，折 力分别为0 5 1 9 、1 0 2 9 、2 0 4 9 、4 0 8 9 、6 1 2 9 、8 1 6 9 、1 0 2 0 9 、1 2 2 4 9 和1 5 og ) 穿过铁丝网格垂直刺激大鼠后肢足底正中足掌部，使之稍成s 形，持续4 - 6s e c 。 大鼠在刺激时间内或在移开v o nf r e y 纤维时立即出现快速的抬足反应，记为阳性 反应，而身体活动所引起的抬足反应则不纳入阳性范畴。每隔3 0 s e e 测1 次，连续 1 0 次，诱发之5 次抬足的v o nf r e y 纤维对应的压力值作为5 0 的抬足阈值。最大 折力为1 5g ，大于此值时记为1 5g 。 热痛阈值测定：将大鼠置入观察笼内，待其安静后，将光辐射焦点对准右足 跖底中部，打开光源，从照射开始至大鼠抬腿或逃走的潜伏期作为退缩潜伏期 t w l ，连续测定3 次，取其平均值。为防止烫伤，规定最长照射时间为3 0 s e c 。每 只大鼠在术前1 天先测定热痛阈潜伏期作为基础热痛阈值。 3 、神经痛大鼠脊髓背角n o s 表达 术后2 8 天取材，并将新鲜标本用4 多聚甲醛固定4 h ，常规脱水、浸蜡、包 埋制作石蜡切片，厚度4 0 1 a m 。切片经p b s 冲洗三次后，依次加入3 h 2 0 2 ，3 0 封闭血清封闭1 0 m i n 后加入抗n n o s 、e n o s 、i n o s 抗体( 1 ：2 0 0 ) ，4 。c 孵育4 8 h 。 p b s 冲洗三次后，滴加生物素标记的第二抗体( 羊抗兔i g g ) 。3 7 。c 孵育1 5h 后p b s 冲洗，d a b 显色，贴片，酒精梯度脱水，中性树胶封片。光镜观察：棕色染色的 为阳性细胞。阴性对照实验中，用p b s 代替一抗或二抗，未见n o s 样染色的神 经元。每个脊髓切片时隔5 张取一张，在o l y m p u s 光学显微镜下选取恒定位置脊 髓背角i i i 层计数n n o s 、e n o s 及i n o s 阳性神经元。 显微照相及图像分析应用u m c bo l y m p u s 图象采集系统， m e t a m o i 冲h c o o ls n a p + x a x 7 0 显微( 荧光) 图象分析系统( v i c r o p e r o l y m p u s ) u s j p ，对切片进行分析处理，每只动物取4 张切片，测定阳性细胞 数值，放大4 0 0 倍照相。 四、统计学分析 用s p s s l1 0 专业统计软件包进行统计分析。计量资料以均数士标准差表示。 两组间一般资料比较采用独立样本r 检验。各组重复测量的机械阈值和热刺激潜 伏期之间的组内及组间差异采用多个样本均数比较的a n o v a 及s n k q 检验的分 析方法。图像中n n o s 、e n o s 及i n o s 阳性神经元数比较采用配对t 检验的分析 方法，p 0 0 5 为差异有统计学意义。 1 2 结果 一、一般情况的比较 所有实验大鼠术前均步态正常，足趾伸展，运动及承重均无异常；c c i 术后 动物表现为大鼠体重增长缓慢( 见表1 ) 。手术结扎侧患足足趾并拢背屈、外翻， 成防御姿势，不负重，患足行走无力，运动时明显跛行，膝关节着地，右足掌悬空或拖 行；术后2 周左右患肢出现明显肌肉萎缩，患肢足底轻触刺激时，大鼠常将其迅速 抬起并放入口中舔吮，然后在空中不停地甩动损伤侧后肢。在实验观察过程中，动 物在休息或活动过程患右后爪偶然接触笼面，会发生明显的缩足反应，大部分的 大鼠可在无任何刺激的情况下发生自发性的缩足发射；整个观察期间无动物自残 现象。 表l ，各组大鼠术前术后平均体重测量结果 相对术前比，c c i 组、p r e h 组和p o s t h 组术后体重降低，p 0 0 5 二、行为学的变化 c c i 组、p r e h 组和p o s t h 组的机械性缩足反射阈值m w t 和热缩足反射 潜伏期t w l 值在各观察点都较c 组及s 组显著降低( 尸 o 0 5 ) ，即坐骨神经结 扎引起了机械性及温度的异常痛觉。p r e h 组的机械性缩足反射阈值m w t 和 热缩足反射潜伏期t w l 值在各观察点显著高于c c i 组( p o 0 5 ) ，表明高压氧对 神经病理性疼痛有一定预防作用。p o s t h 组的机械性缩足反射阈值m w t 值在 1 d 到3 w ，热缩足反射潜伏期t w l 值在1 d 到2 w 显著高于c c i 组( 氏0 0 5 ) ，表 明高压氧对神经病理性疼痛有一定治疗作用。 1 3 l 、机械性缩足反射阈值( m w t ) c c i 组、p r e h 组和p o s t h 组的m w t 值在各观察点都较c 组及s 组显著降 低( 尸 0 0 5 ) 。p r e h 组和p o s t h 组的m w t 值在1 d 到3 w 各观察点显著高于c c i 组( 尸 0 0 5 ) 。各组大鼠各时期机械性缩足反射阈值的变化见表2 和图3 。 表2 ，各组大鼠机械性缩足反射阈值( m w t ) 的测量结果 ，i 相比c ，s 组，c c i 、p r e h 和p o s t h 组，p 0 0 5 ； 群相比c c i 组，p r e h 与p o s t h 组，p 0 0 5 1 2 1 0 8 一、 _ 趔6 - 目 蓦 - 1 d1 d2 d3 d7 d1 4 d2 l d2 8 d 时间( t i m e ) 图3 ，各组大鼠机械性缩足阈值( m w t ) 比较 1 4 2 、热辐射法测定大鼠热缩足反射潜伏期( t w l ) c c i 组、p r e h 组和p o s t h 组的t w l 值在各观察点都较c 组及s 组显著降 低( 氏o 0 5 ) 。p r e h 组和p o s t h 组的t w l 值在1 d 到2 w 各观察点显著高于c c i 组( p o 0 5 ) 。各组大鼠各个时期热辐射法测定大鼠热缩足反射潜伏期的变化见 表3 和图4 。 表3 ，各组大鼠热缩足反射潜伏期( t w l ) 的测量结果 宰相比c ，s 组，c c i 、p r e h 和p o s t h 组，p 0 0 5 ； 群相比c c i 组，p r e h 与p o s t h 组，p 0 0 5 2 5 2 0 5 o 时间( t i m e ) 图4 ，各组大鼠热缩足反射潜伏期( t w l ) 比较 1 5 5 0 l l v趔富一 三、免疫组织化学检测结果 大体标本各组脑和脊髓标本未见异常。坐骨神经结扎后3 d 即见结扎侧坐骨神 经肿胀增粗，与周围组织粘连，但结扎线可轻易剪除；1 4 d 时与周围组织粘连减 轻，坐骨神经较易分离，结扎线开始吸收。假手术侧坐骨神经干无肿胀、出血或 粘连，容易暴露及游离。 1 、c c i 术后各组大鼠n n o s 在脊髓胶质细胞数目显著增加，c c i 组n n o s 细 胞增长较p t e - h b o 组和p o s t - h b o 组显著( p 0 5 ) ( 见表4 ，图5 ，图6 ) 。 表4 ，各组大鼠n n o s 阳性细胞数密度士s ) 阳性细胞数密度( 1 0 4 ) s 组 c c i 组 p h b o 组 p o s t - h b o 组 9 5 9 士2 2 l 4 8 4 5 = 3 2 l 2 8 8 6 士3 5 3 i i 3 2 8 铀- 2 8 8 p w - h b o , p o s t - h b o ，c c i 与s 组比较，p 0 0 5 撑p r e - f i b o , p o s t - f i b o 与c c i 组比较，p 0 0 5 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 s f f i c c i 组p r o - h 组p o s t - h 组 图5 ，各组大鼠n n o s 阳性细胞数密度变化图 p r e - f i b o , p o s t - h b o , c c i 与s 组比较，p 0 0 5 撑p r e - h b o , p o s t - h b o 与c c i 组比较，p 0 0 5 1 6 图6 ，各组脊髓胶质细胞n n o s 阳性细胞免疫组化图片 2 、c c i 术后各组大鼠i n o s 在脊髓胶质细胞数目显著增加，c c i 组i n o s 细 胞增长较p r e h b o 组和p o s t - h b o 组显著( 砌0 5 ) ( 见表5 ，图7 ，图8 ) 。 表5 ，各组大鼠i n o s 阳性细胞数密度士s ) s 组 c c i 组 p 静h b o 组 p o s t - h b o 组 幸p r e - h b o , p o s t - h b o ，c c i 与s 组比较，p 0 0 5 1 7 1 6 5 1 6 1 5 5 1 5 1 4 5 1 4 s 组 c c i 组p r e - h 组p o s t h 组 图9 ，各组大鼠e n o s 阳性细胞数密度变化图 毒p r e - h b o , p o s t - h b o , c c i 与s 组比较，p 0 0 5 1 9 图1 0 ，各组脊髓胶质细胞e n o s 免疫组化图片 讨论 神经病理性疼痛是中枢或外周神经系统损伤或病变引起的疼痛综合征，以自 发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏为特征。近年来，对其基础性研究已取得很大进 步，认为中枢神经系统敏化是维持神经病理性疼痛的基础。即当外周神经损伤时， 脊髓后角一氧化氮合酶( n o s ) 激活产生n o ，通过环磷酸鸟苷( c g m p ) 、超氧 化物、n m d a 、c g m p 、蛋白激酶g ( p k g ) 和自由基等信号系统介导产生和维持 神经病理性疼痛【3 ，5 】。而外周机制认为疼痛的产生与神经纤维的异常放电和离子 通道的异常开放等有关。近年来越来越多的证据表明，中枢神经系统的神经免疫 因素也参与了神经损伤加速了神经病理痛的进程【3 】。当外周神经损伤时，机体产 生免疫炎性因子( p 物质、i l - l f ) 、n 岍吨、前列腺素( p g s ) 、i l _ 6 等) ，激活脊 髓后角兴奋性氨基酸受体( n m d a ) ，通过细胞内信号传递系统，产生痛超敏 8 ，9 】。 这些信号和因子之间存在正反馈，又各自受多种因素影响，因此神经病理性疼痛 确切发病机制尚不完全清楚，临床上缺乏满意的治疗效果。以周围神经痛最为常 见，其症状严重，即使使用强效的阿片也很难奏效，且并发症和副作用很大。因 而神经病理性疼痛是疼痛研究的前沿课题。 下面我们先了解一下疼痛的产生过程。外周神经损伤引起的持续性伤害信息 通过a 8 纤维和c 纤维传入，使兴奋性氨基酸如谷氨酸( g 1 u ) 等在脊髓背角释放增多， g l u 能与n m d a r 和非n m d a r 结合。非n m d a r 被兴奋后，细胞膜对n a + 、k + 通透性增高，产生兴奋性突触后电位( e p s p ) ，引起突触后膜去极化，当去极化达到一 定程度后，可使位于n m d a r 通道内静息状态时阻塞c a 2 + 通道的m 9 2 + 移开，c a 2 + 通 道开放，内流的c a 2 + 与钙调蛋白结合后活化n o s ，n o s 催化l 精氨酸( l a r g ) 再生成 n o t l 2 ，1 3 】。n o 作为一种神经信号传递因子，与环磷酸鸟苷( c g m p ) 酶中活性位点的 亚铁离子结合，激活c g m p 酶，导致细胞内c g m p 的含量升高。c g m p 可以促进靶细 胞突触前释放g l u , 后者作用于n m d a r 促进c a 2 + 等通道开放，从而启动了 g l u n o c g m p 的级联放大反应。c a 2 + 大量内流使神经元兴奋性提高，突触能力加 强，从而引起中枢敏感化，导致痛觉过敏和触诱发痛等慢性疼痛的形成，引起p i c a 依 赖的转录因子和c a m p 反应序列结合蛋白( c r e b ) 的激活，并把外界信号通过第三 信使与基因转录、表达偶联起来，可以使原本很弱、很易被忽略的信息得到放大， 从而引起细胞内显著的病理生理变化。目前认为谷氨酸引起的脊髓神经元敏感化 在炎性疼痛的敏感状态中发挥着重要作用。另外，n o 和谷氨酸可以双向调节，两 者的产生和释放可以互相促进，因此谷氨酸在疼痛中的作用越来越受到人们的重 视。 神经病理性疼痛是由于组织损伤、炎症或者神经系统损伤所导致的。研究证 实其中痛觉过敏的机制包括w a l l e r i a n 变性、肥大细胞的激活和巨噬细胞活化 3 】。 c l a t w o r t h y 发现抑制坐骨神经损伤引起的炎症反应可以减轻痛觉过敏的症状，炎 症反应促进痛觉过敏的发生发展。角叉莱胶、完全弗氏佐剂、酵母多糖诱导的病 理性疼痛模型的出现，能很好的解释神经病理性疼痛的炎症和免疫机制。越来越 多的研究表明免疫和炎症机制对神经病理性疼痛起重要作用。除此之外，脊髓神 经胶质细胞激活对急慢性疼痛起着重要作用；许多形式的疼痛都和胶质细胞有关 【1 4 】。已有研究表明小胶质细胞在神经病理性疼痛的早期形成中起重要作用 1 5 ； 而星形胶质细胞在疼痛的后期维持中起作用 8 。星形胶质细胞包围着神经末梢， 不仅能调节神经元的活动，而且能影响突触传递，对正常突触的形成和维持突触 2 l 的稳定有重要作用。在海马、突触前成分的刺激可引起谷氨酸的释放，激活邻近 突触的星形胶质细胞上的谷氨酸受体，继而使星形细胞内的g l u 水平升高。另一 方面，细胞内g l u 水平升高使星形胶质细胞释放谷氨酸，后者可导致依赖的神经 递质释放的突触前抑制。因此，星形胶质细胞是中枢神经系统内突触的具有双重 相反作用的反馈调节器，它实现了神经元与胶质细胞之间的双向信号交流 1 6 。 n m d a 受体的非竞争性拮抗剂兴奋性氨基酸( e x c i t a t o r ya m i n o a e i d s ，e a a s ) 是大多 数兴奋性神经元的递质，参与兴奋性突触的传递，与突触的可塑性有关。胶质细 胞之间以及胶质细胞与神经元之间的通讯不是通过突触，而是通过缝隙连接，形 成电压门控离子通道。星形胶质细胞和小胶质细胞的活化对神经病理性疼痛的发 生发展起着重要的作用【1 7 】，然而胶质细胞激活的信号机制仍然是不清楚的。 在临床上神经病理性疼痛是常困扰患者的一种病症 1 8 】，为了能了解其发生的 病理机制以及为其治疗提供一个平台，所以有许多学者制作一些动物模型来模拟 临床上神经病理性疼痛的症状。本研究采用大鼠c c i 模型并用v o nf r e y 机械性刺 激和热刺激来测定模型的痛觉过敏。发现c c i 大鼠术后第一天开始出现后爪承重 姿势改变、自发性的缩足反应、机械性异常疼痛及对热刺激潜伏时间缩短的行为 学特征，说明该模型建立是成功的。 神经病理性疼痛治疗困难，其发生机制尚不清楚。有可能与n o s 有多种亚型 的生理作用不同有关。n o s 有n n o s 、i n o s 和e n o s 三种 1 9 】。n n o s 、e n o s 受 c a 2 + 的调节，正常组织中均有表达，被称为e n o s ；而i n o s 的活性不受c a 2 + 的影响。 神经病理性疼痛时脊髓i n o s 转录升高，且转录、翻译后就与钙及钙调蛋白紧密 结合，不受细胞内c a 2 + 的影响，翻译后即具有合成n o 的功能。i n o s 在神经病理 性疼痛中多在活化的小胶质细胞中表达，大量合成的n o 可以激活星形胶质细胞， 促进它产生前列腺素，增加痛觉传递神经元的兴奋性。因此，外周神经损伤后，脊髓 表达及活性增加的i n o s 具有促进疼痛产生的作用。有实验显示神经病理性疼痛 大鼠脊髓中e n o s ( n n o s 和e n o s ) 的活性显著升高，远高于i n o s ，并且e n o s 的活 性对大鼠神经病理性疼痛有着充分的调节作用。n n o s 不仅受c a 2 + 精确调节，而且 本身也具有很多亚型，处于细胞的不同位置，发挥着不同的作用。前言所述n o s 在 疼痛中的矛盾现象可能与n n o s 的这些复杂性有关。但在神经病理性疼痛时，脊髓 背角三种n o s 的表达及活性变化尚不清楚。本实验的目的在于研究神经病理性疼 痛大鼠模型脊髓背角三种类型n o s 的表达水平变化。 本实验结果表明，慢性坐骨神经结扎大鼠脊髓背角n n o s 阳性神经元表达增加， 提示脊髓背角n n o s 阳性神经元在c c i 大鼠慢性神经病理性疼痛的中枢机制中具 有重要作用。高压氧能减少n n o s 的表达，因此很可能达到减轻疼痛的作用。在 神经系统中，研究显示通过不同的方式抑制神经元n n o s 的活性，可以减少n m d a 受体所介导的神经毒性，由此认为n n o s 具有一定的毒性作用。但在这些实验中， n m d a 受体在n o 合成过程中具有至关重要的作用。n m d a 受体本身不仅对神经 元具有保护或抑制作用；而且抑制n n o s 的活性。有研究表明n n o s 产生的n o 可以亚硝基化n m d a 受体，改变n m d a 受体的结构，减少钙离子的内流【2 0 】； 也有研究表明：在肌萎缩性侧束硬化症的运动神经元中神经丝相互聚集，聚集的神 经丝将n n o s 包裹在胞浆中，n n o s 不能对细胞膜上的n m d a 受体产生反馈性抑 制作用，n m d a 受体活性增强，导致运动神经元受损【2 l 】。还有研究表明：n o 扩 散至周围的神经元，增加周围神经元释放更多的神经递质，这些递质包括兴奋性 和抑制神经元的递质，但更多的是单胺类递质，单胺类递质可以抑制神经元释放 谷氨酸 2 2 1 。目前研究认为神经元n n o s 正常释放的n o 抑制神经元的兴奋性，稳 定神经元功能的作用。 脊髓灰质被分为1 0 个板层。板层i 、i i 、i i i 、i v 、v 、v i 、v i i 、v i i i 、x i 和 x 。在免疫组化的观察中我们将脊髓分为四个部分脊髓后角浅层( 板层