（水生生物学专业论文）低聚木糖对凡纳滨对虾生长及低温胁迫下免疫应答的影响.pdf

thediss e rtatio nf ormaste rdegreeof s o u thchinanorma1university theef fce to f yio os a c charid e s on gro w thper f orma n c eandimmune re s p ons eo flito p ena eusv a nname i 一l o u naerlowlemperatures tre s s y a n gy a n g s u p e r v i s o r ：pr o f e s s o ra n i iw a n g s p e c i a l t y ：a q u a t i cb i o l o g y c o l i e g e ：c o l i e g eo fl i f es c i e n c e submi t tedda te ：2010 05 摘要 低聚木糖对凡纳滨对虾( l ，t o p o a n u osv a n a a m ei ) 生长及低温胁迫下免疫应答的影响 专业： 姓名： 导师： 水生生物学 杨阳 王安利教授 丰葡斐 本论文通过在凡纳滨对虾饵料中添加五种不同浓度的低聚 木糖，研究其对凡纳滨对虾在十周的养殖过程及急性低温应激 下( 3 0 一14 ) 生长及其免疫应答的影响，结果如下： 1 添加量为0 2 5 的低聚木糖能显著增加凡纳滨对虾存活 率、增重率和特定生长率，肌肉中蛋白含量在显著性水平上无 差异。 2 添加低聚木糖可增加凡纳滨对虾非特异性免疫系统相关 酶的活力，如s o d 、c a t 、gsh 等，减低体内脂质过氧化程度， 提高凡纳滨对虾的免疫功能。 3 凡纳滨对虾在急性应激下会出现停止泳动、体色变白、 侧卧甚至死亡的现象，在应激开始后1 10 小时内，各组均没有 对虾死亡，而到12 小时后，累积死亡率开始大幅上升，说明 1o 12 小时可能是对虾耐受14 低温的时间阈值，在12 小时2 4 小时，对照组仍继续上升( 36 4 6 ) ，而试验组则出现不同程 度的下降，其中添加量为0 15 和0 2 组在2 4 小时的累积死 亡率为o ，不排除个体差异产生的影响。 4 在刚开始低温应激的1 6 小时内凡纳滨对虾部分非特异 摘要 性免疫酶和消化酶活性会出现先降低后升高的现象，丙二醛含 量也会随之发生相应的变化，表明机体正在清除因环境胁迫而 造成的自由基，但随着应激时间的延续，免疫酶和消化酶逐渐 丧失功能，活力不断下降，最后趋于稳定，与对照组相比，试 验组so d 、c a t 、g sh 活力在某些时间段显著高于对照组，证 明低聚木糖具有提高凡纳滨对虾抗低温能力的作用。 关键词：凡纳滨对虾低聚木糖低温胁迫免疫应答 a b s t r a c t t h ee f f e c t0 fx y l 0 0 lig o s a c c h a rld e s0 ng r o w t h p e r f o r m a n c ea n dim m u n er e s p o n s f0 fl 厂秒户胡，彳s 矿月m 肋e u n d e rl o wt e m p e r a t u r es t r e s s a b s t r a c t m a j o r ：a q u a i cb i o l o g y n a m e ： y a n gy a n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o ra n l iw a n g b ya d d i n g f i v ed i f f e r e n tl e v e l so fx y l o o l i g o s a c c h r i d e s ( x o s ) i n t ot h ed i e to fl i t o p e n e a u sv a n n a m e i ，r e a c h i n gt h e t h e e f f e c to fx o so nt h eg r o w t hp e r f o r m a n c ea n di m m u n er e s p o n so f l v a n n a m e id ur i n gt e nw e e k sr e a r i n ga n dl o wt e m p e r a t u r es t r e s s a t u e l y ( 3 0 一1 4 ) ，t h er e s u l t sa r ef o l l o w i n g ： 1 t h ec o n t e n to f0 2 5 x o si nd i e tc a ni m p r o v es u v i v a l r a t e ( s r ) ，w e i g h tg a i n ( w g ) a n ds p e c i f i cg r o w t hr a t e ( s g r ) o f l v a n n a m e i ，b u tt h e r ei sn o td i f f e r e n c ea m o n gg r o u p si nc o n t e n t o fp r o t e i n ( c p ) 2 a d d i n g x o si nd i e tc a ni n c r e a s et h e n o n - s p e c i f i c i m m u n es y s t e m - r e l a t e de n z y m ea c t i v i t yo fl v a n n a m e i ，s u c ha s s o d ，c a ta n dg s h ，b yr e d u c i n gl i p i dp e r o x i d a t i o n a n d e n h a n c i n gt h ei m m u n i t yo fs h r i m p 3 t h es h r i m pu n d e ra c u t el o wt e m p e r a t u r es t r e s sw i l lo c c u r i nc e s s a t i o no fm o b i l i t y ，c h a n gb o d yc o l o u ri n t ow h i t e ，l i ea s i d e a n de v e nm o r t a l i t y d u r i n g1a n d1 0h o u r sa f t e rl o wt e m p e r a t u r e s t r e s s ，t h e r ei sn os h r i m pd i e di n e a c h g r o u p s ，b u tb e y o n d 1 2 h o u r st h ec u m u l a t i v em o r t a l i t yi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y i n d i c a t i n g 1 0 - 1 2h o u r sm a yb et h et h r e s h o l do fs h r i m pu n d e r1 4 d u r i n g 1 2 - 2 4h o u r s ，t h ec u m u l a t i v e m o r t a l i y o fc o n t r o l g r o u ps t i l l i i i a b s t r a c t i n c r e a s e d ，f r o m3 6 t o4 6 h o w e v e r ，t h et e s tg r o u p sd e c r e a s e d w i t hv a r y i n gd e g r e e s ，o fw h i c ht h ec u m u l a t i v em o r t a l i yo f0 1 5 a n d0 2 g r o u p sw a sz e r oi n2 4h o u r sa f t e rs t r e s s ，b u tw ec a nn o t r u l eo u tt h ee f f e c to fi n d i v i d u a ld i f f e r e n e e s 4 a tt h es t a g eo f1 - 6h o u r sa f t e rl o wt e r n ps t r e s s ，s o m e n o n - s p e c i f i c i m m u n ea n d d i g e s t i v ee n z y m ea c t i v i t y w i l l i n c r e a s e d f i r s t l y t h e n d e c r e a s e d ，t h e c h a n g e o fm d a c o n c e n t r a t i o nf o l l o w i n g ，s h o w i n gt h eb o d yi s r e m o v i n gt h ef r e e r a d i c i a l sc a u s i n gb ye n v i r o n m e n t a ls t r e s s b u tw i t ht h ee x t e n s i o n o ft i m e ，i m m u n ea n dd i g e s t i v ee n z y m ea c t i v i t y g r a d u a l l yl o s t t h e i r f u n t i o n s ，d e c r e a s e dc o n t i n u o u s l yt i l ls t a b i l i z e df i n a l l y c o m p a r e i n gt h ec o n t r o lg r o u p ，s o d ，c a t ，g s ha c t i v i t yo ft e s t g r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g e ri nc e r t a i np e r i o d s ，i n d i c a t i n gt h a t x o sc a ni n e r e a s et h ec o l dr e s i s t e n c eo fl i j a ，l n a m e f k e y w o r d s ：l i t o p e n e a u s v a n n a m e i x y l 0 0 1 i g o s a c c h r i d e s l o w - t e m p e r a t u r e - s t r e s si m m u n er e s p o n s i v 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章引言1 1 1 饲用低聚糖的主要种类1 1 2 低聚寡糖的生物学功能及展望3 1 2 1 优化肠道微生态系、起有益保健功能3 1 2 2 识别、粘附和排除病原微生物4 1 2 3 提高养殖动物的生产性能和免疫力5 1 2 4 低聚寡糖的研究前景9 1 3 低温对水产动物的影响1o 第二章材料与方法1 3 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 动物饲养13 饲料配方与制作1 3 低温应激试验1 5 样品收集与分析1 5 2 4 1 生长指标16 2 4 2 血液指标的测定l 6 2 4 3 组织样品的测定l 6 数据处理l7 试验仪器l 7 第三章试验结果1 8 v 目录 3 1 低聚木糖对凡纳滨对虾生长的影响1 8 3 1 1 低聚木糖对凡纳滨对虾成活率、特定生长率及 肌肉中蛋白含量的影响1 8 3 2低聚木糖对凡纳滨对虾免疫系统的影响2l 3 2 1 低聚木糖对凡纳滨对虾体液免疫的影响2 1 3 2 2 低聚木糖对凡纳滨对虾肝胰腺中免疫因子的影 响2 6 3 2 3 低聚木糖对凡纳滨对虾胰蛋白酶的影响30 3 3 低温胁迫对凡纳滨对虾累积死亡率的影响32 3 4 低聚木糖对低温胁迫下凡纳滨对虾体液免疫的影响3 3 3 5 低聚木糖对低温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺的影响3 8 3 6 低聚木糖对低温胁迫下凡纳滨对虾胰蛋白酶活性的影 响4 2 第四章讨论4 4 4 1 低聚木糖对凡纳滨对虾生长的影响44 4 2 低聚木糖对凡纳滨对虾免疫应答的影响4 5 4 2 1 低聚木糖对凡纳滨对虾血细胞总数( th c ) 的影 响4 5 4 2 2 低聚木糖对儿纳滨对虾超氧化物歧化酶( so d ) 的影响4 6 4 2 3 低聚木糖对凡纳滨对虾过氧化氢酶( c a t ) 的影 响4 7 4 2 4 低聚木糖对凡纳滨对虾谷胱甘肽( g s h ) 的影响 4 8 4 2 5 低聚木糖对凡纳滨对虾碱性磷酸酶( a k p ) 的影 响4 9 4 2 6 低聚木糖对凡纳滨对虾丙二醛( m d a ) 的影响 4 9 4 2 7 低聚木糖对凡纳滨对虾胰蛋白酶( t ryp sin ) 的 影响5 0 4 3 低聚木糖对低温应激下凡纳滨对虾免疫应答的影 v i 目录 响5 1 4 3 1 低温胁迫对凡纳滨对虾存活的影响以及低聚木 糖在提高对虾抗低温能力的作用5 1 4 3 2 低聚木糖对提高低温胁迫下凡纳滨对虾免疫能 力的影响5 2 第五章总结一5 7 参考文献5 8 致谢6 4 v i l 第一章引言 第一章引言 人类进入21 世纪以来，对保护环境和食品安全的呼声越来 越高，而目前的现状是在畜禽水产养殖生产中投喂大量的营养 过剩的饲料不仅严重污染了土壤、空气和水环境，更是造成养 殖动物疾病频发的罪魁祸首。这使人们努力开发既不造成环境 污染又能大幅提高养殖动物本身抗病潜力，满足人们对具有生 理活性食品的追求。 随着市场对高品质水产品需求的不断扩大，人们也在积极 努力地寻求水产业的健康高效无污染养殖新模式。从八十年代 以来，低聚糖由于可增强动物的免疫能力，提高成活率、饲料 转化率和动物的生长速度，且无残留、无污染，被认为是一种 有望替代抗生素的功能性饲料添加剂。据b r 0ek 和v a ndei i 报道， 目前在寡糖研究和生产的积极倡导国日本，食品和饲料( 特别是 断奶仔猪) 中使用寡糖已成为常规( 杨曙明，19 98 ) 。 1 1 饲用低聚糖的主要种类 在动物营养中所研究的低聚糖主要是指不能被人和其他单 胃动物自身分泌的酶分解，但能对机体微生物区系、免疫等功 能有影响的特殊糖类物质。饲料用的主要低聚糖见表卜1 ( 向枭 等，20 02 ) 。 华南师范大学硕士学位论文 表卜1 饲料用的主要低聚糖构成单糖及结合类型 t a blel 一1t h ec o m p o s i t i o na n dc o m b i n a t i o nt y p e so fm a i n o l i g o s a c h h r i d e si nd i e tu s e 主要低聚寡糖构成单糖及结合类型 低聚甘露糖甘露糖( 口一1 ，2 、口一l ，3 、口一1 ，6 糖 苷键) + 葡萄糖 低聚果糖d 一果糖( 一1 ，2 糖苷键) ；d 一果糖( 夕一1 ， 2 糖苷键) + 蔗糖 分支低聚糖葡萄糖( 口一1 ，6 糖苷键) 低聚异麦芽糖异麦芽糖( 口一l ，6 糖苷键) 低聚麦芽糖葡萄糖( 口一l ，2 糖苷键) 低聚乳糖葡萄糖( 口一1 ，6 糖苷键) + 蔗糖 低聚木糖d 一木糖( 一1 ，4 糖苷键) 夕一低聚葡萄糖葡萄糖( 夕一1 ，6 或一l ，4 糖苷键) 低聚焦糖蔗糖合成的蔗果三糖 龙胆二糖葡萄糖( 夕一1 ，6 糖苷键) 反式低聚半乳糖乳糖一( 半乳糖)( 一l ，6 、夕一1 ，4 、夕 一1 ，3 糖苷键) + n 一半乳糖 半乳糖低聚糖半乳糖( p 一1 ，6 糖苷键) + 葡萄糖 海藻糖葡萄糖( 口一1 ，l 糖苷键) + 蔗糖 大豆低聚糖蔗糖、棉籽糖和水苏糖， 此外还有微量的阿拉伯糖 壳寡糖( c h i t o sa no l i g o s a c c h a r i d e ，c o s ) ，也称几丁寡糖。 壳寡糖在人体内吸收率近lo0 ，其功效是壳聚糖的数十倍。壳 寡糖具有提高免疫，抑制癌肿细胞生长，促进肝脾抗体形成， 促进钙及矿物质的吸收，增殖双歧杆菌、乳酸菌等人体有益菌 群，降血脂、降血压、降血糖、调节胆固醇，减肥，预防成人 疾病等功能。 果寡糖( f r u c t oo l i g o s a c c h a r i d e ，f o s ) ，又称为低聚果糖， 分子式为g f f n ( g 为葡萄糖，f 为果糖，n = 13 ) 。具有低 热、稳定、安全无毒的理化性能，大部分不能被动物本身的消 2 第一章引言 化酶所消化，但到达肠道后可作作为有益微生物的底物，但却 不能被病原微生物利用，从而促进有益微生物的繁殖和抑制有 害微生物。 甘露寡糖( m a n n a no l i g o s a c c ha r id e ，mo s ) 是几个甘露糖分 子或甘露糖与葡萄糖通过口一l ，2 、口一1 ，3 和口一1 ，6 糖苷 键组成的寡糖，目前大多是通过发酵法从富含m o s 的酵母细胞壁 中提取。 寡乳糖( l a c t o s e0 l i g o s a c c h a r i d e ，g a s ) 是几个半乳糖通过 q 一1 ，6 糖苷键结合在蔗糖的葡萄糖上而成的寡糖。m ina mi 研究 发现可由乳糖合成或富含植物中提取g a s 。 1 2 低聚寡糖的生物学功能及展望 1 2 1 优化肠道微生态系、起有益保健功能 一 果寡低聚糖对肠道微生态具有调节作用。果寡糖与乳寡糖 可促进人体内双岐杆菌和乳酸杆菌的增殖而抑制病菌源菌如大 肠杆菌、梭状芽胞杆菌和沙门氏菌的生长( it0 等，l9 90 ) 。体 外研究表明，当以果寡糖作为碳源时，双岐杆菌得以增殖而病源 菌如大肠杆菌及梭状芽胞杆菌的生长受到抑制( w a ng ，19 93 ) ? j gibs0 1 3 ( 19 95 ) 与dj0 u ziz 等( 1997 ) 报道，果寡糖与乳寡糖可使 大鼠粪中双歧杆菌的数量以1 0 2 数量级增加。另外，果寡糖被双 歧杆菌利用后可降低某些细菌活性如葡糖苷的水解，减少硝酸 盐及氮衍生物如氨、酚、吲哚及粪臭素等含氮化合物的形成( 张 伟等，20 01 ) 。有报道认为果寡糖可促进肠道内双歧杆菌及乳 酸杆菌等有益微生物的增殖，抑制沙门氏菌与大肠杆菌等病原 菌的增殖，改善肠道微生态环境，从而改善各种营养素的消化 吸收和代谢，故在肉鸡饵料中添加0 5 的果寡糖，饲养6 周后肉 鸡的日增重率和日采食量显著高于对照组，且生产性能和健康 状况得到显著改善( 易中华等，2 0 04 ) 。 而另有报道称，双歧杆菌、消化链球菌与克雷伯杆菌可利 用果寡糖，而大肠杆菌和沙门氏菌不能利用果寡糖，所测试的 3 华南师范大学硕+ 学位论文 20 种血清型沙门氏菌中，无一能在以果寡糖为唯一碳源的培养 基上生长( b a ileyetal ，19 91 ) 。o ya rza b al 等( 1995 ) 研究了13 种直接饲喂微生物和6 种血清型沙门氏菌在添加果寡糖或以果 寡糖为唯一碳源的培养基上的生长及抑制情况，结果表明：两 种双歧杆菌、粪链球菌、两种乳酸杆菌和片球菌明显抑制了6 种血清型沙门氏菌的生长；粪链球菌、乳酸杆菌和片球菌可在 添加有果寡糖或以果寡糖为唯一碳源的培养基上生长；6 种沙门 氏菌可在补充有果寡糖的培养基上生长，而当以果寡糖为唯一 碳源时，没有一种沙门氏菌可在培养基上生长。h o w a rd ( 19 95 ) 报道，当在补充f o s 的培养基中维持恒定的厌氧菌总数时，双歧 杆菌数量增加，这表明大肠中的双歧杆菌可优先利用果寡糖， 从而抑制了其他细菌的生长，其他厌氧菌数明显减少。 饲料中添加甘露寡糖( m o s ) 可以改善肠道微生物组成，形 成以双歧杆菌和乳酸杆菌为优势菌的肠道菌丛。据报道，m o s 或其它寡糖可以作为一种生长代谢的营养物质，被双歧杆菌和 乳酸杆菌进行选择性发酵，并促进其生长繁殖。而大肠杆菌、 沙门氏杆菌、产气芽孢梭菌等致病性菌，却因无法利用导致饥 饿死亡( al lte ch ，19 94 ) 。一些较新的研究还认为，寡糖不仅 只充当一种糖源或营养物质，更重要的作用是参与双歧杆菌的 生长调节及粘附等作用。 对宿主的有益保健功能，是通过形成以双歧杆菌和乳酸杆 菌为优势菌的肠道菌群而实现的。动物消化道微生物区系的结 构和功能与肠道生态环境相互影响，双歧杆菌和乳酸杆菌等有 益菌可将肠道中的可发酵糖转变为醋酸和乳酸，降低p h 值，从 而抑制肠道杂菌的滋生( 杨华等，2 00 5 ) 。 1 2 2 识别、粘附和排除病原微生物 病原菌在黏膜上皮表面的特异性粘附，是通过病原菌表面 特异性的凝集素，与宿主黏膜上皮细胞相应的糖受体相互作用 完成的。除沙门氏杆菌尚存疑问外，多数病原菌的致病性与其 特异性黏膜粘附有较大的相关性( w hitee ta l ，l97 8 ) 。 4 第一章引言 多数肠道细菌可以通过甘露糖特异性凝集素在黏膜上皮细 胞上定植。饲料中小剂量的甘露寡糖可与肠黏膜上皮细胞中含 甘露糖的受体，竞争病原微生物甘露糖特异性凝集素的结合位 点。一般看法认为，甘露寡糖与病原菌凝集素结合，结合后的 甘露寡糖饱和了病原菌凝集素与肠黏膜上皮细胞相应受体结合 的位点，阻碍了病原菌黏膜粘附，又由于甘露寡糖有非消化性， 这种复合物就可顺利通过胃肠道被排出体外( ne w m m a n ，l9 94 ) 。 也有可能是甘露寡糖和病原菌结合后，病原菌无法利用其提供 的营养而饥饿死亡。另外还有一种看法认为，饲料甘露寡糖是 通过封闭肠黏膜上皮细胞上病原微生物的结合位点，来阻止其 黏膜粘附的( 杨华等， 20 0 5 ) 。且动物胃肠道非免疫防疫系统 主要为内源微生物群，动物处于健康状态时，胃肠道存在有正常 微生物，这些正常微生物是动物胃肠道中不可缺少的组成部分。 它分为有益微生物群( 如双歧杆菌属、乳酸杆菌属) 和有害微生 物群( 如大肠杆菌属、葡萄杆菌属)，寡糖可以通过对病原微生 物的识别、黏附和排除作用来调节非免疫防御系统( 陈小兵等， 20o5 ) 。 h a nd0n & r0be rt 作了寡糖在乳酸菌体内新陈代谢的研究， 认为寡糖在乳酸菌种的代谢过程中依赖于a tp 的运输系统，是菌 体内少量酶的作用底物，生成的产物可促进菌体的生长。 1 2 3 提高养殖动物的生产性能和免疫力 在28 日龄断奶猪崽日粮中添加0 25 0 50 的f o s ，在30 天的试验期内，不仅体重提高28 ，而且腹泻频率下降 10 ( f uk uya neta l ，19 88 ) 。添加f o s 或低聚焦糖( sto c ) 对猪崽 腹泻率都无影响( f a r n w o rthe ta1 ，1992 ) 。这可能同添加量 过高有关，有人认为低聚糖过高反而提高腹泻率( j uditheta1 ， l9 94 ) ，大多数学者建议低聚糖用量在1 0 以下为宜。 在仔猪日粮中添加0 1 的果寡糖，仔猪断奶日增重可提高 19 88 ( 尸 0 05 ) ，断奶仔猪腹泻率降低46 7 ( 王亚军等，l999 ) 。在 5 华南师范人学硕士学位论文 同粮中添加异麦芽低聚糖同添加抗生素一样能有效地减少断奶 猪崽腹泻病的发生，但对日增重及料重比均无显著影响( 徐秀容 等，20 0 0 ) 。据报道，0 5 im o ( 异麦芽低聚糖) 比o 25 im o 和1 0o im o 更能有效抑制猪崽腹泻。在基础日粮中添加寡果糖，研究其 对断奶猪崽生长、代谢和免疫的影响，结果表明，试验组较对照 组猪崽日增重提高3 88 ( 尸 0 o5 ) ，料重比下降4 67 ，猪崽血 液尿素氮含量显著升高( 尸 0 01 ) ，甲状腺素( t4 ) 和白细胞介素 一2 ( il 一2 ) 含量也显著升高，血糖和t3 ( 三碘甲腺原氨酸) 含量有 升高趋势，但不显著( 高峰等，2o o1 ) 。有研究指出果聚寡糖有 提高断奶猪崽增重速度和饲料转化率的作用，能提高猪崽抗应 激能力，减少猪崽死亡率的趋势( 杨具田等，20 03 ) 。母猪饲料 中添加寡糖可缩短9d 的发情周期。另外，日本农场在饲料中长 期使用果寡糖可使母猪产仔数平均增加o 7 头；公猪精子数增加 20 25 ；受胎率提高，减少母猪便秘，断奶仔猪体重从5 4kg 提高到6 3kg ，下痢大幅下降，亦可改善夏季采食量下降对猪 造成的不利影响( 孙志洪等，20 03 ) 。在杜长大仔猪的基础r 粮中添加0 30 果寡糖+ 0 15 甘露寡糖、o 45 果寡糖+ o 1o 甘 露寡糖结果表明：在同粮中添加适宜的寡聚糖与对照组相比能 显著( 尸 0 05 ) 提高仔猪的日增重，改善饲料报酬，并能显著 ( 尸 0 05 ) 或极显著( 尸 0 o1 ) 提高仔猪血清中的ig g 水平，在一定 程度上说明寡聚糖能替代抗生素对仔猪有一定的促生长作用， 其作用机理可能与寡聚糖能诱导各种免疫功能的活化、具有免 疫增强剂的功效有关( 宋小珍等，20 05 ) 。 一 在断奶崽兔和肉崽鸡上的试验表明，半乳糖低聚糖和甘露 低聚糖也都有防止下痢的作用( m a er t e ns ，l9 92 ) 。在28 42 日 龄的母肉鸡日粮中添加0 4 的果寡糖，结果表明：果寡糖具有 降低肉鸡死亡率和减少腹腔脂肪沉积以及改变盲肠菌群的效 果，选择性地增加了有益菌，降低了盲肠内挥发性脂肪酸以外 的代谢产物的含量( 曹兵海等，200 3 ) 。用96 只1 日龄广东三黄 鸡，研究了饲料添加0 2 或o 3 的寡糖对肉鸡生产性能与免疫 机能的影响。结果表明：饲料中添加0 2 的寡糖能显著提高 6 第一章引言 1 1 3 0 日龄肉鸡的增重、免疫器官指数及新城疫h1 抗体滴度 ( 尸 0 05 ) ，血液白细胞吞噬率和血清ig g 含量亦高于对照组，但 组间差异不显著；添加o 2 或0 3 的寡糖能明显改善全期的饲 料转化率( 以0 05 ) ( 陈绍红等，20 05 ) 。在黄羽肉种鸡仔鸡的 饵料中添加0 3 的m o s 发现免疫器官胸腺、法氏囊、脾脏的重 量显著增加且对新城疫疫苗应答抗体滴度皆高于对照组( 陈谊 等，20 04 ) 。益生菌剂、异麦芽寡糖提高了肉仔鸡的免疫器官 指数、血清球蛋白含量( p 0 05 ) 和t 一淋巴细胞a n ae 阳性率( p 0 05 ) 。益生菌剂、异麦芽寡糖显著提高了肉仔鸡的体增重， 改善了饲料效率( p 0 05 ) ( 杨桂芹等， 20 0 6 ) 。矗 水产方面，由于水产动物生境的特殊性，因此低聚寡糖在 提高养殖动物营养免疫方面也有多种多样的使用方式和用途， 如在中华鳖日粮中添加果寡糖，结果表明：果寡糖显著提高了 饲料中的粗蛋白质、钙、磷的表观消化率( 尸 o 05 ) ( 肖明松等， 2 00 4 ) 。在鲤鱼饲料中添加60 0m g kg 的果寡糖，结果表明：添 加果寡糖显著提高了鲤鱼的生长速度和饵料利用率( 尸 0 o1 ) 二 同时对鲤鱼的运输能力没有影响( 周小秋，邝声耀等，2 0 02 ) 。 另外有研究表明，当鲤鱼饲料中果寡糖的添加量达到1 3g k g 时可增加相对增重率，降低饲料系数，促进鲤鱼的生长，对鲤 鱼消化酶活性具有正向促进作用( 肖明松等，20o5 ) 。利用甘 露寡糖( 0 2 ) 喂食轮虫和卤虫后，作为军曹鱼的饵料，能增 强其低盐度( 24g l ) 耐受能力并增加肠道微绒毛的重量( g s alz e eta 1 ，20 08 ) ，在凡纳滨对虾的饲料中添加低聚果糖通 过改善凡纳滨对虾肠道有益菌群来催进它的营养吸收、生长及 抗病力的提高，通过深入的研究发现血细胞总数和呼吸爆发这 两项免疫指标也得到了提高( p englietal ，20 07 ) 。同时， 饲料中添加适量的低聚寡糖也能有效的提高水产动物抗氧化抗 感染能力，饲料中添加1gk g 的嗜酸小球菌m a18 5 m ( 粉状) 7 华南师范人学硕士学位论文 饲喂南美蓝对虾，发现实验组存活率、总抗氧化能力、谷胱甘 肽过氧化物酶在显著性水平上都高于对照组( 以0 05 ) ，用黑美 人弧菌( 儿1 7 i g r i p u c h r it u d o ) 进行攻毒，结果发现对照组比 实验组的感染率更高( m athie uc aste x eta l ，20 0 9 ) 。 其他动物日粮中的应用如b a stie 1 3 ( 1990 ) 在兔饲料中添加 果寡糖发现：兔体重增加6 4 ，料肉比下降7 8 ，死亡率下降 32 。王国杰等( 200 0 ) 研究了果寡糖对蛋用鹌鹑的生产性能、脂 肪代谢、免疫和内分泌机能的影响后发现：试验组鹌鹑的产蛋 率和蛋重提高，料蛋比下降，血清总胆固醇( 尸 0 05 ) 和蛋黄胆 固醇浓度降低，t 淋巴细胞转化率和血液中t3 水平显著提高 ( 尸 0 05 ) 。t a k ah a ra 等用5 果寡糖饲喂wistai 雄鼠，结果雄鼠 股骨中的钙、镁、磷的沉积明显增加( 陈主平等，20 05 ) 。在 最近的研究壳寡糖对小鼠微循环和移植性肿瘤影响的试验中， 实验者给小鼠连续灌胃5 天，每天一次，每次注射液中含有0 6 ml 的壳寡糖，结果表明：壳寡糖能够加快小鼠耳廓小动脉血流速 度，提示壳寡糖有改善微循环的作用；对s l8o 肉瘤及肝癌h 22 实体瘤具有抑制作用，且抑瘤率具有一定的量效关系，但其抑 制肿瘤机理尚不十分明确( 王海生等，2 0 05 ) 。另有实验证实 壳寡糖能提高小鼠免疫系统的调节能力，实验者也采取腹部注 射的方法每日一次，连续注射l4 天，结果表明：壳寡糖12o m g k g 。1 组小鼠抗体形成细胞、血清溶血素水平、淋巴细胞增殖率、脾 脏体重指数及耳廓肿胀度较对照组有显著性增加，得出结论适： 当剂量的壳寡糖能提高小鼠的特异性体液免疫及细胞免疫功能 ( 窦江丽等，20 05 ) 。在樱桃谷肉鸭日粮中添加0 1 的甘露寡 糖可使肉鸭期末体重提高5 96 ；平均日增重提高6 65 ；干物 质、粗灰分、粗蛋白的利用率分别提高9 21 ，22 0 9 ，10 6 4 ； 盲肠乳酸杆菌数量显著升高，大肠杆菌和p h 值显著降低( 臧素 敏等，2005 ) 。 除此以外，天然的纯寡糖还有其它如供能、预防蛀牙、降低 血脂及促进矿物质吸收等十分重要的功能。大豆低聚糖还有拮 抗机体过氧化损伤及降脂作用。果寡糖( f o s ) 饮用后钙、铁、镁 8 第一章引言 的吸收率均有上升趋势。基于纯寡糖的上述功能，人们开发出许 多寡糖类保健食品。但某些纯寡糖也有一定的副作用，如大豆低 聚糖中的棉子三糖和水苏四糖不能被胃和肠上段的消化酶消化， 而被结肠中的细菌发酵产气，引起肠胃胀气，被称为大豆胀气因 子，是大豆的抗营养因子之一( 刘晗等，2 00 5 ) 。 1 2 4 低聚寡糖的研究前景 寡糖是饲料中的天然成分，它无残留、无抗药性，具有很 大的发展潜力。但由于寡糖的研究起步较晚，目前的研究成果 还无法取代抗生素在畜牧业中的重要地位。因此，加快对寡糖 的应用研究就显得异常重要。 原来对糖类的利用，是作为能量或利用其甜味等物化特性， 近年来，糖类的生理功能受到了特别重视。寡糖的发展得益乇 对生物膜的研究及应用。有报道，与人体具有共生关系的双歧 杆菌，其细胞表面具有寡糖的受体，寡糖对双歧杆菌的生产及 定值具有重要作用，多种寡糖对双歧杆菌的增殖作用已得以诋 明。随着功能性寡糖种类的增多，许多寡糖的其它生理功能也 得以发现。因此寡糖不仅是大有前途的功能性食品，而且由于 糖链与细胞信息传递及免疫应答关系密切，在植物抗病、疾病 诊断及防治方面的应用潜力也很大。今天，人们对寡糖在食品、 医药及农业方面的发展寄予了厚望。 另外，生物界中还广泛存在着具有信息传递作用的寡糖类 的情报物质，这也是新兴学科糖生物学研究的重要内容。植物 体受外来病原菌入侵时，细胞会合成一种低分子量的抗菌性化 合物一一防御素( p hy1f i xin ) ，这种物质在健康的植物体中是不 存在的，其合成开始的信号物质一一毛莨苷( e ry side ) 就是一种 寡糖。这种寡糖不仅在细胞防卫上起作用，而且在细胞生长、 分化、形态形成上也起着关键的信息传递作用。据报道，几丁 质寡糖的六糖、七糖，对小白鼠有显著的免疫促进效果及抗肿 瘤活性，同时它还与植物防御有关，可诱导几丁质酶的活性及 毛莨苷的活性。这种六糖、七糖对植物病原菌( f u s a r ip ms o l a n i ) 9 华南师范大学硕+ 学位论文 也直接具有抑制作用，并对鞘豌豆产生抗茵物质一一豌豆素 ( pisa tin ) 具诱导效果。寡糖开发的原料资源异常丰富，特别是 纤维素、半纤维类物质的充分利用具有重大社会效益和经济效 益，另一类值得一提的资源是微生物多糖，由于其结构组分类 型的复杂性，有望成为开发具有特殊生理功能的寡糖资源。微 生物已广泛应用于食品工业、医药工业、化学工业及环境、电 子等方面。前述的大部分寡糖都是通过微生物或其产生的酶作 用而生成的。世界上存在着极大数量的微生物，而被认识利用 的不过l0 ，今后新酶产生菌株开发、微生物生理功能的阐明及 基因工程技术的发展和应用，都将会大力促进寡糖的发展( 倪 红等，2003 ) 。 1 3 低温对水产动物的影响 一定的体温是动物体内酶活的基础，从而保证了生理生化 功能的正常运转，无论是变温动物还是恒温动物，遇到外界温 度骤变都会对其自身的生物活性造成一定的影响。 鲤鱼c y pr i n u s ( c )c a r p i oh a e m a t o p t e r u s t e m m i n c ke t s c h le g e l ) 在低温( 6 ) 下呼吸缓慢，成鱼呼吸频率下降到1 1 次min ，幼鱼的呼吸频率下降到19 次m in 。1 ( 陈松波等， 2006 ) ；相似报道也见于南方鲇和瓦氏黄颡鱼，具体表现为在0 胁迫后，耗氧率v 0 ：和呼吸频率vr 表现为先下降、后上升然后 缓慢回落的过程( 彭姜岚等，2 0o7 ) 。在试验中设置10 、16 、22 和2 8 4 个温度梯度，研究了温度变化对黄颡鱼血细胞 数量、大小及血清生化成分的影响。结果显示：红细胞和白细胞 的数量都受到温度的显著影响，两者在10 时数量最高( 杨严鸥 等，2005 ) 。另据报道，低温可以对鲫鱼的性腺发育产生影响 从而造成群体内雌雄比失衡的情况，在低温组( 16 1 ) ，雌雄 比例是l ：1 4 5 ，雌性率达40 8 ，而对照组( 23 25 ) 幼鱼的 雌雄比例大致是l ：1 ( 1 ：1 07 )( 岳敏娟等，20 0 9 ) 。 正常的体温是机体内的酶活顺利进行的基础，而在低温下 酶活力远不能达到正常水平，因此，免疫系统的功能会严重受 1 0 第一章引言 损，从而易受到机械损伤和病菌感染。岱衢族大黄鱼在8 5 低温胁迫下不同持续时间( 0 、12 、2 4 、36h ) 血清生化指标的变 化。结果表明，随着低温胁迫持续时间的延长，大黄鱼血清谷丙 转氨酶、谷草转氨酶、谷酰转肽酶和乳酸脱氢酶活性升高，而 碱性磷酸酶和c a2 + 相比于对照组呈下降趋势；血清总蛋白、白 蛋白、胆固醇和甘油三酯浓度先降低后升高，而铁蛋白、肌酐、 n a + 和cl 一浓度先升高后降低，肌酸激酶同工酶和k + 呈波动状变 化。当低温胁迫持续24h 后，试验鱼开始进入低温适应阶段( 冀 德伟等，200 9 ) 。 相较鱼类而言，对虾的免疫体系更简单原始，因此低温造 成的损失更严重，有报道称中国对虾在18 下生长最慢，且消化 率最低( 田相利，2 0 04 ) 。同样温度对凡纳滨对虾血淋巴免疫 系统影响显著，血细胞酚氧化酶原活力、血淋巴溶菌、抗菌活 力血细胞数量在实验开始时先下降，以后保持稳定( 景福涛等， 20 06 ) 。低温( 9 一l2 ) 条件下白斑综合症( i t ssv ) 也能感染中国 对虾且导致死亡，但低温可抑制白斑综合症( w ssv ) 的增殖，减缓 感染进程，延迟白斑综合症( w ssv ) 的发生( 张俊儒，2 o0 8 ) 。 在不同温度( 5 、10 、1 5 、20 ) 下r 本对虾的最终成活 率分别为：0 、0 、6 7 、4 8 3 ，幼虾体重、体长增长率随温 度的升高而升高( 江敏等，20 02 ) 。 儿纳滨对虾是一种适应性强的养殖品种，有报道其最适水 温为25 32 ，水温低于l8 时，其摄食活动即受影响，9 以 下时侧倒( 张伟权，19 9 0 ；王广军，2 0 00 ) 。也有报道说当水 温在18 以下时，凡纳滨对虾摄食量减少，存活率降低，水温9 时侧卧，温度突变试验，当温度瞬间降至9 时死亡率就高 达96 ( 陈昌生等，20 01 ) 。此外还有报道指出凡纳滨对虾的适 应水温为13 40 ，生长的最适水温为23 3o ：水温低于16 时，基本停食，长期低于l3 出现昏迷，低于7 9 死亡。个 体越小对水温变化的适应能力越弱( 王吉桥，20 02 ) 。从上述 几位研究者的结论中可以发现除了最适水温相差较大外，对于 低温对凡纳滨对虾生理的影响基本一致，故可认为凡纳滨对虾 华南师范大学硕+ 学位论文 在l6 左右时停止摄食活动，低于9 即会出现停止泳动、侧倒 甚至死亡的情况。在我国广大的华北和华东地区，养殖季节仅 限于每年的5 9 月；在华南地区，养殖季节可延长至每年的l1 月甚至12 月，但每年下半年频繁的台风或寒流可能会造成凡纳 滨对虾的大面积发病或死亡，造成养殖减产或失败。200 8 年的 冻灾，仅广东省就冻死水产品4l 万吨，其中，凡纳滨对虾是此 次冻灾死伤的主要养殖品种之一。 由此可见，低温尤其是温度骤降对于凡纳滨对虾的影响是 十分严重的，是秋冬季造成对虾大量减产的罪魁祸首。而前人 的研究多集中于从生理生化角度研究低温对对虾造成的伤害， 鲜见有提高对虾抗低温能力的报道。低聚寡糖作为一种安全环 保的新型饲料添加剂已广泛应用于水产养殖业并产生了良好的 经济价值，本论文的特点即通过研究凡纳滨低温应激的生理反 应，阐明其变化机理，利用营养免疫学的方法来提高凡纳滨对 虾的抗寒能力、存活率及生长速度，延长养殖季节，具有较高 的理论和实践意义。 1 2 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 动物饲养 凡纳滨对虾( l i t o p e n e a u s v an n a m e i ) 购于广州市番禺区东 冲县鱼窝头村，挑选大小均一体格健壮的随机分到2 0 个( 五个 梯度，四个重复) 圆柱形塑胶桶( 2 5 0 l ) 内，桶底按虾数量的1 3 放置8 10 c m 长的p v c 管作为遮蔽物防止对虾互残，桶面加盖 窗纱防止对虾跳出，每桶3 0 尾，每组设四个平行，初始体重为 1 0 4 0 0 3 9 ，试验前先暂养一周，暂养时用商品料和自制料混 喂。正式试验开始后，每天9 ：0 0 ，17 ：0 0 和21 ：0 0 分别投喂 一次，以虾体重的5 为当天的投喂量，投喂量根据对虾的摄食 情况进行调整，饵料以略有残余为准，投喂后一小时清理残