（作物遗传育种专业论文）大豆acc合酶的活性与纯化研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 卜氨基环丙烷一1 一羧酸合酶( a c c 合酶) 是高等植物内源激素乙烯合成路径的限速酶， 其传统的活性检测方法是气相色谱法，主要是通过气相色谱检测最终产物乙烯的量来对 a c c 合酶活性进行间接推算。这在内源乙烯释放量少，a c c 合酶含量低的干果类植物， 如大豆等材料中的研究受到一定程度的限制。本文以植物内源激素乙烯生成路径为依 据，提出并建立以高效液相色谱为主体的a c c 合酶活性检测体系，利用电喷雾电离质谱 ( e s i m s ) ，对体系的可靠性进行了验证。 在对大豆黄化幼苗下胚轴部分的a c e 合酶提取过程中，本研究发现主要活力集中在 4 0 9 6 6 0 的硫酸铵饱和沉淀中。反应温度3 0 ，p h 值8 0 时，酶活力较高，且s 一腺苷蛋 氨酸( s a m ) 自身分解微弱，适合于高效液相色谱( h p l c ) 酶活体系分析，而对材料进 行伤害处理会显著提高酶的比活力。本研究采用阴离子交换层析和凝胶层析对粗酶进行 了纯化，结果表明阴离子交换层析上样缓冲液p h 值为7 0 时可去除粗酶中大量杂蛋白 而不影响目的蛋白；凝胶层析可进一步去除小分子杂蛋白。a c c 合酶不稳定，3 天即丧 失提取当日活力的9 0 0 5 。在反应温度为3 0 ，p h 值为8 0 的条件下，伤害处理的大豆黄 化幼苗下胚轴部分提取的a c e 合酶对底物s a m 催化反应的米氏方程为：y - - 9 7 2 4 7 x + 2 1 9 1 0 6 ，米氏常数l ( 为4 4 3 3 u m o l l 1 。应用该检测体系，对八种不同品系大豆的种子 活力指标与a c c 合酶活性水平的关系进行了初步的探索。结果显示，不同大豆品种间的 种子活力与a c c 合酶的比活力呈显著正相关，这表明内源乙烯可能参与并促进了种子的 萌发。 关键词：高效液相色谱；卜氨基环丙烷_ 1 一羧酸( a c , c 合酶) ；s 一腺苷蛋氨酸；腺嘌呤； 种子活力 大豆a c c 合酶的活性与纯化研究 t h ea c t i v i t ya n dp u r i f i c a t i o ns t u d yo fs o y b e a na c c s y n t h a s e a b s t r a c t 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 - c a r b o x y l i ca c i ds y n t h a s e ( a c es y n t h a s e ) i st h er a t e l i m i t i n g 朗z y n l eo fe n d o g e n e s i sh o r m o n ee t h y l e n eb i o s y n t h e s i si nh i g h e rp l a n t s g a sc h r o m a t o g r a p h y ( o c ) i so n et r a d i t i o n a lm e t h o du s e dt om e a s u r et h ea m o u n to fe t h y l e n e 。t h eu l t i m a t ep r o d u c t r e l e a s e d , a n dt h e nt h ea c t i v i t yo f a c cs y n t h a s ec a nb ed u d u c e di n d i t e c t l y a st od r yf r u i t , l i k e t h el e g u m e ( s o y b c a n ) ，s i n c et h er e l e a s eo f e t h y l e n ei sl i t t l ea n dt h ec o n t e n to f a c c s y n t h a s ei s l o w , t h em e a s i l r e m e mo fa c t i v i t yi sl i m i t e da n dd i m c u l t b a s e do nt h eb i o s y n t b e s i sp a t h w a y o fe t h y l e n e ，an e ws y s t e mu s i i l gt h eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) s y s t e mh a sb e e np u tf o r w a r da n ds e tu pt om e a s u r et h ea c t i v i t yo fa c cs y n t h a s ed i r e c t l y e s i - m sr e s u l t sh a df u r t h e rt e s t i f i e dt h er e l i a b i l i t yo f t h i ss y s t e m i nt h ee x t r a c t i o no fa c cs y n t h a s ef r o me t i o l a t e dh y p o c o t y l so fs o y b e a nt h em a i n a c t i v i t yw a sf o u n dl y i n gi ns a t u r a t i o nw i t ha m m o n i u ms u l f a t ei nt h er a n g eo f 4 0 - 6 0 a t3 0 a n dp h8 0 t h ea c t i v i t yo fe n z y m ew a sr e l a t i v eh i g ha n dt h ed e c o m p o s i t i o nr a t eo fs a m w a sw e a k p r i o rt oe x t r a c t i o n , t h ew o u n dt r e a t m e n tw o u l dm a r k e d l ye l e v a t et h es p e c i f i c a c t i v i t yo fa c cs y n t h a s e n e g a t i v ei o ne x c h a n g ea n dg e lf i l t r a t i o nw e r ep e r f o r m e dt op u r i f y a c cs y n t h a s e n 璩r e s u l t ss h o w e dt h a tn o n - t a r g e tp r o t e i n sw e r ee l i m i n a t e df r o mc r u d e e n z y m e sa tp h7 0w i t h o mi n f l u e n c i n gt h et a r g e tp r o t e i n f u r t h e r , t h eg e lf i l t r a t i o nc o u l dw i p e 0 f fo t h e rr e m a i n e dn o n - t a r g e tp r o t e i n sw i t hl o w e rm o l e c u l ew e i g h t s i n c et h ea c c s y n t h a s e w a su n s t a b l e ，9 0 a c t i v i t i e sw o u l db ei o s ti n3d a y sa f t e re x t r a c t i o n a t3 0 p h8 0 t h e m i c h a e l i s - m e n t e n te q u a t i o nt ot h er e a c t i o no fa c cs y n t h a s ee x t r a c t e d 丘o me t i o l a t e d h y p o c o t y l so fs o y b e a nc a t a l y z i n gs a mw a s ：y = 9 7 2 4 7 x + 2 1 9x 1 0 6 t h em i c h a e l i sc o n s t a n t k mw a s4 4 3 31 1m o l l t h es e e dv i g o ro fe i g h tk i n d so fs o y b e a nc u l t i v a r sa n dt h e i r a c t i v i t i e so f a c cs y n t h a s ew e t ed e t e c t e da n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e mw a ss t u d i e d t h e s e e dv i g o ro fd i f f e r e n tk i n 凼o fs o y b c a n ss h o w e dm a r k e d l yp o s i t i v ec o r r e l a t i o nt ot h e i r a c t i v i t i e so fa c cs y n t h a s e ，s u g g e s t i n gt h a te n d o g e n e s i se t h y l e n em i g h tp a r t i c i p a t ea n d a c c e l e r a t et h eg e r m i n a t i o no f s o y b c a ns e e d s k e yw o r d s ：h p l c ；1 - a m i n o e y e l o p r o p a n e - 1 - c a r b o x y f i ea c i ds y n t h a s e ( a c c s y n t h a s e ) ；s - a d e n o s y l n e t h i o n i n e ( s a m ) ；a d e n i n e ；s e e dv i g o r 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：差垒堡日期：三堕垒! 夕 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名： 羡永负 导师签名：髫矛l 修导师签名：竺塑l 堕 2 丑年上月上日 大连理工大学硕士学位论文 引言 乙烯( c 2 i - h ) 是植物五大内源激素之一，对植物的生长、发育、衰老、器官脱落和果 实成熟等起着重要调节作用。1 9 7 7 年，杨祥发等提出乙烯在果实中的生物合成都是按照 m e t ( 蛋氨酸) - - s a m ( s - 腺苷蛋氨酸) - - a c c ( 1 氨基环丙烷1 羧酸) 一乙烯途径进行的，催 化s a m 生成a c c 和腺苷的1 氨基环丙烷1 羧酸合酶( a c c 合酶) 是高等植物乙烯合 成途径中的限速酶，决定着乙烯产生的速率。 目前，关于植物a c c 合酶活性检测的经典方法是通过气相色谱对终产物乙烯进行 定量从而计算出a c c 合酶的活力。由于在果实成熟阶段乙烯合成和释放旺盛，a c c 合 酶含量相对较高，所以目前对其研究报道多集中于番茄，苹果和瓜类等肉果类植物中； 而由于干果类植物，如大豆等的植株和果实中乙烯释放量较小，a c c 合酶表达水平很 低，不易检测，因此对于大豆a c c 合酶的研究尚无报道。 本论文通过对乙烯合成路径的分析，发现a c c 合酶的直接作用产物腺嘌呤在摩尔 数上与底物s 腺苷蛋氨酸，以及乙烯合成的直接前体a c c 是一一对应的。由于s a m 与腺嘌呤又同样具有紫外的最大吸收波长，因此利用高效液相色谱( h p l c ) 对乙烯合 成路径的中间产物进行定量分析也就成为可能。本文首次提出并建立了以高效液相色谱 为主体的a c c 合酶活性分析体系，较好地解决了大豆等干果类植物a c c 合酶不易检测 的问题。应用此酶活分析体系对从伤害处理的大豆黄化幼苗下胚轴部分提取的a c c 合 酶进行了活性测定，考察了大豆a c c 合酶的性质及纯化方法，并通过比较八个大豆品 种的种子活力和种子萌发阶段的a c c 合酶比活力，初步研究了大豆种子活力与a c c 合酶水平的关系，揭示了内源乙烯可能促进了种子的萌发。 大豆a c c 合酶的活性与纯化研究 1 文献综述 1 1 乙烯研究的发展史 上个世纪中叶( 1 8 6 4 ) ，有报道指出，燃气街灯的漏气会促进附近的树木落叶。1 9 0 1 年，俄国植物学家奈刘波( n e l j u b o w ) 首次证明这是由于照明气中的乙烯在起作用【1 1 。尽 管人们在1 9 3 0 年以前就己认识到乙烯对植物具有多方面的影响，但直到1 9 3 4 年，甘恩 ( g a n e ) 才获得了植物组织确实能产生乙烯的化学证据【2 】。1 9 3 5 1 9 4 0 年，美国的 h a n s e n 3 1 ，英国的k i d d 和w e s t f 4 支持采后植物生理学家的想法，认为乙烯是一种促进 果实成熟的生长调节剂。1 9 4 0 年以后，美国加州大学的b i a l e 和u d a 例提出新的想法， 他们认为乙烯只是果实后熟中的一种副产物，而并不对果实的成熟起重要的作用。1 9 5 2 年，j a m e s 和m a r t i n 发明了气相色谱，它可以对果实在成熟过程中释放乙烯浓度的变化 进行高精度地检测。人们发现，果实只有在乙烯增加到定浓度时才会成熟，从而证明 了乙烯的确是促进果实成熟的一种生长激素。此后几年，在乙烯的生物化学和生理学研 究方面进展很快，人们发现乙烯可以在高等植物的各个部位产生，对许多生理过程都起 着重要的调节作用。1 9 6 5 年，在柏格( b u r g ) 的提议下，乙烯被公认为是植物的天然激 素。 1 2 乙烯的生理作用 乙烯作为一种重要的植物生长调节物质能够诱导与植物组织发育、衰老和果实后熟 的多种生理生化过程，包括种子的萌发，根毛的发育、根瘤的形成、器官凋落、果实成 熟和植物对逆境胁迫的反应等【6 ，“。乙烯诱导和促进果实成熟的生理作用，主要表现在： 乙烯生成量增加与呼吸强度上升时间进程一致，通常出现在果实的完熟期间；外源乙烯 处理可诱导和加速果实成熟；通过抑制乙烯的生物合成( 如使用乙烯合成抑制剂a v g ， a o a ) 或除去贮藏环境中的乙烯( 如减压抽气、乙烯吸收剂等) ，能有效地延缓植物的 成熟衰老；使用乙烯作用的拮抗物( 如a g + ，c 0 2 ，卜t c p ) 可以抑制果蔬的成熟【9 1 。 目前认为乙烯促进成熟的机理主要是由于乙烯具有提高细胞膜透性的作用。乙烯是 脂溶性的，在油脂中的溶解度比在水中大。细胞内许多种膜都是由蛋白质与脂质构成的， 因此这些脂质是乙烯最可能的作用点，乙烯作用于膜的结果会引起膜透性增大，加速气 体交换，使得膜的分室作用减弱增加底物与酶的接触，从而加速成熟例。 另一种观点认为乙烯可能在蛋白质合成系统的转录水平上起调节作用。诱导多种与 果实成熟相关的基因表达，如纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、几丁质酶基因等。 a l b e l e s ( 1 9 7 1 ) 【9 】提出外源乙烯能控制纤维素酶的合成，并调节该酶从细胞质向细胞壁 大连理工大学硕士学位论文 移动。另有实验表明1 1 0 】，用乙烯处理葡萄柚外果皮切块，过氧化物酶、过氧化氢酶、 淀粉酶和苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 的活性增加。将甘薯块根的薄片切块置于乙烯中，过氧 化物酶、多酚氧化酶、绿原酸酶及苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 的活性都有所增加。这些酶系 的表达满足了果实成熟过程中有机物质、色素的变化及果实交软等过程的需要，从丽最 终促进呼吸，诱导呼吸跃变，导致果实成熟。 乙烯除了具有促进植物成熟的作用，还具有促进植物器官脱落的作用，植物器官的 脱落是受到体内多种植物激素的相互作用的结果。乙烯在这一过程中，加速细胞壁降解 酶一纤维素酶的合成并且控制纤维素酶由原生质体释放到细胞壁中，促进细胞衰老和细 胞壁的分解，引起离区近茎侧的细胞膨胀，从而迫使叶片、花或果实机械地脱离【8 】。 此外，乙烯的生理作用还体现在促进开花和雌花分化，引起三重反应和偏上性反应， 诱导插枝不定根的形成，促进根的生长和分化，打破种子和芽的休眠，诱导次生物质的 分泌及加快叶绿素的分解等方面呻】。 1 3 乙烯的生物合成 乙烯( e t h y l e n e ，e t ，e t h ) 是一种最简单的链烯，在正常的条件下为气态。分子量 为2 8 ，轻于空气。低浓度的乙烯时就对植物产生生理效应。种子植物、蕨类、苔藓、真 菌和细菌都可产生乙烯。至于乙烯的直接前体是什么，最初众说纷纭，因为乙烯的化学 结构非常简单，有许多化合物都可以通过不同的化学反应转变为乙烯，所以曾经有许多 化合物被认为是乙烯生物合成的前体，如亚油酸、丙醛、b 一丙氨酸、丙烯酸、乙醇、 乙烷、乙酸、延胡索酸和蛋氨酸。1 9 6 5 年，l i e b e r m a n ，m a p s o n 和k u n i s h i h 提出乙烯 是由蛋氨酸( m e t h i o n i n e ) 转变来的，但并不了解其反应的中间步骤。直到1 9 7 9 年，a d a m s 和y a n g 【1 2 】才发现a c e ( 卜氨基环丙烷羧酸) 是乙烯生物合成的直接前体，弄清了植物体 内乙烯生物合成的途径。乙烯生物合成的主要途径可以概括如下：蛋氨酸一s 一腺苷蛋氨 酸( s a m ) 一卜氨基环丙烷一卜羧酸( a c c ) 一乙烯( e t h ) 。在此过程中，每一步反应都 为特定的生物酶所催化。了解和研究这些酶，才能有效地调控乙烯的生物合成，使之最 终能在生产上得到利用。 1 3 1 甲硫氨酸循环( 蛋氨酸循环) ( 1 ) 甲硫氨酸是乙烯生物合成的前体 l i b e r m a n 和m a p s o n ( 1 9 6 5 ) i h 致力于研究乙烯产生的模式系统。他们发现蛋氨酸 ( m e t ) 是乙烯生物合成的直接前身。他们的试验发现，在有铜离子一抗坏血酸存在时，亚 麻油酸可以降解为乙烷、乙烯和其它的碳氢化合物。为了确定亚麻油酸产生乙烯的反应 是否为自由基反应，他们加入了自由基清除剂蛋氨酸，目的是通过减少自由基来抑 大豆a c c 合酶的活性与纯化研究 制反应和乙烯的产生。然而适得其反，加入蛋氨酸反而促进了乙烯的产生。后来他们又 进一步发现，即使没有亚麻油酸存在，在铜离子一抗坏血酸溶液中，蛋氨酸也可以产生 乙烯。l i e b e r m a n ( 1 9 7 9 ) d 3 1 将1 4 c 标记的蛋氨酸供给苹果，可产生带有1 4 c 的乙烯，从而 证明了乙烯来自蛋氨酸，并且是由蛋氨酸上的第三和第四碳转变来的。植物组织中的蛋 氨酸浓度很低，蛋氨酸中的硫必须循环使用，否则会限制植物组织中的蛋氨酸转化为乙 烯。植物体内的蛋氨酸首先在三磷酸腺苷( a t p ) 参与下，转变为s 一腺营蛋氨酸( 简称 s a m ) ，s a m 被转化为1 一氨基环丙烷卜羧酸( 简称a c c ) 和甲硫腺苷( 简称m t a ) ，m t a 进一步被水解为甲硫核糖( 简称m t r ) ，通过蛋氨酸途径，又可重新合成蛋氨酸。 ( 2 ) s 一腺苷蛋氨酸( s a m ) 为一中间产物 b u r g ，m u r r 和y a n g ( 1 9 7 5 ) 1 4 1 观察到蛋氨酸转交为乙烯需要氧参加，而且这一转化 过程可以被一种氧化磷酸化的解偶联剂( d n p 一二硝基苯酚) 所抑制，因此他们推测s a m 是 由蛋氨酸和a t p 合成的。a d a m s 和y a n g ( 1 9 7 9 ) 1 2 1 的试验证明蛋氨酸在空气中很快生成乙 烯，在氮气下却无乙烯产生，只有m t a ( 5 - 甲硫腺苷) 和a c c ( 卜氨基环丙烷一1 一羧酸) 产生， 这说明s a m 是一个中间产物，在有氧及其它条件满足时，它可以通过a c c 形成乙烯，同 时形成盯a 及其水解产物m t r 。 ( 3 1 从5 甲硫腺苷( m t a ) 到蛋氨酸( m e t ) 虽然植物体内的蛋氨酸( m 哟含量并不高，却不断有乙烯产生，而且没有s 释放出 来，标记试验发现s 是与甲基结合在一块，形成甲硫基在组织中循环的。m u r r 和 y a n g ( 1 9 7 5 ) i j 4 】将1 4 c 标记在m t a 的早基上，在植物组织中得到了标记的蛋氨酸，a d a m s 和y a n g ( 1 9 7 7 ) t ”1 又在m t a 中的硫原子和甲基上进行了双重标记试验，发现m r a 的甲 硫基被结合到蛋氨酸上，这些研究证明了乙烯的生物合成是经过从蛋氨酸一s a m m t a 一蛋氨酸这样一个循环，其中甲硫基可以循环使用。 1 3 2 卜氨基一卜羧酸环丙烷c a c c ) 的合成 乙烯生物合成需要氧气，当植物组织置于无氧条件下，可很快地抑制乙烯的形成。 而将这种组织重新置于空气中，可迅速恢复乙烯形成能力，其速率明显高于没有置于无 氧条件的组织。然而这种升高的速率是暂时的，几小时后，乙烯的合成速率又恢复到原 有的水平。当时人们认为，这种现象可能是在无氧条件下，乙烯合成的中间产物积累的 缘故。在氧气存在下，这种中间体迅速转化为乙烯。a d a m s 和y a n g ( 1 9 7 9 ) 1 1 2 】用苹果组 织测定无氧条件下的蛋氨酸代谢，发现只有当组织处于无氧条件时，蛋氨酸代谢产物积 累，而当组织重新置于空气中时，这种代谢产物迅速消失。从1 4 c 蛋氨酸组织分离这种 标记代谢物整合到乙烯中，经测定这种中间物是a c c 。从s a m 转变来的a c c 被确定为乙 一4 一 大连理工大学硕士学位论文 烯生物合成的直接前体。由于s 一腺苷蛋氨酸( s 圳是一个处于十字路口的中间产物，所 以它既可以变成 e r a 参加蛋氨酸循环，又可以合成a c c 。b o l l e r 和h e m e r ( 1 9 7 9 ) 【1 6 l 发现 番茄果实游离细胞提取液具有使s a m 转变为a c c 的能力，而且这个反应能被a v g ( 氨基羟 乙基乙烯基甘氨酸) 抑制，已知a v g 是一种吡哆醛磷酸化酶( 磷酸毗哆醛酶) 的抑制剂。 r a n d o ( 1 9 7 4 ) 【l 刀证明由s a m 转变为a c c 是通过吡哆醛酶作用，后来又证实了这种吡哆醛 磷酸化酶是a c c 合酶。a c a s t e r 和k e n d e ( 1 9 8 2 ) o s 提纯了a c c 合酶，并在罗马甜瓜、绿 豆下胚轴，黄瓜等组织中被鉴定出来。 1 3 3 乙烯的合成( 从a c o - 乙烯) h o f f m a n 等( 1 9 8 4 ) 0 0 根据a c c 能被次氯酸钠氧化的化学反应，提出a c c 可能被羟化 酶或脱氢酶氧化形成氰甲酸，同时形成乙烯。氰甲酸不稳定，分解形成c o s 和h c n 。h c n 对植物有毒，h c n 被催化与半胱氨酸形成b 一氰基丙氨酸。由a c c 到乙烯需a c c 氧化酶( 也 称乙烯形成酶，e f e ) 作用，这个过程需氧参加，而且解偶联剂( d n p ) 及自由基清除剂都 能抑制乙烯的产生。用细胞匀浆进行试验，因破坏了细胞的结构，乙烯的合成停止，但 有a c c 累积。这说明细胞的组织结构不影响a c c 的合成，但影响乙烯的合成。因此，凡 是影响膜功能的试剂、金属离子都会影响乙烯的合成，如钴离子。这说明由a c c 转化为 乙烯的反应需要膜结构的完整，乙烯合成酶( e f e ) 很可能是与膜结合在一起的。关于e f e 在细胞内的位置，g u y 等( 1 9 8 4 ) 1 2 0 从豌豆幼苗原生质体分离得到的液泡能产生乙烯， 其生成量占原生质体的8 0 ，原生质体能形成a c c ，而液泡没有这种能力。他们认为a c c 主要在细胞质中合成，然后进入液泡，并在液泡中转化为乙烯。e f e 可能就位于液泡膜 和质膜上。因此，从a c c 转化为乙烯是一个酶促反应，也是一个需氧气的氧化反应。缺 氧、高温、解偶联剂、某些金属离子等可抑制a c c 转化为乙烯。 1 3 4 丙二酰基a c c a c c 除了转化为乙烯外，另一个代谢途径是与丙二酰基结合，生成a c c 代谢末端产 物丙二酰基a c c ( 简称m a c c ) 。h o f f m a n ( 1 9 8 3 ) 【2 l 】发现植物体内游离态a c c 除被转化 为乙烯以外，还可以转化为结合态的a c c 。他们把标记的1 4 c - a c c 饲喂失水的小麦叶片 后，大部分a c c 与体内丙二酸结合形成m a c c ，在逆境条件下所产生的m a c c 不能逆转为 a c c ，因而不能用来合成乙烯。m a c c 的生成可看成是调节乙烯形成的另一条途径。 综上所述，乙烯在果蔬中的生物合成遵循蛋氨酸一s a m a c c 一乙烯的途径，其中a c c 合酶是乙烯生成的限速酶，因为该酶的出现使果实大量合成a c c ，并进一步氧化生成乙 烯。a c c 氧化酶是催化乙烯生物合成中a c c 转化为乙烯的酶。图1 1 较详细地展示了乙 烯的生物合成途径。 大豆a c c 合酶的活性与纯化研究 图1 1 乙烯生物合成途径 f i g 1 1t h ep a t h w a ye t h y l e n eb i o s y n t h e s i s 4a c c 合酶概述 在高等植物乙烯合成的途径中，s a m a c c 这一步由卜氨基环丙烷一卜羧酸( a c c ) 合 酶( e c4 4 。1 。1 4 ) 催化。a c c 合酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶圈，它在 植物组织内的活性大小往往决定着乙烯产生的速率，又由于a c c 合酶在植物体内含量低、 易失活，难以提取和纯化，所以对于a c c 合酶的研究是当前乙烯研究中的一个重要课题。 1 4 1a g c 合酶的结构 天冬氨酸氨基转移酶( a a t a s e ) 、酪氨酸和组氨酸等氨基转移酶中，有1 2 个氨基 酸是完全保守的【捌。与此相似的是在a c e 合酶的相应位置也有这1 2 个氨基酸中的1 1 个。 它们组成了a c c 合酶的活性中心，其中位于第四位的赖氨酸残基的e 一氨基通过西夫碱 与磷酸吡哆醛连接【2 4 】，磷酸吡哆醛是a c c 合酶的辅酶，i a a 诱导激活其活性 2 5 1 ，a v g ， a o a 强烈抑制其活性【捌，对底物s a m 的磺酰中心和蛋氨酸半体的d 一碳具有立体专一性。 s a d 能通过使该一氨基烷基化面使a c c 合酶失活。如果以a a t a s e 作为a c c 合酶的结构 模型，则a c e 合酶必须形成二聚体才能发挥作用，因为a t r a s e 活性中心需要由两个亚 基共同构成。研究表明，从伤害诱导的笋瓜果实中分离纯化的a c c 合酶是由5 0 k d 左右 大连理工大学硕士学位论文 的亚基组成的三聚体田l ，从生长素诱导的西葫芦果实中纯化的a c c 合酶是一种由两条分 子量为4 6 k d 的亚基组成的二聚体，而i a a 诱导绿豆下胚轴产生的a c c 合酶则是由两条 分子量为6 0 k d 的多肽组成的二聚体。此外，番茄a c c 合酶还可能是以单体形式发挥作 用。植物体内a c c 合酶含量很少且极不稳定，特定发育阶段、生长条件所控制，难以提 取和纯化。通过改进方法，研究人员已部分地纯化了a c c 合酶，分别得到了分子量不尽 相同的多肽。其中从成熟和伤害诱导的番茄果实中纯化的a c c 合酶差别较大，依次有 4 5 k d ，5 0 k d 和6 7 k d 等。这种差异可能来自酶纯化过程蛋白水解酶的剪切作用和翻译 后的蛋白质的修饰方面。且从不同的植物材料和在不同条件下的同一材料中纯化的a c c 合酶性质如l ( m 值、最适p h 等都存在很大差别，这说明植物体内可能有多种a c c 合酶同 工酶。 外界环境对a c c 的合成影响很大，机械损伤、冷害、高温、化学毒害等逆境和成熟 等因素可刺激乙烯的产生。逆境造成乙烯合成量增加是因为逆境刺激a c c 合酶活性增强， a c c 合成量增加，这过程可被蛋白质合成抑制剂抑制。植物体内可能存在分别与伤害诱 导、生长素诱导和成熟相关的a c c 合酶同工酶，它们受不同生长环境和生长时期信号控 制表达。0 1 s o n 等 2 7 1 研究发现在番茄中至少存在两种a c c 合酶同工酶一a c s i 和a c s 2 。用 特异性的探针探测其基因的表达发现，两种同工酶的删a 在果实成熟过程中都有出现， 机械损伤能很大提高a c s i 的转录活性，但对a c s 2 的转录却没有影响，且a c s i 和a c s 2 的m l n a 长度也不一样，分别为2 1 i k b 和1 1 9 k b 。 1 4 2a c 0 合酶的分子生物学研究 a c c 合酶在各个植物组织基因组中具有相当多的保守序列，在基因工程研究中，可 以通过克隆并表达此酶，再进行提纯和性质研究。高波等阱】将丝瓜a c c 合酶重组质粒 转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 感受态细胞中诱导表达。经s d s p a g e 分析，丝瓜a c c 合酶以 包涵体形式存在。尿素裂解包涵体后，利用亲和层析纯化目的蛋白，再通过复性得到纯 化蛋白s d s p a g e 显示纯化蛋白分子量为5 5 k d 的单一蛋白带。经活性分析，该酶最 适p h 值为8 5 ，米氏常数k m 为4 4 2 p r o o f l 。t o s h i y u k 等 2 9 1 利用r t - p c r 和r a c e - p c r 技术在竹子的芽中克隆得到a c c 合酶，研究表明其序列与大米，苹果等植物材料a c c 合 酶序列相似，活性分析发现此a c c 合酶属于伤害诱导酶。朱青松等【3 0 j 利用丝瓜a c c 合酶 e d n a 在t 7 启动子的作用下，经i p t g 诱导，在大肠杆菌中高效表达，表达外源蛋白可占 菌体总蛋白的4 5 2 。表达的a c c 合酶一部分以可溶的形式存在，具有与天然a c c 合酶 相似的酶活性，将反应底物s a m 转化为a c c ，并在细菌培养基中积累。另一部分则以无 活性的包涵体形式存在于菌体中。s t r a e t e n 等3 1 】将在西红柿果皮中诱导得到的a c c 合 大豆a c c 合酶的活性与纯化研究 酶纯化5 0 0 0 倍，肽链分析发现两种a c c 合酶的克隆，并使其在大肠杆菌中表达制备多 克隆抗体，制备的抗体为在西红柿果皮中提取纯化a c c 合酶提供帮助。n o r t h e r n 杂交说 明了a c c 合酶信使e v a 在果实成熟的时候开始积累。y i p 等洲利用免疫亲和的方法得到 纯度较高的西红柿a c c 酶进而分析酶的蛋白序列得到西红柿a c c 合酶中具有两个高度保 守的1 2 肽段。 1 4 3a c c 合酶由多基因家族编码 在植物体内，a c c 合酶( a c s ) 是由一个基因家族编码的，如拟南芥有约1 2 个基因编 码a c s ，分布于5 条染色体上，其中8 个基因( a c s 2 ，4 9 ，i1 ) 是有功能的，a c s i 是无功 能的，a c s 3 是假基因，a c s l 0 和a c s l 2 编码对天冬氨酸和芳环氨基酸特异的转氨酶 ( a m i n o l r a n s f e r a s e ，a t a s e ) 0 2 1 。在其它植物中也有类似的情况，b a r r y 掣3 3 】研究认为a c c 合酶在番茄中至少由八个成员的基因家族编码，果实的成熟伴随着乙烯的增加，这也使 乙烯的合成从自动抑制到自动调节，他们了解这种过渡的信号路线( 从系统i 到系统i i ) 后开始从事研究a c s 在果实成熟过程中的调节方式。在番茄中转录a c s 相应的4 个基因并 利用乙烯处理成熟抑制株和不成熟株的表达分析发现：系统i 的乙烯是有l e a c s i a 和 l e a c s 6 表达调控的，在过渡期r i n 基因担任重要角色，它引导l e - a c s l a 的大量表达并激 活l e a c s 4 。系统i i 的乙烯合成随后发生并维持。总之，系统i 产生的乙烯用于基本的生 长需要，而系统i i 产生的乙烯在成熟过程中起作用。s h i u 等【蚓在研究水淹对于乙烯合成 的作用时候，又发现了一种新的a c c 合酶启动子l e a c s 7 ，它不同于其他的a c c 合酶家族 启动子，其表达时间是在洪水来到的早期，并且对于伤害诱导时的表达也早于其他a c c 合酶基因。研究进一步表明，a c c 合酶基因家族并不是基因功能的简单罗列，而是相互 重叠，共同作用的。n o b u y o s h in a k a j i m a 等【3 5 】研究发现暴露在臭氧中数小时可以使部分 a c c 合酶基因表达，其诱导模式可能与损伤信号作用模式一致。在研究冬瓜中活性氧因 子( r o s ) 和茉莉酮酸( j a ) 对a c c 合酶c m - a c s l 基因作用时，w a t a n a b e a 等指出c m - a c s l 基因被伤害诱导的产生的j a 激活，而r o s 也是在伤害后迅速产生，并为c m 一矗c s i 基因早期 诱导表达所必须1 3 6 l 。w a n g 等人f 3 7 】发现环己酰亚胺诱导a c s 家族中大部分成员表达，可能 是因为它可以保持a c sm r n a 的活力使a c s 的m r n a 水平稳定上升。磷酸化的a c s 可以提高其 在细胞中的稳定性。大豆a c c 合酶基因家族的研究还不清楚，m e n g 等利用功能基因组学 方法，初步提出大豆a c c 合酶基因家族至少包括1 3 个成员，其序列的同源性在7 7 9 8 之间【3 羽。尽管许多与a c s 有关的基因已经被克隆，但对于它们功能的了解还处于初级阶 段，为了更加清晰描述乙烯合成途径和本身与其他激素的相互作用，未来在这方面研究 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 主要集中在信号是如何传导的，它们是怎样调节各种途径中的成分之间的相互作用，而 d n a 一蛋白芯片技术将是很有效的手段。 1 4 4 反义r n a 技术在抑制乙烯合成过程中的应用 反义技术( a n t i s e n s e t e c h n o l o g y ) 是根据碱基互补原理，利用人工或生物合成特 异互补的d n a 或r n a 片段( 或其修饰产物) 抑制或封闭基因表达的技术，包括反义寡核苷 酸技术、反义r n a 技术和核酶( r i b o z y m e ) 技术等。r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是双链r n a 介导的特异性基因表达沉默现象i 姗。它们都在基因工程中被广泛地使用来抑 制靶基因的表达。在乙烯合成路径中，可利用反义技术抑带u a c c 合酶基因或者a c c 氧化酶 基因的表达来降低乙烯合成速度。利用r n a 干扰技术选择与乙烯合成有关的a c c 氧化酶基 因、a c c 合酶基因或与细胞壁水解速度有关的p g 基因作为靶基因可有效地将番茄果实从 破色期到成熟期需要时间增长【加】。由此可见，反义技术和r n a 干扰技术都能非常有效地 抑制靶基因的表达，是改良果实耐贮性的有效手段。 在a c c 合酶的反义基因技术的研究中，刘传银等【4 1 】利用r t - p c r 技术克隆了a c c 合酶 多基因家族成员之一l e 2 a c c 2 编码区约1 1 7 k b 的c d n a ，经酶切图谱和序列分析鉴定无误 后，反向插入到植物表达载体p b i n 4 3 7 中，构建了表达a c c 合酶反义r n a 的二元载体。经 农杆菌途径转化番茄“丽春”品种后，通过p e r 检测从抗卡那霉素再生植株中筛选到6 株 转基因植株，s o u t h e r n 杂交确证了外源基因是以单拷贝插入到番茄染色体中，对果实乙 烯释放的测定结果表明转基因番茄果实的乙烯释放量仅为对照的3 0 左右，在室温下转 基因番茄果实采后保存6 0 d 以上仍然没有变红、软化。以上结果表明其反义r n a 在转基因 番茄中的表达能有效地抑制乙烯的生物合成从而延缓果实成熟，表现出良好的耐储保鲜 特性。对转基因植株子一代( t 1 ) 的分析结果进一步表明反义a c c 合酶基因以典型的单基 因方式传到子代。通过对子二代的分析已初步筛选到一个耐储藏的转基因番茄纯合品 系。罗云波等【4 2 】将转入反义a c c 合酶基因的番茄采后与普通番茄的生理性状加以比较， 发现该番茄的果实和叶片乙烯以及果实呼吸强度受到抑制，果实乙烯释放量为0 ，没有 出现呼吸高峰，呼吸强度极显著低于对照。反义番茄的叶绿素降解和番茄红素的合成亦 受阻，果实在采后和贮藏期间逐渐变为黄色或桔黄色而番茄红素的合成很少。乙烯催熟 采后3 0 d 的反义番茄，番茄红素增加6 0 倍。汤富强等【4 3 】将a c c 合酶及其反义基因导入番茄， 发现前者形成很小的花苞，但很快枯萎死亡，不能长大开花，用离体叶片为材料的实验 表明转化叶片的衰老与乙烯的释放呈正相关。其转化植株比对照增加了3 7 一6 5 。而反 义基因转化的植株能正常开花，但离体叶片乙烯释放只有对照的0 - 8 ，衰老也缓慢得 多，一周后的离体叶片中叶绿素的含量是对照的1 6 8 2 7 8 倍。 大豆a c c 合酶的活性与纯化研究 由于来源不同植物内a c c 合酶基因核苷酸序列上的差异，番茄来源a c c 合酶的反义基 因是否能在其它植物内起作用是研究的又一个重点，王春霞等人1 4 4 1 将番茄的a c c 合酶基 因及其反义基因导入西瓜并研究其在西瓜体内的表达情况，结果发现正义转基因植株的 乙烯释放比对照增加8 0 左右，反义转基因植株的乙烯释放分别为对照的6 7 和7 8 。实 验分析表明，西瓜和番茄的a c c 合酶基因具有一定程度的同源性，番茄的a c c 合酶基因在 西瓜中可以得到不同程度的表达，这为改良西瓜品种提供了可行的遗传转化方法。虽然 番茄的a c c 合酶反义基因可以抑制西瓜果实中乙烯的释放，但是抑制程度没有抑制番茄 本身高。g m c a c c s i ，是在大豆叶片中受机械伤害诱导产生的一种a c c 合酶基因，李明亮等 1 4 5 1 利用r t - p c r 技术克隆了大h a c c 合酶基因g m c a c c s i 编码区1 1 5 k b 的c d n a 片段，经酶切图 谱分析和序列分析鉴定后，反向插入到双元载体p b i n 4 3 8 中，构建了表达a c c 合酶反义h n a 的植物表达载体，转化农杆菌后用该农杆菌侵染美洲黑杨叶片，在含卡那霉素的m s 培养 基上选择转化子和植株再生，通过p c r 检测从抗卡那植株中选到1 5 株转基因植株， s o u t h e r n 杂交分析初步确证了外源基因是以单拷贝插入到杨树基因组d n a 中。对杨树幼 苗乙烯释放的测定结果表明转基因杨树幼苗的乙烯释放量为对照的2 2 。 1 4 5a c c 合酶的提取及纯化方法 由于a c c 合酶在植物组织中含量极低，使对其的分离提纯变得困难，而对于实验来 说，纯度高的酶是实验成功的前提。t s a i 等【舶】在纯化绿豆下胚轴部分的a c c 合酶时利用 较高的磷酸盐浓度来加强提取过程中酶的稳定性，并通过加入部分激素来显著提高了酶 的活力，纯化过程分别包括羟基磷灰石柱层析，p h e n y l s e p h a r o s e 疏水层析，阴离子交 换柱上的f p l c 等将酶浓缩了1 0 5 0 倍，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现该酶的分子量为 6 5 k 1 ) ，以二聚体的形式发挥作用，活力最适的p h 值为8 0 ，温度为3 0 。并发现当温度 超过4 0 c 时，酶失去活力。胡建成等 4 7 4 8 喇用五步纯化，包括p e g 沉淀，葡聚糖凝胶层 析，羟基磷灰石柱层析，p h e n y 卜s e p h a r o s e 疏水层析和阴离子交换柱层析得到比活性达 1 1 6 8 7 0 u m g 蛋白质以上的番茄果实伤诱导a c c 合酶，对其一些酶学性质进行检测得到酶 反应的最适p h 值为9 5 ，在p h 8 o t 最稳定，并通过动力学研究得到酶的半衰期为1 0 7 分 钟。a c a s t e r 等【4 9 】发现利用a c c 合酶与底物进行的亲和层析虽然可以使酶挂柱，但却不能 再被底物溶液特异性地洗脱，而利用等电