（病理学与病理生理学专业论文）白血病干细胞中aquaporins的表达及其意义.pdf

徐州医学院硕士学位论文 缩略词 心 a q p s b s a c h m 2 8 e d t a f a c s f i t c h g f s h p c h s c 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称中文全称 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 碱性磷酸酶 a q u a p o r i n s水通道蛋白 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清蛋白 c h a n n e l f o r m i n gi n t e g r a lm e m b r a n e形成通道的整合膜 p r o t e i n2 8 k d a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d f l o wc ”o m e t r y f l n u o e r s e e i ni s o t h i o e y a n a e t h e m a t o p o i e t i cg r o w t hf a c t o r s h e m a t o p o i e t i cp r o g e n i t o rc e l l s h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s 蛋白2 8 乙二胺四乙酸 流式细胞仪 异硫氰酸荧光素 造血生长因子 造血祖细胞 造血干细胞 h s c h p c h e m a t o p o i e t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l s 造血干祖细胞 m a c s n b t d p b s p e p m s f p v d f m a g n e t i c a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g n i t r o b l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e 免疫磁珠法 氮兰四唑 光密度 磷酸盐缓冲液 藻红蛋白 苯甲基磺酰氟 聚偏氟乙烯 太砂 厶0 ，f， 办 徐州医学院硕士学位论文 r p m s d s t e m e d s r e v o l u t i o np e rm i n u t e 转分钟 十二烷基硫酸钠 四甲基乙二胺 i r i sh y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 2 n 徐州医学院硕士学位论文 白血病干细胞中a q u a p o r i n s 的表达及其意义 中文摘要 目的检测白血病干细胞中是否有a q p l ( 水通道蛋白) 与a q p 9 ( 水甘油通 道蛋白) 的表达，判断其与白血病细胞异常增殖间可能存在的关系。 方法采用m a c s 法分离纯化白血病患者骨髓中c d 3 4 + c d 3 8 细胞，f a c s 检测分离纯化程度；实验分组：白血病干细胞组、白血病非干细胞组、白血病 红细胞组、正常干细胞组、正常非干细胞组、正常红细胞组，外周血白细胞组和 外周血红细胞组为阳性对照组，w e s t e r nb l o t 检测各组中a q p l 与a q p 9 蛋白的表 达；r t - p c r 检测各组中a q p l 与a q p 9m r n a 的表达；甘油试剂盒检测各 组中甘油的有无及含量；瑞氏姬姆萨染色观察纯化干细胞形态。 结果纯化后各细胞比例：c d 3 4 + c d 3 8 细胞占6 0 0 6 ，c d 3 4 + c d 3 8 + 细胞 占3 5 1 5 ，c d 3 4 c d 3 8 。细胞占5 4 7 ，c d 3 4 c d 3 8 + 细胞占1 3 2 ；w e s t e r nb l o t 结果显示白血病干细胞组与正常干细胞组均无a q p l 蛋白表达，白血病非干细胞 组、白血病红细胞组、正常非干细胞组、正常红细胞组、外周血白细胞组和外周 血红细胞组a q p l 蛋白表达分别为：0 9 7 + 0 0 1 、0 9 5 + 0 0 3 、0 9 6 4 - 0 0 2 、0 9 4 4 - 0 0 3 、 0 9 5 4 - 0 0 3 、0 9 5 4 - 0 0 2 ，但无统计学差异( p 0 0 5 ) ，a q p 9 蛋白仅在阳性对照外周 血白细胞组中有表达；r t - p c r 结果显示白血病干细胞组与正常干细胞组均无 a q p lm r n a 表达，白血病非干细胞组、正常非干细胞组、外周血白细胞组a q p l m r n a 表达分别为：0 9 1 4 - 0 0 2 、0 8 6 4 - 0 0 3 、0 9 5 + 0 0 2 ，但无统计学差异( 尸 0 0 5 ) ， a q p 9m r n a 仅在阳性对照外周血白细胞组中有表达；甘油试剂盒检测结果显 示各组细胞内均含有甘油，白血病干细胞组、白血病非干细胞组、白血病红细胞 组、正常干细胞组、正常非干细胞组、j 下常红细胞组、外周血白细胞组和外周血 红细胞组，各组的甘油含量( r t g m 1 ) 分别为：7 3 1 7 4 - 4 2 5 、6 0 8 3 4 - 6 0 1 、6 5 4 3 4 - 6 5 0 、 气 ? 一 徐州医学院硕士学位论文 1 0 4 0 0 - a ：4 5 8 、9 1 1 7 4 - 4 3 7 、9 7 4 3 4 - 5 0 6 、8 6 7 3 4 - 4 2 5 、9 2 3 3 4 - 2 7 5 ，且组间比较有统 计学差异( 尸，o 0 0 1 ) 。白血病干细胞组与正常干细胞组、白血病非干细胞组与正常 非干细胞组、白血病红细胞组与正常红细胞组、白血病干细胞组与白血病非干细 胞组、正常干细胞组与正常非干细胞组的两两比较均有统计学差异( 氏o 0 5 ) ，且 正常组均高于白血病组、干细胞组均高于非干细胞组。白血病干细胞组、正常干 细胞组、白血病非干细胞组与外周血白细胞组比较有统计学差异( 氏o 0 5 ) ，正常 非干细胞组与外周血白细胞组比较无统计学差异( p 加0 5 ) 。白血病红细胞组与外 周血红细胞组比较有统计学差异( p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fa q p 9m r n a w a s o n l y i np o s i t i v ec o n t r o lp e r i p h e r a lb l o o d w h i t eb l o o dc e l l sg r o u p ；t h er e s u l to fg l y c e r o lk i ts h o w e dt h a te v e r yg r o u pc e l l s c o n t a i n e dg l y c e r i n , t h ec o n t e n to f 酉y c e r i n ( p g r n l ) i nl e u k e m i as t e mc e l l sg r o u p ， l e u k e m i an o n - s t e mc e l l sg r o u p ，l e u k e m i ar e db l o o dc e l l sg r o u p ，n o r m a ls t e mc e l l sg r o u p ， n o r m a ln o n - s t e mc e l l sg r o u p ，n o r m a lr e db l o o dc e l l sg r o u p ，p e r i p h e r a lb l o o dw h i t e b l o o dc e l l sg r o u pa n dp e r i p h e r a lb l o o dr e db l o o dc e l l sg r o u p ，w a sr e s p e c t i v e l y ：7 3 17 4 2 5 ，6 0 8 3 士6 0 1 ，6 5 4 3 6 5 0 ，1 0 4 0 0 4 5 8 ，9 1 1 7 4 3 7 ，9 7 4 3 5 0 6 ，8 6 7 3 士4 2 5 ， 9 2 3 3 士2 7 5 t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gt h e s eg r o u p s ( 氏0 0 01 ) t h e d i f f e r e n c e sw e r es i g n i f i c a n t ( 尸如0 5 ) ，b e t w e e nl e u k e m i as t e mc e l l sg r o u pa n dn o r m a l s t e mc e l l sg r o u p ，b e t w e e nl e u k e m i an o n s t e mc e l l sg r o u pa n dn o r m a ln o n - s t e r nc e l l s g r o u p ，b e t w e e nl e u k e m i ar e db l o o dc e l l sg r o u pa n dn o r m a lr e db l o o dc e l l sg r o u p ， b e t w e e nl e u k e m i as t e mc e l l sg r o u pa n dl e u k e m i an o n - s t e mc e l l sg r o u p ，b e t w e e nn o r m a l s t e mc e l l sg r o u pa n dn o r m a ln o n - s t e mc e l l sg r o u p ，e v e r yn o r m a lg r o u pw a sh i g h e rt h a n e v e r yl e u k e m i ag r o u p ，a n de v e r ys t e mc e l l sg r o u pw a sh i g h e rt h a ne v e r yn o n - s t e mc e l l s g r o u p t h ec o m p a r i s o n so fl e u k e m i as t e mc e l l sg r o u p ，n o r m a ls t e mc e l l sg r o u p ， l e u k e m i an o n - s t e mc e l l sg r o u pa n dp e r i p h e r a lb l o o dw h i t eb l o o dc e l l sg r o u pw e r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 帜o 0 5 ) ，b u tt h ec o m p a r i s o no fn o r m a ln o n - s t e mc e l l sg r o u pa n d p e r i p h e r a lb l o o dw h i t eb l o o dc e l l sg r o u pw a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 妒 0 0 5 ) t h e c o m p a r i s o no fl e u k e m i ar e db l o o dc e l l sg r o u pa n dp e r i p h e r a lb l o o dr e db l o o dc e l l s g r o u pw a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p o 0 5 ) ； i nb o n em a r r o wa n dt h es t e mc e l l ss m e a r , t h es a m es h a p ea n ds i z eo fp r i m i t i v ec e l l s w e r es e e nb yo i lm i c r o s c o p e t h e s ep r i m i t i v ec e l l sw e r er o u n do ro v a l n u c l e u sw a s r o u n do rs l i g h t l yo v a l ，o ri r r e g u l a r , o c c u p i e da l m o s ta l lt h ec e l l s ，i nt h em i d d l eo rb i a s e d t o w a r d so n es i d e ，l i g h tp u r p l er e d c h r o m a t i nw a st e n d e r , u n i f o r md i s t r i b u t e d ，w i t h o u t a n yp h e n o m e n o no fc o n c e n t r a t i o na n dd e e p l ys t a i n e d n u c l e a rm e m b r a n ew a sn e a ta n d t h i n n u c l e u sh a dt h r e et os i xn u c l e o l i c y t o p l a s mw a ss e l d o m , n op a r t i c l e s ，l i g h tb l u e c o n c l u s i o nl e u k e m i as t e r nc e l l sa n dn o r m a lb o n em a r r o ws t e mc e l l sd i dn o t e x p r e s sa q p 1 b u tl e u k e m i an o n s t e mc e l l sa n dn o r m a lb o n em a r r o wn o n - s t e mc e l l s e x p r e s s e da q p1 ，w h i c hw ec o u l dg u e s s e dt h a tt h em o r ee x u b e r a n tc e l l sf u n c t i o na n d m e t a b o l i s mw e r e ，t h em o r ea c t i v ec e l l sw a t e rm e t a b o l i s mw e r e ；l e u k e m i as t e m c e l l s ，n o r m a lb o n em a r r o ws t e mc e l l s ，l e u k e m i an o n - s t e mc e l l sa n dn o r m a lb o n e 6 徐州医学院硕士学位论文 m a l t o wn o n - s t e mc e l l s c o n t 撕n e d 酉”吼i i l ，a n dn o r m a lg r o u p sw e r eh i g h e rt h a n l e u k e m i ag r o u p s ，s t e mc e l l sg r o u p sw e r eh i g h e rt h a nn o n = s t e mc e l l sg r o u p s ，w h i c h p o i n t e dt h a tc e l l sp r o l i f e r a t i v es t a t u sw e 舱r e l a t e dw i t hc e l l sg l y c e r o lc o n t e n t , t h eh i g h e r c e l l sg l y c e r o lc o n t e n tw a s ，t h el o w e rc e l l sp r o l i f e r a t i v er a t ew a s ，w h i c hi l l u s t r a t e dt h a t t h ei n c r e a s eo fc e l l sg l y c e r o lc o n t e n tm a yb ec o n t r i b u t e dt or e d u c et h ep r o l i f e r a t i v er a t e o fc a l l c e rc e l l s ；l e u k e m i as t e mc e l l s ，n o r m a lb o n em a r r o ws t e mc e l l s ，l e u k e m i a n o n - s t e mc e l l sa n dn o r m a lb o n em a r r o wn o n - s t e mc e l l sc o n t a i n e dg l y c e r i 玛b u tt l l e yd i d n o te x p r e s sa q p 9 ，w h i c hi l l u s t r a t e dt h a tt h e yh a do t h e rs w i t c h e da p p r o a c h so fg l y e e r i r l k e yw o r d sl e u k e m i a ；s t e mc e l l s ；g l y c e r i n ；a q p1 ；a q p 9 7 徐州医学院硕士学位论文 前言 肿瘤是剥夺人类生命的重要杀手之一，异常失控的增殖是肿瘤细胞最主要的 生物学特征。尽管对肿瘤细胞异常增殖机制的研究已经非常深入和广泛，但迄今 为止还没有发现切实可行的抑制肿瘤细胞异常增殖的有效途径。 在自然界，有许多静止与复苏交替进行的生命现象，种子的萌发是其中之一。 在适宜的温度和湿度下，静止的种子便会生长、发芽。处于静止期的种子最主要 的特征就是干燥，而饱满干燥的种子遇水几乎都会发芽细胞内复水的过程可 能是其由静止进入增殖的关键环节。种子的另一特征是含有植物油，几乎所有的 种子都可以用来榨油，而出油的部分主要在胚芽，胚芽将发育成茎和叶。可以推 测的是，油水置换很可能参与种子萌发的始动过程。 在自然界，无论是动物还是植物，其基本结构单位都是细胞：不同来源的细 胞，都有类似的基本生命活动规律。造血的“种子 ，造血干细胞参与机体造血的 维持和更新，是动物体内最需要静止增殖交替进行的细胞群体。成年动物造血干 细胞主要定居于骨髓，而骨髓，众所周知，是含有“骨髓油的。“上帝 的这种 安排，应该不仅仅是巧合。造血干细胞内外水的交换，可能也是其静止增殖转换 的k e yp o i n t 。明确造血干细胞膜上水通道蛋白表达的有无及其数量的改变，将有 助于明确这一推测。 另一方面，由于油水分别属于具有不同极性的物质，油水置换显然具有物理 学方面的难度，如果有其它水溶性的物质可以和细胞内的水进行置换，将是干细 胞静止增殖交替更可能、更可行的途径。科学研究的进展给我们提供了另一种可 能的选择：动物细胞膜上的水通道蛋白，恰好有一种亚型水甘油通道蛋白。 而一定浓度的甘油，既具有水溶性，也有足够的抑制细胞内信息传递的粘滞度。 明确造血干细胞膜上水甘油通道蛋白表达的有无及细胞内甘油的有无及含量，将 有助于解释这一猜测。 徐州医学院硕士学位论文 目前的研究已经几乎可以肯定，肿瘤起源于干细胞，是获得异常增殖能力的 干细胞。由于肿瘤细胞的细胞周期并不比其来源的正常组织细胞的细胞周期明显 缩短，因此其异常增殖更可能是静止增殖之间的转换机制障碍，使进入增殖周期 的干细胞不能重新恢复静止而造成其异常增殖。 造血系统肿瘤，自血病干细胞的异常增殖，是否和上述可能机制有关，可以 通过白血病干细胞与正常造血干细胞膜表面水通道蛋白、水甘油通道蛋白、细胞 内甘油的有无及含量差异的比较获得答案。不同来源的肿瘤，应该有至少是相似 的异常增殖机制，明确自血病的发病机制将有助于阐明肿瘤的发生机理。 我们选择血液系统肿瘤作为研究对象的另一原因，是不同阶段造血细胞的表 面标志已经非常明确，利用现有的工具，可以成功分离获得正常以及异常干细胞。 造血干细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，h s c ) 是各种血细胞和免疫细胞的起源 细胞，可以增殖、分化成为各种淋巴细胞、浆细胞、红细胞、血小板、单核细胞 和各种粒细胞。h s c 在体内形成造血干细胞池后，自我更新和多向分化之间常保 持动态平衡。骨髓是出生后的主要造血器官，h s c 主要存在其中。造血 ( h e m a t o p o i e s i s ) 是一个极其复杂精细的动态调控，涉及造血干祖细胞 ( h c m a t o p o i e t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l s ，h s c h p c ) 、造血微环境及造血生长因子 ( h c m a t o p o i c t i cg r o w t hf a c t o r s ，h g f s ) 的相互制约；反映了机体对各种竞争性刺 激、增强和抑制因子反应的平衡性结果；体现了造血细胞增殖、分化、成熟与程 序死亡的全过程；从而维持了h s c h p c 、可辩认的前体细胞以及成熟血细胞的相 对稳定；满足了人体每天持续约1 0 1 2 至少八个系列血细胞的更新与交换。如此大 量血细胞的新陈代谢仅靠骨髓中微量的h s c 就能维持【1 翻。但一旦骨髓中的h s c 受到致病因素作用而造成损害时，造血系统将发生严重疾病。通常认为下列疾病 可与h s c 受损有关，即：再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生 异常综合症、急性非淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病，包括真性红细胞增多症、 慢性粒细胞性白血病、原发性血小板增多症和骨髓纤维化。 9 徐州医学院硕士学位论文 水通道蛋白( a q u a p o r i n s ，a q p s ) ，又称水孔蛋白，是一族广泛存在于原核和 真核细胞膜上，选择性高效转运水分子的特异孔道。自从九十年代红细胞膜上的 水通道蛋白l ( a q p i ) 被发现以来，有关水通道蛋白结构与功能的研究取得了迅 速的、系列性的进展，并于2 0 0 3 年获得了诺贝尔奖殊荣【3 1 。目前在哺乳类已发现 至少有1 3 个成员( a q p 0 a q p l 2 ) 。 a q p l 是首个被鉴定的水通道蛋白，仅能通透水分子。越来越多的研究表明： a q p l 是水通道家族中唯一在内皮细胞表达的亚型，几乎在全身组织中都有分布【4 】， 是目前所知的分布最广泛的水通道蛋白。a q p l 表达或功能的改变不仅对水分子的 传输产生明显影响，而且对细胞的生命活动也至关重要。许多疾病可能与a q p l 功能异常或调节失控有关。目前已有大量的研究表明a q p l 的功能或表达异常与 多种疾病如心肾功能衰竭、脑水肿、肺水肿、肾病性尿崩症、视网膜水肿、青光 眼等的发生相关【5 1 。也有大量研究证实，许多肿瘤组织、细胞系及肿瘤微血管内皮 细胞中高度表达a q p l 6 。引。 a q p 9 最早发现于脂肪组织，之后在白细胞、肝脏、睾丸、脾和脑等器官也有 发现【9 】，并且是目前所知的唯一一种在造血系统表达的水甘油通道蛋白。a q p 9 可通透多种小分子，如水、尿素、甘油、多羟基化合物、瞟呤和嘧啶等【4 】，对保持 细胞内外环境的稳态平衡起重要作用。研究表明a q p 9 与妊娠性高血压疾病、脑 水肿、肝细胞脂肪变性、糖尿病等密切相关【1 m 1 3 1 。 目前国内外对a q p s 在造血干细胞中的表达、分布以及意义尚不清楚，本课题 拟通过免疫磁珠法( m a c s ) 分离纯化白血病和正常骨髓的c d 3 4 + c d 3 8 细胞，通 过w e s t e r nb l o t 法和r t - p c r 法分别检测细胞中a q p i 、a q p 9 蛋白和m r n a 的表 达，甘油含量检测试剂盒检测细胞内甘油含量，探讨a q p i 和a q p 9 在白血病细 胞中的表达及其意义。 l o 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 1 材料 1 1 标本来源 骨髓的获取来自徐州医学院附属医院血液科白血病病人及无血液疾患同时无 病原体感染的开胸患者( 知情同意) ；外周血来自健康志愿者。 1 2 主要试剂耗材 s t e m s e p 富集早期人造血干祖细胞( 1 4 0 5 7 )杭州百通生物技术有限公司 淋巴细胞分离液( 0 7 9 0 7 )杭州百通生物技术有限公司 缓冲液( 2 0 1 0 4 )杭州百通生物技术有限公司 磁珠( 1 9 1 5 0 )杭州百通生物技术有限公司 b d 流式管( 3 5 2 0 0 3 )杭州百通生物技术有限公司 a q p 9 ( g 3 ) 鼠单克隆抗体( s c r 7 4 4 0 9 ) s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ，i n c a q p l ( 1 ) 鼠单克隆抗体( s 争3 2 7 3 8 ) s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ，i n c 马抗鼠二抗北京中杉金桥生物公司 改良w e s t e r n 及口细胞裂解液上海西唐生物科技有限公司 p v d f 膜 美国m i l l i p o r e 公司 n b t b c i p p r o m e g a 公司 人甘油e l i s a 法检测试剂盒( e 0 1 g 0 0 1 5 )上海蓝基生物科技有限公司 r n a p r e pp u r e 培养细胞总r n a 提取试剂盒 天根生化科技有限公司 t i a n s c r i p te d n a 第一链合成试剂盒( k r l 0 4 )天根生化科技有限公司 2 x t a qp c r m a s t e rm i x ( k t 2 0 1 - 0 1 )天根生化科技有限公司 红细胞裂解液天根生化科技有限公司 f i t ca n t i h u m a nc d 3 8 ( 8 5 11 - 0 3 8 9 - 4 1 ) e b i o s c i e n c , e p ea n t i h u m a nc d 3 4( 8 5 12 0 3 4 9 - 41 )e b i o s c i e n 、 徐州医学院硕士学位论文 1 3 试剂配制 1 3 1 p b s 溶液( 0 0 1 m o l l ，p h 7 4 ) 配制： n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 n a i - 1 2 p 0 4 n a c l 双蒸水 1 3 2 蛋白质测定及w e s t e r nb l o t 试剂 ( 1 ) 电泳缓冲液： 3 7 5 9 0 4 3 9 7 2 9 至1 0 0 0 m l 2 5 m m t r i s ( p h 8 3 8 8 ) ，2 5 0 m m 甘氨酸，0 1 s d s 。 ( 2 ) 电转移缓冲液： 2 5 m m i r i s ( p u g 3 8 8 ) ，1 9 2 m m 甘氨酸，0 0 5 s d s ，2 0 甲醇。 ( 3 ) w a s h i n g b u f f e r ( 1 0 0 0 m l 、p h 7 5 、调节p h 、4 保存、用时复温) ( 4 冻) 成份称量 浓度 ( 5 ) 配f o r l i n 甲( 现用现配) ： 1 2 解 徐州医学院硕士学位论文 2 酒石酸钾钠0 5 m l + 1 c u s 0 4 5 h 2 00 5 m l 混匀制成a 液 0 2 nn a o h2 5 m l + 4 n a 2 c 0 32 5 m l 混匀制成b 液 a ：b 以1 ：5 0 的比例混合，先将b 液混匀，再将a 液加入。 ( 6 )s d s 聚丙烯酰胺凝胶： ( 7 ) 封闭液( 2 0 m l 、p h 7 5 、调节p h 、4 c 保存、用时复温) 成份 称量 脱脂奶粉 w a s h i n g b u f f e r l g 2 0 m l ( 8 ) 一抗及二抗工作液：用1 3 封闭液+ 扔w a s h i n g b u 脑稀释至所需浓度。 ( 9 )碱性磷酸酶底物缓冲液：a pb u f f e r ( 1 0 0 m l 、p h 9 0 、调节p h 、4 保存、 用时复温) 1 3 徐州医学院硕士学位论文 ( 1 0 ) n b t b c i p 显z 色液：显色前，： ：1 0 m la p 底物缓冲液中先后力l a 6 6 9 ln b t 和3 3 i t lb c i p ，混匀。 1 3 3r t - p c r 相关试剂的配制 ( 1 ) 电泳液的配制：贮存液1 0 x t b e ( p h8 0 - - 8 2 ) t r i s 1 0 8 0 9 e d t a 9 3 0 9 硼酸 5 5 o g 双蒸水至1 0 0 0 m l 电泳时工作液浓度为0 5 x t b e ，将贮存液稀释2 0 倍。 ( 2 ) 1 0 琼脂糖凝胶的配制： 称取0 3 9 琼脂糖加) k 3 0 m l 电泳缓冲工作液中，微波炉中火加热至沸腾，熔化 的琼脂物冷却至约6 0 1 2 时加入l o m g m l 的溴化乙锭2 5 p l ，充分混匀，将温热的凝胶 倒入已置好梳子的胶模中，在室温下放置2 0 3 0 m i n 后加样进行电泳。 1 4 主要仪器 a l i k et d l - 4 0 b 台式离心机 上海安亭科学仪器厂 a t 2 6 1 电子精密天平 m e t t l c r 酶标仪thermof o r m a ( m a r i e t t a ，o h ，u s a ) d p l 0 显微照相系统日本o l y m p u s 公司 o l y m p u sb x 5 1 显微镜日本o l y m p u s 公司 d y c p 31c 型电泳槽北京六一仪器厂 d y y - 8 c 型电泳仪北京六一仪器厂 d 3 7 5 2 0 型低温离心机h e r a r u s ( g e r m a n y ) k g 2 0 v 6 5 t i 西门子电冰箱安徽博西华制冷有限公司 n c 2 0 2 型电热干燥箱南京市长江电器仪器厂 s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海亚容生化仪器厂 1 4 徐州医学院硕士学位论文 t s 1 型脱色摇床 v l - 1 台式小型高速离心机 w s 2 8 4 - 7 3 手提高压蒸汽消毒器 x 、肌8 q a 涡旋混合器 y j 1 4 5 0 医用净化工作台 蛋白电泳及电转移装置 流式细胞仪( 屺sc a l i b u r 型) 数显恒温水浴锅h h 4 c k 4 0 f 2 0 0 倒置显微镜 p c r 仪 凝胶图像分析系统 恒温磁力搅拌器 移液器 2 方法 2 1 骨髓中单个有核细胞的分离 江苏海门市麒麟医用仪器厂 上海船厂设备分厂 无锡第二医疗器械厂 上海医科大学仪器厂 苏州净化设备公司 美国b i o r a d 公司 美国b d 公司 常州国华电器有限公司 日本o l y m p u s 公司 德国b i o m e t r a 公司 上海复日科技有限公司 常州国华电器公司 e p p e n d o r f ( g e r m a n y ) 骨髓中单个有核细胞的分离采用f i c o l l 分层法：取肝素抗凝的骨髓用p b s1 ：1 稀释后，缓慢叠加于f i c o l l 淋巴细胞分离液( 比重1 0 7 7 ) 上，2 0 0 0 r p m ，离心1 5 m i n ， 吸取单个有核细胞层及底层细胞。p b s 洗涤细胞，2 0 0 0 r p m ，离心5 m i n ，两次。 2 2 免疫磁珠分选干细胞 ( 1 )缓冲液调整单个有核细胞浓度于5 x 1 0 7 个m l ； ( 2 ) 按1 0 0 1 d 抗体m l 细胞悬液的比例，加入s t e m s e p 负选人造血干细胞抗体 混合物( 例如：l m l 细胞悬液加入1 0 0 9 l 抗体混合物) ，混匀，4 c 孵育3 0 m i n ； ( 3 ) 加入e a s y s c p 磁珠，用移液器上下吹打几次，使之充分混匀。磁珠加入 量为1 0 0 1 t l m l ( 例如：l m l 细胞悬液加入1 0 0 9 l 磁珠) ，混匀，4 c 孵育1 5 m i n ； ( 4 )加入缓冲液使总容积增至2 5 m l 。用移液管在试管中轻轻上下吹打2 3 次 1 5 徐州医学院硕士学位论文 使细胞混匀。将试管( 无盖) 置于磁极中。静置1 0 m i r a ( 5 )将磁极连试管一起拿起，连续缓慢倾倒磁极盒流式管，将需要的未吸附细 胞转移至另一个新的流式管中。标记了磁微粒的非目标细胞由于磁极的磁场的吸 引，仍然留在原来的管子中。保持磁极与流式管倒置状态2 3 s ，然后使流式管口 恢复向上的位置； ( 6 ) 从e a s y s e p 磁极中取出装有非目的细胞的流式管，并将含有目的细胞的 新流式管置于磁极中，准备下一轮的磁微粒分选。静置1 0 m i n 并重复第五步； ( 7 ) 缓冲液重悬收集非目的细胞。 2 3 分选细胞的纯度检测及占骨髓细胞、单个有核细胞的比例 ( 1 )调整分选出的干细胞和非干细胞浓度于l x l 0 6 个枷； ( 2 )加入c d 3 4 - p e 、c d 3 8 - f i t c5 i _ d m l ，混匀； ( 3 ) 在冰上避光孵育3 0 m i n ； ( 4 )流式细胞仪( f a c s ) 分析，计算其纯度； ( 5 )台盼蓝染色计算分选出的干细胞占骨髓细胞、单个有核细胞的比例。 2 4 红细胞裂解液裂解外周血红细胞 在血液样品中加入3 倍体积的红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5 1 0 m i n ， 直至液体变成半透明状态，3 0 0 0 r p m ，离心1 5 r a i n ，去上清。p b s 洗涤细胞，2 0 0 0 r p m ， 离心5 m i n ，两次。 2 5w e s t e r nb l o t 检测细胞中a q p l 和a q p 9 的蛋白表达 2 5 1实验分组： ( 1 )白血病干细胞组：白血病病人骨髓经免疫磁珠分选后的干细胞； ( 2 ) 白血病非干细胞组：白血病病人骨髓经免疫磁珠分选后的非干细胞； ( 3 )白血病红细胞组：白血病病人骨髓经f i c o l l 淋巴细胞分离液分离后的底层 细胞； ( 4 )正常干细胞组：无血液疾患同时无病原体感染的开胸患者骨髓经免疫磁珠 1 6 徐州医学院硕士学位论文 分选后的干细胞； ( 5 )正常非干细胞组：无血液疾患同时无病原体感染的开胸患者骨髓经免疫磁 珠分选后的非干细胞； ( 6 ) 正常红细胞组：无血液疾患同时无病原体感染的开胸患者骨髓经f i e o l l 淋 巴细胞分离液分离后的底层细胞。 ( 7 )外周血白细胞组：外周血经红细胞裂解液裂解后所得白细胞，为阳性对照 组： ( 8 ) 外周血红细胞组：外周血经f i e o l l 淋巴细胞分离液分离后的底层细胞，为 阳性对照组。 2 5 2 提取各组细胞的总蛋白 ( 1 ) 收集各组细胞l x l 0 7 个； ( 2 ) 离一1 二, 2 0 0 0 r p m ，5 m i n ，弃上清； ( 3 )力1 1 , k p m s f2 p l ，混匀，2 - 3 m i n 后立即加入裂解液2 0 0 p l ，涡旋震荡； ( 4 ) 离，i ) 1 3 0 0 0 r p m ，4 1 2 ，5 m i n ，取上清。 2 5 3 f o r l i n 法蛋白测定： 吸取上清，迅速按下表中剂量分别加样到标号的试管中，使每管溶液量均为 2 4 m l ，向上述每个试管中加入f o r l i n 甲2 m l ，振荡器迅速混匀后，3 0 c 水浴1 5 m i n 。 然后每管加入f o r l i n 乙0 2 m l ，混匀，3 0 水浴3 0 m i n 。 从水浴取出各管，用分光光度仪5 0 0 n m 波长澳j b s a 组及样品组的d 值，记录各 管的d 值。按下列公式计算v 分装体积： 分装体积v = 4 0 0 l ，t g c 样品 1 7 徐州医学院硕士学位论文 b = c 样品- - d 样品l o x 2 0 p 2 0 + 4 0 x z + 6 0 风+ 8 0 z ) 2 0 2 + 4 0 2 + 6 0 2 + 8 0 2 注：9 2 0 、d 4 0 、d s o 分别为b s a 的2 0 i ，t l 、4 0 t l 、6 0 i t l 、8 0 1 上1 管的d 值。 按上述计算的样品分装体积将各蛋白提取液分装，用双蒸水补至每管1 2 0 1 上1 ， 加入4 0 1 上1 上样缓冲液，混匀，加热煮沸5 m i n ( 液体呈均质蓝色) ，电泳加样或2 0 保存。 2 5 4 凝胶制备 ( 1 )s d s 聚丙烯酰胺凝胶制备：按说明书安装好蛋白凝胶电泳装置，配1 2 5 分离胶后，立即用吸管，沿玻璃板壁，使胶均匀缓慢流下，避免形成气泡，用注 射器在其表面加双蒸水覆盖，凝胶时间控制在约1 5 - 2 0 r a i n ，完全聚合后吸去双蒸 水，同样方法立即将浓缩胶加于分离胶上，迅速插上样梳，避免形成气泡，待浓 缩胶凝固后，两手同时拿住梳子轻轻拔出； ( 2 ) 上样与蛋白电泳：用微量加样器，分别缓慢加入m a r k e r 及4 0 山上样液，避 免样品外溢，盖上电泳槽盖子，插上电极。恒压1 2 0 v 至溴酚兰到达分离胶底部。 然后关闭电源，根据目的蛋白位置裁膜。 2 5 5w e s t e r nb l o t ( 1 )转膜：根据转膜面积( e r a 2 ) 计算转膜电流( n 认) ，电流= 膜的面积2 5 转膜张数；电压不超过2 5 v ( 一般为2 4 v ) ； 根据分子量计算计算转膜时间： 小于6 0 k d 的蛋白，转膜时间= 分子量+ 1 0 ( r a i n ) ； 大于6 0 k d 的蛋白，转膜时间= 分子量( m i n ) ； 设定好仪器后进行转印，将蛋白转移至p v d f 膜上； ( 2 )漂洗封闭：转膜结束后，关闭电源，取出p v d f 膜，将p v d f 膜胶面向上 放于装有w a s h i n gb u f f e r 培养皿中，在摇床上洗1 2 m i n ，洗去p v d f 膜上的转移液， 徐州医学院硕士学位论文 倒掉w a s h i n gb u f f e r ，直接加入封闭液，封闭2 小时； ( 3 ) 将p v d f 膜分别放进一抗：用抗体稀释液将a q p l 和a q p 9 一抗稀释( 1 ：2 0 0 稀释) ，4 过夜； ( 4 ) 第二天复温3 0 m i n 后，w a s h i n gb u f f e r 缓冲液中漂洗5 m i n x 3 次； ( 5 )加入a p 标记的二抗( 1 1 0 0 0 ) ，置于摇床上，室温结合2 小时； ( 6 ) w a s h i n gb u f f e r 缓冲液中漂洗5 m i n x 3 次，再用双蒸水漂洗3 m i n ； ( 7 )显色：将p v d f 膜浸入n b t b c i p 显色液中，随时观察，蛋白条带显示清 楚后，倒掉显色液，加入双蒸水中止反应； ( 8 )取出p v d f 膜晾干，扫描； ( 9 ) 采用i m a g e - j _ 显微图象分析系统测定各条带灰度值，结果以a q p l 、a q p 9 与p - a c t i n 的灰度比值表示a q p l 与a q p 9 蛋白表达的相对强度。 2 6 r t - p c r 检测细胞q a a q p l 和a q p 9 的m r n a 表达 2 6 1 实验分组：取消2 5 1 分组中红细胞组，余相同。 2 6 2 引物设计：a q p l 上游引物：5 c t g g t g c 可订g c g t g c t g3 ，下游引物： 5 a c c c t o g a g ，r r g a t g t c g3 ，产物长度3 4 7 b p ；a q p 9 上游引物：5 g a g c a g c t r a g c g a a a g3 ，下游引物：5 c a c c a g c a a a g g a c a t a3 ，产物 长度3 4 4 b p ；内参g a p d